CN1304999A - 编码gpm基因的新核苷酸序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种分离的多核苷酸,其含有选自如下一组的多核苷酸序列:a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸基的多核苷酸。本发明还涉及经扩增gpm基因制备L－氨基酸的发酵方法。

Description

编码gpm基因的新核苷酸序列
本发明提供了编码gpm基因的新核苷酸序列，及用棒杆菌经发酵制备氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中棒杆菌中gpm基因是扩增的。
氨基酸，尤其L-赖氨酸，用于人的内服药及制药工业，但尤为用于动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产，由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施。如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-半胱氨酸有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产L-赖氨酸的菌株改良，其通过扩增各个赖氨酸生物合成基因，并研究对L-赖氨酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))，及Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。
本发明人目的在于为改良氨基酸，尤其L-赖氨酸的生产而提供新措施。
氨基酸，尤其L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养。因此提供生产氨基酸，尤其L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了衍生自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)、b)或c)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选是能复制的DNA，含有
(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了
权利要求4的多核苷酸，含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，
权利要求6的多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽，
含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是图2所示的穿梭载体或质粒载体pXKgpmexp，
以及作为宿主细胞的棒状细菌，其含有该载体或其中gpm基因是扩增的。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上含有一多核苷酸序列，其可通过用含有所述多核苷酸序列的相应于SEQ ID NO:1或其片段的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述文库包括具有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA,cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码磷酸甘油酸变位酶的全长cDNA，以及分离与磷酸甘油酸变位酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码磷酸甘油酸变位酶的DNA或基因的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸包括至少30个，优选至少20个，特别优选至少15个连续碱基。具有至少40个或50个碱基对的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽。特别是具有磷酸甘油酸变位酶活性的多肽。以及与SEQ ID NO:2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO:2的多肽80％，特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌生产氨基酸尤其L-赖氨基酸的发酵方法，在该棒状细菌中编码gpm基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒状菌属，在棒状菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
以下已知野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒杆菌ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-赖氨酸的突变体或菌株，如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P1709
黄色短杆菌FERM-P1708
乳发酵短杆菌FERM-P1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464和
谷氨酸棒杆菌DSM5715。是棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株的适当实例。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码磷酸甘油酸变位酶(EC5.4.2.1)的新gpm基因。
为分离谷氨酸棒杆菌的gpm基因或其它基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacken所著教材：基因与克隆，基因工程入门(VerlagChamie,Weinhein，德国，1990)，或Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。一非常熟知的基因文库是由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在入载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252,255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCosⅠ(Wahl等，1987，美国科学院院报84,2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3),317-316)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivan，生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19:259～268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH52mcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645～4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977))所述。
以此方式可获得编码gpm基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1，是本发明的一部分。另外，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得gpm基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
