JP2003159066A - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来よりもさらに改良された発酵法によるＬ
−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ−アミノ酸の製造
法、及びそれに用いる菌株を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸等のＬ
−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌にｒＲＮＡをコ
ードする遺伝子を導入し、ｒＲＮＡ遺伝子の発現を増強
することによって、これらのＬ−アミノ酸生産能 及び
生産速度を向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
アミノ酸の製造法、特にＬ−リジン及びＬ−グルタミン
酸の製造法に関する。Ｌ−リジンは飼料添加物等とし
て、Ｌ−グルタミン酸は調味料原料等として広く用いら
れている。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸
等のＬ−アミノ酸は、これらのＬ−アミノ酸生産能を有
するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属
するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されて
いる。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるた
めに、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異
株が用いられている。

【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ
酸の生合成酵素を増強することによって、Ｌ−アミノ酸
の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例
えば、Ｌ−リジン生産能を有するコリネ型細菌におい
て、Ｌ−リジン及びＬ−スレオニンによるフィードバッ
ク阻害が解除されたアスパルトキナーゼをコードする遺
伝子（変異型lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ遺伝子（dapB）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺
伝子（dapA）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
遺伝子（lysA）遺伝子、及びジアミノピメリン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子（ddh）（WO96/40934）を導入するこ
とにより、同細菌のＬ−リジン生産能が向上することが
知られている。

【０００４】また、コリネバクテリウム属細菌におい
て、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ
遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強すること
によって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術
が開示されている（特開昭63-214189号）。

【０００５】ところで、ｒＲＮＡをコードする遺伝子
は、エシェリヒア・コリでは既にクローニングされ、塩
基配列が報告されている（16S RNA遺伝子：Brosius, J.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4801-4805
(1978)。23S rRNA遺伝子：Brosius, J. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77, 201-204 (1980)。5S rRNA
遺伝子：Singh, B. et al., Biochim. Biophys. Acta,
698, 252-259 (1982)）。また、エシェリヒア・コリで
は、１６ＳｒＲＮＡ、２３ＳｒＲＮＡ、５ＳｒＲＮＡの
それぞれをコードする遺伝子が、グルタミン酸のtRNAを
コードする遺伝子（Glu-tRNA-2）と共にオペロン（rrnB
オペロン）を形成していることが知られている。

【０００６】また、微生物のｒＲＮＡの発現量と生育速
度には正の相関があることが知られている（Bremer, H.
et al., Modulation of chemical composition and ot
herparameters of the cell growth rate. In Escheric
hia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and
Molecular Biology, pp.1527-1542. Edited by F.C.Nei
dhardt et al., Washington, DC: American Society fo
r Microbiology）が、ｒＲＮＡの発現量とＬ−アミノ酸
等の発酵生産物の生産性との関係は知られていない。

【発明が解決しようとする課題】本発明は、従来よりも
さらに改良された発酵法によるＬ−リジン又はＬ−グル
タミン酸等のＬ−アミノ酸の製造法、及びそれに用いる
菌株を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意検討を行った結果、エシェリヒア
・コリのｒＲＮＡをコードするオペロンをコリネ型細菌
に導入し、ｒＲＮＡの発現量を増強することにより、Ｌ
−リジン又はＬ−グルタミン酸の生産量を増大させるこ
とができること、及びこれらのＬ−アミノ酸の生産速度
を高めることができることを見出し、本発明を完成する
に至った。すなわち本発明は、以下のとおりである。

【０００８】（１）細胞中のｒＲＮＡ遺伝子の発現が増
強され、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細
菌。 （２）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸から選ばれる（１）のコリネ型細菌。 （３）前記ｒＲＮＡ遺伝子が、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、
２３ＳｒＲＮＡ遺伝子及び５ＳｒＲＮＡ遺伝子から選ば
れる１、２又は３種である（１）のコリネ型細菌。 （４）前記ｒＲＮＡ遺伝子がエシェリヒア属細菌由来の
ｒｒｎオペロンである前記（３）のコリネ型細菌。 （５）前記ｒＲＮＡ遺伝子の発現の増強が、前記細菌細
胞内のｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を高めることによるも
のである（１）のコリネ型細菌。 （６）前記（１）〜（５）のいずれか一項に記載のコリ
ネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸を
生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取する
ことを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。 （７）前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ−グルタ
ミン酸から選ばれる（６）の方法。

