KR100904744B1

KR100904744B1 - 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 ｍｄｈＡ 유전자를암호화하는 뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR100904744B1
Application number: KR1020037000075A
Authority: KR
Inventors: 도우베 몰레나르; 데르 레스트 미헬 에두아르트 판; 안드레 드리슈
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2009-06-29
Also published as: EP1297148A1; DE60115900D1; AU2001279674A1; WO2002002778A1; US20020037568A1; DE60115900T2; ES2254459T3; KR20030013521A; ATE312929T1; CN1440458A; WO2002002778A8; US20040142454A1; EP1297148B1; DE10032350A1; US6995002B2; US7067288B2

Abstract

본 발명은, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드, 및 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, mdhA 유전자를 암호화하는 코리네형 세균으로부터의 폴리뉴클레오타이드; 및 적어도 mdhA 유전자가 감쇠된 형태로 존재하는 코리네형 세균을 사용하는 L-아미노산의 발효적 제조방법, 및 하이브리드화 프로브로서 당해 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도에 관한 것이다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), L-라이신, mdhA 유전자, 하이브리드화, 프로브

Description

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 ｍｄｈＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열{Nucleotide sequences which code for the mdhA gene from Corynebacterium glutamicum}

본 발명은 mdhA 유전자를 암호화하는 코리네형 세균으로부터의 뉴클레오타이드 서열 및 mdhA 유전자의 감쇠에 의한, 아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조방법을 제공한다.

L-아미노산, 특히 라이신은 사람 의약 및 약제 산업, 식량 산업 및 보다 특히 동물 사료에 사용된다.

아미노산은 균주 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 발효에 의해 제조되는 것으로 공지되어 있다. 이의 큰 중요성으로 인해, 제조방법을 개선시키기 위한 작업이 지속적으로 행해지고 있다. 방법에 있어서 개선은 예를 들어, 교반 및 산소 공급과 같은 발효 방법, 또는 예를 들어, 발효 동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산 특성과 관련될 수 있다.

이러한 미생물의 생산 특성을 개선시키기 위해 돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이체 선별법이 사용된다. 이러한 방법으로, 항대사물질에 내성이거나 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며 아미노산을 생성하는 균주가 수득된다.

또한, 재조합 DNA 기술 방법이 L-아미노산을 생성하는 코리네박테리움 균주를 개선시키기 위해 수년동안 사용되었다.

발명의 목적

본 발명자들은 아미노산, 특히 L-라이신의 개선된 발효적 제조를 위한 신규한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

L-아미노산, 특히 라이신은 사람 의약 및 약제 산업, 식량 산업 및 보다 특히 동물 사료에 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-라이신의 신규하게 개선된 제조방법을 제공하는데 전반적인 관심이 있다.

본 발명은

a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고 바람직하게는 말레이트 데하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

b) 서열번호 3의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하고 바람직하게는 말레이트 데하이드로게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

c) 상기 a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드, 및

d) 상기 a), b), 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택되고 mdhA 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하는, 말레이트 데하이드로게나제 활성을 갖는 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 청구항 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 이는 바람직하게는,

(i) 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열, 또는

(ii) 유전자 코드의 축퇴성 범위 내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로

(iv) 상기 (i)에서 중성 기능의 센스 돌연변이를 포함하는 복제가능한 DNA이다.

또한, 본 발명은

복제가능하고, 서열번호 2에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA,

DSMZ[독일 브라운슈바이크 소재의 도이췌 삼릉 폰 미크로오가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하]에 2000년 5월 18일자로 이. 콜라이(E. coli) DSM 13494로서 기탁된, 청구항 제1항의 d)에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터, 특히 pEMmdhAint,

및 특히 벡터 pEMmdhAint를 사용하여 mdhA 유전자내 결실 또는 삽입을 함유하는 코리네형 세균을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 mdhA 유전자를 포함하는 상응하는 유전자 라이브러리를, 언급된 서열번호 2에 따르는 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드화함으로써 스크리닝하여 언급한 DNA 서열을 분리하여 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 실질적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드는, 말레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 전장 핵산, 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 분리하거나, 말레이트 데하이드로게나제 유전자의 서열과 높은 유사성을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 분리하기 위해서, RNA, cDNA 및 DNA용 하이브리드화 프로브로서 적절하다.

본 발명에 따른 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드는, 말레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA 유전자가 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 제조되는데 사용되는 프라이머로서 더욱 적절하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 보다 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적 뉴클레 오타이드를 포함한다. 40개 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또한 적절하다.

"분리된"은 천연 환경으로부터 분리됨을 의미한다.

일반적으로 "폴리뉴클레오타이드"는 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드와 관련있는 것으로, 이들은 비변형되거나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열번호 3에 따른 폴리펩타이드, 특히 말레이트 데하이드로게나제의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드, 및 서열번호 3에 따른 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 및 특히 90% 내지 95% 이상 동일하고, 언급된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

추가로 본 발명은, 이미 아미노산을 생성하며 mdhA 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 감쇠, 특히 제거되거나 저수준으로 발현되는 코리네형 세균을 사용하는 아미노산, 특히 라이신의 발효적 제조방법을 제공한다.

이와 관련하여, 용어 "감쇠"는 예를 들면, 약한 프로모터를 사용하거나, 낮은 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하거나, 상응하는 유전자 또는 효소(단백질)를 불활성화시키는 유전자 또는 대립유전자를 사용하고 임의로 이들 방법을 병용함으로써 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물내 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 감소 또는 제거함을 나타낸다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코스, 수크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 아미노산, 특히 라이신을 생산할 수 있다. 이러한 미생물로는 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속이 대표적일 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서, 특히 L-아미노산을 생성할 수 있는 능력에 대해 당해 숙련가에게 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적절한 균주는, 특히 하기 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870

코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965

코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및 이로부터 제조되는 L-아미노산 생성 돌연변이체, 또는 균주, 예를 들어, L-라이신 생성 균주로서:

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464

코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1

코리네박테리움 글루타미쿰 DG52-5

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5714 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12866이다.

효소 말레이트 데하이드로게나제(EC 1.1.1.37)를 암호화하는 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum)의 신규한 mdhA 유전자가 발견되었다.