通过遗传密码的简并性产生自SEQ ID NO:1的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至稳定其功能。本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987)),O’Regan等(基因77:237-251(1989)),Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994))，和Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO:1的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用产生自SEQ ID NO:1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的一部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15bp的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)，以及Liebl等(国际系统细菌学杂志(1991)41:255～260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在gpm基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改良表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893,Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991)),Reischeid等(应用及环境微生物学60,126-132(1994)),LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物学综述60:512-538(1996)及已知关于遗传及分子生物学的教材。例如，本发明的gpm基因已借助于质粒被过表达。
适当的质粒是那些在棒状细菌中复制的质粒。许多已知质粒载体例如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64,549-554),pEKEx1(Eikamanns等，基因102,93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107,69-74,(1991))，是基于隐蔽性质粒pHM1519,pBL1或pGA1其它质粒载体，例如那些基于pCG4(US-A-4,489,160),pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学信息66,119-124(1990)或pAG1(US-A-5,158,891)的质粒载体，可以相同方式使用。
利用其可过表达gpm基因的质粒例如是E.coli/谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pXKgpmexp。此载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179,1525-1532(1997))，质粒pAG1的卡那霉素抗性基因aph(3’)-Ⅱa，复制起点，trc启动子，终止区T1和T2,lacⅠq基因(E.coli的lac操纵子的阻抑物)及质粒pTRC99A(Amann等，(1988)，基因69,301-315)的多克隆位点(mcs)(Norrander,J.M.等，基因26,101-106(1983))。
穿梭表达载体pXKgpmexp示于图2。
另外，除gpm基因之外，特殊生物合成途径，糖酵解，添补反应，柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的过表达，对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产可以是有益的。
因此，例如以下基因可被过表达以生产L-赖氨酸：
·编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)可以同时过表达，或
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)可以同时过表达，或
·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)可以同时过表达，或
·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)可以同时过表达，或
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174,6076-6086)可以同时过表达，或
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)可以同时过表达，或
·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254,395-403)可以同时过表达，或
·zwa1基因(DE19959328.0,DSM13115)可以同时过表达。
除扩增gpm基因之外，同时弱化以下基因对氨基酸尤其L-赖氨酸的生产也可以是有益的：
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1,DSM13047)，或
·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396478,DSM12969)，或
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7,dsm1314)AK
·zwa2基因(DE19959327.2,DSM13113)。
除过表达gpm基因之外，排除非所需的二级反应对L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续或非连续通过分批法，补料分批法或重复补料发批法培养，以生产氨基酸尤其L-赖氨酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag,Brunswick/Wieshaden,1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-赖氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
L-赖氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用进行。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
·谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pXKgpmexp，保藏号DSM13456。
·谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pEC-XK，保藏号DSM13455。
本发明的发酵方法用于生产氨基酸，尤其L-赖氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详细阐述。
实施例1：制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒文库
如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Joua,USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体Super Cosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报84:2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg,德国，产品描述XbaⅠ编码27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA混合，并用T2 DNA连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶。编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡ XL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA，产品描述GigapackⅡ XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细菌置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox.1955，病毒学，1:190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2gpm基因的分离与测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau 3AJ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990，美国科学院院报87:4645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot9600(产品号900200,Qiagen,Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044,Weiterstadt，德国)，在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29:1)(产品号A124.1,Roth,Karlsruhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。