【０００９】本発明において、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、
２３ＳｒＲＮＡ遺伝子もしくは５ＳｒＲＮＡ遺伝子、又
はこれらの任意の１、２又は３種、又はこれらを含むオ
ペロンを総称して、ｒＲＮＡ遺伝子ということがある。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１１】＜１＞本発明のコリネ型細菌 本発明のコリネ型細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、
細胞中の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強されたコリ
ネ型細菌である。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−リジン、
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシン、Ｌ
−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン等
の種々のＬ−アミノ酸が挙げられる。これらの中では、
Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸が好ましい。以下、本
発明の実施の形態を、主としてＬ−リジン生産能又はＬ
−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌について説
明するが、本発明は、他のＬ−アミノ酸についても同様
に適用され得る。

【００１２】本発明でいうコリネ型細菌としては、バー
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群
の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。Ｌ−リジン又はＬ−グルタミン酸の
製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、
例えば以下に示すものが挙げられる。

【００１３】 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 （ブレビバクテリウム・ディバリカタム） ATCC14020 （ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869 〔コリネバクテリウム・リリウム） ATCC15990 （ブレビバクテリウム・フラバム） ATCC14067 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC14068 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ12340(FERM BP-1539)

【００１４】これらを入手するには、例えばアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションより分譲を受ける
ことができる。すなわち、各微生物ごとに対応する登録
番号が付与されており、この登録番号を引用して分譲を
受けることができる。各微生物に対応する登録番号はア
メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタロ
グに記載されている。また、AJ12340株は、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にブダペスト条約に
基づいて寄託されている。

【００１５】また、上記菌株以外にも、これらの菌株か
ら誘導されたＬ−リジン生産能又はＬ−グルタミン酸生
産能を有する変異株等も、本発明に利用できる。この様
な人工変異株としては次の様なものがある。Ｓ−（２−
アミノエチル）−システイン（以下、「AEC」と略記す
る）耐性変異株（例えば、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタムAJ11082（NRRL B-11470）、特公昭56-19
14号、特公昭56-1915号、特公昭57-14157号、特公昭57-
14158号、特公昭57-30474号、特公昭58-10075号、特公
昭59-4993号、特公昭61-35840号、特公昭62-24074号、
特公昭62-36673号、特公平5-11958号、特公平7-112437
号、特公平7-112438号参照）、その成長にＬ−ホモセリ
ン等のアミノ酸を必要とする変異株（特公昭48-28078
号、特公昭56-6499号）、AECに耐性を示し、更にＬ−ロ
イシン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、
Ｌ−アルギニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン等のアミノ
酸を要求する変異株（米国特許第3708395号及び第38254
72号）、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−
アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナロ
グ、スルファ剤、キノイド、Ｎ−ラウロイルロイシンに
耐性を示すＬ−リジン生産変異株、オキザロ酢酸脱炭酸
酵素（デカルボキシラーゼ）または呼吸系酵素阻害剤の
耐性を示すＬ−リジン生産変異株（特開昭50-53588号、
特開昭50-31093号、特開昭52-102498号、特開昭53-9394
号、特開昭53-86089号、特開昭55-9783号、特開昭55-97
59号、特開昭56-32995号、特開昭56-39778号、特公昭53
-43591号、特公昭53-1833号）、イノシトールまたは酢
酸を要求するＬ−リジン生産変異株（特開昭55-9784
号、特開昭56-8692号）、フルオロピルビン酸または34
℃以上の温度に対して感受性を示すＬ−リジン生産変異
株（特開昭55-9783号、特開昭53-86090号）、エチレン
グリコールに耐性を示し、Ｌ−リジンを生産するブレビ
バクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異
株（米国特許第4411997号）。

