KR100837844B1

KR100837844B1 - Ｌ-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및이를 이용한 ｌ-글루탐산 생산 방법

Info

Publication number: KR100837844B1
Application number: KR1020060127852A
Authority: KR
Inventors: 이원식; 구현민; 양영렬; 조승준; 박영훈; 채수홍
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2006-12-14
Filing date: 2006-12-14
Publication date: 2008-06-13

Abstract

본 발명은 L-글루탐산 함량이 높은 아미노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 것을 특징으로 하는 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 그 미생물을 사용하여 L-글루탐산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-글루탐산, 코리네박테리움, 유전자 불활성화

Description

Ｌ-글루탐산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 Ｌ-글루탐산 생산 방법{Microoragnism of Corynbacterium genus with an enhanced L-glutamic acid productivity and method of producing L-glutamic acid using the microorganism}

도 1은 서열번호 1의 NCgl0032 유전자 단편 및 서열번호 2의 NCgl0825 유전자 단편이 클로닝된 재조합 벡터를 개략적으로 도시하는 도면이다.

본 발명은 L-글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 L-글루탐산의 생산방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 균주(Corynebacterium), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-글루탐산은 식품, 동물 사료 등에 사용되고 있으며 주로 코리네박테리움 균주의 발효에 의해 생성되고 있다. 이와 같이 코리네박테리움 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.

그 중에서 재조합 DNA 기술을 이용하여 특정유전자를 파괴시키거나 감쇄 발현시킴으로써 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 있었다. 예를 들면, 미국특허 제6,872,553호에는 a) 포스포에놀피루베이트 (PEP) 카르복시키나제 (pck)를 코딩하는 유전자가 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 넌센스 코돈의 삽입에 의한 전이(transition) 또는 전환(transversion) 돌연변이로 구성되는 군으로부터 선택되는 돌연변이 방법 중 하나의 방법에 의하여 그 발현이 감쇄되어 있거나, 감쇄되지 않은 코리네박테리움에 비하여 해당 산물(PEP pck)의 활성이 감소된 코리네박테리움을 배양하는 단계; b) 배지 또는 상기 박테리아의 세포 중에 원하는 L-아미노산 산물을 축적시키는 단계; 및 c) 상기 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 코리네박테리움의 배양에 의해 L-라이신을 생산하는 방법이 개시되어 있다.

또한, 각각의 L-아미노산 생합성에 관련된 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 수행되었다(Eggeling, Amino Acids 6, 261-272 (1994)). 다른 박테리아 유래의 외래 유전자를 도입하는 경우도 있다. 예를 들면, 일본 특개평 제7-121228호에는 미생물의 시트르산 신타제의 합성에 관여하는 유전 정보를 갖는 DNA 단편과 벡터 DNA의 재조합체 DNA를 보유하는 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속에 속하는 미생물을 배양하고, 배양물 중에 L-글루타민산 및 L-프롤린산을 제조하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기한 종래 방법에 의하더라도 여전히 L-글루탐산의 생산능이 향상 된 균주는 여전히 요구되고 있다.

L-글루탐산은 세포 내의 질소 대사의 중추적 대사체로서, 세포의 구성이나 단백질 합성의 단위체 또는 조절인자로서 작용한다. 세포 구성 단위체로서는 세포의 핵산, 아미노산 또는 지방질 합성에 사용되며, 단백질 합성의 단위체로서는 단백질의 구조나 주요 작용기로서 사용된다. 세포 내에서 세포의 생장, 유지 및 조절에 필수적이지 않은 비필수 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 구성하는데 L-글루탐산이 다량으로 사용되고 있다. 따라서, L-글루탐산 함량이 높은 비필수 단백질을 코딩하는 유전자를 제거하거나 불활성화시키면 그 유전자의 산물 합성에 소요되는 다량의 L-글루탐산의 불필요한 소비를 감소시키거나 제거할 수 있다. 즉 불필요한 L-글루탐산의 소비를 줄인다는 측면에서 궁극적으로는, 동일조건에서 L-글루탐산 생산에 유리하게 작용할 것으로 생각된다. 이에 본 발명자들은 L-글루탐산 함량이 높은 아미노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 유전자를 불활성화시켜 L-글루탐산의 생산수율이 증가된 코리네박테리움 속 미생물을 개발했다.