이를 위해서, 말레이트 데하이드로게나제 효소 단백질은 우선 크로마토그래피법으로 균질해질 때까지 정제된다. 단백질 정제 및 제조에 대한 방법 및 설명은 예를 들면, 교과서[참고문헌: Schleifer and Wensink., Practical Methods in Molecular Biology(Springer Verlag, Berlin, Germany, 1981)]; 편람[참고문헌: Harris and Angal., Protein Purification Methods, A Practical Approach(IRL Press, Oxford, UK, 1989]; 교과서[참고문헌: Scopes., Protein Purification, Principles and Practice, 3^rd ed.(Springer Verlag, New York, USA, 1993)], 및 통상적으로 공지된 교과서 및 편람에 기재되어 있다. 이어서, 순수한 효소 단백질은 예를 들어, 트립신 또는 키모트립신과 같은 적절한 효소로 처리하여 펩타이드로 분해할 수 있다. 이들 펩타이드의 아미노산 서열은 문헌[참고문헌: Edman., Archives of Biochemistry 22, 475 (1949)]에 기재된 N-말단 서열화 방법으로 결정될 수 있다. 이와 같이 정제된 효소 단백질의 N-말단 아미노산을 바로 결정할 수 있다. 단백질 서열화 방법 및 설명은 예를 들면, 문헌[참고문헌: Smith., Protein Sequencing Protocolls [sic], Methods in Molecular Biology, Vol. 64 and Vol. 112 (Humana Press, Totowa, NJ, USA, 1996) 및 Kamp et al., Protein Structure Analysis, Preparation, Characterization, and Microsequencing (Springer Verlag. New York, NY, USA, 1997)]에 기재되어 있다. 이러한 방법으로, 말레이트 데하이드로게나제 효소 단백질의 아미노산 서열은 시간경과에 따라서 부분적으로 또는 완전하게 결정될 수 있다. 분리된 말레이트 데하이드로게나제 효소 단백질의 20개 N-말단 아미노산을 서열번호 1에 제시한다.

코리네형 세균에 대한 공지된 코돈 용법을 사용하여[참고문헌: Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993)], 합성 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있고, 이를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 상응하는 염색체 DNA 절편의 증폭용 프라이머로서 사용할 수 있다. 이를 위한 설명은 특히, 예를 들어, 편람[참고문헌: Gait., Oligonukleotide [sic] synthesis, a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) 및 Newton and Graham., PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 당해 전문가가 찾아볼 수 있다. 이어서, 이러한 방법으로 수득된 sod 유전자의 DNA 단편은 예를 들어, 문헌[참고문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2^nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1989)]에 기재된 바와 같은 공지된 방법으로 클로닝되고, 유전자 라이브러리에서 이의 5' 및 3' 인접부(flank)를 포함하는 완전한 유전자를 찾아내기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.

이와 같이, "플라스미드 회수(plasmid rescue)" 방법에 의해, 이의 5' 및 3' 인접부를 포함하는 완전한 유전자를 분리할 수 있다. 이러한 방법에서, 예를 들어, 상기 기재된 방법으로 수득된 관심있는 유전자 단편은 코리네형 세균에 대해 복제성이 아닌 플라스미드 벡터에서 클로닝된다. 유전자 단편을 함유하는 플라스미드 벡터는 형질전환 및 후속적 상동 재조합에 의해 숙주의 표적 유전자 내로 혼입 또는 통합된다. 표적 유전자는 이로써 표시된다. 이어서, 이런 방식으로 표시된 균주의 염색체 DNA는 분리되고, 적절한 제한 효소로 분해된다. 특히, 적절한 제한 효소는 사용된 벡터 DNA 내에서는 절단하지 않는 효소이다. 수득한 DNA 단편은 리가아제로 처리하여 환상화되고, 플라스미드 벡터의 복제에 적절한 숙주, 전형적으로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)는 연결 혼합물로 형질전환된다. 플라스미드 DNA는 형질전환체로부터 분리되고, 클로닝된 DNA 부분은 서열화된다. "플라스미드 회수" 방법은 예를 들면, 문헌[참고문헌: Niaudet et al., Gene 19, 277-284 (1982)]에 기재되어 있다. DNA 서열화 방법은 특히, 문헌[참고문헌: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463-5467, 1977] 또는 프로토콜[참고문헌: Zimmerman et al., BioTechniques 17: 302 (1994)]에 기재되어 있다.

이어서 수득한 DNA 서열은 예를 들면, 스타덴(Staden)[참고문헌: Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)], 마크(Marck)[참고문헌: Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)]의 프로그램과 같은 공지된 알고리듬 또는 서열 분석 프로그램 또는 버틀러(Butler)[참고문헌: Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)]의 GCG 프로그램을 사용하여 조사될 수 있다.

mdhA 유전자를 암호화하고, 서열번호 2로서 본 발명을 구성하는 씨. 글루타미쿰의 신규한 DNA 서열은 이러한 방법으로 발견되었다. 상응하는 해독 산물 또는 유전자 생성물의 아미노산 서열은 상기 기재된 방법에 의해 당해 DNA 서열로부터 추가로 유추되었다. 수득한 mdhA 유전자 생성물의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제시된다. 개시 코돈 ATG에 의해 암호화되는 아미노산 메티오닌 또는 포르밀-메티오닌은 숙주의 효소에 의해 다양한 단백질로부터 제거된다는 것은 공지되어 있다[참고문헌: O'Regan et al., Gene 77, 237-251 (1989)].

또한, 유전자 코드의 축퇴성에 의해 서열번호 2로부터 수득한 암호화 DNA 서열이 본 발명을 구성한다. 동일한 방법으로, 서열번호 2 또는 서열번호 2의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열이 본 발명을 구성한다. 마지막으로, 서열번호 2로부터 수득한 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조되는 DNA 서열이 본 발명을 구성한다.

하이브리드화에 의한 DNA 서열의 동정에 대한 지침은 특히, 편람[참고문헌: "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) 및 Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 당해 전문가가 찾아볼 수 있다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 DNA 서열의 증폭 방법에 대한 지침은 특히, 편람[참고문헌: Gait., Oligonukleotide [sic] synthesis, a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) 및 Newton and Graham, PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 당해 전문가가 찾아볼 수 있다.

코리네형 세균이 mdhA 유전자 감쇠후 개선된 방법으로, 아미노산, 특히 L-라이신을 생성한다는 것이 밝혀졌다.

감쇠를 이루기 위해서, mdhA 유전자 발현 또는 효소 단백질의 촉매적 특성이 감소되거나 제거될 수 있다. 두가지 방법은 임의로 배합될 수 있다.

유전자 발현 감소는 적절한 배양 또는 유전자 발현의 시그날 구조의 유전적 변형(돌연변이)에 의해 발생할 수 있다. 유전자 발현의 시그날 구조는 예를 들면, 억제인자 유전자, 활성인자 유전자, 오퍼레이터, 프로모터, 아테뉴에이터(attenuator), 리보솜 결합 부위, 개시 코돈 및 터미네이터이다. 당해 전문가는 예를 들어, 문헌[참고문헌: 특허원 제WO 96/15246호, Boyd and Murphy., Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988), Voskuil and Chambliss., Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), Jensen and Hammer., Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998), Patek et al., Microbiology 142: 1297 (1996), Vasicova et al., Journal of Bacteriology 181: 6188 (1999)] 및 예를 들어, 교과서[참고문헌: Knippers., "Molekulare Genetik[Molecular Genetics]", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995 또는 Winnacker., "Gene und Klone[Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990]과 같은 공지된 유전학 및 분자생물학 교과서에서 이에 대한 정보를 발견할 수 있다.