【００１６】＜２＞ｒＲＮＡ遺伝子の発現の増強 コリネ型細菌細胞中のｒＲＮＡ遺伝子の発現を増強する
には、ｒＲＮＡ遺伝子断片を、該細菌で機能するベクタ
ー、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組
み換えＤＮＡを作製し、これをＬ−リジン又はＬ−グル
タミン酸生産能を有するコリネ型細菌に導入して形質転
換すればよい。形質転換株の細胞内のｒＲＮＡ遺伝子の
コピー数が上昇する結果、ｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強
される。増強されるｒＲＮＡ遺伝子としては、１６Ｓｒ
ＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子及び５ＳｒＲＮＡ
遺伝子から選ばれる任意の１、２又は３種が挙げられる
が、３種とも増強されることが好ましい。エシェリヒア
・コリでは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺
伝子及び５ＳｒＲＮＡ遺伝子は、グルタミン酸のtRNAを
コードする遺伝子（Glu-tRNA-2）と共にrrnBオペロンに
よってコードされている。

【００１７】ｒＲＮＡ遺伝子は、コリネ型細菌の遺伝子
を用いることも、エシェリヒア属細菌等の他の生物由来
の遺伝子のいずれも使用することができる。エシェリヒ
ア・コリの各ｒＲＮＡ遺伝子及びそれらを含むオペロン
（rrnB）の塩基配列は既に明らかにされている（16S RN
A遺伝子：Brosius, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA, 75, 4801-4805 (1978)。23S rRNA遺伝子：Bros
ius,J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 201
-204 (1980)。5S rRNA遺伝子：Singh, B. et al., Bioc
him. Biophys. Acta, 698, 252-259 (1982)。rrnB：EMB
L/GenBank/DDBJ accession No. J01695）ので、その塩
基配列に基づいて作製したプライマーを用いてエシェリ
ヒア・コリ染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣ
Ｒ：polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;
Trends Genet. 5,185(1989)参照）によって、各ｒＲＮ
Ａ遺伝子又はrrnBオペロンを取得することができる。rr
nBオペロンは、例えば配列表配列番号１及び２に示すプ
ライマーを用いて取得することができる。コリネ型細菌
等の他の微生物のｒＲＮＡ遺伝子も、同様にして取得さ
れ得る。尚、rrnBオペロンを取得する際に、同オペロン
にGlu-tRNA-2が含まれていてもよいが、含まれていなく
てもよい。

【００１８】染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌
から、例えば、斎藤、三浦の方法（H.Saito and K.Miur
a Biochem.Biophys.Acta, 72,619,(1963)、生物工学実
験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９
９２年参照）等により調製することができる。

【００１９】ＰＣＲ法により増幅されたｒＲＮＡ遺伝子
は、エシェリヒア・コリ及び／又はコリネ型細菌の細胞
内において自律複製可能なベクターＤＮＡに接続して組
換えＤＮＡを調製し、これをエシェリヒア・コリ細胞に
導入しておくと、後の操作がしやすくなる。エシェリヒ
ア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとして
は、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自
立複製可能なものが好ましく、例えば pUC19、pUC18、p
BR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げ
られる。

【００２０】コリネ型細菌の細胞内において自律複製可
能なベクターとしては、pAM330（特開昭58-67699号公報
参照）、pHM1519（特開昭58-77895号公報参照）等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つＤＮＡ断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。

【００２１】このようなシャトルベクターとしては、以
下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクターを保持
する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっこ内に示
した。 pAJ655 エシェリヒア・コリAJ11882(FERM BP-136)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8201(ATCC39135) pAJ1844 エシェリヒア・コリAJ11883(FERM BP-137)コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクム SR8202(ATCC39136) pAJ611 エシェリヒア・コリAJ11884(FERM BP-138) pAJ3148 コリネハ゛クテリウム・ク゛ルタミクムSR8203(ATCC39137) pAJ440 ハ゛チルス・ス゛フ゛チリスAJ11901(FERM BP-140) pHC4 エシェリヒア・コリAJ12617(FERM BP-3532)

【００２２】ｒＲＮＡ遺伝子とコリネ型細菌で機能する
ベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、ｒ
ＲＮＡ遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを
切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを
用いて行うのが普通である。

