JP2003144161A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
Ｌ−アミノ酸の製造法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ
−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造
法、及びそれに用いる菌株を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ
−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌にマレートデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入し、マレートデ
ヒドロゲナーゼ活性を増強することによって、これらの
Ｌ−アミノ酸生産能を向上させる。
−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造
法、及びそれに用いる菌株を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ
−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌にマレートデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子を導入し、マレートデ
ヒドロゲナーゼ活性を増強することによって、これらの
Ｌ−アミノ酸生産能を向上させる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等とし
て、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いら
れている。
アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等とし
て、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いら
れている。
【０００２】
【従来の技術】従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸
等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有
するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属
するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されて
いる。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるた
めに、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異
株が用いられている。
等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有
するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属
するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されて
いる。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるた
めに、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異
株が用いられている。
【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌におい
て、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ遺伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺
伝子（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
遺伝子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、lysA及びddh
（特開平9−322774号）、lysC、lysA及びホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平1
0-165180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（aspC）
（特開平10-215883号）を導入することにより、同細菌
のＬ−リジン生産能が向上することが知られている。
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌におい
て、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ遺伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺
伝子（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
遺伝子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）、lysA及びddh
（特開平9−322774号）、lysC、lysA及びホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）（特開平1
0-165180号）、変異型lysC、dapB、dapA、lysA及びアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（aspC）
（特開平10-215883号）を導入することにより、同細菌
のＬ−リジン生産能が向上することが知られている。
【０００４】また、エシェリヒア属細菌においては、da
pA、変異型lysC、dapB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（又はテトラヒドロジピコリン酸
スクシニラーゼ遺伝子（dapD）及びスクシニルジアミノ
ピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強す
るとＬ−リジン生産能が向上することが知られている
（WO 95/16042）。尚、WO 95/16042ではテトラヒドロジ
ピコリン酸スクシニラーゼがスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼと誤記されている。一方、コリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌にお
いて、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グ
ルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝
子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的で
あったことが報告されている（特公平7-121228号）。ま
た、特開昭61-268185号公報には、コリネバクテリウム
属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さ
らに、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸
シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタ
ミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
pA、変異型lysC、dapB、ジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子（ddh）（又はテトラヒドロジピコリン酸
スクシニラーゼ遺伝子（dapD）及びスクシニルジアミノ
ピメリン酸デアシラーゼ遺伝子（dapE））を順次増強す
るとＬ−リジン生産能が向上することが知られている
（WO 95/16042）。尚、WO 95/16042ではテトラヒドロジ
ピコリン酸スクシニラーゼがスクシニルジアミノピメリ
ン酸トランスアミナーゼと誤記されている。一方、コリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属細菌にお
いて、エシェリヒア・コリ又はコリネバクテリウム・グ
ルタミクム由来のクエン酸シンターゼをコードする遺伝
子の導入が、Ｌ−グルタミン酸生産能の増強に効果的で
あったことが報告されている（特公平7-121228号）。ま
た、特開昭61-268185号公報には、コリネバクテリウム
属細菌由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含
む組換え体ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さ
らに、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺
伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸
シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタ
ミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００５】しかし、マレートデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子の構造はコリネ型細菌では報告されておら
ず、マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をコ
リネ型細菌の育種に利用することも知られていない。
ドする遺伝子の構造はコリネ型細菌では報告されておら
ず、マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子をコ
リネ型細菌の育種に利用することも知られていない。
【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来よりも
さらに改良された発酵法によるＬ−リジン又はＬ−グル
タミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法、及びそれに用いる
菌株を提供することを課題とする。
さらに改良された発酵法によるＬ−リジン又はＬ−グル
タミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法、及びそれに用いる
