CN1305009A - 用棒状细菌经发酵生产l－氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产L－氨基酸的方法,其中进行以下步骤:a)发酵所需生产L－氨基酸的棒状细菌,该细菌中至少glyA基因是弱化的,特别是通过除去天然启动子而弱化的,b)浓缩培养基或细菌细胞中所需产物,和c)分离L－氨基酸,任选地所用细菌中所需L－氨基酸的生物合成途径的其它基因是额外扩增的,或所用细菌中降低所需L－氨基酸生成的代谢途径至少被部分关闭。本发明还涉及lacI－tac－5’glyA或lacI－tac－glyA单元的核苷酸序列。

Description

用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸的方法

本发明涉及用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸，尤其L-苏氨酸的方法，其中棒状细菌中glyA基因是弱化的。

L-氨基酸用于动物营养，人用药物及制药工业。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法。以此方式获得对抗代谢产物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)有抗性，或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸如苏氨酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于谷氨酸棒杆菌生产L-氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究其对L-氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，Benjamin Cummings,英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。

本发明目的在于为改良用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸的方法提供新措施。

L-氨基酸用于人用药物及制药工业，食品工业，特别是动物营养。因而提供生产L-氨基酸的新改良方法总是令人感兴趣的。

下文提及L-氨基酸时，指L-苏氨酸或L-异亮氨酸。

本发明提供了一种用棒状细菌发酵生产L-氨基酸的方法，此棒状细菌中至少编码glyA基因产物的核苷酸序列(glyA基因)是弱化的，尤其低水平表达，所需产物在培养基或细胞中浓缩，并分离L-氨基酸。

所用菌株优选在glyA基因弱化之前已产生L-氨基酸。

优选的实施方案见于权利要求。

术语“弱化”是指微生物中由相应DNA(在此为glyA基因)编码的一或多种酶(蛋白质)胞内活性的降低或消除，例如通过用弱启动子，或用编码低活性酶(蛋白质)的基因或等位基因，或失活相应基因或酶，及任选地组合使用这些方法。

本发明的微生的可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜，淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸。此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。

适当的棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC13032

醋谷棒杆菌ATCC15806

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870

Corynebacterium melassecola ATCC17965

嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539

黄色短杆菌ATCC14067

乳发酵短杆菌ATCC13869和

扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变体或菌体，例如生产L-苏氨酸的菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC21649

黄色短杆菌BB69

黄色短杆菌DSM5399

乳发酵短杆菌FERM-BP269

乳发酵短杆菌TBB-10和例如生产L-异亮氨酸的菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC14309

谷氨酸棒杆菌ATCC14310

谷氨酸棒杆菌ATCC14311

谷氨酸棒杆菌ATCC15168

产氨棒杆菌ATCC6871

技术人员已发现在glyA基因弱化之后，棒状细菌以改良生产L-氨基酸。

glyA基因编码丝氨酸羟甲基转移酶(EC2.1.2.1)。glyA基因的核苷酸序列已由日本特许公开JP-A-08107788阐述。根据本发明可使用该参考文献阐述的glyA基因。另外还可使用得自遗码密码的简并，或中性功能的有义突变的glyA基因的等位基因。

为获得弱化，可降低或消除glyA基因的表达或基因产物的催化性质。可任选组合这二种措施。

通过对基因表达信号结构的遗传修饰(突变)或通过适当培养可降低基因表达。基因表达的信号结构例如是阻抑物基因，激活物基因，操纵子，启动子，弱化子，核糖体结合位点，起始密码子及终止子。本领域技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见如专利申请WO96/15246,Boyd和Murphy(细菌学杂志170:5949(1988)),Voskuil和Chambliss(核酸研究26:3548(1998)),Jensen和Hammer(生物技术及生物工程学58:191(1998)),Patek等(微生物学142:1297(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材，如由Knippers所著教材(分子遗传学，第6卷，Georg Thieme Verlag,Stuttgart,德国，1995)或由Winnacker所著教材(基因与克隆，VCH Verlagsgeselschaft,Weinheim,德国，1990)。

现有技术已知导致酶蛋白催化性质改变或降低的突变，可提及的例如Qiu和Goodman(生物化学杂志272:8611-8617(1997)),Sugimoto等(生物科学生物技术及生物化学61:1760-1762(1997))，及Mockel(谷氨酸棒杆菌的苏氨酸脱水酶：删除酶的别构调节和结构，Julich研究中心报告，Jul-2906,ISSN09442952,Julich,德国，1994)。在遗传及分子生物学的已知教材例如由Hagemann所著教材(普通遗传学，Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1986)中可发现相关综述。