본 발명의 목적은 L-글루탐산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 L-글루탐산의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 L-글루탐산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-글루탐산 함량이 높은 아미 노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 L-글루탐산 함량이 높은 아미노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 유전자는 NCBI 기탁번호 NCgl0032(NCBI Gene ID:1021111:서열번호 8) 또는 NCgl0825(NCBI Gene ID:1018881:서열번호 9)의 서열을 갖는 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 게놈의 완전한 서열 분석으로부터 그 활성이 예측된 것으로서, 코딩하는 단백질의 아미노산 서열 중에 글루탐산 함량이 높다. NCgl0032의 서열을 갖는 유전자는 뉴클레오티드 서열은 밝혀져 있으나, 그 기능은 규명되지 않은 가상의 단백질이고, NCgl0825의 서열을 갖는 유전자는 막 단백질을 코딩하는 것으로 추정되고 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '비필수 단백질'이라는 용어는 미생물의 생장, 유지 및 조절과 같은 생존에 필수적인 기능을 수행하지 않으므로 발현되지 않거나 또는 그 발현량이 감소되어도 미생물에 큰 영향을 미치지 않는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, L-글루탐산 함량이 높은 아미노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 불활성화는 당업계에 알려진 임의의 불활성화 방법 에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명에 있어서, 유전자의 불활성화란 해당 유전자의 발현이 야생 균주에 비하여 낮은 수준으로 감소하거나 전혀 발현이 되지 않는 유전자 및 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소되어 있는 유전자가 생성되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 상기 불활성화는 상기 NCgl0032 또는 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내에 넌센스 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이 (transition) 또는 전환 (transversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 의하여 불활성화된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 미생물에 있어서 상기 불활성화는 상기 NCgl0032 또는 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자의 일부분과 항생제 머커를 포함하는 벡터를 코리네박테리움 속 미생물에 형질전환시키고, 상기 항생제의 존재하에서 배양하여 선발되는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 각각 NCgl0032의 서열을 갖는 유전자의 일부로서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖거나 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자의 일부로서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자 단편을 포함하는 pCR-△NCgl0032 또는 pCR-△NCgl0825 벡터일 수 있다. 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 상기 미생물에 형질전환하고, 선발 마커 하에서 배양하는 경우 상기 유전자의 일부 서열과 상기 미생물 내의 내재적 유전자와 상동 재조합을 일으킨다. 상기 상동 재조합에 의하여 상기 미생물의 게놈 상에 존재하는 상기 내재적 유전자는 벡터 상의 유전자와 재조합되고, 재조합체들 중에서 상기 마커를 포함하는 재조합체만이 선발 마커에 의하여 선발되게 된다. 그 결과, 내재적인 NCgl0032의 서열을 갖는 유전자 또는 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자가 파괴되어 그 발현이 불활성화된 코리네박테리움 속 미생물을 얻을 수 있다. 그러나, 본원의 균주를 얻는 방법은 이러한 상동 재조합 방법에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 유전자의 '파괴(disruption)'라는 용어는 유전자의 서열이 돌연변이 또는 외래 서열의 삽입에 의해 변형되어 원래 코딩하는 서열이 제대로 발현될 수 없게 된 상태를 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서, 'NCgl0032의 서열을 갖는 유전자'는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 10332 균주 유래의 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것뿐만 아니라, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물에 존재하는 유전자로서 상기 NCgl0032의 유전자 산물과 실질적으로 동일한 산물을 발현하는 유전자를 의미한다. 본 발명에서 'NCgl0032 유전자'라는 용어는 'NCgl032의 서열을 갖는 유전자'와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, '실질적으로 동일'이란 NCgl0032 유전자 산물과 동일한 종류의 활성 및 조절 기작을 갖는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 NCgl0032의 서열을 갖는 유전자는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자이다.

또한, 본 발명에 있어서, 'NCgl0825의 서열을 갖는 유전자'는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 10332 균주 유래의 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것 뿐만 아니라, 코리네박테리움 속에 속하는 미생물에 존재하는 유전자로서 상기 NCgl0825의 유전자 산물과 실질적으로 동일한 산물을 발현하는 유전자를 의미한다. 본 발명에서 'NCgl0825 유전자'라는 용어는 'NCgl0825의 서열을 갖는 유전자'와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, '실질적으로 동일'이란 NCgl0825 유전자 산물과 동일한 종류의 활성 및 조절 기작을 갖는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자이다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 미생물은 NCgl0032의 서열을 갖는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0016(수탁번호 KCCM 10808)이다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 미생물은 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자가 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0017(수탁번호 KCCM 10809)이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 미생물을 배양하여 배양물 또는 세포 중에 L-글루탐산을 생산하는 단계; 및