菌株を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、マレートデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子をコリネ型細菌に導入
し、マレートデヒドロゲナーゼ活性を増幅することによ
り、Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の生産量を増大さ
せることができることを見出し、本発明を完成するに至
った。すなわち本発明は、以下のとおりである。
を解決するために鋭意検討を行った結果、マレートデヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子をコリネ型細菌に導入
し、マレートデヒドロゲナーゼ活性を増幅することによ
り、Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の生産量を増大さ
せることができることを見出し、本発明を完成するに至
った。すなわち本発明は、以下のとおりである。
【０００７】（１）細胞中のマレートデヒドロゲナーゼ
活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリ
ネ型細菌。 （２）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン
から選ばれる（１）のコリネ型細菌。 （３）前記マレートデヒドロゲナーゼ活性の増強が、前
記細菌細胞内のマレートデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子のコピー数を高めることによるものである前記
（１）のコリネ型細菌。 （４）前記マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子がエシェリヒア属細菌由来である（３）のコリネ型細
菌。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかのコリネ型細菌を
培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴
とするＬ−アミノ酸の製造法。 （６）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン
から選ばれる（５）の方法。
活性が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリ
ネ型細菌。 （２）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン
から選ばれる（１）のコリネ型細菌。 （３）前記マレートデヒドロゲナーゼ活性の増強が、前
記細菌細胞内のマレートデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子のコピー数を高めることによるものである前記
（１）のコリネ型細菌。 （４）前記マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝
子がエシェリヒア属細菌由来である（３）のコリネ型細
菌。 （５）前記（１）〜（４）のいずれかのコリネ型細菌を
培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を生成蓄積せ
しめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取することを特徴
とするＬ−アミノ酸の製造法。 （６）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミ
ン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン
から選ばれる（５）の方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】＜１＞本発明のコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、
細胞中のマレートデヒドロゲナーゼ活性が増強されたコ
リネ型細菌である。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−セリン等が挙げられる。これらの中では、Ｌ
−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。以下、本発
明の実施の形態を、主としてＬ−リジン生産能又はＬ−
グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌について説明
するが、本発明は、目的とするＬ−アミノ酸固有の生合
成系がマレートデヒドロゲナーゼよりも下流に位置する
ものについては同様に適用され得る。
細胞中のマレートデヒドロゲナーゼ活性が増強されたコ
リネ型細菌である。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−セリン等が挙げられる。これらの中では、Ｌ
−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。以下、本発
明の実施の形態を、主としてＬ−リジン生産能又はＬ−
グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌について説明
するが、本発明は、目的とするＬ−アミノ酸固有の生合
成系がマレートデヒドロゲナーゼよりも下流に位置する
ものについては同様に適用され得る。
【００１０】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の
製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、
例えば以下に示すものが挙げられる。
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の
製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、
例えば以下に示すものが挙げられる。
【００１１】コリネバクテリウム・アセトアシドフィル
ム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15
806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15
991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13
032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14
020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13
869 (コリネバクテリウム・リリウム） ATCC159
90 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14
067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17
965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14
066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14
068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13
825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19
240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15
354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ1234
0(FERM BP-1539)
ム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15
806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15
991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13
032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14
020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13
869 (コリネバクテリウム・リリウム） ATCC159
90 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14
067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17
965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14
066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14
068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13
825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19
240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15
354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ1234
0(FERM BP-1539)
【００１２】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection、住所 12301 Parklawn Drive, Roc
kville, Maryland 20852, United States of America）
より分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ご
とに対応する登録番号が付与されており、この登録番号
を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応
する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションのカタログに記載されている。また、AJ12340