효소 단백질의 촉매적 특성에서 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이는 선행기술; 언급될 수 있는 예로는 문헌[참고문헌: Qiu and Goodman., Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Sugimoto et al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997) 및 Mockel., "Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms [Threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum: Cancelling the allosteric regulation and structure of the enzyme]", 보고서[참고문헌: Julich Research Centre, Jul-2906, ISSN09442952, Julich, Germany, 1994)]로부터 공지되어 있다. 포괄적인 기재는 예를 들어, 교과서[참고문헌: Hagemann., "Allgemeine Genetik [General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]와 같은 공지된 유전학 및 분자생물학 교과서에서 발견될 수 있다.

가능한 돌연변이는 전위, 역위, 삽입 및 결실이다. 효소 활성에 대한 아미노산 치환의 영향에 따라서, 미스센스 돌연변이 또는 넌센스 돌연변이가 언급된다. 유전자내 하나 이상의 염기쌍 삽입 또는 결실은 잘못된 아미노산이 혼입되거나 해독이 미숙하게 중단되는 결과로서, 프레임 쉬프트(frame shift) 돌연변이를 야기한다. 수개의 코돈 결실은 전형적으로 효소 활성의 완전한 손실을 야기한다. 이러한 돌연변이의 발생에 대한 설명은 선행 기술분야로, 예를 들어, 교과서[참고문헌: Knippers., "Molekulare Genetik[Molecular Genetics]", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995, Winnacker., "Gene und Klone[Genes and Clones]", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990, 또는 Hagemann., "Allgemeine Genetik[General Genetics]", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986]과 같은 공지된 유전학 및 분자생물학 교과서에서 발견될 수 있다.

씨. 글루타미쿰의 유전자를 돌연변이시키는 통상의 방법은 문헌[참고문헌: Schwarzer and Puhler., Bio/Technology 9, 84-87 (1990)]에 기재된 유전자 파괴 및 유전자 치환의 방법이다.

유전자 파괴 방법에서, 관심있는 유전자의 암호화 영역의 중심 부분은 숙주(전형적으로 이. 콜라이(E. coli))내에서 복제할 수 있으나 씨. 글루타미쿰내에서는 복제할 수 없는 플라스미드 벡터내로 클로닝된다. 가능한 벡터는 예를 들면, pSUP301[참고문헌: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참고문헌: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pK18mobsacB 또는 pK19mobsacB[참고문헌: Jager et al., Journal of Bacteriology 174: 5462-65 (1992)], pGEM-T[참고문헌: Promega corporation, Madison, WI, USA], pCR2.1-TOPO[참고문헌: Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; 미국 특허원 제5,487,993호], pCR

Blunt[참고문헌: Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)] 또는 pEM1[참고문헌: Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516]이다. 이어서, 유전자 암호화 영역의 중심 부분을 함유하는 플라스미드 벡터는 접합 또는 형질전환에 의해 목적하는 균주 씨. 글루타미쿰내로 전달된다. 접합 방법은 예를 들어, 문헌[참고문헌: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기재되어 있다. 형질전환 방법은 예를 들어, 문헌[참고문헌: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988), Dunican and Shivnan., Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) 및 Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기재되어 있다. "교차(cross-over)" 이벤트에 의한 상동 재조합후, 당해 유전자의 암호화 영역은 벡터 서열에 의해 중단되고, 3' 말단이 없는 것과, 5' 말단이 없는 두개의 불완전한 대립유전자가 수득된다. 이러한 방법은 예를 들어, 문헌[참고문헌: Fitzpatrick et al., Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)]에 씨. 글루타미쿰의 recA 유전자를 제거하기 위해 사용되었다.

도 1은 mdhA 유전자를 파괴하거나 제거하는데 사용되는 플라스미드 벡터 pEMmdhAint를 예시로서 나타낸다.

유전자 대체의 방법에서, 예를 들면, 결실, 삽입 또는 염기 치환 같은 돌연변이는 관심있는 유전자내에서 시험관내에서 이루어진다. 제조된 대립유전자는 다시 씨. 글루타미쿰에 대해 복제하지 않는 벡터내에서 클로닝되고, 이어서 형질전환 또는 접합에 의해 씨. 글루타미쿰의 목적하는 숙주내로 전달된다. 표적 유전자 또는 표적 서열내 통합에 영향을 미치는 첫번째 "교차" 이벤트 및 제거에 미치는 적절한 두번째 "교차" 이벤트에 의한 상동 재조합후, 돌연변이 또는 대립유전자의 혼입이 이루어진다. 이러한 방법은 예를 들면, 피터스-웬디쉬(Peters-Wendisch)[참조: Microbiology 144, 915-927 (1998)]에 의해서 결실에 의한 씨. 글루타미쿰의 pyc 유전자를 제거하는데 사용되었다.

결실, 삽입 또는 염기 치환은 이러한 방법으로 mdhA 유전자내로 혼입될 수 있다.

추가로, mdhA 유전자의 감쇠 이외에, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충대사, 펜토스 인산회로 또는 아미노산 배출 수송체중의 하나 이상의 효소를 증강, 특히 과발현시키는 것이 L-아미노산, 특히 L-라이신의 생성에 이로울 수 있다.

따라서, L-라이신의 제조를 위해, 예를 들어 하기 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증강, 특히 과발현시킬 수 있다:

·디하이드로디피콜리네이트 합성효소를 암호화하는 dapA 유전자(EP-B 0 197 335),

·에놀라제를 암호화하는 eno 유전자[참고문헌: DE: 19947791.4],

·zwf 유전자 생성물을 암호화하는 zwf 유전자[참고문헌: JP-A_09224661],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참고문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

·라이신 배출 수송체를 암호화하는 lysE 유전자[참고문헌: DE-A-195 48 222].

추가로, mdhA 유전자의 감쇠 이외에, 하기 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠되는 것이 아미노산, 특히 L-라이신의 생성에 이로울 수 있다:

·포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참고문헌: DE 199 50 409.1, DSM 13047],

·글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참고문헌: US 09/396,478, DSM 12969],

·피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[참고문헌: DE:1995 1975.7, DSM 13114].

mdhA 유전자의 감쇠 이외에, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 아미노산, 특히 L-라이신의 생성에 또한 이로울 수 있다[참고문헌: Nakayama., "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 미생물을 제공하고, 이들은 L-아미노산, 특히 L-라이신 생산을 목적으로 회분 공정(회분 배양) 또는 유가식 공정(유가 공정) 또는 반복 유가 공정(반복 유가 공정)에서 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 교과서[참고문헌: Chmiel., Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 교과서[참고문헌: Storhas., Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기재되어 있다.

