CN1440458A - 编码mdhA基因的新核苷酸序列 - Google Patents

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CN1440458A
CN1440458A CN01812254A CN01812254A CN1440458A CN 1440458 A CN1440458 A CN 1440458A CN 01812254 A CN01812254 A CN 01812254A CN 01812254 A CN01812254 A CN 01812254A CN 1440458 A CN1440458 A CN 1440458A
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Abstract

本发明涉及来自于棒状细菌的编码mdhA基因并且包含选自于下列一组的多核苷酸序列的多核苷酸：a)与编码包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少有70％的相同性的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列至少有70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，和d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸；本发明还涉及利用具有至少以弱化形式存在的mdhA基因的棒状细菌发酵制备L－氨基酸的方法，以及所述的多核苷酸序列作为杂交探针的用途。

Description

编码mdhA基因的新核苷酸序列
本发明提供了来自于棒状细菌的编码mdhA基因的核苷酸序列，提供了利用mdhA基因的弱化发酵制备氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。
现有技术
L-氨基酸特别是赖氨酸被用于人用药物和制药工业，饲料工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其意义重大，其制备工艺一直在不断改进。生产方法的改进可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或对产品形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有的产量特性。
为改进这些微生物的产量特性，可使用诱变，选择及突变体选择的方法，以此方法可获得具有抗代谢物抗性或对重要的调节代谢物具有营养缺陷性的、并产生氨基酸的菌株。
若干年来，重组DNA技术的方法也用于生产L-氨基酸的棒杆菌属菌株的改良。
发明目的
本发明人的目的是提供新的措施以改良氨基酸，特别是L-赖氨酸的发酵制备。
发明描述
L-氨基酸特别是赖氨酸用于人用药物和制药工业、饲料工业、特别是动物营养。因此提供用于制备氨基酸，特别是L-赖氨酸的新的改良的方法有广泛的需要。
本发明提供了来自于棒状细菌的分离的多核苷酸，包括选自于下列一组的编码mdhA基因的多核苷酸序列：
a)与编码包含SEQ ID NO.：3所述的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少有70％相同性的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO.：3所述的氨基酸序列至少有70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，和
d)包含a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，
该多肽优选地具有苹果酸脱氢酶活性。
本发明还提供了具有苹果酸脱氢酶活性的分离的多肽，其包含SEQ DNO.：1所述的氨基酸序列。
本发明还提供了权利要求1所述的多核苷酸，它优选地是能够复制的DNA，包含：
(i)SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，或
(ii)至少一个对应于(i)的遗传密码简并范围内的序列，或
(iii)至少一个与序列(i)或(ii)互补的序列杂交的序列，和任选地
(iv)(i)的中性功能有义突变。
本发明还提供了：
能够复制的DNA，其包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
含有在权利要求1的第d点要求保护的多核苷酸的载体，特别是
pEMmdhAint，其以在大肠杆菌DSM 13494中的形式，于2000年5
月18日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)；
在mdhA基因中含有缺失或插入的、特别是使用pEMmdhAint载体的
棒状细菌。
本发明还提供了实质上包含一个多核苷酸序列的多核苷酸，该多核苷酸序列可通过对相应的基因文库进行杂交筛选和分离相应的DNA序列而获得，所述基因文库包含具有对应于SEQ ID NO：2的多核苷酸序列的完整mdhA基因，杂交所用的探针包含前述SEQ ID NO.：2的多核苷酸序列或其片段。
含有本发明的序列的多核苷酸适用作为RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以便分离编码苹果酸脱氢酶的全长核酸、或多核苷酸或基因，或分离与苹果酸脱氢酶基因序列具有高度相似性的核酸或多核苷酸或基因。
此外含有本发明序列的多核苷酸序列适用作为引物，用于通过聚合酶链反应(PCR)可以制备编码苹果酸脱氢酶的基因的DNA。
用作探针或引物的这样的寡核苷酸包括至少30，优选的至少20，特别优选的至少15连续的核苷酸。具有至少40或50个核苷酸长度的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般是指多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：3的多肽，特别是具有苹果酸脱氢酶的生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：3的多肽至少具有70％，优选地至少80％，特别是至少90-95％相同性并具有所述活性的多肽。
此外本发明进一步提供了用棒状细菌，特别是已经产生氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸，尤其是生产赖氨酸的方法，所述棒状细菌中编码mdhA基因的核苷酸序列是弱化的，尤其是被去除的或低水平表达的。
术语″弱化″在本文中描述了例如利用一个弱的启动子或利用一个编码具有低活性的对应酶的基因，或等位基因，减少或除去微生物中由对应的DNA编码的一个或多个酶(蛋白质)的胞内的活性，或使对应基因或酶(蛋白质)失去活性，以及将这些手段任选地结合进行。
本发明提供的微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素、或从甘油和乙醇制造氨基酸，特别是赖氨酸。它们可以是典型的棒状杆菌，特别是棒杆菌属。就棒杆菌属而言，可以被特别提到的是谷氨酸棒杆菌，本领域内技术人员知道其具有生产L-氨基酸的能力。
棒杆菌属特别是谷氨酸棒杆菌的合适菌株是如下的已知野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒状杆菌ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC13870