株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）にブダペスト条約に基づいて寄託されている。
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection、住所 12301 Parklawn Drive, Roc
kville, Maryland 20852, United States of America）
より分譲を受けることができる。すなわち、各微生物ご
とに対応する登録番号が付与されており、この登録番号
を引用して分譲を受けることができる。各微生物に対応
する登録番号はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クションのカタログに記載されている。また、AJ12340
株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番
３号）にブダペスト条約に基づいて寄託されている。
【００１３】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−
アミノ酸生産能を有する変異株等も、本発明に利用でき
る。この様な人工変異株としては次の様なものがある。
Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「AE
C」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-1147
0）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特公昭57-14
157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474号、特公昭5
8-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公
昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5-11958号、
特公平7-112437号、特公平7-112438号参照）、その成長
にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特
公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示
し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−
バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708
395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプ
ロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラ
ギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロ
イルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキ
ザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸
系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開
昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498
号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-97
83号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995号、特開昭56-
39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イノ
シトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株
（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、フルオロピル
ビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−
リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090
号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを
生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウ
ム属の生産変異株（米国特許第4411997号）。
ら誘導されたＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−
アミノ酸生産能を有する変異株等も、本発明に利用でき
る。この様な人工変異株としては次の様なものがある。
Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン（以下、「AE
C」と略記する）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムAJ11082（NRRL B-1147
0）、特公昭56-1914号、特公昭56-1915号、特公昭57-14
157号、特公昭57-14158号、特公昭57-30474号、特公昭5
8-10075号、特公昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公
昭62-24074号、特公昭62-36673号、特公平5-11958号、
特公平7-112437号、特公平7-112438号参照）、その成長
にＬ−ホモセリン等のアミノ酸を必要とする変異株（特
公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示
し、更にＬ−ロイシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−セリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−
バリン等のアミノ酸を要求する変異株（米国特許第3708
395号及び第3825472号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプ
ロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラ
ギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロ
イルロイシンに耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキ
ザロ酢酸脱炭酸酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸
系酵素阻害剤の耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開
昭50-53588号、特開昭50-31093号、特開昭52-102498
号、特開昭53-9394号、特開昭53-86089号、特開昭55-97
83号、特開昭55-9759号、特開昭56-32995号、特開昭56-
39778号、特公昭53-43591号、特公昭53-1833号）、イノ
シトールまたは酢酸を要求するＬ−リジン生産変異株
（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、フルオロピル
ビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−
リジン生産変異株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090
号）、エチレングリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを
生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウ
ム属の生産変異株（米国特許第4411997号）。
【００１４】また、Ｌ−スレオニン生産能を有するコリ
ネ型細菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシド
フィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,94
9号参照）等が、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリ
ネ型細菌としてはブレビバクテリウム・フラバム AJ121
49（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が挙
げられる。
ネ型細菌としては、コリネバクテリウム・アセトアシド
フィラム AJ12318（FERM BP-1172)(米国特許第5,188,94
9号参照）等が、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリ
ネ型細菌としてはブレビバクテリウム・フラバム AJ121
49（FERM BP-759)(米国特許第4,656,135号参照）等が挙
げられる。
【００１５】＜２＞マレートデヒドロゲナーゼ活性の増
幅 コリネ型細菌細胞中のマレートデヒドロゲナーゼ活性を
増幅するには、マレートデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくは
マルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを
作製し、これをＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸生産能
を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。
形質転換株の細胞内のマレートデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子のコピー数が上昇する結果、マレートデヒ
ドロゲナーゼ活性が増幅される。マレートデヒドロゲナ
ーゼは、エシェリヒア・コリではmdh遺伝子にコードさ
れている。
幅 コリネ型細菌細胞中のマレートデヒドロゲナーゼ活性を
増幅するには、マレートデヒドロゲナーゼをコードする
遺伝子断片を、該細菌で機能するベクター、好ましくは
マルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを
作製し、これをＬ−リジン又はＬ−グルタミン酸生産能