사용될 배양 배지는 적절한 방법으로 특정 균주의 요건에 부합해야 한다. 다양한 미생물용 배양 배지는 편람[참고문헌: "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 예를 들어, 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유와 같은 오일 및 지방, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들어, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예를 들어, 아세트산과 같은 유기산이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아와 같은 질소 함유 유기 화합물 또는 예를 들어, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 화합물이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염이 인공급원으로서 사용될 수 있다. 배양 배지는 또한 증식에 필수적인 예를 들어, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질 이외에 아미노산 및 비타민과 같은 필수 증식 물질 이 사용될 수 있다. 추가로, 적절한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 개시 물질은 단일 뱃치형으로 배양물에 부가되거나, 적절한 방법으로 배양 동안 공급될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물이 적절한 방법으로 pH를 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제는 기포발생을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항생제와 같은 선별적 작용을 갖는 적절한 물질이 플라스미드 안정성을 유지하기 위해 배지에 부가될 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해, 예를 들어, 공기와 같은 산소 또는 산소 함유 가스 혼합물이 배양물내로 도입된다. 배양물의 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이며 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 최대량의 목적하는 생성물이 형성될 때까지 배양을 계속한다. 상기 목적은 통상적으로 10시간 내지 160시간 이내에 달성된다.

L-아미노산의 측정 방법은 선행 기술분야로부터 공지되어 있다. 따라서 분석은 예를 들면, 문헌[참고문헌: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기재된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화에 의해 이루어지거나, 예를 들면, 문헌[참고문헌: Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기재된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 수행될 수 있다.

하기 미생물은 2000년 5월 18일 부다페스트 조약에 따라, 독일 브라운슈바이크에 소재하는 도이췌 삼릉 퓌어 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ)]에 기탁되었다:

·DSM13494로서 에스케리키아 콜라이 DH5αmcr/pEMmdhAint.

본 발명에 따른 방법은 아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조를 위해 사용된다.

본 발명은 예시적 양태를 사용하여 하기에 보다 상세히 설명된다.

에스케리키아 콜라이로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 모든 제한 기술, 클레노우 및 알칼리 포스파타제 처리가 문헌[참고문헌: Sambrook et al., Molecular cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA]의 방법으로 수행되었다. 에스케리키아 콜라이의 형질전환 방법도 상기 문헌에 기재되어 있다.

LB 또는 TY 배지와 같은 통상의 영양 배지의 조성은 또한 편람[참고문헌: Sambrook et al]에서 발견될 수 있다.

말레이트 데하이드로게나제 활성은 문헌[참고문헌: Sanwal., Journal of Biological Chemistry 244 (7): 1831-1837 (1969) 및 Smith., Methods of Enzymatical Analysis, 1985, ed. 3, volume 3(Bergmeyer et al. (eds.), VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany]에 기재된 바와 같이 측정되었다. 단백질 농도는 문헌[참고문헌: Smith et al., Analytical Biochemistry 150: 76-85 (1985)]의 방법으로 측정되었다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 말레이트 데하이드로게나제의 분리 및 정제

100㎖ 2 ×TY에 각각의 경우 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 콜로니를 4회 접종시켜 각각의 경우에 30℃ 및 분당 200 회전수로 16시간 동안 250㎖ 원추형 플라스크에서 배양시켰다. 세포를 4℃에서 완충액 A(50mM K 포스페이트, pH 7.5, 1mM 디티오트레이톨, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산)으로 2회 세척하였고, 20㎖의 동일한 완충액내에 재현탁시켰다. 세포를 165MPa하에서 Spectronic Unicam사(Rochester, NY, USA)의 예비냉각된 French Pressure Cell내에서 3회 분해시켰다. 이어서, 세포 잔사를 75600 ×g로 10분 동안 4℃에서 원심분리로 침강시켰다. 말레이트 데하이드로게나제 단백질을 3 단계로 정제하였다.

단계 1 - 스트렙토마이신 설페이트 침전물:

상청액을 제거하고, 스트렙토마이신 설페이트 침전물로 추가로 처리하였다. 이를 위해서, 10%(중량/용적) 스트렙토마이신 설페이트 용액을 0.75%의 최종 농도에 도달할 때까지 0℃로 교반하면서 서서히 부가하였다. 뱃치를 빙상에서 15분 동안 배양하고, 이어서 4℃ 및 15000 x g로 10분 동안 원심분리하였다. 이어서 상청액을 제조사(Medicell, London, UK)의 설명서에 따라 예비처리된 투석 호스내로 주입하고, 4℃에서 1.5시간 동안 1ℓ완충액 B(10mM K 포스페이트, pH 7.5, 1mM 디티오트레이톨, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산)에서 각각의 경우에 2회 투석시켰다. 이어서 투석물을 4℃ 및 75600 ×g로 15분 동안 원심분리하였다.

단계 2 - 음이온 교환 크로마토크래피:

단계 1로부터의 상청액을 제거하고, "Resource Q"(1㎖ 컬럼 용적, Amercham Pharmacia사, Freiburg, Germany) 타입의 음이온 교환 컬럼상에 주입하여 4 컬럼 용적의 완충액 B와 평형화시켰다. 컬럼에 4 컬럼 용적의 완충액 B를 흘려보냈고, 이어서 15 칼럼 용적의 완충액 B 내지 완충액 C(10mM K 포스페이트, pH 7.5, 1mM 디티오트레이톨, 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 1M NaCl)의 선형 구배로 용출시켰다. 음이온 교환 크로마토그래피를 20℃에서 수행하였고, 분획물을 4℃에서 수거하였다. 말레이트 데하이드로게나제를 약 0.5M의 NaCl로 용출시켰다. 말레이트 데하이드로게나제 활성을 함유하는 분획물을 합하여, 제조사의 설명서에 따라 빙냉 완충액 D(10mM K 포스페이트, pH 7.5)로 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia사, Freiburg, Germany)상에 겔 여과에 의해 탈염시켰다.

단계 3 - 염료 친화 크로마토그래피:

단계 2로부터의 10㎎ 미만의 총 단백질을 2.5㎖의 컬럼 물질 "Reactive Brown 10"(Sigma사, Deisenho, Germany)로 충전된 컬럼상에 주입하였고, 12.5㎖ 완충액 D로 평형시켰다. 컬럼에 15㎖의 빙냉 완충액 D를 흘려보냈고, 말레이트 데하이드로게나제를 2.5㎖ 완충액 E(10mM K 포스페이트, pH 7.5, 1mM NADH)로 용출시켰다. 용출액을 상기 기술된 바와 같이 PD-10 컬럼상에서 겔 여과에 의해 탈염시켰다.