Corynebacterium melassecola ATCC17965
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020
和由此制备的、产生L-氨基酸的突变体或菌株，例如产生L-赖氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌FERM-P1709
黄色短杆菌FERM-P1708
乳发酵短杆菌FERM-P1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464
谷氨酸棒杆菌DM58-1
谷氨酸棒杆菌DG52-5
谷氨酸棒杆菌DSM5714和
谷氨酸棒杆菌DSM12866。
已经发现了编码苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)的谷氨酸棒杆菌的新的mdhA基因。
为此，首先通过层析方法将苹果酸脱氢酶蛋白质纯化至同质。蛋白质纯化和制备的方法和规程可参见Schleifer和Wensink在教科书PracticalMethods in Molecular Biology(Springer Verlag，Berlin，Germany，1981)；以及Harris和Angal的手册：蛋白质纯化方法：实用的入门(IRL 出版社，牛津大学，UK，1989)；Scopes的教科书：蛋白质纯化：原理和实践，第三版(Springer Verlag，N.Y.，USA，1993)和通常已知的教科书和手册的描述。然后通过用合适的酶，例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理将纯的酶蛋白质分解为肽。采用Edman(Archives ofBiochemistry 22，475(1949))描述的N-末端测序方法可以测定这些肽的氨基酸序列。同样地直接测定纯化酶蛋白质的的N-末端氨基酸是可能的。蛋白质测序的方法和指导见例如Smith：蛋白质测序方案[sic]：分子生物学方法，Vol.64和Vol.112(Humana出版社，Totowa，N.J.，USA，1996)和Kamp等人：蛋白质结构分析：制备，定性和微测序(Springer Verlag.纽约，N.Y.，USA，1997)所述。以这种方式，依靠外置物可以部分或全部测定苹果酸脱氢酶蛋白质的氨基酸序列。所分离的苹果酸脱氢酶蛋白质的20个N-末端氨基酸显示于SEQ ID NO..1。
利用棒状细菌的密码子的已知的用法(Malumbres等人(基因134，15-24(1993))，可以合成寡核苷酸并将其作为引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增对应的染色体的DNA片段。该规程由专家建立，例如Gait的手册：寡核苷酸合成：实用入门(IRL出版社，Oxford，UK，1984)和Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。然后将以这种方式获得的sod基因的DNA片段用已知方法，如Sambrook等人：分子克隆实验指南，第2版(冷泉港实验室出版社，USA，1989)所述，进行克隆，并以该片段作为探针，在基因文库中搜寻整个基因，包括其5′和3′侧翼。
同样地，可以采用″质粒拯救″的方法分离包括其5′和3′侧翼的整个基因。将以上述方式获得的目的基因片段克隆到质粒载体，该载体在棒状杆菌中是不复制的。通过转化和随后的同源的重组，将含有该基因片段的质粒载体掺入到或整合到宿主的靶基因，从而将靶基因标记。然后用适当的限制性酶对以这种方式标记的菌株的染色体DNA进行分离和消化。适当的限制性酶尤其是指不裂解所使用的载体DNA的那些酶。通过用连接酶处理将获得的DNA片段环化，用连接混合体转化适用于质粒载体复制的宿主，典型的是大肠杆菌。从转化体分离质粒DNA并将克隆DNA区段测序。″质粒拯救″的方法见例如Niaudet等人(基因19，277-284(1982))所述。DNA测序方法见Sanger等人(美国科学院学报，74：5463-5467，1977)或Zimmerman等人的方案(BioTechniques 17：302(1994))所述。
然后用已知的算法或序列分析方案，例如Staden(Nucleic AcidsResearch 14，217-232(1986))、Marck(Nucleic Acids Research 16，1829-1836(1988))所述的方法或Butler的GCG程序(生化分析方法39，74-97(1998))，对获得的DNA序列进行研究。
以这种方式发现了本发明的如SEQ ID NO：2所示的谷氨酸棒杆菌的编码mdhA基因的新的DNA序列。此外采用上述方法已经从本发明的DNA序列获得了对应的转译产物或基因产物的氨基酸序列。获得的mdhA基因产物的氨基酸序列显示于SEQ ID NO.3。已知(O′Regan等人，基因77，237-251(1989))各种的蛋白质中由起始密码子ATG编码的甲硫氨酸或甲酰基甲硫氨酸被宿主的酶去除。
由遗传密码的简并性从SEQ ID NO.2获得的DNA编码序列也是本发明的一部分。同样的，与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.2的部分杂交的DNA序列是本发明的一部分。最后，利用从SEQ ID NO.2得到的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列是本发明的一部分。
在Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，德国，1993)的手册″TheDIG System Users Guide for Filter Hybridization″，和在Liebl等人(Intemational Journal of Systematic Bacteriology(1991)41：255-260)的手册中专业人员可以找到借助于杂交识别DNA序列的规程。在Gait：Oligonukleotide synthesis：a practical approach(IRL Press，Oxford，UK，1984)的手册，和在Newton and Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)手册中专业人员可以找到借助于聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的规程。
已经发现在mdhA基因弱化后，棒状杆菌以改良的方式产生氨基酸，特别是L-赖氨酸。
为了达到弱化，可以降低或除去mdhA基因的表达或酶蛋白的催化性能。可选择的将二个措施结合进行。
采用合适的培养方法或基因表达的信号结构的遗传修饰(突变)可以实现基因表达的减少。例如基因表达的信号结构是阻遏基因，活化基因，操纵基因，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子和终止子。专业人员可在例如专利申请WO 96/15246，在Boyd和Murphy (Joumal ofBacteriology 170：5949(1988))，在Voskuil和Chambliss(Nucleic AcidsResearch 26：3548(1998)，在Jensen和Hammer(BiotechNO.logy andBioengineering 58：191(1998))，在Patek等人(Microbiology 142：1297(1996))，Vasicova等人(Joumal of Bacteriology 181：6188(1999))和在已知的遗传学和分子生物学教科书，例如教科书Knippers(″Molekulare Genetik[分子遗传学]″，第6版，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，德国，1995)或Winnacker(″Gene und Klone[基因和克隆]″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)中发现这些信息。