배양물로부터 L-글루탐산을 회수하는 단계를 포함하는, L-글루탐산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다. 코리네박테리움 속 균주 배양을 위하여 사용될 수 있는 배지로는 예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)에 개시된 배지가 사용될 수 있다. 배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 맥아당, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 바람직하게는, 10 내지 160 시간이다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양은 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 임의의 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 L-글루탐산을 생산하는 방법은 L-글루탐산 생산능을 갖는 코리네박테리움을 배양하여 수득한 배양물로부터 L-글루탐산을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, L-글루탐산의 회수는 배양액의 여과 및 결정화 과정을 포함하는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의하여 분리되고 분석될 수 있다(Spackman et al., Analytical Chemistry 30(1958), 1190).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전체 내에서 L- 글루탐 산 코돈을 다량 포함하는 유전자의 선정

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032을 모균주로 하여 글루탐산 함량이 높은 비필수 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화된 균주를 개발하기 위해, 모균주 내의 글루탐산을 다량으로 사용하는 유전자를 찾기 위해 각 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열(NCBI 등록번호: BA000036)을 분석하였다. 야생주에서 L-글루탐산을 다량으로 사용하는 유전자는 표 1과 같다.

표 1. 글루탐산 함량이 높은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자

유전자	기능	L-글루탐산 함량
NCgl0825	막 단백질	10%
NCgl0032	가상의 단백질	16.3%
NCgl2126	디히드로리포아미드 아세틸트랜스퍼라아제	12.3%
NCgl1090	가상의 단백질	13.1%
NCgl0458	전사종결 억제 단백질	13.2%
NCgl1494	가상의 단백질	8.9%
NCgl0836	DNA를 주형으로 하는 RNA 중합효소	6.7%
NCgl2150	추정적인 피리독신 생합성 효소	12.5%

표 1의 L-글루탐산이 다량으로 포함된 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 중, 글루탐산 함량이 높으며 글루탐산이 연속적으로 배열된 NCgl0032(NCBI GeneID:1021111)와 NCgl0825(NCBI Gene ID:1018881)를 본 발명의 미생물을 개발하기 위한 불활성화 대상으로 선정하였다.

실시예 2: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 유래 NCgl0032 또는 NCgl0825 유전자 파괴용 재조합벡터 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032 균주의 NCgl0032(NCBI Gene ID:1021111) 유전자 또는 NCgl0825 유전자(NCBI Gene ID:1018881)를 제거하기 위하여, 상기 유전자의 중간 부분만을 증폭하여 양끝부위가 제거된 단편을 게놈 상의 NCgl0032 또는 NCgl0825 서열을 갖는 유전자와 재조합시킴으로써 즉, 벡터 및 NCgl0032 또는 NCgl0825 단편의 삽입에 의해 NCgl0032 또는 NCgl0825 유전자의 발현을 불활성화시키고자 하였다.

우선 NCgl0032 또는 NCgl0825의 각각 465bp, 717bp의 염기서열만을 증폭하여 NCgl0032 단편(서열번호 1) 또는 NCgl0825 단편(서열번호 2)을 제작하기 위해, NCgl0032 및 NCgl0825의 서열을 근거로 각각 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍 및 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머 쌍을 제작하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC 13032)의 염색체 DNA를 주형으로 하고 각각 서열번호 3과 서열번호 4의 프라이머 쌍 및 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄반응법(PCR)(PCR 조건: 변성=96℃, 30초/어닐링=48℃, 30초/중합=72℃, 30초, 30회)으로 NCgl0032 단편 또는 NCgl0825 단편을 증폭한 후, TOPO Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1(Invitrogen)에 클로닝하여 도 1과 같이 각각 pCR-△NCgl0032 또는 pCR-△NCgl0825를 획득하였다.

실시예 3: L-라이신 생산 코리네박테리움에서의 NCgl0032 또는 NCgl0825 유 전자 파괴 확인

실시예 1에서 제작한 pCR-△NCgl0032 또는 pCR-△NCgl0825를 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC 13032)에 전기펄스법으로 형질전환한 후(Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신(kanamycin) 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환균주를 획득하였다. 1차 재조합과정(cross-over)으로 게놈상으로 삽입된 pCR-△NCgl0032 또는 pCR-△NCgl0825에 의하여 NCgl0032 또는 NCgl0825 유전자가 파괴된 균주를 획득하였다(ATCC13032/△0032, ATCC13032/△0825).