단계 4 - 염료 친화 크로마토그래피:

단계 3을 반복하였다. 이러한 방법으로 정제된 단백질을 -20℃에서 보관하였다. 활성의 안정화를 위해서, 샘플에 1㎎/㎖의 소혈청 알부민을 보충시켰다. 말레이트 데하이드로게나제 단백질의 N-말단 서열의 결정에 사용되는 샘플의 경우에는 소혈청 알부민의 보충을 생략하였다. Perkin Elmer사(Foster City, CA, USA)의 Lambda-10 분광광도계를 정제된 효소의 활성을 측정하는데 사용하였다. 정제된 말레이트 데하이드로게나제는 1200 내지 1300μmol/분의 최대 특정 옥살아세테이트-감소 활성 및 0.1mM의 옥살아세테이트 및 0.3mM의 NADH 농도로 ㎎단백질을 가졌다.

분리된 말레이트 데하이드로게나제의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 결정하였다. 분석은 정제된 말레이트 데하이드로게나제가 33kDa의 겉보기 분자량을 갖는 균질한 단백질로서 존재함을 나타냈다.

실시예 2

N-위치의 아미노산 서열 결정

정제된 말레이트 데하이드로게나제 단백질의 N-위치 아미노산 서열은 PE Biosystems사(Foster City, CA, USA)의 자동 서열기 모델 476A에 의해 에드만(Edman) 분해법[참고문헌: Edman, Molecular Biology Biochemistry Biophysics 8: 211-55 (1970)]으로 결정하였다. 수득한 아미노산 서열(서열번호 1 참조)은 하기와 같았다:

Asn-Ser-Pro-Gln-Asn-Val-Ser-Thr-Lys-Lys-Val-Thr-Val-Thr-Gly-Ala-Ala-Gly-Gln-Ile.

실시예 3

mdhA 유전자 내부 단편의 복사체를 갖는 벡터 제조

mdhA 유전자 절편을 균주 ATCC13032의 염색체 DNA로부터 개시하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키고, 이어서 클로닝하였다.

실시예 2에서 결정된 N-위치 아미노산 서열을 사용하여 축퇴성 프라이머 P1을 폐기시켰다. 이 프라이머는 하기 서열을 가졌다:

5'-AARGTYACYGTYACYGGY-3'.

하기 서열을 갖는 프라이머 P2를 제2 축퇴성 프라이머로서 사용하였다:

5'-CGRTTRTGRTCVARRCG-3'.

약어 R은 뉴클레오염기 A 또는 G를 나타내고, 약어 Y는 C 또는 T를 나타내고, 약어 V는 A, G 또는 C를 나타낸다.

제시된 프라이머는 MWG Biotech사(Ebersberg, Germany)에 의해 합성되었다. PCR 반응을 문헌[참고문헌: Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press, New York, USA]의 표준 PCR 방법으로 수행하였다. 문헌[참고문헌: Pospiech and Neumann., Trends in Genetics 11: 217-218 (1995)]에 기재된 방법으로 분리된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로서 사용하였다.

폴리머라제 연쇄 반응에서, 변성(30초, 94℃), 어닐링(60초, 63℃) 및 합성(90초, 72℃)을 포함하는 1주기는 30회에 걸쳐 이루어졌다. 이어서 72℃에서 마지막 10분의 합성이 수행되었다. Promega사(Madison, WI, USA)의 Taq 폴리머라제 및 Techne사(Cambridge, UK)의 써모사이클러(Thermocycler)를 사용하였다.

이러한 방법으로 제조된 약 470 bp 길이의 mdhA 유전자의 DNA 단편을 Qiagen사(Hilden, Germany)의 QIAQuick PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 벡터 pBlueskript II SK(+)(Stratagene사, La Jolla, CA, USA))의 EcoRV 절단 부위내로 클로닝시켰다. 이어서 단편을 제한효소 BamHI 및 HindIII을 사용하여 분리시켜 이. 콜라이 DHα에서, 제한효소 BamHI 및 HindIII로 처리된 벡터 pEM1내로 클로닝시켰고[참고문헌: Schrumpf et al. Journal of Bacteriology 173, 4510-4516 (1991)], 50μg/㎖ 카나마이신이 보충된 LB 배지상에서 선별하였다. 이러한 방법으로 형성된 플라스미드를 pEMmdhAint라 칭했다.

실시예 4

mdhA 유전자 서열 결정

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032에서, mdhA 유전자를 플라스미드 pEMmdhAint를 사용하여 불활성화시켰다.

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 문헌[참고문헌: Van der Rest et al., Applied Microbiology and Biotechnology 52, 541-545 (1999)]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pEMmdhAint로 형질전환시켰다. 형질전환체의 선별은 25㎎/ℓ 카나마이신으로 보충된 LBHIS 아가상에서 이루어졌다. LBHIS 아가는 18.5g/ℓ뇌심배지(Becton Dickinson, Sparks MD, USA), 91g/ℓ솔비톨 및 15g/ℓ아가-아가로 보충된 LB 배지를 포함한다. 플라스미드 pEMmdhAint가 mdhA 유전자 내로 통합된 균주 ATCC13032mdhA::pEMmdhAint를 이러한 방법으로 제조하였다.

염색체 DNA를 문헌[참고문헌: Pospiech and Neumann., Trends in Genetics 11: 217-218 (1995)]에 기재된 바와 같이, 균주 ATCC13032mdhA::pEMmdhAint로부터 분리시켰고, 한번은 제한효소 StuI를 사용하고, 또한번은 제한효소 XbaI를 사용하여 2가지 상이한 뱃치에서 완전하게 분해시켰다. 염색체 제한 단편을 문헌[참고문헌: Niaudet et al., Gene 19, 277-284 (1982)]에 기재된 바와 같이 연결하였고, 에스케리키아 콜라이 DH5α-MCR[참고문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 87, 4645-4649 (1990)]을 연결 뱃치로 형질전환시켰다. 형질전환체를 50㎎/ℓ 카나마이신을 갖는 LB 아가상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고, 제한 분석하였다. 플라스미드 pEMmdhAint 내에 이미 클로닝된 470 bp 길이의 mdhA 유전자 내부 단편 이외에, 유전자의 5' 및 3' 말단 영역을 갖는 플라스미드 pEMmdhAint-StuI 및 pEMmdhAint-XbaI를 이러한 방법으로 동정하였다. StuI 분해로부터 수득된 플라스미드 pEMmdhAint-StuI는 추가로 470bp 영역 중의 5' 말단상의 0.56kb 및 3' 말단상의 0.40kb를 가졌다. XbaI 분해로부터 수득된 플라스미드 pEMmdhAint-XbaI는 추가로 470bp 영역의 3' 말단상의 1.2kb를 가졌다.