を有するコリネ型細菌に導入して形質転換すればよい。
形質転換株の細胞内のマレートデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子のコピー数が上昇する結果、マレートデヒ
ドロゲナーゼ活性が増幅される。マレートデヒドロゲナ
ーゼは、エシェリヒア・コリではmdh遺伝子にコードさ
れている。
【００１６】マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子は、コリ
ネ型細菌の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌
等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することがで
きる。エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列は既
に明らかにされている（VogelR. F. et al., Arch. Mic
robiol., 149 (1), 36-42 (1987), Genbank/EMBL/DDBJ
accetion No. M24777）ので、その塩基配列に基づいて
作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及び２に
示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain
reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185
(1989)参照）によって、mdh遺伝子を取得することがで
きる。コリネ型細菌等の他の微生物のマレートデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子も、同様にして取得され得
る。
ネ型細菌の遺伝子を用いることも、エシェリヒア属細菌
等の他の生物由来の遺伝子のいずれも使用することがで
きる。エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列は既
に明らかにされている（VogelR. F. et al., Arch. Mic
robiol., 149 (1), 36-42 (1987), Genbank/EMBL/DDBJ
accetion No. M24777）ので、その塩基配列に基づいて
作製したプライマー、例えば配列表配列番号１及び２に
示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリ染色体Ｄ
ＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：polymerase chain
reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet. 5,185
(1989)参照）によって、mdh遺伝子を取得することがで
きる。コリネ型細菌等の他の微生物のマレートデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子も、同様にして取得され得
る。
【００１７】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K. Mi
ura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K. Mi
ura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工
学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、
１９９２年参照）等により調製することができる。
【００１８】ＰＣＲ法により増幅されたマレートデヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ
及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能
なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、こ
れをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操
作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において
自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクター
が好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ま
しく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG39
9、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
ロゲナーゼをコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリ
及び／又はコリネ型細菌の細胞内において自律複製可能
なベクターＤＮＡに接続して組換えＤＮＡを調製し、こ
れをエシェリヒア・コリ細胞に導入しておくと、後の操
作がしやすくなる。エシェリヒア・コリ細胞内において
自律複製可能なベクターとしては、プラスミドベクター
が好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ま
しく、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG39
9、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。
【００１９】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)
【００２０】マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組み
換えＤＮＡを調製するには、マレートデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子の末端に合うような制限酵素でベク
ターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガ
ーゼを用いて行うのが普通である。
伝子とコリネ型細菌で機能するベクターを連結して組み
換えＤＮＡを調製するには、マレートデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子の末端に合うような制限酵素でベク
ターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガ
ーゼを用いて行うのが普通である。
【００２１】上記のように調製した組み換えＤＮＡをコ
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。
【００２２】マレートデヒドロゲナーゼをコードする活
性の増幅は、マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させる
ことによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生
物の染色体ＤＮＡ上にマレートデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ
上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換え
により行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列と
しては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在す
るインバーティッド・リピートが利用できる。あるい
は、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているよ
うに、マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
トランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方
法によっても形質転換株内のマレートデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、マレー
トデヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
性の増幅は、マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させる
ことによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生
物の染色体ＤＮＡ上にマレートデヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ
上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換え
により行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列と
しては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在す
るインバーティッド・リピートが利用できる。あるい
は、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているよ
うに、マレートデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を
トランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮ
Ａ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方
法によっても形質転換株内のマレートデヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、マレー
トデヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
【００２３】マレートデヒドロゲナーゼ活性の増幅は、
上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプ
ラスミド上のマレートデヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置
換することによっても達成される（特開平１−２１５２