导致酶蛋白质的催化性能改变或降低的突变是现有技术中已知的；可以提到的例子是Qiu和Goodman(Joumal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997))，Sugimoto等人(Bioscience BiotechNO.logy andBiochemistry 61：1760-1762(1997))和Mckel(″Die Threonindehydratase ausCorynebacterium glutamicum：Aufhebung der allosterischen Regulation undStruktur des Enzyms[谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶：酶的变构的取消调节和酶的结构]″的著作，Jülich研究中心的报告，Jül-2906，ISSN09442952，Jülich，德国，1994)。广泛的描述可发现于已知的遗传学和分子生物学教科书，例如Hagemann(″Allgemeine Genetik[常规遗传学]″，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1986)。
可能的突变是转换，易位，插入和缺失。依据氨基酸交换对酶活性的作用，可提到的是错义突变或无意义的突变。一个基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致框移突变，其结果是掺入不正确的氨基酸或翻译过程被提前中断。几个密码子的缺失通常导致酶活性的全部损失。产生这样的突变的规程可参见现有技术，可以在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到，例如Knippers(″Molekulare Genetik[分子遗传学]″，第6版，Georg ThiemeVerlag，Stuttgart，德国，1995)，Winnacker(″Gene und Klone[基因和克隆]″，VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1990)或Hagemann (＂AllgemeineGenetik[常规遗传学]″，Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1986)的教科书。
使谷氨酸棒杆菌基因产生变异的普通的方法是Schwarzer和Pühler(Bio/TechNO.logy 9，84-87(1991))描述的基因破坏和基因置换方法。
在基因破坏方法中将目的基因的编码区域的中央部分克隆到可以在宿主(通常大肠杆菌)中复制但不能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中。合适的载体例如是pSUP301(Simon等人，Bio/TechNO.logy 1，784-791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schfer等人，基因145，69-73(1994))，pK18mobsacB或pK19mobsacB (Jger等人，Journal of Bacteriology 174：5462-65(1992))，pGEM-T(Promega corporation，Madison，WI.，USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994).Journal of Biological Chemistry 269：32678-84；美国专利5,487,993)，pCRBlunt(Invitrogen，Groningen，Holland；Bemard等人，Jourmal ofMolecular Biology，234：534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等人，1991，Journal of Bacteriology 173：4510-4516)。然后采用接合或转化的方法将含有该基因的编码区的中央部分的质粒载体转移到所需的谷氨酸棒杆菌菌株中。Schfer等人(Applied and Environmental Microbiology 60，756-759(1994))描述了接合方法。例如由Thierbach等人(Applied Microbiology andBiotechNO.logy 29，356-362(1988))，Dunican和Shivnan(Bio/TechNO.logy 7，1067-1070(1989))和Tauch等人(FEMS Microbiological Letters 123，343-347(1994))描述转化方法。在″交叉杂交″同源重组之后，所需基因的编码区域被载体序列打断，获得二个不完全的等位基因，一个缺乏3′末端和一个缺乏5′末端。该方法已经被Fitzpatrick等人(Applied Microbiology andBiotechNO.logy 42，575-580(1994))使用以除去谷氨酸棒杆菌的recA基因。
图1显示了质粒载体pEMmdhAint，借助于该质粒可以破坏或去除mdhA基因。
在基因置换方法中，体外建立目的基因的突变，例如缺失，插入或碱基交换。依次将所制备的等位基因克隆到在谷氨酸棒杆菌中不复制的载体中，然后将其通过转化或接合转移到所需的谷氨酸棒杆菌宿主中。同源重组的过程为第一次″交换″实现整合，适当的第二″交换″实现靶基因或靶序列切除，经过同源重组可实现突变或等位基因的掺入。例如Peters-Wendisch(Microbiology 144，915-927(1998))使用该方法以通过缺失除去谷氨酸棒杆菌pyc基因。
以这种方式将缺失，插入或碱基交换掺入到mdhA基因。
另外，除了弱化mdhA基因，加强，特别是过量表达糖酵解、回补、戊糖磷酸盐循环或氨基酸输出的生物合成途径的一个或多个特定的酶，对于生产L-氨基酸，特别是L-赖氨酸以是有益的。
因此，例如，为制备L-赖氨酸，可同时增强、特别是过量表达选自下列基因的一个或多个基因：
·编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B0 197335)，
·编码烯醇化酶的enoO基因(DE：19947791.4)，
·编码zwf基因产物的zwf基因(JP-A-09224661)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，Journal ofBacteriology 174：6076-6086)，
·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-195 48 222)。