수득된 플라스미드를 Seqlab사(Gorringen, Germany)에 의한 사이클-서열화 프로토콜[참고문헌: Zimmerman et al., BioTechniques 17: 302 (1994)]을 사용하여 서열화하였다. 서열을 Intelligenetics Inc.사(Geneva, Switzerland)의 PC/Gene Version 6.60을 사용하여 평가하였다. mdhA 유전자 일단의 서열은 서열번호 2에 제시된다.

실시예 5

불활성화된 mdhA 유전자를 사용한 L-라이신 생성자의 제조

실험을 라이신 생성에 대한 mdhA 유전자의 제거 효과를 조사하기 위해서 다양하게 공지된 라이신 생성자 씨. 글루타미쿰으로 수행하였다.

5.1. 균주의 제조

균주 MH20-22B는 제EP-B-0435132호에 기재되어 있고, 부다페스트 조약에 따라 DSM5715로서 기탁되어 있다. 균주 DM58-1은 제EP-B-0358940호에 기재되어 있다. 상기 특허에 기재된 형진전환체 DM58-1/pDM6은 부다페스트 조약에 따라 DSM4697로서 기탁되어 있다. 균주 DM58-1을 예를 들면, 문헌[참고문헌: Schafer et al., Journal of Bacteriology, 176, 7309-7319 (1994)]에 기재된 "플라스미드 제거" 방법과 같은 제거 방법으로 DSM4697로부터 제조할 수 있다. 균주 DG 52-5는 제DE-C-3823451호에 기재되어 있다. 상기 특허에 기재된 형질전환체 DG 52-5/pZ1-asd는 부다페스트 조약에 따라 DSM4421로 기탁되어 있다. 또한, 균주 DG52-5는 "플라스미드 제거"의 방법으로 DSM4421로부터 제조될 수 있다.

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 MH20-22B를 문헌[참고문헌: Van der Rest et al., Applied Microbiology and Biotechnology 52, 541-545 (1999)]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pEMmdhAint를 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환체의 선별을 25㎎/ℓ카나마이신으로 보충된 LBHIS 아가상에서 수행하였다. 균주 MH20-22BmdhA::pEMmdhAint를 이러한 방법으로 형성시켰다. 균주 DG52-5 및 DM58-1로부터 개시하여, 각각의 경우에 균주 DG52-5mdhA::pEMmdhAint 및 DM58-1mdhA::pEMmdhAint를 동일한 방법으로 형성시켰다.

5.2. 말레이트 데하이드로게나제 활성의 측정

삽입 돌연변이유발의 성공을 확인하기 위해서, 말레이트 데하이드로게나제 활성을 균주 MH20-22B, DM58-1 및 DG52-5에서 및 삽입 돌연변이 MH20-22BmdhA::pEMmdhAint, DG52-5mdhA::pEMmdhAint 및 DM58-1mdhA::pEMmdhAint에서 측정하였다. 이를 위해서, 각각의 경우에 균주의 콜로니를 50㎖ 2 ×TY 배지에 접종시켜 30℃ 및 분당 200 회전수로 250㎖ 원추형 플라스크에 16시간 동안 배양시켰다. 균주 MH20-22BmdhA::pEMmdhAint, DG52-5mdhA::pEMmdhAint 및 DM58-1mdhA::pEMmdhAint용 배지는 여기에 25μg/㎖의 카나마이신을 부가로 함유했다. 배양물을 10000 ×g로 10분 동안 원심분리하였고, 50mM 인산칼륨 pH 7.5로 2회 세척하고, 이어서 동일한 완충액 5㎖에서 현탁시켰다. 세포 현탁물을 165MPa하에 빙냉 French Press Cell에 2회 통과시켜 분해시켰다. 이어서 샘플을 75000 ×g 및 4℃로 10분 동안 원심분리하였다. 투명한 상청액을 말레이트 데하이드로게나제 활성 측정을 위한 조추출물로서 사용하였다. 말레이트 데하이드로게나제를 완충액으로서 4.5mM MgCl₂ 및 2.9mM NAD⁺를 부가적으로 갖는 100mM 3-아미노-1-프로판올(pH 9.2)을 사용하여 결정하였다. 시험 뱃치는 1㎖의 이 완충액 및 50㎕의 조추출물을 함유하였다. 뱃치를 우선 30℃로 30분 동안 배양하였다. 이후에, 말레이트 데하이드로게나제 반응을 25mM 중화된 L-말레이트의 부가로 개시하였다. 흡수를 PE Biosystems사(Foster City, CA, USA)의 Lambda-10 분광광도계에서 340nm 파장으로 측정하였다. L-말레이트 없이 완전한 반응 뱃치를 사용한 측정을 특정 NAD⁺ 감소율의 대조군으로서 사용하였다.

개시 균주 MH20-22B, DM58-1 및 DG52-5는 각각 301, 380 및 354nmol/분 ×㎎ 단백질의 특이적 말레이트 데하이드로게나제 활성을 갖는 반면, mdhA 삽입 돌연변이는 어떠한 말레이트 데하이드로게나제 활성도 검출되지 않았다. 여기서 활성에 대한 보다 낮은 검출 한계는 2nmol/분 ×㎎ 단백질이었다.

실시예 6

L-라이신의 제조

실시예 5에 기재된 균주를 삽입 돌연변이체의 경우 카나마이신(25μg/㎖)이 보충된 2 ×TY 배지에서 30℃로 24시간 동안 배양하였다. 액체 배지내 배양을 위해, 삽입 돌연변이체를 위해 카나마이신(25㎎/ℓ)이 부가로 보충된 배지 CgIII[참고문헌: Keilhauer et al., 1993, Journal of Bacteriology 175: 5595-5603]을 사용하였다. 이를 위해서, 100㎖ 원추형 플라스크내 함유된 10㎖ 배지를 균주의 콜로니로 접종시키고, 이어서 배양물을 예비배양물로서 추가로 사용하였다.

CGXII-글루코스 최소 배지[참고문헌: Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)]를 생산 및 시험배지로서 사용하였다. 당해 배지는 어떠한 카나마이신도 함유하지 않았다. 바닥에서 모서리를 따라 놓인 직경 2㎝의 금속 나사로 장착된 500㎖ 원추형 플라스크내에서 배양하였다. 이들 플라스크를 60㎖ CGXII-글루코스 최소 배지로 충전시켰다. 배양물을 개시에서 광밀도가 0.5 내지 0.6의 값을 갖도록 예비배양물로 접종시켰다. 플라스크를 분당 140 회전수의 빈도로 진탕시켰다.

72시간 동안 배양후, 생산 배지내 배양물 및 라이신 농도의 광밀도를 측정하였다.

광밀도(OD)를 600nm 파장으로 Perkin-Elmer사의 Lambda B 분광광도계를 사용하여 측정하였다.