所得原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,MD,USA)的非冗余数据库进行进一步分析。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对该核苷酸序列的分析显示-744碱基对的开放读框，其被称为gpm基因。gpm基因编码248个氨基酸的多肽。
实施例3制备扩增谷氨酸棒杆菌中gpm基因的穿梭表达载体pXKgmpexp。
3.1gpm基因的克隆
通过Eikmanns等(微生物学140,1817-1828(1994))的方法，从菌株ATCC13032中分离染色体DNA。基于从实施例2中所知的谷氨酸棒杆菌gpm基因的序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应。
Gpm(ex1.1):5’TAA AGT GGC AAA CTA GTACC3’
Gpm(ex2):5’CTA CTT ACC CTG GTT T3’
由APK生物系统科学有限公司(Darmstadt，德国)合成所示引物，并用Innis等(PCR实验方法和应用介绍，1990，学术出版社)的标准PCR方法，用Roche诊断试剂有限公司(德国曼海姆)的Pwo聚合酶进行PCR。通过聚合酶链反应，引物扩增出携带gpm基因的大约0.77kb DNA片段。
大约0.77kb的gpm片段是用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)，从琼脂糖凝胶中分离的。
3.2穿梭载体pEC-XK99E的构建
根据现有技术构建大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XK99E。此载体含有的质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179,1525-1532(1997))，大肠杆菌的卡那霉素抗性基因aph(3’)-Ⅱa(Beck等，(1982)，基因19,327-336)，质粒pTRC99A(Amann等，(1988)，基因69,301-315)的复制起点，trc启动子，终止区T1和T2,lacⅠq基因(E.colilac操纵子的阻抑基因)，及多克隆位点(mcs)(Norrander,J.M.等，基因26,101-106(1983))。
将构建的大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XK99E电穿孔(Liebl等，1989,FEMS微生物学通信53,299-303)入谷氨酸棒杆菌DSM5715中。在已补加25mg/l卡那霉素的，由18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨醇，5g/l细菌培养用胰化蛋白胨，2.5g/l细菌培养用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l细菌培养用琼脂组成的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃保温培养2天。通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144,915-927)从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶HindⅢ酶切，此质粒随后经琼脂糖凝胶电泳检验。
所得质粒构建体被称为pEC-XK99E(图1)。将质粒pEC-XK99E电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中所得菌株被称为DSM5715/pEC-XK99E，且根据布达佩斯条约以保藏号DSM13455保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ,Brunswick，德国)。
3.3大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XK99E中gpm的克隆
所用载体是实施例3.2中所述的大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XK99E。此质粒的DNA用限制性内切酶Ecl136Ⅱ充分酶切，然后用虾碱性磷酸酶(Roche诊断试剂GmbH，德国曼海姆，产品描述SAP，产品号1758250)去磷酸化。
将通过PCR所得的如实施例3.1所述的0.77kb的gpm片段，与制备的载体pEC-XK99E混合，并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4 DNA连接酶，编码号27-0870-04(处理此混合物。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α(Hanahan,DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，Oxford，华盛顿DC，美国)。通过在含25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学1,190)上铺板转化混合物，选择携带质粒的细胞。在37℃保温过夜后，选择重组单个克隆。根据厂商指导，用Qiaprep Spin微量制备试剂盒〔产品号27106,Qiagen,Hilden，德国〕从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，以通过随后的琼脂糖凝胶电泳分析质粒。所得质粒被称为pXKgpmexp，示于图2。
实施例4用质粒pXKgpmexp转化菌株DSM5715
用如Liebl等所述(FEMS微生物学通信53,299-303(1989))的电穿孔法，用质粒pXKgpmexp转化菌株DSM5715。在补加25mg/l卡那霉素的由18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨醇，5g/l细菌培养用胰化蛋白胨，2.5g/l细菌培养用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l细菌培养用琼脂组成的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃保温2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144,915-927)从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，随后经琼脂糖凝胶电泳分析此质粒。所得菌株被称为DSM5715/pXKgpmexp。
以下微生物根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ,Brunswick，德国)：
·谷氨酸棒杆菌DSM5715/pXKgpmexp，保藏号DDSM13456。
实施例5制备赖氨酸
将实施例4中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pXKgpmexp在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgⅢ。
培养基CgⅢ
NaCl                   2.5g/l
Bacto-肽胨             10g/l
Bacto-酵母膏           10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)   2％(w/v)pH调节为7.4。
加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)            5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)     20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)   50g/l
(NH4)2SO4          25g/l
KH2PO4              0.1g/l
MgSO4·7H2O         1.0g/l