除了mdhA基因的弱化，为更加利于生产氨基酸，特别是L-赖氨酸，可同时将选自于下列基因的一个或多个基因进行弱化：
·编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，
·编码葡萄糖6-磷酸异构酶的pgi基因(U.S.09/396,478，DSM12969)，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE：1995 1975.7，DSM 13114)。
除了弱化mdhA基因，消除不合需要的次要反应将进一步有利于生产氨基酸，特别是L-赖氨酸(Nakayama：″产生氨基酸的微生物的育种″，见：微生物的产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(eds.)，学术出版社，英国伦敦，1982)。
本发明还提供了按照本发明制备的微生物，可以将这些微生物以分批方法(分批培养)或在补料分批(补料方法)或重复补料分批方法(重复补料方法)中连续地或不连续地培养，以生产L-氨基酸，特别是L-赖氨酸。已知的培养方法的概要见Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung indie Bioverfahrenstechnik[Bioprocess TechNO.logy]生物过程技术的导论(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或见Storhas的教科书(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen[Bioreactors and Peripheral Equipment](ViewegVerlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))所述。
所使用的培养基必须以合适的方式满足特定的菌株。美国细菌学协会的手册″Manual of Methods for General Bacteriology″(Washington D.C.，USA，1981)描述了各种的微生物的培养基。糖和碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉，和纤维素，油类和脂肪，例如大豆油，向日葵油，落花生油和椰子脂油，脂肪酸，例如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇，例如甘油和乙醇，和有机酸，例如乙酸，可用作为碳源。这些物质可以是单独或作为混合物使用。含有有机氮的化合物，例如蛋白胨，酵母提取物，肉类提取物，麦芽提取物，玉米浆，大豆粉，和尿素，或无机化合物，例如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵可用作为氮源。氮源可以是单独或作为混合物使用。磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或或相应的钠盐可用作为磷源。此外如果生长必要，培养基包括金属盐，例如硫酸镁或硫酸亚铁。最后，除了上面提到的物质，可以包括必要的生长物质，例如氨基酸和维生素。培养基中还可加入合适的前体。所提到的起始物质可以单一批量形式添加入培养物，或是以合适的方式在培养期间进料。
可以以适当的方式使用碱性的化合物，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或含水的氨，或酸化合物，例如磷酸或硫酸以控制pH。可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯控制泡沫的发生。可以在培养基中加入具有选择作用的合适的物质例如抗生素以维持质粒的稳定性。为了维持需氧的状态，将氧或含有氧的气体混合物，例如空气导入到培养物。通常培养物的温度是20℃到45℃，优选的是25℃到40℃。连续培养直到形成最大量的所需产品。通常在10小时到160小时内达到该目标。
现有技术中已知测定L-氨基酸的方法。因此该分析可以按照例Spackman等人(Analytical Chemistry，30，(1958)，1190)描述的阴离子交换层析法继而茚三酮衍生法来进行，或者按照Lindroth等人(AnalyticalChemistry(1979)51：1167-1174)的描述的反向HPLC进行。
根据布达佩斯条约的规定，于2000年5月18日将下面的微生物保藏于德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen undZellkulturen，DSMZ，德国不伦瑞克)：
·大肠杆菌DH5αmcr/pEMmdhAint，保藏号DSM13494。
本发明的方法可用于发酵制备氨基酸，特别是L-赖氨酸。
借助于实施例，更详细地解释本发明。
从大肠杆菌分离质粒DNA以及所有的限制性消化、Klenow和碱性磷酸酶处理技术按照Sambrook等人(分子克隆实验指南(1989)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，美国)所述进行。在该手册中描述了大肠杆菌的转化方法。
Sambrook等人在手册中还描述了常用的营养培养基组合物，例如LB或TY培养基。
苹果酸脱氢酶的活性可根据Sanwal(Joumal of Biological Chemistry244(7)：1831-1837(1969))和Smith(Methods of Enzymatical Analysis，1985，ed.3，volume 3(Bergmeyer等人(eds.))VCH Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany)等人所述进行测定。蛋白质浓度可按照Smith等人的方法进行测定(Analytical Biochemistry 150：76-85(1985))。
实施例1
从谷氨酸棒杆菌ATCC13032分离和纯化苹果酸脱氢酶
100ml 2×TY培养基共4份，在每份中均接种谷氨酸棒杆菌ATCC13032的菌落，每份均培养于在250ml圆锥形瓶中，在30℃、每分钟200转数条件下培养16小时。将细胞以缓冲液A(50mM磷酸钾，pH7.5，1mM二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸)在4℃洗涤两次，重新悬浮于20毫升的相同的缓冲液中。将细胞在预先冷却的Spectronic Unicam(Rochester. N.Y.，USA)的French Pressure Cell中165 MPa破碎3次。然后在4℃，以75600xg离心10分钟将细胞碎片沉淀。苹果酸脱氢酶蛋白质经过三个步骤纯化。
步骤1
硫酸链霉素沉淀：
取上清液进一步地用硫酸链霉素沉淀处理。对此，慢慢地加入10％(重量/体积)硫酸链霉素溶液，在0℃搅拌，直到终浓度达到0.75％。在冰上放置15分钟，然后在4℃，15000xg离心10分钟。然后将上清液导入根据制造商(Medicell，London，UK)说明预处理的透析袋中，在1升缓冲液B(10mM磷酸K，pH7.5，1mM二硫苏糖醇，2mM乙二胺四乙酸)中，4℃渗析，每次1.5小时，共两次。然后在4℃，75600xg将透析液离心15分钟。
步骤2
阴离子交换层析法
