KR101072708B1 - ５＇－크산틸산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ５＇－크산틸산의 생산방법 - Google Patents

５＇－크산틸산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ５＇－크산틸산의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 5'-크산틸산 생산능이 증가된 미생물에 관한 것으로서, 구체적으로 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 유래의 미생물, 서열번호 7의 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물, 및 상기 형질전환되어 제조된 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
5'-크산틸산, 말레이트 디하이드로게나아제, 형질전환, 코리네박테리움

Description

５＇－크산틸산 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ５＇－크산틸산의 생산방법{A CORYNEBACTERIA HAVING ENHANCED 5'-XANTHOSINE MONOPHOSPHATE PRODUCTIVITY AND A METHOD OF PRODUCING 5'-XANTHOSINE MONOPHOSPHATE USING THE SAME}
본 발명은 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 유래의 미생물, 서열번호 7의 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 도입된 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물, 및 상기 형질전환되어 제조된 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
5'-구아닐산(5'- guanosine monophosphate: 이하 GMP)는 IMP (inosine monophosphate)와 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. GMP는 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 IMP과 같이 쓰여졌을 때 강하게 나타난다.
지금까지 알려진 GMP의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 5'-GMP를 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5’-크산틸산(5'-xanthosine monophosphate; 이하 XMP라 칭한다)을 코리네형 미생물을 이용하여 GMP로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 XMP를 에세리키아 콜리 (Escherichia Coli)를 이용하여 GMP로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.
상기 서술한 방법 중 XMP를 생산하여 GMP로 전환시키는 방법을 이용하여 GMP를 생산 할 경우 XMP의 생산성을 강화하는 전략이 필요하다. 예를 들면, 대한민국 특허출원 제10-1991-018061호는 XMP 수율을 높이기 위하여 아데닌과 구아닌 반영양요구성형의 크산틸산아미나제 불활성 균주이며 구아노신 유사체 내성을 가지고 있고 세포벽 분해 효소인 라이소자임에 감수성이 매우 높은 균주를 제작하여 개시하고 있고, 대한민국 특허출원 제10-2001-000513호에는 XMP를 생산하는 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)를 친주로 자외선을 조사하여, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 등의 변이 유발제를 통상적인 방법에 따라 처리함으로써, 친주의 형질을 변형시켜 XMP의 생합성에 영향을 주는 발린(valine)에 대한 유사체(analoge)인 노르발린(norvaline) 내성주를 선별하는 한편, 그 결과 XMP을 고수율, 고농도로 배양액 중에 직접 축적시키는 미생물을 이 용한 XMP 생산방법을 개시하고 있다. 또한 대한민국 특허출원 제10-2008-006537호에서는 XMP의 생합성에 관련하는 생합성 경로의 유전자인 purN, purH 를 강화하여 XMP 수율을 향상시킨 예도 있다.
한편, 고수율의 XMP 생산주를 만들기 위하여는 XMP 생합성 경로상 주요 전구체인 ATP의 생산을 증대하는 것이 필요하고, ATP의 생산의 증대를 위하여서는 말레이트 디하이드로게나아제의 활성이 강화되어야 한다. 그러나, 상기 효소를 강화시켜 XMP 수율을 향상시킨 미생물에 관한 예 및 그를 이용하여 고수율의 XMP를 생산하는 방법은 개시된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 예의 노력한 결과, XMP 수율을 향상시킬 수 있는 유전자를 밝히고, 상기 유전자를 포함하는 벡터를 디자인하는 한편, 상기 벡터로 형질전환된 코리네박테리아 속 미생물을 제조함으로써, 상기 미생물로부터 XMP를 고수율로 수득할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 7의 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서 하나의 양태로서 본 발명은 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 유래의 미생물에 관한 것이다. 바람직하게 본 발명의 말레이트 디하드로게나아제 활성을 내재적 활성보다 증가시킴으로써 크산틸산 생산능이 향상된 코리네박테리아 속 미생물을 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "말레이트 디하이드로게나아제 (malate degydrogenase)"란 말산탈수소 효소라고도 하며, 말산 (malate)에서 수소를 제거하여 옥살로아세트산 (oxaloacetate)을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 상기 효소는 자연계에 널리 분포하고 있고, 항상 락트산 탈수소효소에 수반하여 나타나며 DPN, NAD를 조효소로 필요로 한다. 바람직하게 본 발명은 상기 말레이트 디하이드로게나아제 효소의 활성을 증가시킴으로써 5'-크산틸산의 생산능이 증대된 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "내재적 활성"이란 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 효소의 활성 상태를 의미하고, "내재적 활성이 증가"되어 있다는 의미는 천연 상태의 효소 활성과 비교할 때 활성이 더 향상된 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 코리네박테리아 속 미생물에 상기 말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 벡터를 사용하여 외부에서 도입함으로써 그 내재적 활성보다 현저히 증가된 형질전환된 미생물을 생산하였다.