【００２３】上記のように調製した組み換えＤＮＡをコ
リネ型細菌に導入するには、これまでに報告されている
形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア
・コリ Ｋ−１２について報告されているような、受容
菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増
す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53,159
(1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告
されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセ
ルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wil
son,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）があ
る。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵
母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞
を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまた
はスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ
受容菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Mole
c. Gen. Genet., 168, 111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.
M.andHopwood,O.A.,Nature, 274, 398 (1978);Hinnen,
A.,Hicks,J.B.and Fink,G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。本発明の実施例
で用いた形質転換の方法は、電気パルス法（特開平２−
２０７７９１号公報参照）である。

【００２４】ｒＲＮＡ遺伝子の増強は、ｒＲＮＡ遺伝子
を上記宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させること
によっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生物の
染色体ＤＮＡ上にｒＲＮＡ遺伝子を多コピーで導入する
には、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に
利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コ
ピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移
因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利
用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に
開示されているように、ｒＲＮＡ遺伝子をトランスポゾ
ンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピ
ー導入することも可能である。いずれの方法によっても
形質転換株内のｒＲＮＡ遺伝子のコピー数が上昇する結
果、ｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強される。

【００２５】ｒＲＮＡ遺伝子の発現の増強は、上記の遺
伝子増幅による以外に、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド
上のｒＲＮＡ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を
強力なものに置換することによっても達成される。たと
えば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒ
ｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージ
のＰ_Rプロモーター、Ｐ_Lプロモーター等が強力なプロモ
ーターとして知られている。これらのプロモーターへの
置換により、ｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強される。

【００２６】また、本発明のコリネ型細菌は、ｒＲＮＡ
遺伝子の発現の増強に加えて、Ｌ−アミノ酸生合成経路
又は解糖系等の酵素遺伝子を強化することによって、そ
れらの酵素活性が増強されてもよい。例えば、Ｌ−リジ
ンの製造に利用可能な遺伝子の例としては、Ｌ−リジン
及びＬ−スレオニンによる相乗的なフィードバック阻害
が実質的に解除されたアスパルトキナーゼαサブユニッ
ト蛋白質又はβサブユニット蛋白質をコードする遺伝子
（WO94/25605国際公開パンフレット）、コリネホルム細
菌由来の野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子（特開昭60-87788号公報）、コリネホルム細
菌由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコード
する遺伝子（特公平6-55149号公報）等が知られてい
る。

【００２７】さらに、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐
してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する
酵素の活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−グル
タミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以
外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、ホ
モセリンデヒドロゲナーゼがある（WO 95/23864参
照）。

【００２８】また、Ｌ−グルタミン酸の製造に利用可能
な遺伝子の例としては、解糖系のホスフォフルクトキナ
ーゼ（ＰＦＫ、特開昭６３−１０２６９２号）、アナプ
レロティック経路のホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ（ＰＥＰＣ、特開昭６０−８７７８８号、特開
昭６２−５５０８９号）、ＴＣＡ回路のクエン酸合成酵
素（ＣＳ、特開昭６２−２０１５８５号、特開昭６３−
１１９６８８号）、アコニット酸ヒドラターゼ（ＡＣ
Ｏ、特開昭６２−２９４０８６号）、イソクエン酸デヒ
ドロゲナーゼ（ＩＣＤＨ、特開昭６２−１６６８９０
号、特開昭６３−２１４１８９号）等がある。

【００２９】さらに、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路か
ら分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反
応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよ
い。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グ
ルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
としては、αケトグルタール酸デヒドロゲナーゼ（αＫ
ＧＤＨ）、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトラ
ンスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シ
ンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトラン
スフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デ
カルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ、等
がある。

【００３０】さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有する
コリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質
に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができ
る（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌とし
ては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ130
29株は、1994年９月２日付けで工業技術院生命工学工業
技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、
１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。

【００３１】また、Ｌ−リジン及びＬ−グルタミン酸生
産能を有するコリネ型細菌に、ビオチン作用抑制物質に
対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量の
ビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の
非存在下でＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸を同時生産
させることができる（WO96/06180号参照）。このような
菌株としては、WO96/06180号に記載されているブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993株が挙げら
れる。同株は１９９４年６月３日付けで工業技術院生命
工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14348で寄託さ
れ、１９９５年８月１日にブダペスト条約に基づく国際
寄託に移管され、受託番号FERM BP-5188が付与されてい
る。