取步骤1的上清液并导入到型号为″Resource Q″(1ml柱体积，Amersham Pharmacia，Freiburg，Germany)的阴离子交换柱，该柱已经用4个柱体积的缓冲液B平衡。用4个柱体积的缓冲液B冲洗该柱，然后用15个柱体积的缓冲液B到缓冲液C(10mM磷酸钾，pH7.5，1mM二硫苏糖醇，2mM乙烯四乙酸，1M NaCl)的线性梯度进行洗脱。在20℃进行阴离子交换层析，在4℃收集馏分。在约0.5M NaCl处洗脱苹果酸脱氢酶。将含有苹果酸脱氢酶活性的馏分合并，然后根据制造商的说明，借助于PD-10柱(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国)，用冰冷的缓冲液D(10mM磷酸盐K，pH7.5)进行凝胶过滤而去盐。
步骤3
染料亲和层析法：
将步骤2的不到10毫克的总蛋白质导入到填充了2.5毫升柱材料″Reactive Brown 10″(Sigma，Deisenhofen，德国)和用12.5毫升缓冲液D平衡的柱。该柱用15毫升冰的缓冲液D冲洗，用2.5毫升缓冲液E(10mM磷酸钾，pH7.5，1mM NADH)洗脱苹果酸脱氢酶。洗脱液用如上所述的PD-10柱进行凝胶过滤去盐。
步骤4
染料亲和层析法
重复步骤3。以这种方式将纯化的蛋白质储存于-20℃。为了稳定其活性，在样品中添加1mg/ml牛血清白蛋白。用于测定苹果酸脱氢酶蛋白质的N-末端序列的样品不添加牛血清白蛋白。用Perkin Elmer(Foster City，Calif.，USA)Lambda-10分光光度计测定纯化的酶的活性。在0.1mM草酰乙酸和0.3mM NADH条件下，纯化的苹果酸脱氢酶具有最大的特异性草酰乙酸-还原活性，其还原活性为每分钟每毫克蛋白质1200-1300微摩尔。
借助于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分离的苹果酸脱氢酶纯度。该分析显示纯化的苹果酸脱氢酶的表观分子量为33kDa的同质的蛋白质。
实施例2
N-位置的氨基酸序列的测定
借助于PE Biosystems(Foster City，Calif.，USA)的476A型自动序列分析仪，通过Edman降解法(Edman，Molecular Biology BiochemistryBiophysics 8：211-55(1970))测定纯化的苹果酸脱氢酶蛋白质的N-位置氨基酸序列。获得的氨基酸序列(也可参见SEQ ID NO..1)是：
Asn-Ser-Pro-Gln-Asn-Val-Ser-Thr-Lys-Lys-Val-Thr-Val-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Gln-Ile。
实施例3
制备具有一个拷贝mdhA基因内部片段的载体
用聚合酶链反应(PCR)从菌株ATCC13032的染色体DNA起始扩增mdhA基因片段，然后将其克隆。借助于实施例2测定的N-位置的氨基酸序列，丢弃简并引物P1。该引物具有序列：5′-AARGTYACYGTYACYGGY-3′。
具有下列序列的引物P2用作为第二简并引物：
5′-CGRTTRTGRTCVARRCG-3′。
缩写R代表核苷碱基A或G，缩写Y代表C或T，缩写V代表A、G或C。
所示引物由MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成。采用Innis等人的标准PCR方法(PCR方案，方法和应用指南，1990，学术出版社，纽约，美国)进行PCR反应。模板为按照Pospiech和Neumann描述的方法分离的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA(Trends in Genetics 11：217-218(1995))。
在聚合酶链反应中，将包括变性(30秒，94℃)，退火(60秒，63℃)和合成(90秒，72℃)的一个循环，进行30次。然后在72℃最后合成10分钟。使用来自于Promega(Madison，Wis.，USA)的Taq聚合酶和Techne(Cambridge，UK)的热循环仪。
借助于Qiagen(Hilden，德国)的QIAQuick PCR纯化试剂盒纯化以这种方式制备的、长约470bp的mdhA基因的DNA片段，将其克隆到载体pBlueskript II SK(+)(Stratagene，La Jolla，Calif.，USA)的EcoRV裂解位点。然后借助于限制性酶BamHI和HindIII分离该片段，克隆到用限制性酶BamHI和HindIII(Schrumpf等人Journal of Bacteriology 173，4510-4516(1991))处理的大肠杆菌DHα的载体pEM1中，在补充50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中进行选择。以这种方式形成的质粒称之为pEMmdhAint。
实施例4
mdhA基因序列的测定
在菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，用质粒pEMmdhAint使mdhA基因失活。
按Van der Rest等人(Applied Microbiology and Biotechnology 52，541-545(1999))所述，用质粒pEMmdhAint转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032菌株。在补充了25mG/l卡那霉素的LBHIS琼脂上选择转化体，LBHIS琼脂包含补充了18.5g/l脑心肉汤(Becton Dickinson，Sparks Md.，USA)，91g/l山梨醇和15g/l琼脂—琼脂的LB培养基。以这种方式形成在mdhA基因中整合了质粒pEMmdhAint的菌株ATCC13032 mdhA∷pEMmdhAint。
根据Pospiech和Neumann(Trends in Genetics 11：217-218(1995))所述从菌株ATCC13032mdhA∷pEMmdhAint分离染色体DNA，分为两个不同的批次进行完全消化，一次用限制性酶StuI，一次用限制性酶XbaI。按照Niaudet等人(Gene 19，277-284(1982))描述，将染色体限制性片段连接，使用连接批次转化大肠杆菌DH5α-MCR(Grant等人美国国家科学院学报87，4645-4649(1990))。在加了50mg/l卡那霉素的LB琼脂上挑选转化体。从转化体分离质粒DNA用于限制性分析。以这种方式鉴定了质粒pEMmdhAint-StuI和pEMmdhAint-XbaI，所述质粒除了携带已经克隆到质粒pEMmdhAint中的长470bp的mdhA基因的内部片段，还携带该基因的5′和3′末端区域。从StuI消化获得的pEMmdhAint-StuI质粒另外在470bp区域的5′末端具有0.56kb，在3′末端具有0.40kb。从XbaI消化获得的质粒pEMmdhAint-XbaI另外在470bp区域3′末端具有1.2kb。
利用Zimmerman等人的循环测序草案(BioTechniques 17：302(1994))，采用Seqlab(Gttingen，德国)对所获得的质粒测序。用Intelligenetics公司(日内瓦，瑞士)的PC/Gene Version 6.60评估该序列。mdhA基因串的序列显示于SEQ ID NO.2。
实施例5
制备具有失活的mdhA基因的L-赖氨酸生产菌
用各种已知谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产菌进行实验以便研究去除mdhA基因对赖氨酸生产的影响。