본 발명의 "코리네박테리아 속 미생물"은 당업계에서 사용되는 코리네박테리아 속 미생물이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 코리네박테리아 암모니아게네스, 코리에박테리움 글루타미쿰, 브레비박테리움 플라부므, 브레비박테리움 락토메르멘툼 등이 사용될 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용될 수 있는 코리네박테리아 속 미생물의 종류가 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 상기 코리네박테리아 속 미생물에는, 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6872, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032), 코리네박테리움 글루타미쿰 R, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) ATCC 13869 및 이들로 부터 제조된 균주를 포함한다. 바람직하게는 코리네박테리아 암모니아게네스 KCCM-10530로부터 형질전환된 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-1304일 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 서열번호 7의 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 서열번호 7의 유전자는 코리네박테리아의 mqo 유전자의 천연형 서열이다. 상기 "mqo 유전자"는 "malate:quinone oxidoreductase"의 약자로서 말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 말레이트 (malate)를 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)로 산화시키는 기능을 수행하는 효소이다.
본 발명에 의해 활성이 증가되는 효소인 말레이트 디하이드로게나아제는 코리네 박테리아의 mqo 유전자에 의해 암호화 될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화 될 수 있다. 상기 증가된 효소의 활성은 유전자 카피 수의 증가, 감소, 프로모터 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등 당업계에 알려진 방법이 제한 없이 사용된 결과에 의해 효소 활성이 증가될 수 있으며, 상기 예들에 의해 효소 활성 증가 방법이 제한되는 것은 아니다.
유전자 카피 수의 증가는, 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가 뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함된다. 내재적 유전자의 증폭은 당업계에 알려진 방법, 예를 들면 적당한 선택 압력 하에서 배양하는 방법 등에 의해 용이하게 이루어질 수 있으며, 상기 예에 의해 내재적 유전자 증폭 방법이 제한되는 것은 아니다.
바람직한 양태로서 본 발명은, 서열번호 7로 표시되는 mqo 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다. 본 발명의 벡터는 mqo 유전자를 포함할 수 있는 벡터라면 당업계에서 통상적으로 사용되는 벡터를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게 상기 벡터는 pDZ-mqo일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pDZ에 서열번호 7을 포함하는 mqo 유전자를 도입함으로서 pDZ-mqo 벡터를 제조하였다(도 1 참조).
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 mqo 유전자를 포함하는 재조합 벡터가 도입된 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환된 미생물은 코리네박테리아 유래의 mqo 유전자를 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 제한없이 사용하여, 형질전환된 미생물을 제조할 수 있다. mqo 유전자는 벡터에 클로닝 되어 세포에 형질전환되는 것이 바람직하다.