８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモ
ーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモ
ーター等が強力なプロモーターとして知られている。こ
れらのプロモーターへの置換により、マレートデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されることに
よってマレートデヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
上記の遺伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプ
ラスミド上のマレートデヒドロゲナーゼをコードする遺
伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置
換することによっても達成される（特開平１−２１５２
８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモ
ーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモ
ーター等が強力なプロモーターとして知られている。こ
れらのプロモーターへの置換により、マレートデヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されることに
よってマレートデヒドロゲナーゼ活性が増幅される。
【００２４】また、本発明のコリネ型細菌は、マレート
デヒドロゲナーゼ活性に加えて、他のアミノ酸生合成経
路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化することによって、
それらの酵素活性が増強されてもよい。例えば、Ｌ−リ
ジンの製造に利用可能な遺伝子の例としては、Ｌ−リジ
ン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻
害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼαサブユニ
ット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコードする遺伝
子（WO94/25605国際公開パンフレット）、コリネホルム
細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子（特開昭60-87788号公報）、コリネホルム
細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコー
ドする遺伝子（特公平6-55149号公報）等が知られてい
る。
デヒドロゲナーゼ活性に加えて、他のアミノ酸生合成経
路又は解糖系等の酵素遺伝子を強化することによって、
それらの酵素活性が増強されてもよい。例えば、Ｌ−リ
ジンの製造に利用可能な遺伝子の例としては、Ｌ−リジ
ン及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻
害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼαサブユニ
ット蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコードする遺伝
子（WO94/25605国際公開パンフレット）、コリネホルム
細菌由来の野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子（特開昭60-87788号公報）、コリネホルム
細菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコー
ドする遺伝子（特公平6-55149号公報）等が知られてい
る。
【００２５】また、Ｌ−グルタミン酸の製造に利用可能
な遺伝子の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＤＨ、特開昭６１−２６８１８５号）、グルタミン
シンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸
デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、特開
昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラターゼ
（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンター
ゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７
８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン
酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、
ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ（特開昭６３−１０２６９２号）、グルコ
ースリン酸イソメラーゼ等がある。
な遺伝子の例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＤＨ、特開昭６１−２６８１８５号）、グルタミン
シンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸
デヒドロゲナーゼ（特開昭６２−１６６８９０号、特開
昭６３−２１４１８９号）、アコニット酸ヒドラターゼ
（特開昭６２−２９４０８６号）、クエン酸シンター
ゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ（特開昭６０−８７７
８８号、特開昭６２−５５０８９号）、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン
酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、
ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３
−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフル
クトキナーゼ（特開昭６３−１０２６９２号）、グルコ
ースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００２６】さらに、目的とするＬ−アミノ酸の生合成
経路から分岐して同Ｌ−アミノ酸以外の化合物を生成す
る反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していて
もよい。例えば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐して
Ｌ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/
23864参照）。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路か
ら分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒド
ロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルト
ランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸
シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸
デカルボキシラーゼ、１−ピロリン酸デヒドロゲナー
ゼ、等がある。
経路から分岐して同Ｌ−アミノ酸以外の化合物を生成す
る反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していて
もよい。例えば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐して
Ｌ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/
23864参照）。また、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路か
ら分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素としては、αケトグルタール酸デヒド
ロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルト
ランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸
シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸
デカルボキシラーゼ、１−ピロリン酸デヒドロゲナー
ゼ、等がある。
【００２７】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、
１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、
１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００２８】また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。
【００２９】＜３＞Ｌ−アミノ酸の生産
マレートデヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつ、Ｌ−
アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培
養すれば、同Ｌ−アミノ酸が培地に蓄積する。例えば、
マレートデヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつＬ−リ
ジン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養
すれば、Ｌ−リジンが培地に蓄積する。また、マレート
デヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン
酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれ
ば、Ｌ−グルタミン酸が培地に蓄積する。
アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培
養すれば、同Ｌ−アミノ酸が培地に蓄積する。例えば、
マレートデヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつＬ−リ
ジン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養
すれば、Ｌ−リジンが培地に蓄積する。また、マレート
デヒドロゲナーゼ活性が増幅され、かつＬ−グルタミン
酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれ
ば、Ｌ−グルタミン酸が培地に蓄積する。
【００３０】さらに、マレートデヒドロゲナーゼ活性が
増幅され、かつＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能
を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、Ｌ−リジン
及びＬ−グルタミン酸が培地に蓄積する。Ｌ−リジンと
Ｌ−グルタミン酸を同時に醗酵生産する場合には、Ｌ−
リジン生産菌をＬ−グルタミン酸の生産条件下で培養し
てもよいし、あるいはＬ−リジン生産能を有するコリネ
型細菌とＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌
を混合培養してもよい（特開平５−３７９３号公報）。
増幅され、かつＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能
を有するコリネ型細菌を培地で培養すれば、Ｌ−リジン
及びＬ−グルタミン酸が培地に蓄積する。Ｌ−リジンと
Ｌ−グルタミン酸を同時に醗酵生産する場合には、Ｌ−
リジン生産菌をＬ−グルタミン酸の生産条件下で培養し
てもよいし、あるいはＬ−リジン生産能を有するコリネ
型細菌とＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌
を混合培養してもよい（特開平５−３７９３号公報）。
【００３１】本発明の微生物を用いてＬ−リジン又はＬ
−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を製造するのに用いる
培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じそ
の他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭
素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトー
ス、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分
解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどの
アルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸
等の有機酸類を用いることができる。
−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸を製造するのに用いる
培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じそ
の他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭
素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトー
ス、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分
解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどの
アルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸
等の有機酸類を用いることができる。
【００３２】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
が できる。
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
が できる。
【００３３】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
【００３４】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。
【００３５】発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は、通常
のＬ−アミノ酸の製造法と同様にして行うことができ
る。例えば、Ｌ−リジンの採取は、通常イオン交換樹脂
法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることによ
り実施できる。また、Ｌ−グルタミン酸を採取する方法
も常法によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、
晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタ
ミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、
または中和晶析させればよい。Ｌ−リジン及びＬ−グル
タミン酸の両方を製造する場合、これらを混合物として
用いる場合には、これらのアミノ酸を相互に分離するこ
とは不要である。
のＬ−アミノ酸の製造法と同様にして行うことができ
る。例えば、Ｌ−リジンの採取は、通常イオン交換樹脂
法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせることによ
り実施できる。また、Ｌ−グルタミン酸を採取する方法
も常法によって行えばよく、例えばイオン交換樹脂法、
晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタ
ミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、
または中和晶析させればよい。Ｌ−リジン及びＬ−グル
タミン酸の両方を製造する場合、これらを混合物として
用いる場合には、これらのアミノ酸を相互に分離するこ
とは不要である。
【００３６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００３７】＜１＞エシェリヒア・コリJM109株のmdh遺
伝子のクローニング エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列は既に明ら
かにされている（VogelR. F. et al., Arch. Microbio
l., 149 (1), 36-42 (1987), Genbank/EMBL/DDBJ accet
ion No. M24777）。報告されている塩基配列に基づいて
配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エ
シェリヒア・コリJM109株の染色体ＤＮＡを鋳型にして
ＰＣＲ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増
幅した。
伝子のクローニング エシェリヒア・コリのmdh遺伝子の塩基配列は既に明ら
かにされている（VogelR. F. et al., Arch. Microbio
l., 149 (1), 36-42 (1987), Genbank/EMBL/DDBJ accet
ion No. M24777）。報告されている塩基配列に基づいて
配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エ
シェリヒア・コリJM109株の染色体ＤＮＡを鋳型にして
ＰＣＲ法によりピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を増
幅した。
【００３８】合成したプライマーの内、配列番号１は、
Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. M24777に記載されて
いるmdh遺伝子の塩基配列の１番目から２４番目の塩基
に至る配列に相当し、配列番号２は、２４７０番目から
２４４７番目の塩基に至る配列に相当する。
Genbank/EMBL/DDBJ accetion No. M24777に記載されて
いるmdh遺伝子の塩基配列の１番目から２４番目の塩基
に至る配列に相当し、配列番号２は、２４７０番目から
２４４７番目の塩基に至る配列に相当する。
【００３９】エシェリヒア・コリJM109株の染色体ＤＮ
Ａの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工
学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立
出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反
応条件を用いた。
Ａの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工
学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立
出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反
応条件を用いた。
【００４０】生成したＰＣＲ産物を常法により精製後、
SmaIで切断したプラスミドｐＨＣ４と、ライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒ
ア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用
いて形質転換を行い、クロラムフェニコール３０μg/ml
を含むＬ培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイース
トエキストラクト 5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.
2）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。取得
した形質転換体よりプラスミドを抽出し、ベクターに
mdh遺伝子が結合したプラスミドｐＨＣ４ｐｐｓを得
た。
SmaIで切断したプラスミドｐＨＣ４と、ライゲーション
キット（宝酒造社製）を用いて連結した後、エシェリヒ
ア・コリJM109のコンピテントセル（宝酒造社製）を用
いて形質転換を行い、クロラムフェニコール３０μg/ml
を含むＬ培地（バクトトリプトン10g/L、バクトイース
トエキストラクト 5g/L、NaCl 5g/L、寒天15g/L、pH7.