可能的突变是转换、颠换、插入及缺失。依于氨基酸置换对酶活性的影响，指作错义突变或无义突变。基因中至少一个碱基对的插入或缺失导致移码突变，这是由于不正确氨基酸被掺入或翻译被过早中断。一些密码子的缺失典型地导致酶活性的完全丧失。目前已知这种突变产生的方法，并可见于已知遗传及分子生物学的教材，例如由Knippers所著教材(分子遗传，第6卷，Georg Thieme Verlag,Stuttgart,德国，1995),由Winnacker所著教材(基因与克隆，VCHVerlagsgesellschaft,Weinheim,德国，1990)或由Hagemann所著教材(普通遗传学，Gustav Fischer Verlag,Stutgart,1986)。

例如，glyA基因的弱化可通过除去天然启动子并插入位于上游的可调节控制元件而进行。lacⅠ-tac系统被用作控制元件。为将lacⅠ-tac系统掺入染色体glyA基因的上游，制备整合质粒pK18mobglyA’(图1)。质粒pKl8mobglyA’含有tac启动子(Amann等，基因25:167-178(1983)；De Boer等，美国科学院院报80:21-25(1983))，和位于tac启动子直接下游的SEQ ID NO:1所示的glyA基因5’末端序列。此质粒还含有编码Lac抑制物的lacⅠ基因(Farabaugh，自然274:765-769(1978):Stark等，基因51:255-267(1987))。lacⅠ-tac-5’glyA单元的序列示作SEQ ID NO:2。质粒pKl8mobglyA’能在大肠杆菌而不能在谷氨酸棒杆菌中复制。转化及通过实现整合的“交换”事件而同源重组之后，可以获得glyA基因的完整拷贝，其表达可由上游lacⅠ-tac控制元件控制和调节，及获得在3’末端截短的包括天然启动子的glyA基因的失活拷贝。lacⅠ-tac-glyA单元的序列示作SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4示出已知glyA基因产物的氨基酸序列。通过加入适当浓度的乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(Furste等，基因48:119-131(1986)),glyA基因的表达可被控制，或丝氨酸羟甲基转移酶的细胞含量可被弱化或调节。

其它关于整合诱变的阐述例如见于Schwarzer和Puhler(生物/技术学9,84-87(1991)),Peters-Wendish等(微生物学144,915-927(1998))或Fitzpatrick等(应用微生物学生物工程42,575-580,(1994))。

具有弱化的glyA基因的棒状细菌的生产氨基酸的菌株例如是生产苏氨酸的黄色短杆菌DM368-2::pK18mobglyA’。

另外，除弱化glyA基因之外，扩增特定生物合成途径，糖酵解，回补代谢，柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶，对氨基酸的生产可以是有益的。

这样，例如为制备L-苏氨酸：

·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2,63-72(1988))或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的hom^dr等位基因(Archer等,基因107,53-59(1991)),和/或

·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns等，细菌学杂志174:6076-6086(1992))，或

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144:915-927(1998))，或

·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254,395-403(1988))，或

·编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因(DE 19941478.5；DSM 12840)可以同时过表达。

为生产氨基酸，除glyA基因之外，同时弱化

·编码烯醇丙酮酸磷酶羧激酶的pck基因(DE 19950409.1,DSM13047)和/或

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE 19951975.7；DSM 13114)也可以是有益的。

最后，除弱化glyA基因之外，排除非所需二级反应对氨基酸的生产也是有益的(Nakayama:“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphahzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。

所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿特区，美国，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。所述起始物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。

可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气如空气，可充入培养基中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃-45℃，优选25℃-40℃，持续培养直至氨基酸形成最大量。此目的通常在10-160小时范围达到。

本领域目前已知确定L-氨基酸的方法。可如Spackman等所述(分析化学30(1958),1190)通过阴离子交换层析，随后茚三酮衍生化作用进行分析，或通过例如由Lindroth等(分析化学(1979)51:1167-1174)所述的反相HPLC进行分析。

以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：

·大肠杆菌DH5αmcr/pK18mobgly A’，保藏号DSM 13170。

本发明借助于以下提供的实施例得以更详细阐述。

通过Sambrook等所述方法(分子克隆实验手册(1989)Cold SpringHarbour Laboratory Press)，进行从大肠杆菌中分离质粒DNA，及所有限制消化，Klenow及虾碱性磷酶处理。除非另外阐述，通过Chung等方法进行大肠杆菌的转化(美国科学院院报(1989)86:2172-2175)。

实施例1：谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的glyA基因的克隆与测序

将glyA基因克隆入大肠杆菌克隆载体pUC18(Norrander等，基因(1983)26:101-106,Roche Diagnostics，德国曼海姆)中。以两步进行克隆。首先用衍生自日本特许公开JP-A-08107788的以下寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增谷氨酸棒杆菌ATCC13032的该基因。

glyA1-正向：5’-GCT TGC AGC GTT TTG CTC TGC C-3’

glyA-反向：5’-ACC CGT AAC CTC TTC CAC ATA GG-3’