형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. "형질전환"이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것 으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl2 침전법, CaCl2 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다. 본 발명의 pDZ-mqp를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 전달할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 숙주의 염색체 내로 재조합 가능하게 하도록 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 바람직하게 본 발명의 mqo 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 포함하는 재조합 벡터일 수 있으며, 상기 도 1의 개열지도를 갖는 벡터는 코리네형 박테리아에 순차적으로 또는 동시에 도입된 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 형질전환의 방법으로 상기 벡터를 수탁번호 KCCM-10530인 코리네박테리움 암모니아게네스에 도입한 후, 선택 배지에 배양하여 2 카피의 mqo 유전자를 내재적 유전자의 자리에 상동 재조합 방법에 의해 치환시킴으로써, 2 카피를 갖는 mqo 유전자가 염색체 내에 삽입되도록 제조하였다. 그 결과 코리네박테리움 암모니아게네스의 형질전환으로 암모니아게네스 KCJ-1304인 신규한 형질전환된 미생물을 수득하였으며, 이를 수탁번호 KCCM10972P로 기탁하였다.
KCJ-1304 균주는 수탁번호가 KCCM-10530인 코리네박테리움 암모니아게네스에 도 1의 개열지도를 갖는 벡터 pDZ-mqo가 도입되고, 이를 선택배지에 배양함으로써 2개 카피의 mqo 유전자가 내재적 유전자를 상동 재조합에 의해 치환됨으로써 2 카피의 mqo 유전자가 염색체 내에 삽입되어 있는 균주이다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 형질전환된 미생물을 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 기술된 형질전환된 미생물을 이용하여 직접 발효법에 의함으로써 배양액 내에 고수율로 5'-크산틸산 (5'-xanthosine monophosphate, 5'-XMP)을 수득할 수 있다. 바람직하게 상기 방법에서 사용되는 형질전환된 미생물은 말레이트 디하이드로게나아제의 활성이 증가된 미생물이며, 또한 상기 형질전환된 미생물인 숙주의 염색체 내에 벡터의 mqo 유전자가 삽입됨으로써 5'-크산틸산의 생산량을 증가시킬 수 있다. 이러한 생산방법에 사용되는 미생물은 바람직하게 수탁번호 KCCM10972P호 일 수 있다.
본 발명에서 배양액으로 사용되는 배지는, 당업계에서 통상적으로 사용되는 배지가 제한없이 사용될 수 있다. 바람직하게 배지는 포도당을 탄소원으로 사용하고, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있는데 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 원하는 5'-크산틸산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성할 수 있다.
5'-크산틸산은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다. 본 발명의 5'-크산틸산을 생산하는 방법은, 세포 또는 배양 배지로부터 5'-크산틸산을 회수하는 단계를 포함한다. 세포 또는 배양 배지로부터 5'-크산틸산을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 5'-크산틸산 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "5'-크산틸산"이란 5'-크산틸산은 핵산 생합성 대사계의 중간물질로 동식물의 체내에서 생리적으로 중요한 의미를 가질 뿐 아니라 식품, 의약품 및 각종 의료적 용도로 다방면에서 이용되고 있으며, 특히, 글루타민산 나트륨과 같이 사용하면 맛의 상승 효과가 커서 정미성 조미료로 각광을 받고 있는 핵산계 조미료 중의 하나이다. 5'-크산틸산은 퓨린 뉴클레오타이드(purine nucleotide) 생합성 대사계의 중간 생성물로 5'-구아닐산 (5'-guanylic acid)의 제조원료로서 중요한 물질이다. 바람직하게 본 발명은 이러한 5'-크산틸산의 생산능 이 향상된 형질전환된 미생물을 제조하였고, 이를 배양하여, 그 배양액으로부터 5'-크산틸산을 생산한 결과, 종전의 미생물보다 약 6%가 향상된 XMP 생산능을 갖는 형질전환된 미생물 균주를 수득할 수 있었으며, 이를 통하여 XMP 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 코리네박테리아 속 유래의 미생물을 이용하면, 말레이트 디하이드로게나아제의 증대된 활성으로 인하여 기존의 5'-크산틸산 생산 미생물에 비해 현저하게 높은 수득률로 5'-크산틸산을 생산할 수 있다. 따라서 본 발명의 미생물을 사용하면 고효율로 5'-크산틸산을 수득할 수 있다.