2）に塗布し、一晩培養後、出現した白色のコロニーを
釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。取得
した形質転換体よりプラスミドを抽出し、ベクターに
mdh遺伝子が結合したプラスミドｐＨＣ４ｐｐｓを得
た。
【００４１】ｐＨＣ４を保持するエシェリヒア・コリ
は、プライベートナンバーAJ12617と命名され、１９９
１年４月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２２１５
として寄託され、１９９１年８月２６日に、ブタペスト
条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３５３２が付与されている。
は、プライベートナンバーAJ12617と命名され、１９９
１年４月２４日に、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東
一丁目１番３号）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２２１５
として寄託され、１９９１年８月２６日に、ブタペスト
条約に基く国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３５３２が付与されている。
【００４２】次に、クローニングされたＤＮＡ断片がマ
レートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドしていることを確認するため、ＪＭ１０９株及び、ｐ
ＨＣ４ｍｄｈを保持するＪＭ１０９株のマレートデヒド
ロゲナーゼ活性をBanaszak,L. J. & Bradshaw, R. A.,
The Enzymes (3rd ed.), 11, 369-396 (1975)に記載の
方法により測定した。その結果、ｐＨＣ４ｍｄｈを保持
するＪＭ１０９株は、ｐＨＣ４ｍｄｈを保持しないＪＭ
１０９株の約１４倍のマレートデヒドロゲナーゼ活性を
示すことから、mdh遺伝子が発現していることを確認し
た。
レートデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコー
ドしていることを確認するため、ＪＭ１０９株及び、ｐ
ＨＣ４ｍｄｈを保持するＪＭ１０９株のマレートデヒド
ロゲナーゼ活性をBanaszak,L. J. & Bradshaw, R. A.,
The Enzymes (3rd ed.), 11, 369-396 (1975)に記載の
方法により測定した。その結果、ｐＨＣ４ｍｄｈを保持
するＪＭ１０９株は、ｐＨＣ４ｍｄｈを保持しないＪＭ
１０９株の約１４倍のマレートデヒドロゲナーゼ活性を
示すことから、mdh遺伝子が発現していることを確認し
た。
【００４３】＜２＞コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生
産株へのｐＨＣ４ｍｄｈの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4mdhで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ13029/pHC4mdhを用いてＬ−
グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。
5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレー
ト培地にて培養して得たAJ13029/pHC4mdh株の菌体を、5
μg/mlのクロラムフェニコールを含む下記組成を有する
Ｌ−グルタミン酸生産培地に接種し、31.5℃にて振とう
培養し、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
得られた培養物を、同じ組成の培地に５％量接種し、37
℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コ
ントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ13029株
に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自
律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス法により
形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
産株へのｐＨＣ４ｍｄｈの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4mdhで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ13029/pHC4mdhを用いてＬ−
グルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。
5μg/mlのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレー
ト培地にて培養して得たAJ13029/pHC4mdh株の菌体を、5
μg/mlのクロラムフェニコールを含む下記組成を有する
Ｌ−グルタミン酸生産培地に接種し、31.5℃にて振とう
培養し、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
得られた培養物を、同じ組成の培地に５％量接種し、37
℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。コ
ントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ13029株
に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で自
律複製可能なプラスミドｐＨＣ４を電気パルス法により
形質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００４４】〔Ｌ−グルタミン酸生産培地〕下記成分
（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製し、115℃で15
分殺菌する。 グルコース 150g ＫＨ2ＰＯ4 2g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1.5g ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 15mg ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ 15mg 大豆蛋白加水分解液 50ml ビオチン 2mg サイアミン塩酸塩 3mg
（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製し、115℃で15
分殺菌する。 グルコース 150g ＫＨ2ＰＯ4 2g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1.5g ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 15mg ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ 15mg 大豆蛋白加水分解液 50ml ビオチン 2mg サイアミン塩酸塩 3mg
【００４５】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表１に示し
た。
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表１に示し
た。
【００４６】
【表１】
【００４７】＜３＞コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へ
のpHC4mdhの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4mdhで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ11082/pHC4mdhを用いてＬ−
リジン生産のための培養を以下のように行った。5μg/m
lのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地
にて培養して得たAJ11082/pHC4mdh株の菌体を、5μg/ml
のクロラムフェニコールを含む下記組成のＬ−リジン生
産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるま
で振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリ
ウム属細菌AJ11082株に、既に取得されているコリネバ
クテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpHC4を電
気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして
培養した。
のpHC4mdhの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4mdhで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ11082/pHC4mdhを用いてＬ−
リジン生産のための培養を以下のように行った。5μg/m
lのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｂプレート培地
にて培養して得たAJ11082/pHC4mdh株の菌体を、5μg/ml
のクロラムフェニコールを含む下記組成のＬ−リジン生
産培地に接種し、31.5℃にて培地中の糖が消費されるま
で振とう培養した。コントロールとしてコリネバクテリ
ウム属細菌AJ11082株に、既に取得されているコリネバ
クテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミドpHC4を電
気パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして
培養した。