在存在200μM三磷酸脱氧核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)情况下，将PCR进行30循环，在Themo循环仪(PTC-100,MJ Research公司，Watertown,美国)中，以如下条件：94℃30秒，64℃1分钟，68℃3分钟进行循环。每种情况下反应物为1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体DNA，1/10体积的10倍反应缓冲液和2.6单位热稳定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(Expand HighFidelity PCR System from Roche Diagnostics，德国曼海姆)。

然后将大约1.7kb大小的扩增的片段，借助于SureClone连接试剂盒(Amersham Phamacia Biotech,Uppsala,Sweden)根据厂商指导连于载体pUC18的SmaⅠ切割位点。用全部连接混合物转化大肠杆菌DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)87:4645-4649)。根据其在含50μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上对羧苄青霉素抗性鉴别转化体。从7个转化体中制备质粒，并通过限制性分析检测作为插入体的1.7kb的PCR片段的存在与否。以此方式形成的重组质粒在以下被称为pUC18glyA。

质粒pUC18glyA中的1.7kb的PCR片段的核苷酸序列通过Sanger等的二脱氧链终止法(美国科学院院(1977)74:5463-5467)进行测定。为此，借助于以下引物对pUC18glyA的完整插入片段测序。

通用引物：5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’

反向引物：5’-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3’

所得核苷酸序列用Lasergene程序包(Biocomputing Software forWindows,DNASTAR,Madison,USA)进行分析。分析结果鉴定出一长度为1302bp的开放读框。相应基因被称为glyA基因。相关基因产物含有434个氨基酸，并以SEQ ID NO:4所示。

实施例2：构建降低glyA表达的载体

用限制性内切酶EcoRⅠ和TfiⅠ，从实施例1中所述的质粒pUC18glyA中酶切下大小为1418bp的DNA片段，该片段含有无自身启动子区域的glyA基因。用Klenow酶处理该片段的5’和3’末端。将所得DNA片段连于预先用BamHⅠ线性化的载体pVWEx2中。用Klenow酶处理并去磷酸化。(Wendish,谷氨酸棒杆菌的野生型菌株和重组菌株中，中心代谢途径体内活性的生理学及NMR光谱学分析，Julich研究中心报告，Jul-3397,ISSN09442952,Julich,德国，1997)，这样glyA基因以相同方向直接位于载体tac启动子之后，该启动子可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。大肠杆菌DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)87:4645-4649)用全部连接混合物转化。通过在含有15μg/ml四环素的LB琼脂平板上其对四环素抗性鉴别转化体。从12个转化体中制备质粒，并通过限制性分析检测相对于tac启动子以正确方向插入的1418bp的片段的存在与否。以此方式形成的重组质粒在以下被称为pVWEx2glyA。

然后利用以下寡核苷酸引物，通过PCR从质粒pVWEx2glyA中扩增一DNA片段，该片段含有tac启动子阻抑物基因lacⅠ,tac启动子和克隆的谷氨酸棒杆菌glyA基因头438bp。

glyA2-正向(划线处为附加的EcoRⅠ识别序列)

5’-CCG GAA TTC TCA CTG CCC GCT TTC CAG TC-3’

glyA2-反向(划线处为附加的BamHⅠ识别序列)

5’-CGG GAT CCC AGC TTT CCG GAG AAG TTC AAC-3’

在存在200μM三磷酸脱氧核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)下将PCR进行30循环，每次反应物为1μM相应寡核苷酸，100ngpVWEx2glyA的质粒DNA,1/10体积的10倍反应缓冲液及2.6单位的热稳定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(Expand High Fidelity PCRSystem from Roche Diagnostics,德国曼海姆)，在Thermo循环仪(PTC-100,MJ研究公司，Watertown,美国)中以以下条件进行：94℃30秒，58℃30秒，72℃2分钟。

随后将大小大约为2.0kb的扩增的片段用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，并用Macherey-Nagel公司(Duren,德国)的NucleoSpin提取2合1试剂盒，根据厂商指导分离，然后连于已用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切并去磷酸化的载体pK18mob中(Schafer等，基因(1994)145:69-73)。大肠杆菌DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)87:4645-4649)用全部连接混合物转化。通过在含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上其对卡那霉素的抗性鉴别转化体。从12个转化体中制备质粒，并通过限制性分析检测作为插入体的2.0kb的PCR片段的存在与否。以此方式形成的重组质粒在以下被称为pK18mobglyA’(见图1)。

实施例3：构建具有降低的，可调节的glyA表达的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032::pK18mobglyA’

通过电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61:329-334)，将空白对照载体pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64:549-554)及实施例2所述质粒pK18mobglyA’导入谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC13032(Abe等，普通及应用微生物学(1967)13:279-301)。