1.菌株的制备
菌株MH20-22B如EP-B-0435132所述，其根据布达佩斯条约保藏，保藏号DSM5715。菌株DM58-1描述于EP-B-0358940。其中描述的转化体DM58-1/pDM6根据布达佩斯条约保藏，保藏号DSM4697。经过自愈方法从DSM4697制备菌株DM58-1，例如Schafer等人(Journal ofBacteriology，176，7309-7319(1994))描述的″质粒自愈″方法。菌株DG 52-5描述于DE-C-3823451。根据布达佩斯条约将其中描述的转化体DG 52-5/pZl-asd保藏，保藏号DSM4421。采用″质粒自愈″方法也能从DSM4421制备菌株DG52-5。
根据Van der Rest等人(Applied Microbiology and BiotechNO.logy52，541-545(1999))描述，通过用质粒pEMmdhAint转化菌株谷氨酸棒杆菌MH20-22B，在LBHIS琼脂上进行转化体的选择，该培养基已经补充了25mg/l卡那霉素。以这种方式形成菌株MH20-22BmdhA∷pEMmdhAint。从菌株DG52-5和DM58-1开始，在各种情况下以相同的方式形成菌株DG52-5mdhA∷pEMmdhAint和DM58-1mdhA∷pEMmdhAint。
2.苹果酸脱氢酶活性的测定
为了证实成功地进行插入诱变，在菌株MH20-22B、DM58-1和DG52-5和在插入突变体MH20-22BmdhA∷pEMmdhAint、DG52-SmdhA∷pEMmdhAint和DM58-1mdhA∷pEMmdhAint测定苹果酸脱氢酶活性。为此，在各种情况下将菌株的菌落接种到50ml2×TY培养基，在250ml圆锥瓶中、在30℃和200旋转/分钟培养16小时。本实验用于菌株MH20-22BmdhA∷pEMmdhAint，DG52-5mdhA∷pEMmdhAint andDM58-1mdhA∷pEMmdhAint的培养基另外加入25mug/ml卡那霉素。在10000xg将培养物离心10分钟，用50mM磷酸钾pH7.5洗涤2次，然后悬浮于5ml同样的缓冲液。经过两次，在冰冷的French压榨细胞机，以165Mpa，将细胞悬液破碎。然后将样品以75000xg和4℃，离心10分钟。将澄清的上清液用作为粗制的提取液，进行苹果酸脱氢酶活性测定。用添加了4.5mM MgCl2和2.9mM NAD+的100mM 3-氨基-1-丙醇(pH9.2)缓冲液测定苹果酸脱氢酶。测试的批量含有1毫升的该缓冲液和50μl的粗制的提取液。首先将该批量在30℃孵育30分钟。其后，通过加入25mM中和的L-苹果酸开始苹果酸脱氢酶反应。用PE Biosystems(Foster City，Calif.，USA)的Lambda-10分光光度计，在340nm波长处测量吸收值。没有L-苹果酸的整个反应批量的测量值作为特定的NAD+还原率的对照。
起始菌株MH20-22B、DM58-1和DG52-5分别具有苹果酸脱氢酶比活性301，380和354nmol/min x mg蛋白质，而mdhA插入突变体没有显示可检测的苹果酸脱氢酶活性。此时对于活性的检测下限是2nmol/minxmg蛋白质。
实施例6
L-赖氨酸的制备
将实施例5描述的菌株在2×TY培养基中，30℃培养24小时，对于插入突变体该培养基已经补充了卡那霉素(25μg/ml)。对于在液体培养基中培养，对于插入突变体，使用另外补充卡那霉素(25mg/l)的CgIII培养基(Keilhauer等，1993，Journal of Bacteriology 175：5595-5603)。对此，在含有的10毫升培养基的100毫升圆锥形瓶中接种该菌株的菌落，然后将该培养物进一步用作预培养物。
将CGXII-葡萄糖基本培养基(Keilhauer等人Journal of Bacteriology175，5595-5603(1993))用作为生产和测试培养基。该培养基不含有卡那霉素。在底部配备了直径为2cm沿着边缘横躺的金属螺旋的500ml圆锥瓶中进行培养。这些瓶填充了60ml CGXII-葡萄糖基本培养基。培养物用预培养物接种，以便在起始时光密度值为0.5到0.6之间。在30℃培养72小时。以每分钟140转数的频率摇动烧瓶。
在培养72小时之后，测定生产培养基中培养物的光密度和赖氨酸浓度。
在600nm波长处用Perkin-Elmer的Lambda B分光光度计测定光密度(OD)。
使用Chromatographie-Service，Langerwehe，德国″Hypersil ODS 5μ″柱(容积：125×4mm)进行″高效液相层析″测定L-赖氨酸。采用移动相A：0.1mM乙酸钠，pH7.5和B：甲醇(A∶B的比率85∶15到0∶100)的线性梯度进行分离。在应用之前5分钟用ortho-phthalodialdehyde(OPA reagent，Pierce，Rockford Ill.，USA)衍生氨基酸。通过测量激发波长为243nm和发射波长为436nm的荧光进行检测。实验结果显示于表1。
表1
    菌株   光密度  L-赖氨酸(mM)
    MH20-22B     37.1     26.1
    MH20-22BmdhA∷pEMmdhAint     36.5     29.3
    DG52-5     32.4     13.6
    DG52-5mdhA∷pEMmdhAint     48.7     44.4
    DM58-1     42.0     32.2
    DM58-1mdhA∷pEMmdhAint     38.7     42.2
附图简述
图1：质粒pEMmdhAint的结构图。
所使用的缩写和命名具有下面的意义。所注明的碱基对数目是在测量的可重复性背景中获得的近似值。
MdhAint：mdhA基因的内部的片段，Seq.ID.NO..1的碱基566到1035
Km基因：Km抗性基因(Tn5)
OriV：大肠杆菌复制起始点
oriT：从质粒RP4转移(mobilization)的起始点
BamHI：限制性酶BamHI的裂解位置
HindIII：限制性酶HindIII的裂解位置
                          序列表<110>德古萨股份公司<120>编码mdhA基因的新的核苷酸序列<130>000219 BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<220><223>N-端<400>1Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly Ala1               5                  10                  15Ala Gly Gln Ile