【００３２】＜３＞Ｌ−アミノ酸の生産 ｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強され、かつＬ−リジン酸生
産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、
Ｌ−リジンが培地に蓄積する。また、ｒＲＮＡ遺伝の発
現が増強され、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコ
リネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン
酸が培地に蓄積する。

【００３３】さらに、ｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強さ
れ、かつＬ−リジン及びＬ−グルタミン酸生産能を有す
るコリネ型細菌を培地で培養すれば、Ｌ−リジン及びＬ
−グルタミン酸が培地に蓄積する。Ｌ−リジンとＬ−グ
ルタミン酸を同時に醗酵生産する場合には、Ｌ−リジン
生産菌をＬ−グルタミン酸の生産条件下で培養してもよ
いし、あるいはＬ−リジン生産能を有するコリネ型細菌
とＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を混合
培養してもよい（特開平５−３７９３号公報）。

【００３４】本発明の微生物を用いてＬ−リジン及び／
又はＬ−グルタミン酸を製造するのに用いる培地は、炭
素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機
微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源として
は、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクト
ース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭
水化物、エタノールやイノシトールなどのアルコール
類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類を用いることができる。

【００３５】窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモ
ニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、
コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有
機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いること
ができる。

【００３６】無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ₁など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。

【００３７】培養は、振とう培養、通気撹拌培養等によ
る好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培
養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御
する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるい
はアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用するこ
とができる。

【００３８】発酵液からのＬ−リジンの採取は、通常イ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。また、Ｌ−グルタミン酸を
採取する方法も常法によって行えばよく、例えばイオン
交換樹脂法、晶析法等によることができる。具体的に
は、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、
分離させるか、または中和晶析させればよい。Ｌ−リジ
ン及びＬ−グルタミン酸の両方を製造する場合、これら
を混合物として用いる場合には、これらのアミノ酸を相
互に分離することは不要である。

【００３９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００４０】＜１＞エシェリヒア・コリW3110株のｒＲ
ＮＡ遺伝子（rrnBオペロン）のクローニング エシェリヒア・コリW3110株のrrnBオペロンの塩基配列
は既に明らかにされている（EMBL/GenBank/DDBJ access
ion No. J01695）。報告されている塩基配列に基づいて
配列表配列番号１及び２に示すプライマーを合成し、エ
シェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型にして
ＰＣＲ法によりrrnBオペロンを増幅した。

【００４１】合成したプライマーの内、配列番号１は、
EMBL/GenBank/DDBJ accession No.J01695に登録されて
いるrrnB遺伝子の塩基配列の251番目から270番目の塩基
に至る配列に相当し、配列番号２は、7488番目から7508
番目の塩基に至る配列に相当する。尚、配列番号１及び
２の塩基配列には制限酵素KpnIの認識配列が挿入されて
いる。

【００４２】エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮ
Ａの調製は常法によった（生物工学実験書、日本生物工
学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年）。また、
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ法最前線（関谷剛男ほか編、共立
出版社、１９８９年）１８５頁に記載されている標準反
応条件を用いた。生成したＰＣＲ産物を常法により精製
後、制限酵素KpnIを反応させ、制限酵素KpnIで切断した
プラスミドpVK7と、ライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いて連結した。

【００４３】前記のpVK7は、以下のようにして、エシェ
リヒア・コリ用ベクターであるpHSG299（Km^r；Takeshit
a, S. et al., Gene, 61, 63-74, (1987)参照）にブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムのクリプティッ
クプラスミドであるpAM330を結合することによって構築
した。pAM330は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムATCC13869株より調製した。pHSG299を一箇所切断
酵素であるAvaII（宝酒造（株）製）にて切断し、T4 DN
Aポリメラーゼにて平滑末端化したのち、HindIII（宝酒
造（株）製）にて切断し、T4 DNAポリメラーゼにて平滑
末端化したpAM330と接続した。pHSG299に対するpAM330
の挿入方向により、生成した２種類のプラスミドをpVK
6、pVK7と命名し、pVK7を以下の実験に用いた。pVK7
は、E. coli及びブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムの細胞中で自律複製可能であり、かつ、pHSG299
由来のマルチプルクローニングサイトと、lacZ’及びマ
ーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を保持している。