L-라이신을 "고성능 액체 크로마토그래피" 방법으로 측정하였고, Chromatographie-Service사(Langerwehe, Germany)의 "Hypersil ODS 5μ" 컬럼(차원: 125 ×4mm)을 사용하였다. 이동상 A: 0.1mM 나트륨 아세테이트, pH 7.5 및 B: 메탄올(A:B의 비율이 85:15 내지 0:100)의 선형 구배에 의해 분리하였다. 적용 5분전, 아미노산을 오르토-프탈로디알데하이드(OPA 시약, Pierce, Rockford IL, USA)로 유도체화시켰다. 243nm 여기 파장 및 436nm 방출 파장을 갖는 형광을 측정 하여 검출하였다. 실험 결과를 표 1에 나타낸다.

균주	광밀도	L-라이신(mM)
MH20-22B	37.1	26.1
MH20-22BmdhA::pEMmdhAint	36.5	29.3
DG52-5	32.4	13.6
DG52-5mdhA::pEMmdhAint	48.7	44.4
DM58-1	42.0	32.2
DM58-1mdhA::pEMmdhAint	38.7	42.2

도 1: 플라스미드 pEMmdhAint의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 의미를 갖는다. 언급된 염기쌍수는 측정의 재현성의 범주에서 수득된 근사값이다.

mdhAint 서열번호 1의 염기 566 내지 1035의, mdhA 유전자의 내부 단편

Km 유전자 Km 내성 유전자(Tn5)

oriV 이. 콜라이 복제 기원

oriT 플라스미드 RP4로부터 전달(기동) 기원

BamHI 제한효소 BamHI의 절단 부위

HindIII 제한효소 HindIII의 절단 부위

<110> Degussa AG <120> Nucleotide sequences which code for the mdhA gene from Corynebacterium glutamicum <130> 000219 BT <150> DE 100 32 350.2 <151> 2000-07-04 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <223> N-Terminus <400> 1 Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly Ala 1 5 10 15 Ala Gly Gln Ile 20 <210> 2 <211> 2663 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (536)..(1519) <223> mdhA gene <400> 2 aaggcctttc ttatcgccaa agtgatagtg gatcatgcgc ttggacatgc cagatgcctt 60 cgcgattttc tccaatttgg tttcgctaaa accatcctct gcaaaaaatg tcagagcggt 120 ggctactacc tcttcagggg ttgcggtgtg tcctgaatca gattcaatga attcgctacc 180 ggcctggtct atgttttcgg catctcgacg tgatgtcgcc ataatcgatc aattcctttc 240 gggtaacgag aaaacgtgaa ttagaaacgg ggttaaggta aatatcaaag ataacaccat 300 cggcaaatcc cagctgacaa ctataaatgg tgcccgatat caggaaaaat tgcttgcaca 360 cgcgcgccga ttccccatga tgccctaaca tcttgcaggt gaggggtaca tattggggca 420 attcgggggt aattttgcag tatcgtcaag atcacccaaa actggtggct gttctctttt 480 aagcgggata gcatgggttc ttagaggacc ccctacaagg attgaggatt gttta atg 538 Met 1 aat tcc ccg cag aac gtc tcc acc aag aag gtc acc gtc acc ggc gca 586 Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly Ala 5 10 15 gct ggt caa atc tct tat tca ctg ttg tgg cgc atc gcc aac ggt gaa 634 Ala Gly Gln Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Asn Gly Glu 20 25 30 gta ttc ggc acc gac acc cct gta gaa ctg aaa ctt ctg gag atc cct 682 Val Phe Gly Thr Asp Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Leu Glu Ile Pro 35 40 45 cag gct ctt ggc ggg gca gag ggt gtg gct atg gaa ctt ctg gat tct 730 Gln Ala Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Ala Met Glu Leu Leu Asp Ser 50 55 60 65 gcc ttc ccc ctc ctg cga aac atc acc atc acc gcg gat gcc aat gag 778 Ala Phe Pro Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ile Thr Ala Asp Ala Asn Glu 70 75 80 gca ttc gac ggc gct aat gcg gcg ttt ttg gtc ggt gcg aag cct cgc 826 Ala Phe Asp Gly Ala Asn Ala Ala Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro Arg 85 90 95 gga aaa ggc gaa gag cgc gca gat ttg ctg gct aac aac ggc aag att 874 Gly Lys Gly Glu Glu Arg Ala Asp Leu Leu Ala Asn Asn Gly Lys Ile 100 105 110 ttc gga cct caa ggt aaa gct atc aat gac aac gcc gca gat gac att 922 Phe Gly Pro Gln Gly Lys Ala Ile Asn Asp Asn Ala Ala Asp Asp Ile 115 120 125 cgt gtc cta gtt gtt gga aac cca gcg aac acc aac gcg ttg att gct 970 Arg Val Leu Val Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile Ala 130 135 140 145 tca gct gcg gcc cca gat gtt cca gca tcc cgc ttc aac gca atg atg 1018 Ser Ala Ala Ala Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Phe Asn Ala Met Met 150 155 160 cgc ctt gat cac aac cgt gcg atc tcc cag ctg gcc acc aag ctt ggc 1066 Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Lys Leu Gly 165 170 175 cgt gga tct gcg gaa ttt aac aac att gtg gtc tgg gga aat cac tcc 1114 Arg Gly Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Val Val Trp Gly Asn His Ser 180 185 190 gca acc cag ttc cca gac atc acc tac gca acc gtt ggt gga gaa aag 1162 Ala Thr Gln Phe Pro Asp Ile Thr Tyr Ala Thr Val Gly Gly Glu Lys 195 200 205 gtc act gac ctg gtt gat cac gat tgg tat gtg gag gag ttc att cct 1210 Val Thr Asp Leu Val Asp His Asp Trp Tyr Val Glu Glu Phe Ile Pro 210 215 220 225 cgc gtg gct aac cgt ggc gct gaa atc att gag gtc cgt gga aag tct 1258 Arg Val Ala Asn Arg Gly Ala Glu Ile Ile Glu Val Arg Gly Lys Ser 230 235 240 tct gca gct tct gca gca tcc tct gcg att gat cac atg cgc gat tgg 1306 Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ile Asp His Met Arg Asp Trp 245 250 255 gta cag ggc acc gag gcg tgg tcc tct gcg gca att cct tcc acc ggt 1354 Val Gln Gly Thr Glu Ala Trp Ser Ser Ala Ala Ile Pro Ser Thr Gly 260 265 270 gca tac ggc att cct gag ggc att ttt gtc ggt ctg cca acc gta tcc 1402 Ala Tyr Gly Ile Pro Glu Gly Ile Phe Val Gly Leu Pro Thr Val Ser 275 280 285 cgc aac ggt gag tgg gaa atc gtt gaa ggc ctg gag att tcc gat ttc 1450 Arg Asn Gly Glu Trp Glu Ile Val Glu Gly Leu Glu Ile Ser Asp Phe 290 295 300 305 cag cgc gcc cgc atc gac gcg aat gct cag gaa ttg cag gcc gag cgc 1498 Gln Arg Ala Arg Ile Asp Ala Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ala Glu Arg 310 315 320 gag gca gtg cgc gac ttg ctc taatctttaa cgcatgactt cgcttttcga 1549 Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu 325 cgccccaacc ctccaacgcg tcaccgtttt cacgggctcg gcgctcggca gttcctcgct 1609 gtacacgcaa gcggctcaaa ccttggcgaa aaccgcggta gaccgcggca tcgacttggt 1669 ttacggtggc ggaaaagtgg ggctcatggg tatcgtcgcg gatgcgttcc tggaatcagg 1729 tggcgaagcc tttggcgtca tcacggaatc acttatgaag ggtgagcttg ggcatgaaaa 1789 gctcaccgaa cttgaaatcg ttcctgatat gcacatccgc aagcgtcgca tggcagaact 1849 tggcgatggt tttatcgcca tgcccggtgg cgccggcacc ttggaagaac ttttcgaggt 1909 ctggacctgg caacagctgg gcattcatca aaagcccgtc gcactttatg atgtcgatgg 1969 tttttggcag cccctgctgg aaatgcttga gcagatgacc cagcgtggat ttatcaagcg 2029 agacttcttt gagtgcctca tcgtggaatc cgacccgcat gccctgctaa aggcaatgca 2089 gacctggact ccaccagcac caaaatggta actaaattgt gtgctcgacg gtaacgccgc 2149 cgagtatctt gatggaaatg gaagccacgc cgttgtcatt gactgtgatg gtttcttcta 2209 cttctgggcc atcgaaacgt gaaatctcgg tagcatccac atcggtgatg gagctatcaa 2269 aaggaatctt gatttcactg agcagggaaa tatctccggg gctgccatcc tcggacacgg 2329 tggagtattc cacgaacctg aaccaaccaa tgttgtgcac cgccttgtag catcgtttcg 2389 ccacggtcgc agaatcggtg tccggggcga tcagcgggtc aaagctcacg gcacgaccag 2449 aatcgtgctc acggaacaca ccgatgcctc gcgcaacgcg gtcccttagg tggaaaccag 2509 aggaagggtc agccgcgatg gccagaccca ccgcagtgga acctgagggg aatggggagc 2569 ggtggacacg gcggccgaaa cgctcgcgga gcaacctgga aacgagtggg agcgaggatc 2629 cactagttct agagcggccg ccaccgcggt ggag 2663 <210> 3 <211> 328 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Asn Ser Pro Gln Asn Val Ser Thr Lys Lys Val Thr Val Thr Gly 1 5 10 15 Ala Ala Gly Gln Ile Ser Tyr Ser Leu Leu Trp Arg Ile Ala Asn Gly 20 25 30 Glu Val Phe Gly Thr Asp Thr Pro Val Glu Leu Lys Leu Leu Glu Ile 35 40 45 Pro Gln Ala Leu Gly Gly Ala Glu Gly Val Ala Met Glu Leu Leu Asp 50 55 60 Ser Ala Phe Pro Leu Leu Arg Asn Ile Thr Ile Thr Ala Asp Ala Asn 65 70 75 80 Glu Ala Phe Asp Gly Ala Asn Ala Ala Phe Leu Val Gly Ala Lys Pro 85 90 95 Arg Gly Lys Gly Glu Glu Arg Ala Asp Leu Leu Ala Asn Asn Gly Lys 100 105 110 Ile Phe Gly Pro Gln Gly Lys Ala Ile Asn Asp Asn Ala Ala Asp Asp 115 120 125 Ile Arg Val Leu Val Val Gly Asn Pro Ala Asn Thr Asn Ala Leu Ile 130 135 140 Ala Ser Ala Ala Ala Pro Asp Val Pro Ala Ser Arg Phe Asn Ala Met 145 150 155 160 Met Arg Leu Asp His Asn Arg Ala Ile Ser Gln Leu Ala Thr Lys Leu 165 170 175 Gly Arg Gly Ser Ala Glu Phe Asn Asn Ile Val Val Trp Gly Asn His 180 185 190 Ser Ala Thr Gln Phe Pro Asp Ile Thr Tyr Ala Thr Val Gly Gly Glu 195 200 205 Lys Val Thr Asp Leu Val Asp His Asp Trp Tyr Val Glu Glu Phe Ile 210 215 220 Pro Arg Val Ala Asn Arg Gly Ala Glu Ile Ile Glu Val Arg Gly Lys 225 230 235 240 Ser Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ile Asp His Met Arg Asp 245 250 255 Trp Val Gln Gly Thr Glu Ala Trp Ser Ser Ala Ala Ile Pro Ser Thr 260 265 270 Gly Ala Tyr Gly Ile Pro Glu Gly Ile Phe Val Gly Leu Pro Thr Val 275 280 285 Ser Arg Asn Gly Glu Trp Glu Ile Val Glu Gly Leu Glu Ile Ser Asp 290 295 300 Phe Gln Arg Ala Arg Ile Asp Ala Asn Ala Gln Glu Leu Gln Ala Glu 305 310 315 320 Arg Glu Ala Val Arg Asp Leu Leu 325