실시예 1: XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530 유래 mqo 클로닝 및 염색체 삽입용 재조합벡터 (pDZ-mqo) 제작
본 실시예에서는 NIH GenBank를 근거로 하여 mqo 유전자의 염기서열 정보 (NCBI ID _ 3345228)를 확보하고, 이에 근거하여 두 쌍의 프라이머 (서열번호 1 내 지 4)를 합성하였다.
코리네박테리움 KCCM-10530 를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra™ 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (stratagene)이고, PCR 조건은 변성 95℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 68℃, 2분을 25회 반복하였다. 그 결과 2.1kb의 mqo 유전자 두쌍 (mqo-A, mqo-B)을 얻었다. mqo-A는 서열번호 1과 2를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, mqo-B는 서열번호 3과 4를 프라이머로 하여 증폭된 것이다.
서열 번호 1 gctctagaATCGGTCATTCCATGAACCC
서열 번호 2 cgcggatccCATCGATATCGCCAACTCCA
서열 번호 3 cgcggatccATCGGTCATTCCATGAACCC
서열 번호 4 gctctagaCATCGATATCGCCAACTCCA
상기 증폭산물 mqo-A, mqo-B의 각 말단에 포함된 제한효소 (mqo-A: XbaI + BamHI, mqo-B: BamHI + XbaI)를 처리하고, 다음으로 제한효소 XbaI과 shrimp alkaline phosphotase가 처리된 pDZ 벡터(특허출원 제 10-2007-94433호에 기술된 삽입방법 참고)에 3조각 접합을 통하여, 최종적으로 mqo 2 카피가 연속적으로 클로닝된 pDZ-mqo 재조합 벡터를 얻었다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 pDZ-mqo를 나타내는 도면이다.
실시예 2: mqo 삽입 균주 개발
제작된 pDZ-mqo벡터를 KCCM-10530 균주에 형질 전환하고, 실시 예1에서 기술한 것과 같이 2차 재조합 과정을 거쳐 염색체 상에서 mqo 유전자의 바로 옆에 1 카피의 mqo 유전자를 추가로 삽입하여 카피 수를 2개로 증가시킨 XMP 생산균주 코리네박테리움 암모니아게네스 KCJ-1304를 얻었다. 연속적으로 삽입된 mqo 유전자는 2 카피의 mqo의 upstream과 downstream 염기서열 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 (서열 5, 6)을 이용한 PCR로 최종 확인하였다.
서열 번호 5 CTTTTCGATGACGCCCAA
서열 번호 6 CCACTTTATCGGGTGAGACCA
실시예 3: mqo 삽입균주의 말레이트 디하이드로게나아제 활성
실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1304의 말레이트 디하이드로게나이제 활성 확인을 위해 아래와 같은 방법으로 효소활성을 측정하였다. 박토펩톤 10g/ℓ, 박토 쇠고기 추출물 (beef extract) 5g/ℓ, 박토 효모 추출물 (yeast extract) 5g/ℓ, NaCl 2.5g/ℓ, 아데닌 50 ㎎/ℓ, 구아닌 50 ㎎/ℓ 배지에 균주를 접종하고, 30℃에서 12시간 동안 OD 10이 되도록 배양하였다. 배양 후 10 ㎖의 세포를 배양액에서 회수하여 50mM Hepes, 10mM 아세트산 칼륨 (potassium acetate), 10mM CaCl2, 10mM MgCl2 버퍼에 2번 세척하여 동일한 버퍼 1ml에 풀어주었다. 세포 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 파괴한 후, 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하였다. 분리된 상등액을 다시 원심분리하여 펠렛 (pellet)만을 취하여 100 ㎕ 버퍼에 녹였다. 이 중 10 ㎕를 효소액으로 사용하였다. 반응액은 50mM Hepes, 10mM 아세트산 칼륨 (potassium acetate), 50 μM 2,6-디클로로인돌페놀 (2,6-dichloroindolphenol, Cl2Ind)의 혼합물 (mixture)를 만든다. Cl2Ind는 얼려두었다가 반응 직전에 섞어주었다. 만들어 놓은 반응 mixture 980 ㎕에 기질 (substrate)인 100mM 말레이트 (malate) 10 ㎕, 효소액 10 ㎕를 첨가하여 30℃에서 15분 동안 섞어(shaking) 반응시켰다. 반응 후 효소의 활성은 환원된 Cl2Ind의 농도로 확인할 수 있다. Cl2Ind의 600nm에서 흡수 계수 (absorption coefficient)는 22 cm-1 mM-1이다.