在用pZ1转化之后，通过在含15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65:299-304)上其对卡那霉素的抗性鉴别转化体。从3个转化体制备质粒，并通过限制性分析检测pZ1空白对照载体的存在是否。以此方式形成对照菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pZ1。

在用pK18mobglyA’转化之后，通过glyA克隆的5’末端的同源重组，将质粒整合入谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体中。将所得的卡那霉素抗性克隆在含15μg/ml卡那霉素和1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LBHIS琼脂上鉴别(Liebl等，FEMS微生物学(1989)65:299-304)。利用以下寡核苷酸引物，通过PCR在2个所得整合突变体中检测染色体中pK18mobglyA’的正确整合。

反向引物(RSP):5’-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3’

glyA2-反向:5’-CGG GAT CCC AGC TTT CCG GAG AAG TTCAAC-3’

在Thermo循环仪中(PTC-100，MJ研究公司，Watertown，美国)，以下列条件：94℃30秒，48℃30秒，72℃2分钟，将PCR在存在200μM三磷酸脱氧核苷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)情况下进行30循环，每次反应物为1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC13032::pK18mobglyA’的染色体DNA,1/10体积的10倍反应缓冲液及2.6单位热稳定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(ExpandHigh Fidelity PCR System from Roche Diagnostics,德国曼海姆)。以此方式形成谷氨酸棒杆菌ATCC13032::pK18mobglyA’,其中glyA基因是在tac启动子控制下，该启动子可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。

实施例4：检测谷氨酸棒杆菌ATCC13032::pK18mobglyA’中由glyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶活性

为获得待检测的由glyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶的粗制提取物，将实施例3中所述的谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pZ1和谷氨酸棒杆菌ATCC13032::pK18mobglyA’,在具有25μg/ml卡那霉素和100μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的100ml脑心浸液培养基(Difco Laboratories,Detroit,USA)中，在30℃预培养14小时。然后用0.9％(w/v)氯化钠溶液将细胞冲洗一次，并用此悬液接种100mlCgⅫ培养基，以使OD₆₀₀(测量波长为600nm的光密度)为0.5。此培养基与Keilhauer等所述培养基(细菌学杂志(1993)175:5593-5603)相同，但额外含有25μg/ml卡那霉素和0,10或100μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。Keilhauer等所述培养基组分见表1。

表1 CGⅫ培养基组分

组分	浓度
		(NH4)2SO4	20g/l
尿素	5g/l
		KH2PO4	1g/l
K2HPO4	1g/l
		MgSO4×7H2O	0.25g/l
3-吗啉代丙磺酸	42g/l
		CaCl2	10mg/L
FeSO4×7H2O	10mg/L
		MnSO4×H2O	10mg/L
ZnSO4×7H2O	1mg/L

CuSO4	0.2mg/L
		NiCl2×6H2O	0.02mg/L
生物素	0.2mg/L
		葡萄糖	40g/L
原儿茶酸	30mg/L

在30℃培养这两个菌株。10小时之后，用4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸/NaOH缓冲液(PH7.0)将细胞冲洗一次，离心(用Heraeus,Osterode,德国的Minifuge RF,以每分钟5000转离心10分钟)，并重悬浮于200mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸/NaOH缓冲液(PH7.0)中，这样终体积为5ml。向此细胞悬浮液加入50ul 2mM吡哆醛-5-磷酸溶液和50μl 100mM二硫苏糖醇溶液，并将细胞破碎。通过超声破碎器在0℃将细胞破碎(Branson Sonifier W-250,BransonSonic Power Co.,Danbury，美国；超声时间6分钟，脉冲长100％，超声强度2.5)。在超声处理之后，离心分离出细胞碎片(在Sigma-Aldrich,Deisenhofen，德国的可冷却Sigma 202MK离心机中，在4℃以13000转/分，离心30分钟)。上清液直接用作测定酶活性的无细胞粗提物。

无细胞粗提物中蛋白质的测定通过Bensadoun和Weinstein的方法(分析生物化学(1976)70:241-250)经分光光度法进行。在此蛋白质含量的测定通过用胎牛血清白蛋白作标准描绘的校正曲线进行。