【００４４】上記のようにして得られたrrnBオペロンが
挿入されたプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM
109のコンピテントセル（宝酒造社製）を形質転換し、I
PTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ
ド）10μg/ml、X-Gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）40μg/ml及びカナ
マイシン25μg/mlを含むＬ培地（バクトトリプトン10g/
L、バクトイーストエキストラクト 5g/L、NaCl 5g/L、
寒天15g/L、pH7.2）に塗布し、一晩培養後、出現した白
色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換
株を得た。

【００４５】形質転換株からアルカリ法（生物工学実験
書、日本生物工学会編、１０５頁、培風館、１９９２
年）を用いてプラスミドを調製した後、ベクターに挿入
されたＤＮＡ断片の制限酵素地図を作成し、報告されて
いるrrnBオペロンの制限酵素地図と比較し、同一制限酵
素地図を有するＤＮＡ断片が挿入されているプラスミド
をpVKRRNと名付けた。

【００４６】＜３＞コリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生
産株へのpVKRRNの導入とＬ−グルタミン酸生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpVKRRNで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ13029/pVKRRNを用いてＬ−グ
ルタミン酸生産のための培養を以下のように行った。25
μg/mlのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて
培養して得たAJ13029/pVKRRNの菌体を、25μg/mlのカナ
マイシンを含む表１に示す組成の種培養培地に接種し、
３１．５℃で２４時間振とう培養して種培養を得た。表
１に示す組成の本培養培地を５００ml容ガラス製ジャー
ファーメンターに３００mlずつ分注し加熱殺菌した後、
上記種培養を４０ml接種した。撹拌速度を８００〜１３
００rpm、通気量を１／２〜１／１vvmとし、培養温度３
１．５℃にて培養を開始した。培養液のｐＨはアンモニ
アガスで７．５に維持した。培養を開始してから８時間
後に培養温度を３７℃にシフトした。コントロールとし
てコリネバクテリウム属細菌AJ13029株に、pVK7を電気
パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培
養した。

【００４７】

【表１】 表１ ────────────────────────────────── 濃 度 成 分 ──────────────────── 種培養 本培養 ────────────────────────────────── グルコース ５ g/dl １５ g/dl ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．１ g/dl ０．２ g/dl ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０４g/dl ０．１５g/dl ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ １ mg/dl １．５ mg/dl 大豆蛋白加水分解液 ２ ml/dl ５ ml/dl ビオチン ５０ μｇ/l ２００ μg/dl サイアミン塩酸塩 ２００ μｇ/l ３００ μg/dl ──────────────────────────────────

【００４８】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表２に示し
た。

【００４９】

【表２】 表２ ──────────────────────────── 菌 株 L-ク゛ルタミン酸生成量(g/dL) 培養時間(ｈ) ──────────────────────────── AJ13029/pVK7 １９．７ ２４ AJ13029/pVKRRN ２０．９ １７ ────────────────────────────

【００５０】＜４＞コリネ型細菌のＬ−リジン生産株へ
のpVKRRNの導入とＬ−リジン生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11082を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpVKRRNで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ11082/pVKRRNを用いてＬ−リ
ジン生産のための培養を以下のように行った。25μg/ml
のカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプレート培地にて培養し
て得たAJ11082/pVKRRN株の菌体を、25μg/mlのカナマイ
シンを含む下記組成のＬ−リジン生産培地に接種し、3
1.5℃にて培地中の糖が消費されるまで振とう培養し
た。コントロールとしてコリネバクテリウム属細菌AJ11
082株に、pVK7を電気パルス法により形質転換した菌株
を上記と同様にして培養した。

【００５１】〔Ｌ−リジン生産培地〕炭酸カルシウム以
外の下記成分（１Ｌ中）を溶解し、KOHでpH8.0に調製
し、115℃で15分殺菌した後、別に乾熱殺菌した炭酸カ
ルシウムを50ｇ加える。 グルコース 100 g （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ 55 g ＫＨ₂ＰＯ₄ 1 g ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 1 g ビオチン 500 μg チアミン 2000 μg ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.01 g ニコチンアミド 5 mg 蛋白質加水分解物（豆濃） 30 ml 炭酸カルシウム 50 g