균주명 KCCM-10530 KCJ-1304
환원된 CL2Ind (μM) 15.45 20.17
상기 표 1 에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1304는 모균주 KCCM-10530에 비하여 말레이트 디하이드로게나아제 효소활성이 30.6% 증가 되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 4: mqo 삽입 균주의 XMP 생산
실시예 2에서 최종적으로 제작된 XMP 생산 균주인 코리네박테리아 암모니아게네스 KCJ-1304를 XMP 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다. 하기 종 배지 3 ㎖을 함유하는 14 ㎖ 튜브 (tube)에 코리네박테리움 암모니아게네스 모균주 KCCM-10530와 KCJ-1304를 접종하고 30℃에서 20시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산배지 32 ㎖ (본배지 24㎖ + 별살배지 8㎖)을 포함하고 있는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 0.4 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 96 시간 동안 230 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 5'-크산틸산의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 암모니아게네스 KCCM-10530와 KCJ-1304에 대한 배양액 중의 XMP 결과는 아래 표 2와 같다.
균주명 KCCM-10530 KCJ-1304
XMP (g/l) 28.6 30.3
종배지: 포도당 30g/ℓ, 펩톤 15g/ℓ, 효모엑기스 15g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 우레아 3g/ℓ, 아데닌 150 ㎎/ℓ, 구아닌 150 ㎎/ℓ, pH 7.2
생산배지 (본배지): 포도당 80g/ℓ, 황산마그네슘 10g/ℓ, 황산철 20 ㎎/ℓ, 황산아연 10 ㎎/ℓ, 황산망간 10 ㎎/ℓ, 아데닌 30 ㎎/ℓ, 구아닌 30 ㎎/ℓ, 비오틴 100 ㎍/ℓ, 황산구리 1 ㎎/ℓ, 티아민염산염 5 ㎎/ℓ, 염화칼슘 10 ㎎/ℓ, pH 7.2
생산배지 (별살배지): 인산제1칼륨 10g/ℓ, 인산제2칼륨 10g/ℓ, 우레아 7g/ℓ, 황산암모늄 5g/ℓ
상기 표 2 에서 나타낸 바와 같이, KCJ-1304는 모균주 KCCM-10530에 비하여 XMP 생산이 1.7 g/ℓ 증가되었음을 확인 할 수 있었으며, 이는 5.9%의 생산증가를 의미한다.
도 1은 pDZ 벡터에 mqo 유전자를 클로닝한 pDZ-mqo 벡터 구조를 나타낸다.