为测定无细胞粗提物中丝氨酸羟甲基转移酶活性，使用非连续酶测试，其中从苏氨酸底物形成的甘氮酸被定量。将以下组分的反应物在37℃保温15分钟(根据Scrimgeour和Huennekens酶学方法(1962)，第5卷，838-843，学术出版社，加以修改)：20mM苏氨酸，200μM吡哆醛-5-磷酸，900μM四氢叶酸，100mM4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸/NaOH缓冲液(PH7.0)和1.0-1.5mg蛋白质(取自粗提物)，终体积为1ml。通过加入0.25体积25％(w/v)三氯乙酸溶液终止反应，将混合物在0℃保温15分钟，并将变性蛋白质离心除去(在Sigma-Aldrich,Deisenhofen，德国的冷冻Sigma 202MK离心机中，以13000转/分在4℃离心15分钟)。在酶测试中从底物生成的甘氨酸的定量测定通过反相HPLC(Lindroth等，分析化学(1979)51:1167-1174)进行。使用与荧光检测仪(G1321A)相连的HP1100系列的HPLC装置(Hewlett-Packard，Waldbronn，德国)，用HP-Chem-Station(Hewlett-Packard)控制系统并评价数据。将1μl被分析的氨基酸溶液与20μL正邻苯二醛/2-巯基乙醇现成试剂(Pierce EuropeBV,Oud-Beijerland，荷兰)在一自动前置柱中混合而衍生化。将形成的荧光硫代异吲哚(Jones等，层析学杂志(1983)266:471-482)用升高的非极性相(甲醇)梯度程序从组合的前置柱(40×4mm Hyper silODS5)和主柱(Hypersil ODS 5，两柱均得自CS-CheomatographieService GmbH,Langerwehe，德国)中分离。极性洗脱液为乙酸钠(0.1摩尔，PH7.2)；流速为每分钟0.8ml。衍生的氨基酸的荧光检测在激发波长为230nm且发射波长450nm时进行。通过与外部标准及作为附加的内部标准的天冬酰胺相对比，计算甘氨酸浓度。

用苏氨酸作底物的酶测试结果列于表2。

表2

菌株	IPTG浓度(μM)	丝氨酸羟甲基转移酶活性(nmol甘氨酸/分/mg蛋白质)
			ATCC13032/pZ1	0	0.9
ATCC13032::pK18mobglyA’	0	0.3
			10	0.7
	100	1.6

实施例5 构建具有降低的可调节的glyA表达的黄色短杆菌DM368-2::pK18mobglyA’

通过电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61:329-334)，将实施例2所述的对照载体pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64:549-554)及质粒pK18mobglyA’导入产生苏氨酸的黄色短杆菌菌株DM368-2中。菌株DM368-2是在EP-B-0 385 940中阐述的，并以保藏号DSM5399保藏。

在用pZ1转化之后，通过在含有15μg/ml卡那霉素的LBHIS琼脂平板上(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65:299-304)对卡那霉素的抗性鉴别转化体。从3个转化体中制备质粒，并通过限制性分析检测pZ1空白对照载体的存在与否。以此方式形成对照菌株黄色短杆菌DM368/pZ1。

在用pK18mobglyA’转化之后，通过克隆的glyA的5’末端的同源重组，将质粒整合入黄色短杆菌DM368-2的染色体中。将所得卡那霉素抗性克隆在含有15μg/ml卡那霉素和1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LBHIS-琼脂平板上(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65:299-304)加以鉴别。通过如实施例3中已述的聚合酶链反应(PCR)，用100ng黄色短杆菌DM368-2::pK18mobglyA’的染色体DNA作模板，检测4个所得整合突变体中染色体中pK18mobglyA’的正确整合。以此方式形成菌株黄色短杆菌DM368-2::pK18mobglyA’,其中glyA基因在tac启动子的控制下，此tac启动子可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)诱导。

实施例6测定菌株黄色短杆菌DM368-2::pK18mobglyA’中，由glyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶的活性

如实施例4所述，获得粗提物，以测定实施例5所述菌株黄色短杆菌DM368-2/pZ1和黄色短杆菌DM368-2::pK18mobglyA’中，由glyA编码的丝氨酸羟甲基转移酶的活性。如实施例4所述类似地进行所得无细菌粗提物中蛋白质测定及非连续酶测试，其中生成自苏氨酸底物的甘氨酸被定量。

用苏氨酸作底物的酶测试结果列于表3。

表3

菌株	IPTG浓度(μM)	丝氨酸羟甲基转移酶活性(nmol甘氨酸/分/mg蛋白质)
			DM368-2/pZ1	0	1.6
DM368-2::pK18mobglyA’	0	＜0.1
			10	0.8
	100	1.7

实施例7用黄色短杆菌生产L-苏氨酸

为评价其苏氨酸生成力，将实施例5中所述菌株黄色短杆菌DM368-2/pZ1和DM368-2::pK18mobglyA’在30℃，在100ml具有25μg卡那霉素/ml和100μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)的脑心浸液培养基(Difco Laboratories,Detroit,美国)中，预培养14小时。然后将细胞用0.9％(w/v)氯化钠溶液冲洗一次，并用此悬液接种60ml CgⅫ培养基，以使OD₆₀₀(在600nm的光密度)为0.5。此培养基与Keilhauer等所述培养基(细菌学杂志(1993)175:5593-5603)相同，但额外含有25μg卡那霉素/ml和0,10或100μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的(IPTG)。