Claims

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말레이트 데하이드로게나제 활성을 갖고 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 mdhA 유전자의 발현이 제거된, 분리된 코리네형 세균.
a) L-라이신을 생산하는 제6항에 따르는 세균을 발효시키는 단계,

b) 배지내 또는 세균의 세포내에서 L-라이신을 농축시키는 단계, 및

c) L-라이신을 분리하는 단계를 수행하는 것을 포함하는, L-라이신의 제조방법.
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제7항에 있어서,

a) 디하이드로디피콜리네이트 합성효소를 암호화하는 dapA 유전자,

b) 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

c) 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자,

d) zwf 유전자 생성물을 암호화하는 zwf 유전자, 및

e) 라이신 배출 수송체를 암호화하는 lysE 유전자

로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 증진된 세균을 발효시키는, L-라이신의 제조방법.
제7항에 있어서,

a) 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

b) 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자, 및

c) 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 동시에 제거되는 방법.
제7항, 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 미생물이 사용되는 방법.
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제6항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 코리네형 세균.
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제6항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 536번 내지 1519번에 의해 암호화된 코리네형 세균.
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제7항에 있어서, mdhA 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레타이드의 발현이 제거된 방법.
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말레이트 데하이드로게나제 효소의 세포내 활성이 제거되고 당해 효소의 아미노산 서열이 서열번호 3의 폴리펩타이드인 코리네형 세균을 발효시킴에 의한 L-라이신의 제조방법.
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제30항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 536번 내지 1519번에 의해 암호화된 방법.
제30항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열번호 2로 제시된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 방법.