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> A CORYNEBACTERIA HAVING ENHANCED 5'-XANTHOSINE MONOPHOSPHATE PRODUCTIVITY AND A METHOD OF PRODUCING 5'-XANTHOSINE MONOPHOSPHATE USING THE SAME <130> PA080571/KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mqo-A <400> 1 gctctagaat cggtcattcc atgaaccc 28 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mqo-A <400> 2 cgcggatccc atcgatatcg ccaactcca 29 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mqo-B <400> 3 cgcggatcca tcggtcattc catgaaccc 29 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mqo-B <400> 4 gctctagaca tcgatatcgc caactcca 28 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for detecting mqo <400> 5 cttttcgatg acgcccaa 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for detecting mqo <400> 6 ccactttatc gggtgagacc a 21 <210> 7 <211> 1503 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes <400> 7 atgtcagatt ccccgaagaa cgcaccgagg attaccgatg aggcagatgt agttctcatt 60 ggtgccggta tcatgagctc cacgctgggt gcaatgctgc gtcagctgga gccaagctgg 120 actcagatcg tcttcgagcg tttggatgga ccggcacaag agtcgtcctc cccgtggaac 180 aatgcaggaa ccggccactc tgctctatgc gagctgaact acaccccaga ggttaagggc 240 aaggttgaaa ttgccaaggc tgtaggaatc aacgagaagt tccaggtttc ccgtcagttc 300 tggtctcacc tcgttgaaga gggagtgctg tctgatccta aggaattcat caaccctgtt 360 cctcacgtat ctttcggcca gggcgcagat caggttgcat acatcaaggc tcgctacgaa 420 gctttgaagg atcacccact cttccagggc atgacctacg ctgacgatga agctaccttc 480 accgagaagc tgcctttgat ggcaaagggc cgtgacttct ctgatccagt agcaatctct 540 tggatcgatg aaggcaccga catcaactac ggtgctcaga ccaagcagta cctggatgca 600 gctgaagttg aaggcactga aatccgctat ggccacgaag tcaagagcat caaggctgat 660 ggcgcaaagt ggatcgtgac cgtcaagaac gtacacactg gcgacaccaa gaccatcaag 720 gcaaacttcg tgttcgtcgg cgcaggcgga tacgcactgg atctgcttcg cagcgcaggc 780 atcccacagg tcaagggctt cgctggattc ccagtatccg gcctgtggct tcgttgcacc 840 aacgaggaac tgatcgagca gcacgcagcc aaggtatatg gcaaggcatc tgttggcgct 900 cctccaatgt ctgttcctca ccttgacacc cgcgttatcg agggtgaaaa gggtctgctc 960 tttggacctt acggtggctg gacccctaag ttcttgaagg aaggctccta cctggacctg 1020 ttcaagtcca tccgcccaga caacattcct tcctaccttg gcgttgctgc tcaggaattt 1080 gatctgacca agtaccttgt cactgaagtt ctcaaggacc aggacaagcg tatggatgct 1140 cttcgcgagt acatgccaga ggcacaaaac ggcgattggg agaccatcgt tgccggacag 1200 cgtgttcagg ttattaagcc tgcaggattc cctaagttcg gttccctgga attcggcacc 1260 accttgatca acaactccga aggcaccatc gccggattgc tcggtgcttc ccctggagca 1320 tccatcgcac cttccgcaat gatcgagctg cttgagcgtt gcttcggtga ccgcatgatc 1380 gagtggggcg acaagctgaa ggacatgatc ccttcctacg gcaagaagct tgcttccgag 1440 ccagcactgt ttgagcagca gtgggcacgc acccagaaga ccctgaagct tgaggaagcc 1500 taa 1503

Claims (10)

  1. 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가된 코리네박테리아 속 유래의 형질전환 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물을 배양한 배양액으로부터 5'-크산틸산을 회수하는 단계를 포함하는 5'-크산틸산 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네형 박테리아의 mqo 유전자의 발현량 증가에 의해 말레이트 디하이드로게나아제의 활성이 증가된, 5'-크산틸산 생산 방법.
  3. 삭제
  4. 서열번호 7의 유전자를 포함하는 도 1의 개열지도를 갖는 재조합 벡터가 도입된 형질전환된 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 미생물을 배양한 배양액으로부터 5'-크산틸산을 회수하는 단계를 포함하는 5'-크산틸산 생산 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 말레이트 디하이드로게나아제(malate dehydroganase)의 활성이 증가된 코리네박테리아 속 유래의 형질전환된 미생물인, 5'-크산틸산 생산 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 5'-크산틸산 생산능이 증가된 형질전환 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes)인, 5'-크산틸산 생산 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 수탁번호 제KCCM10972P호인, 5'-크산틸산 생산 방법.
  8. 삭제
  9. 말레이트 디하이드로게나아제 활성이 내재적 활성보다 증가되도록 형질전환되어 5'-크산틸산 생산능이 증가된 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes).
  10. 제9항에 있어서, 상기 코리네박테리움 암모니아게네스는 수탁번호 제KCCM10972P호인 코리네박테리움 암모니아게네스.
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