         20<210>2<211>2663<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(536)..(1519)<223>mdhA基因<400>2aaggcctttc ttatcgccaa agtgatagtg gatcatgcgc ttggacatgc cagatgcctt  60cgcgattttc tccaatttgg tttcgctaaa accatcctct gcaaaaaatg tcagagcggt  120ggctactacc tcttcagggg ttgcggtgtg tcctgaatca gattcaatga attcgctacc  180ggcctggtct atgttttcgg catctcgacg tgatgtcgcc ataatcgatc aattcctttc  240gggtaacgag aaaacgtgaa ttagaaacgg ggttaaggta aatatcaaag ataacaccat  300cggcaaatcc cagctgacaa ctataaatgg tgcccgatat caggaaaaat tgcttgcaca  360cgcgcgccga ttccccatga tgccctaaca tcttgcaggt gaggggtaca tattggggca  420attcgggggt aattttgcag tatcgtcaag atcacccaaa actggtggct gttctctttt  480aagcgggata gcatgggttc ttagaggacc ccctacaagg attgaggatt gttta atg   538
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            310                 315                 320gag gca gtg cgc gac ttg ctc taatctttaa cgcatgactt cgcttttcga        1549Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu
        325cgccccaacc ctccaacgcg tcaccgtttt cacgggctcg gcgctcggca gttcctcgct   1609gtacacgcaa gcggctcaaa ccttggcgaa aaccgcggta gaccgcggca tcgacttggt   1669ttacggtggc ggaaaagtgg ggctcatggg tatcgtcgcg gatgcgttcc tggaatcagg   1729tggcgaagcc tttggcgtca tcacggaatc acttatgaag ggtgagcttg ggcatgaaaa   1789gctcaccgaa cttgaaatcg ttcctgatat gcacatccgc aagcgtcgca tggcagaact   1849tggcgatggt tttatcgcca tgcccggtgg cgccggcacc ttggaagaac ttttcgaggt   1909ctggacctgg caacagctgg gcattcatca aaagcccgtc gcactttatg atgtcgatgg   1969tttttggcag cccctgctgg aaatgcttga gcagatgacc cagcgtggat ttatcaagcg   2029agacttcttt gagtgcctca tcgtggaatc cgacccgcat gccctgctaa aggcaatgca   2089gacctggact ccaccagcac caaaatggta actaaattgt gtgctcgacg gtaacgccgc   2149cgagtatctt gatggaaatg gaagccacgc cgttgtcatt gactgtgatg gtttcttcta   2209cttctgggcc atcgaaacgt gaaatctcgg tagcatccac atcggtgatg gagctatcaa   2269aaggaatctt gatttcactg agcagggaaa tatctccggg gctgccatcc tcggacacgg   2329tggagtattc cacgaacctg aaccaaccaa tgttgtgcac cgccttgtag catcgtttcg   2389ccacggtcgc agaatcggtg tccggggcga tcagcgggtc aaagctcacg gcacgaccag   2449aatcgtgctc acggaacaca ccgatgcctc gcgcaacgcg gtcccttagg tggaaaccag   2509aggaagggtc agccgcgatg gccagaccca ccgcagtgga acctgagggg aatggggagc   2569ggtggacacg gcggccgaaa cgctcgcgga gcaacctgga aacgagtggg agcgaggatc   2629cactagttct agagcggccg ccaccgcggt ggag                               2663<210>3<211>328<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>3Met Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly1               5                  10                  15Ala Ala Gly Gln Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Asn Gly
         20                  25                  30Glu Val Phe Gly Thr Asp Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Leu Glu Ile
     35                  40                  45Pro Gln Ala Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Ala Met Glu Leu Leu Asp
 50                  55                  60Ser Ala Phe Pro Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ile Thr Ala Asp Ala Asn65                  70                  75                  80Glu Ala Phe Asp Gly Ala Asn Ala Ala Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro
             85                  90                  95Arg Gly Lys Gly Glu Glu Arg Ala Asp Leu Leu Ala Asn Asn Gly Lys
        100                 105                 110Ile Phe Gly Pro Gln Gly Lys Ala Ile Asn Asp Asn Ala Ala Asp Asp
    115                 120                 125Ile Arg Val Leu Val Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile
130                 135                 140Ala Ser Ala Ala Ala Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Phe Asn Ala Met145                 150                 155                 160Met Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Lys Leu
            165                 170                 175Gly Arg Gly Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Val Val Trp Gly Asn His
        180                 185                 190Ser Ala Thr Gln Phe Pro Asp Ile Thr Tyr Ala Thr Val Gly Gly Glu
    195                 200                 205Lys Val Thr Asp Leu Val Asp His Asp Trp Tyr Val Glu Glu Phe Ile
210                 215                 220Pro Arg Val Ala Asn Arg Gly Ala Glu Ile Ile Glu Val Arg Gly Lys225                 230                 235                 240Ser Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ile Asp His Met Arg Asp
            245                 250                 255Trp Val Gln Gly Thr Glu Ala Trp Ser Ser Ala Ala Ile Pro Ser Thr
        260                 265                 270Gly Ala Tyr Gly Ile Pro Glu Gly Ile Phe Val Gly Leu Pro Thr Val
    275                 280                 285Ser Arg Asn Gly Glu Trp Glu Ile Val Glu Gly Leu Glu Ile Ser Asp
290                 295                 300Phe Gln Arg Ala Arg Ile Asp Ala Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ala Glu305                 310                 315                 320Arg Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu
            325

Claims (16)

1.一种来自于棒状细杆菌的分离的多核苷酸，它包含选自于下列一组的编码mdhA基因的多核苷酸序列：
a)与编码SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列的多核苷酸至少有70％相同性的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列至少有70％相同性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，和
d)包括a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸，
该多肽优选地具有苹果酸脱氢酶活性。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸优选是一种能够在棒状细菌中复制的重组DNA。
3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述的多核苷酸是RNA。
4.一种具有苹果酸脱氢酶活性的分离的多肽，它包括SEQ ID NO：1所示的如下N-末端的氨基酸序列
Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly Ala Ala Gly
1                5                  10                  15
Gln Ile。
    20
5.根据权利要求2所述的能够复制的DNA，其包含：
(i)显示于SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或
(ii)至少一个在遗传密码简并范围内相应于序列(i)的序列，或
(iii)至少一个与序列(i)或(ii)的互补序列杂交的序列，和任选地
(iv)(i)的中性功能有义突变。
6.一种棒状细菌，其中mdhA基因被弱化，优选是被去除。
7.制备L-氨基酸，特别是L-赖氨酸的方法，包括下列步骤：
a)将产生所需的L-氨基酸的细菌发酵，该细菌中至少mdhA基因被弱化，
b)浓缩培养基或细菌细胞中的所需的产物，
c)分离L-氨基酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中使用这样的细菌，其中所需L-氨基酸的生物合成途径的其他基因被另外扩增。
9.根据权利要求7所述的方法，其中使用这样的细菌，其中降低所需L-氨基酸形成的代谢途径至少部分被删除。
10.根据权利要求7所述的方法，其中编码mdhA基因的多核苷酸的表达被降低，特别是被去除。
11.根据权利要求7所述的方法，其中多核苷酸mdhA基因编码的多肽(酶蛋白)的催化特性被降低。
12.根据权利要求7所述的方法，其中为发酵制备L-氨基酸，特别是L-赖氨酸，所述细菌中的选自于下列基因的一个或多个基因同时被增强，优选是过量表达：
12.1编码二氢吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
12.2编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
12.3编码烯醇酶的eno基因，
12.4编码zwf基因产物的zwf基因，
12.5编码赖氨酸输出的lysE基因。
13.根据权利要求7所述的方法，其中选自于下列基因的一个或多个基因同时被弱化：
13.1编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，
13.2编码葡萄糖6-磷酸异构酶的pgi基因，
13.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因。
14.根据前面任一项权利要求所述的方法，其中使用谷氨酸棒杆菌的微生物。
15.发现RNA，cDNA和DNA以用于分离编码苹果酸脱氢酶或与苹果酸脱氢酶基因的序列具有高度相似性的核酸或多核苷酸或基因的方法，包括使用如权利要求1-4的多核苷酸序列作为杂交探针。
16.根据权利要求15所述的方法，其中使用阵列，微阵列或DNA芯片。
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