在30℃，将此两个菌株培养72小时。在48和72小时之后，取样并短时离心除去细胞(用Heracus,Osterode，德国的Biofuge Pico离心机，以13000转/分离心5分钟)。

通过反相HPLC(Lindroth等，分析化学(1979)51:1167-1174)如实施例4所述，进行培养基上清液中胞外氨基酸浓度的定量测定。通过与外部标准及作为额外内部标准的天冬酰胺相对比，计算苏氨酸浓度。

结果列于表4。

表4

菌株	IPTG浓度	L-苏氨酸(g/l)
				μM	48小时	72小时
	DM368-2/pZ1	0	1.27				1.32
DM368-2::pK18mobglyA’				10	1.32	1.44
	0	1.41	1.60

本发明有如下附图：

图1：质粒pK18mobglyA’图，长度数据应知为近似值

所用缩写和符号意义如下：

BamHⅠ：解淀粉芽孢杆菌的限制性内切酶

BglⅡ：枯草芽孢杆菌的限制性内切酶

BstEⅡ：嗜热脂肪芽孢杆菌的限制性内切酶

EcoRⅠ：大肠杆菌的限制性内切酶

EcoRⅤ：大肠杆菌的限制性内切酶

HindⅢ：流感嗜血杆菌的限制性内切酶

SacⅠ：不产色链霉菌的限制性内切酶

kan：卡那霉素抗性基因

lacⅠ^q:tac启动子Ptac的阻抑物基因

Ptac：tac启动子

glyA’：丝氨酸羟甲基转移酶的5’部分

glyA2-反向：检测整合的引物

RSP：检测整合的反向标准引物

序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司于利希研究中心有限公司<120>用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸的方法<130>990200 BT<140><141><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>438<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌 ATCC13032<220><221>N_区<222>(1)..(438)<223>5’glyA<400>1atgaccgatg cccaccaagc ggacgatgtc cgttaccagc cactgaacga gcttgatcct 60gaggtggctg ctgccatcgc tggggaactt gcccgtcaac gcgatacatt agagatgatc 120gcgtctgaga acttcgttcc ccgttctgtt ttgcaggcgc agggttctgt tcttaccaat 180aagtatgccg agggttaccc tggccgccgt tactacggtg gttgcgaaca agttgacatc 240attgaggatc ttgcacgtga tcgtgcgaag gctctcttcg gtgcagagtt cgccaatgtt 300cagcctcact ctggcgcaca ggctaatgct gctgtgctga tgactttggc tgagccaggc 360gacaagatca tgggtctgtc tttggctcat ggtggtcact tgacccacgg aatgaagttg 420aacttctccg gaaagctg                                               438<210>2<211>2000<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述lacⅠ-tac-5’glyA<220><221>基因<222>互补((6)..(1097))<223>lacⅠ<220><221>启动子<222>(1391)..(1434)<223>tac<220><221>N_区<222>(1562)..(1999)<223>5’glyA<400>2aattctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 60gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 120agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 180cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt tgacggcggg 240atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 300cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 360agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 420atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 480ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 540gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 600tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 660acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 720atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 780ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 840atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 900agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 960gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc 1020acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact 1080ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga 1140aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg taaatgcatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg 1200aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc 1260agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc 1320tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca 1380aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg 1440agcggataac aatttcacac aggaaacaga attaaaagat atgaccatga ttacgccaag 1500cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcattcgtct tgtgaaaggt tagctgacct 1560gatgaccgat gcccaccaag cggacgatgt ccgttaccag ccactgaacg agcttgatcc 1620tgaggtggct gctgccatcg ctggggaact tgcccgtcaa cgcgatacat tagagatgat 1680cgcgtctgag aacttcgttc cccgttctgt tttgcaggcg cagggttctg ttcttaccaa 1740taagtatgcc gagggttacc ctggccgccg ttactacggt ggttgcgaac aagttgacat 1800cattgaggat cttgcacgtg atcgtgcgaa ggctctcttc ggtgcagagt tcgccaatgt 1860tcagcctcac tctggcgcac aggctaatgc tgctgtgctg atgactttgg ctgagccagg 1920cgacaagatc atgggtctgt ctttggctca tggtggtcac ttgacccacg gaatgaagtt 1980gaacttctcc ggaaagctgg                                             2000<210>3<211>2866<212>DNA<213>合成序列<220><223>合成序列描述：lacⅠ-tac-glyA<220><221>基因<222>互补((6)..(1097))<223>lacⅠ<220><221>启动子<222>(1391)..(1434)<223>tac<220><221>CDS<222>(1562)..(2863)<223>glyA<400>3aattctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 60gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 120agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 180cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt tgacggcggg 240atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 300cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 360agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 420atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 480ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 540gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 600tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 660acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 720atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 780ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 840atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 900agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 960gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc 1020acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact 1080ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga 1140aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg taaatgcatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg 1200aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc 1260agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttc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1               5                  10                  15gag ctt gat cct gag gtg gct gct gcc atc gct ggg gaa ctt gcc cgt    1657Glu Leu Asp Pro Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Glu Leu Ala Arg