【００４８】ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムAJ11082は、1979年６月18日にアグリカルチュラル・
リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agri
cultural Research Service Culture Collection）に国
際寄託され、受託番号NRRL B-11470が付与されている。
ムAJ11082は、1979年６月18日にアグリカルチュラル・
リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agri
cultural Research Service Culture Collection）に国
際寄託され、受託番号NRRL B-11470が付与されている。
【００４９】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。 グルコース 100 g （ＮＨ4）2ＳＯ4 55 g ＫＨ2ＰＯ4 1 g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。 グルコース 100 g （ＮＨ4）2ＳＯ4 55 g ＫＨ2ＰＯ4 1 g ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g
【００５０】培養終了後、培養液中のＬ−リジン蓄積量
を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１
０により測定した。このときの結果を表２に示した。
を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ−２１
０により測定した。このときの結果を表２に示した。
【００５１】
【表２】
【００５２】＜４＞コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−
グルタミン酸生産株へのpHC4mdhの導入とＬ−リジン及
びＬ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4mdhで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ12993/pHC4mdhを用いてＬ−
リジン及びＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下の
ように行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含む
ＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ12993/pHC4md
h株の菌体を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む前
記Ｌ−リジン生産培地に接種して31.5℃にて培養した。
培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシ
フトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ12993
株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で
自律複製可能なプラスミドpHC4を電気パルス法により形
質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
グルタミン酸生産株へのpHC4mdhの導入とＬ−リジン及
びＬ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpHC4mdhで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ12993/pHC4mdhを用いてＬ−
リジン及びＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下の
ように行った。5μg/mlのクロラムフェニコールを含む
ＣＭ２Ｂプレート培地にて培養して得たAJ12993/pHC4md
h株の菌体を、5μg/mlのクロラムフェニコールを含む前
記Ｌ−リジン生産培地に接種して31.5℃にて培養した。
培養を開始してから１２時間後に培養温度を３４℃にシ
フトし、培地中の糖が消費されるまで振とう培養した。
コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ12993
株に、既に取得されているコリネバクテリウム属細菌で
自律複製可能なプラスミドpHC4を電気パルス法により形
質転換した菌株を上記と同様にして培養した。
【００５３】培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表３に示した。
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表３に示した。
【００５４】
【表３】
表３
───────────────────────────────────
菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/L) Ｌ−グルタミン酸生成量(g/L)
───────────────────────────────────
AJ12993/pHC4 １０．５ １８．９
AJ12993/pHC4mdh １２．９ ２２．３
───────────────────────────────────
【００５５】
【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産能を向
上させることができる。
ン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の生産能を向
上させることができる。
【００５６】
【配列表】Sequence Listing
【００５７】<110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., In
c.) <120> Ｌ−アミノ酸の製造法 <130> P-6643 <141> 1999-07-02 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0
c.) <120> Ｌ−アミノ酸の製造法 <130> P-6643 <141> 1999-07-02 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００５８】
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying Esherichia coli mdh gene
<400> 1
cagctggcag gcagtaaacc attt 24
【００５９】
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence:primer for
amplifying Esherichia coli mdh gene
<400> 2
ggatccggtg taatcatgga tcac 24
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｐ 13/14 Ａ
13/14 13/06
//(Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:15
Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｐ 13/08
(Ｃ１２Ｐ 13/08 13/14
Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 13/14
Ｃ１２Ｒ 1:15）
(72)発明者 倉橋 修
神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素
株式会社発酵技術研究所内
Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA08 BA71 BA72
BA74 CA03 CA20 DA05 DA06
DA10 EA04 GA14 GA19 GA27
4B064 AE19 AE25 CA02 CA19 CC01
CC24 CD02 CD09 CD22 CD30
DA10
4B065 AA22X AA24X AA26X AA26Y
AB01 AC14 AC15 AC16 BA02
BA03 BA25 BB03 BB15 BB20
BB27 BC02 BC03 BC26 CA17
CA28 CA41 CA43
Claims (6)
- 【請求項１】 細胞中のマレートデヒドロゲナーゼ活性
が増強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型
細菌。 - 【請求項２】 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−セリンから選ばれる請求項１記載のコリネ型細菌。 - 【請求項３】 前記マレートデヒドロゲナーゼ活性の増
強が、前記細菌細胞内のマレートデヒドロゲナーゼをコ
ードする遺伝子のコピー数を高めることによるものであ
る請求項１記載のコリネ型細菌。 - 【請求項４】 前記マレートデヒドロゲナーゼをコード
する遺伝子がエシェリヒア属細菌由来である請求項３記
載のコリネ型細菌。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸
を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取す
ることを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。 - 【請求項６】 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−
グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ
−セリンから選ばれる請求項５記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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