【００５２】培養終了後、培養液中のＬ−グルタミン酸
蓄積量を旭化成工業社製バイオテックアナライザーＡＳ
−２１０により測定した。このときの結果を表３に示し
た。

【００５３】

【表３】 表３ ──────────────────────────── 菌 株 Ｌ−リジン生成量(g/dL) 培養時間(ｈ) ──────────────────────────── AJ13029/pVK7 ２８．９ ７２ AJ13029/pVKRRN ３０．４ ５７ ────────────────────────────

【００５４】＜５＞コリネ型細菌のＬ−リジン及びＬ−
グルタミン酸生産株へのpVKRRNの導入とＬ−リジン及び
Ｌ−グルタミン酸同時生産 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12993を
電気パルス法（特開平2-207791号公報参照）によりプラ
スミドpVKRRNで形質転換し、得られた形質転換株を得
た。得られた形質転換株AJ12993/pVKRRNを用いてＬ−リ
ジン及びＬ−グルタミン酸生産のための培養を以下のよ
うに行った。25μg/mlのカナマイシンを含むＣＭ２Ｂプ
レート培地にて培養して得たAJ12993/pVKRRN株の菌体
を、25μg/mlのカナマイシンを含む前記Ｌ−リジン生産
培地に接種して31.5℃にて培養した。培養を開始してか
ら１２時間後に培養温度を３４℃にシフトし、培地中の
糖が消費されるまで振とう培養した。コントロールとし
てコリネバクテリウム属細菌AJ12993株に、pVK7を電気
パルス法により形質転換した菌株を上記と同様にして培
養した。

【００５５】培養終了後、培養液中のＬ−リジン及びＬ
−グルタミン酸蓄積量を旭化成工業社製バイオテックア
ナライザーＡＳ−２１０により測定した。このときの結
果を表４に示した。

【００５６】

【表４】 表４ ─────────────────────────────────── 菌 株 L-リシ゛ン生成量(g/dl) L-ク゛ルタミン酸生成量(g/dl) 培養時間 ─────────────────────────────────── AJ12993/pVK7 １０．５ １８．９ ６０ AJ12993/pVKRRN １１．３ ２０．３ ４４ ───────────────────────────────────

【００５７】

【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌のＬ−リジ
ン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラ
ニン等のＬ−アミノ酸の生産能を向上させることができ
る。また、これらのＬ−アミノ酸の生産速度を改善する
ことができる。

【００５８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> Ｌ−アミノ酸の製造法 <130> P-6308 <141> 1999-07-19 <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００５９】 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Esherichia coli rrnB operon <400> 1 gcgcggtacc tagccaacct gttcgacaaa 30

【００６０】 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for amplifying Esherichia coli rrnB operon <400> 2 gcgcggtacc ggatccagac gagttaagtc 30

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 倉橋 修 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA71 BA72 BA74 CA01 DA10 EA04 4B064 AE03 AE19 AE25 CA02 CA19 CC24 DA10 4B065 AA24X AA26Y AB01 AC14 CA17 CA41

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 細胞中のｒＲＮＡ遺伝子の発現が増強さ
   れ、かつＬ−アミノ酸生産能を有するコリネ型細菌。
2. 【請求項２】 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ
   −グルタミン酸から選ばれる請求項１記載のコリネ型細
   菌。
3. 【請求項３】 前記ｒＲＮＡ遺伝子が、１６ＳｒＲＮＡ
   遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子及び５ＳｒＲＮＡ遺伝子
   から選ばれる１、２又は３種である請求項１記載のコリ
   ネ型細菌。
4. 【請求項４】 前記ｒＲＮＡ遺伝子がエシェリヒア属細
   菌由来のｒＲＮＡオペロンである請求項３記載のコリネ
   型細菌。
5. 【請求項５】 前記ｒＲＮＡ遺伝子の発現の増強が、前
   記細菌細胞内のｒＲＮＡ遺伝子のコピー数を高めること
   によるものである請求項１記載のコリネ型細菌。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載のコ
   リネ型細菌を培地に培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸
   を生成蓄積せしめ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取す
   ることを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
7. 【請求項７】 前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−リジン及びＬ
   −グルタミン酸から選ばれる請求項６記載の方法。