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        100                 105                 110ctg atg act ttg gct gag cca ggc gac aag atc atg ggt ctg tct ttg    1945Leu Met Thr Leu Ala Glu Pro Gly Asp Lys Ile Met Gly Leu Ser Leu

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            165                 170                 175gta att atc gct ggc tgg tct gca tac cct cgc cac ctt gat ttc gag    2137Val Ile Ile Ala Gly Trp Ser Ala Tyr Pro Arg His Leu Asp Phe Glu

        180                 185                 190gct ttc cag tct att gct gcg gaa gtt ggc gcg aag ctg tgg gtc gat    2185Ala Phe Gln Ser Ile Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Trp Val Asp

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210                 215                 220gtt cct tac tct gat gtt gtt tct tcc act gtc cac aag act ttg ggt    2281Val Pro Tyr Ser Asp Val Val Ser Ser Thr Val His Lys Thr Leu Gly225                 230                 235                 240gga cct cgt tcc ggc atc att ctg gct aag cag gag tac gcg aag aag    2329Gly Pro Arg Ser Gly Ile Ile Leu Ala Lys Gln Glu Tyr Ala Lys Lys

            245                 250                 255ctg aac tct tcc gta ttc cca ggt cag cag ggt ggt cct ttg atg cac    2377Leu Asn Ser Ser Val Phe Pro Gly Gln Gln Gly Gly Pro Leu Met His

        260                 265                 270gca gtt gct gcg aag gct act tct ttg aag att gct ggc act gag cag    2425Ala Val Ala Ala Lys Ala Thr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Thr Glu Gln

    275                 280                 285ttc cgt gac cgt cag gct cgc acg ttg gag ggt gct cgc att ctt gct    2473Phe Arg Asp Arg Gln Ala Arg Thr Leu Glu Gly Ala Arg Ile Leu Ala

290                 295                 300gag cgt ctg act gct tct gat gcg aag gcc gct ggc gtg gat gtc ttg    2521Glu Arg Leu Thr Ala Ser Asp Ala Lys Ala Ala Gly Val Asp Val Leu305                 310                 315                 320acc ggt ggc act gat gtg cac ttg gtt ttg gct gat ctg cgt aac tcc    2569Thr Gly Gly Thr Asp Val His Leu Val Leu Ala Asp Leu Arg Asn Ser

            325                 330                 335cag atg gat ggc cag cag gcg gaa gat ctg ctg cac gag gtt ggt atc    2617Gln Met Asp Gly Gln Gln Ala Glu Asp Leu Leu His Glu Val Gly Ile

        340                 345                 350act gtg aac cgt aac gcg gtt cct ttc gat cct cgt cca cca atg gtt    2665Thr Val Asn Arg Asn Ala Val Pro Phe Asp Pro Arg Pro Pro Met Val

    355                 360                 365act tct ggt ctg cgt att ggt act cct gcg ctg gct acc cgt ggt ttc    2713Thr Ser Gly Leu Arg Ile Gly Thr Pro Ala Leu Ala Thr Arg Gly Phe

370                 375                 380gat att cct gca ttc act gag gtt gca gac atc att ggt act gct ttg    2761Asp Ile Pro Ala Phe Thr Glu Val Ala Asp Ile Ile Gly Thr Ala Leu385                 390                 395                 400gct aat ggt aag tcc gca gac att gag tct ctg cgt ggc cgt gta gca    2809Ala Asn Gly Lys Ser Ala Asp Ile Glu Ser Leu Arg Gly Arg Val Ala

            405                 410                 415aag ctt gct gca gat tac cca ctg tat gag ggc ttg gaa gac tgg acc    2857Lys Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Leu Tyr Glu Gly Leu Glu Asp Trp Thr

        423                 425                 430atc gtc taa                                                        2866Ile Val<210>4<211>434<212>PRT<400>4Met Thr Asp Ala His Gln Ala Asp Asp Val Arg Tyr Gln Pro Leu Asn1               5                  10                  15Glu Leu Asp Pro Glu Val Ala Ala Ala Ile Ala Gly Glu Leu Ala Arg

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     35                  40                  45Ser Val Leu Gln Ala Gln Gly Ser Val Leu Thr Asn Lys Tyr Ala Glu

 50                  55                  60Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Tyr Tyr Gly Gly Cys Glu Gln Val Asp Ile65                  70                  75                  80Ile Glu Asp Leu Ala Arg Asp Arg Ala Lys Ala Leu Phe Gly Ala Glu