유전자 NCgl0032 또는 NCgl0825의 파괴여부는 연쇄중합법(PCR법)(PCR 조건: 변성=96℃, 30초/어닐링=48℃, 30초/중합=72℃,600초, 30회)으로 확인하였다. 유전자 NCgl0032 파괴확인을 위해 서열번호 3과 pCR2.1내의 서열에 대한 서열번호 7의 프라이머를 사용하고 유전자 NCgl0825 파쇄 확인을 위해서는 서열번호 4와 서열번호 7의 프라이머를 사용하였다.

한편, NCgl0032 또는 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자가 파괴된 균주로 확인된 상기 ATCC13032/△NCgl0032 , ATCC13032/△NCgl0825를 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0016과 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0017로 명명한 후 2006년 12월 6일 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 10808 및 KCCM 10809를 부여받았다.

실시예 4: NCgl0032 또는 NCgl0825 유전자가 파괴된 균주에서의 L-글루탐산 생산

실시예 3에서와 같이 알라닌 요구성을 갖는 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0016 (KCCM 10808)와 코리네박테리움 CO01-0017 (KCCM 10809)를 L-글루탐산 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 ATCC13032와 본 발명의 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0016 (KCCM 10808) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0017 (KCCM 10809)를 각각 접종하고 30℃에서 20시간 동안 진탕배양(200 rmp)하였다. 하기의 생산배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 각각 접종하고 30℃에서 40시간 동안 진탕배양(200 rpm)하였다. 배양 종료 후 아미노산 분석기에 의해 L-글루탐산의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 와 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0016 (KCCM 10808) 및 코리네박테리움 CO01-0017 (KCCM 10809)에 대한 배양물 중의 L-글루탐산에 대한 결과는 아래 표 2와 같다.

표 2.

균주	L-글루탐산
ATCC13032	7g/L
CO01-0016	8g/L
CO01-0017	8.5g/L

종배지 ( pH 7.0)

: 원당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 5g, 요소 1.5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄·7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니 코틴 아마이드 2000㎍ (공정수 1리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

: 포도당 30g, (NH₄)·2SO₄ 1g, 콩 단백질(Soy Protein) 2.5g, 요소 5g, KH₂PO₄ 1g, MgSO₄ ㆍ7H₂O 0.2g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 100㎍, K₂HPO₄ 1g, MnSO₄ 10mg(공정수 1리터 기준)

상기의 표 2에서와 같이, 유전자 NCgl0032의 파괴균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0016 (KCCM 10808) 및 NCgl0825의 파괴균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CO01-0017 (KCCM 10809)의 경우 모균주 ATCC13032에 비해 글루탐산 생산이 현저히 증가되었다.

본 발명의 미생물에 의하면, L-글루탐산 함량이 높은 아미노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되어 있어 L-글루탐산의 생산성이 향상되었다.

본 발명의 방법에 의하면, L-글루탐산을 높은 생산성으로 생산할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

L-글루탐산 함량이 높은 아미노산 서열의 비필수 단백질을 코딩하는 NCgl0032의 서열(서열번호 8)을 갖는 유전자 또는 NCgl0825의 서열(서열번호 9)을 갖는 유전자가 불활성화된 것을 특징으로 하는 L-글루탐산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 불활성화는 상기 유전자 내로 하나 이상의 염기쌍의 삽입에 의한 삽입 돌연변이, 상기 유전자 내의 하나 이상의 염기쌍의 결실을 갖는 결실 돌연변이, 및 상기 유전자 내로 넌센스 코돈을 도입시키는 염기쌍의 전이(transition) 또는 전환(trasnversion) 돌연변이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이에 의해 이루어지는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제2항에 있어서, 상기 불활성화는 상기 유전자의 일부분과 항생제 마커를 포함하는 재조합 벡터로 상기 미생물을 형질전환시켜서 수행되는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제3항에 있어서, 상기 유전자의 일부분은 NCgl0032의 서열을 갖는 유전자의 일부로서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 10808인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제3항에 있어서, 상기 유전자의 일부분은 NCgl0825의 서열을 갖는 유전자의 일부로서, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제6항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 10809인 것인 코리네박테리움 속 미생물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-글루탐산의 생산방법.