             85                  90                  95Phe Ala Asn Val Gln Pro His Ser Gly Ala Gln Ala Asn Ala Ala Val

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130                 135                 140Lys Leu Tyr Glu Val Val Ala Tyr Gly Val Asp Pro Glu Thr Met Arg145                 150                 155                 160Val Asp Met Asp Gln Val Arg Glu Ile Ala Leu Lys Glu Gln Pro Lys

            165                 170                 175Val Ile Ile Ala Gly Trp Ser Ala Tyr Pro Arg His Leu Asp Phe Glu

        180                 185                 190Ala Phe Gln Ser Ile Ala Ala Glu Val Gly Ala Lys Leu Trp Val Asp

    195                 200                 205Met Ala His Phe Ala Gly Leu Val Ala Ala Gly Leu His Pro Ser Pro

210                 215                 220Val Pro Tyr Ser Asp Val Val Ser Ser Thr Val His Lys Thr Leu Gly225                 230                 235                 240Gly Pro Arg Ser Gly Ile Ile Leu Ala Lys Gln Glu Tyr Ala Lys Lys

            245                 250                 255Leu Asn Ser Ser Val Phe Pro Gly Gln Gln Gly Gly Pro Leu Met His

        260                 265                 270Ala Val Ala Ala Lys Ala Thr Ser Leu Lys Ile Ala Gly Thr Glu Gln

    275                 280                 285Phe Arg Asp Arg Gln Ala Arg Thr Leu Glu Gly Ala Arg Ile Leu Ala

290                 295                 300Glu Arg Leu Thr Ala Ser Asp Ala Lys Ala Ala Gly Val Asp Val Leu305                 310                 315                 320Thr Gly Gly Thr Asp Val His Leu Val Leu Ala Asp Leu Arg Asn Ser

            325                 330                 335Gln Met Asp Gly Gln Gln Ala Glu Asp Leu Leu His Glu Val Gly Ile

        340                 345                 350Thr Val Asn Arg Asn Ala Val Pro Phe Asp Pro Arg Pro Pro Met Val

    355                 360                 365Thr Ser Gly Leu Arg Ile Gly Thr Pro Ala Leu Ala Thr Arg Gly Phe

370                 375                 380Asp Ile Pro Ala Phe Thr Glu Val Ala Asp Ile Ile Gly Thr Ala Leu385                 390                 395                 400Ala Asn Gly Lys Ser Ala Asp Ile Glu Ser Leu Arg Gly Arg Val Ala

            405                 410                 415Lys Leu Ala Ala Asp Tyr Pro Leu Tyr Glu Gly Leu Glu Asp Trp Thr

        420                 425                 430Ile Val

Claims (13)

1、生产L-氨基酸的方法，特征在于进行以下步骤：

a)发酵所需生产L-氨基酸的棒状细菌，该细菌中至少glyA基因是弱化的，

b)浓缩培养基或细菌细胞中所需产物，和

c)分离L-氨基酸。

2、权利要求1的方法，特征在于使用的细菌中所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因是额外扩增的。

3、权利要求1的方法，特征在于使用的细菌中降低所需L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分关闭。

4、权利要求1的方法，特征在于编码glyA基因的多核苷酸的表达被降低。

5、权利要求1的方法，特征在于多核苷酸glyA编码的多肽(酶蛋白)的催化性质被降低。

6、权利要求1的方法，特征在于用通过载体pK18mobglyA’的整合诱变的方法实现弱化，此载体示于图1并保藏在大肠杆菌中，保藏号DSM13170。

7、权利要求1的方法，特征在于为生产L-苏氨酸，发酵如下细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因是同时过表达或扩增的：

7.1编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因，

7.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，

7.3编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

7.4编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，

7.5编码苏氨酸输出蛋白的thrE基因。

8、权利要求1的方法，特征在于为生产L-苏氨酸，发酵如下细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因是同时弱化的：

8.1编码烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因，

8.2编码丙酮酸氧化酶的poxB基因。

9、前述一或多个权利要求的方法，特征在于使用谷氨酸棒杆菌的微生物。

10、其中glyA基因是弱化的棒状细菌。

11、载体pK19mobglyA’，示于图1并保藏在大肠杆菌中，保藏号DSM13170。

12、分离的多核苷酸，包括

(ⅰ)示于SEQ ID NO.2的lacⅠ-tac-5’glyA单元的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或

(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，及任选地

(ⅳ)(ⅰ)中中性功能的有义突变体。

13、分离的多核苷酸，包括

(ⅰ)示于SEQ ID NO.3的lacⅠ-tac-glyA单元的核苷酸序列，或

(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或

(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，及任选地

(ⅳ)(ⅰ)中中性功能的有义突变体。

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