CaCl2·2H2O         10mg/l
FeSO4·7H2O         10mg/l
MnSO4·H2O          5.0mg/1
生物素(过滤灭菌)       0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)  0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)     0.1g/l
CaCO3                25g/l
用氨水将CSL,MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。72小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-Bio Tronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
试验结果示于表1。
表1
菌株 OD(660) 赖氨酸HCl(g/l)
DSM5715  6.8     13.68
 DSM5715/pXKgpmexp  7.3     14.35
本发明包括以下附图：
图1：质粒pEC-XK99E图。
图2：质粒pXKgpmexp图。
图中所采用的缩写和符号有如下含义：
per：pGA1的控制拷贝数的基因。
oriE：大肠杆菌的质粒编码的复制源点。
rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点。
Ptrc：pTRC99A的trc启动子。
T1,T2：pTRC99A的终止子区1和2。
lacⅠq：lac操纵子的阻抑物基因。
kan：卡那霉素抗性基因。
gpm：谷氨酸棒杆菌的gpm基因。
EcoRⅠ：限制酶EcoRⅠ的酶切位点。
Ec1136Ⅱ：限制酶Ecl136Ⅱ的酶切位点。
HindⅢ：限制酶HindⅢ的酶切位点。
KpnⅠ：限制酶KpnⅠ的酶切位点。
SalⅠ：限制酶SalⅠ的酶切位点。
SmaⅠ：限制酶SmaⅠ的酶切位点。
PstⅠ：限制酶PstⅠ的酶切位点。
BamHⅠ：限制酶BamHⅠ的酶切位点。
NcoⅠ：限制酶NcoⅠ的酶切位点。
XbaⅠ：限制酶XabⅠ的酶切位点。
XmaⅠ：限制酶XmaⅠ的酶切位点。
SacⅠ：限制酶SacⅠ的酶切位点。
序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码gpm基因的新核苷酸序列<130>990168BT<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1020<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(181)..(924)<400>1acgcgcatca gaatgggtga agacgccgtc gaacacgcca gaacattctc ctgggcggcc 60accgccgcac agctatcgtc gctgtacaac gacgctattg ccaacgaaaa tgtcgacggt 120gaaacgcatc acggctaagt aaacgcgcgt cgtggaacat aaagtggcaa actagtacct 180atg act aac gga aaa ttg att ctt crt cgt cac ggt cag agc gaa tgg   228Met Thr Asn Gly Lys Leu Ile Leu Leu Arg His Gly Gln Ser Glu Trp1               5                  10                  15aac gca tcc aac cag ttc act gga tgg gtc gac gtc aat ctg acc gaa   276Asn Ala Ser Asn Gln Phe Thr Gly Trp Val Asp Val Asn Leu Thr Glu
         20                  25                  30cag ggt gag gct gag gcc aag cgc gga ggc gaa crc ctc gtc gag gca   324Gln Gly Glu Ala Glu Ala Lys Arg Gly Gly Glu Leu Leu Val Glu Ala
     35                  40                  45ggc gtc ctc cca ggc gtt gta tac acc tcc ttg ctg cgt cgc gcg arc   372Gty Val Leu Pro Gly Val Val Tyr Thr Ser Leu Leu Arg Arg Ala Ile
 50                  55                  60cgc act gca aac atc gca ctg aac gct gca gac cgc cac tgg atc cca   420Arg Thr Ala Asn Ile Ala Leu Asn Ala Ala Asp Arg His Trp Ile Pro65                  70                  75                  80gtg atc cgc gac tgg cgc ctc aac gag cgt cac tac ggc gca ctg cag   468Val Ile Arg Asp Trp Arg Leu Asn Glu Arg His Tyr Gly Ala Leu Gln
             85                  90                  95ggc ctt gac aag gct gca acc aag gaa aaa tac ggc gac gac cag ttc   516Gly Leu Asp Lys Ala Ala Thr Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Asp Gln Phe
        l00                 105                 110atg gaa tgg cgc cgc tcc tac gac acc cca cca cca gag ctc gcg gat    564Met Glu Trp Arg Arg Ser Tyr Asp Thr Pro Pro Pro Glu Leu Ala Asp
    115                 120                 125gac gca gag tac tcc cag gca aat gac cct cgt tac gcg gac ctc gac    612Asp Ala Glu Tyr Ser Gln Ala Asn Asp Pro Arg Tyr Ala Asp Leu Asp
130                 135                 140gta gtt cca cgc acc gaa tgc ctc aag gac gtt gtg gtt cgt ttt gtt    660Val Val Pro Arg Thr Glu Cys Leu Lys Asp Val Val Val Arg Phe Val145                 150                 155                 160cct tac ttc gag gaa gaa atc ctg cca cgc gca aag aag ggc gaa acc    708Pro Tyr Phe Glu Glu Glu Ile Leu Pro Arg Ala Lys Lys Gly Glu Thr
            165                 170                 175gtc ctc atc gca gca cac ggc aac tcc ctg cgt gcg ctg gtt aag cac    756Val Leu Ile Ala Ala His Gly Asn Ser Leu Arg Ala Leu Val Lys His
        180                 185                 190ctt gac ggc atc tcc gat gct gat atc gca gag ctc aac atc cca acc    804Leu Asp Gly Ile Ser Asp Ala Asp Ile Ala Glu Leu Asn Ile Pro Thr
    195                 200                 205ggc atc cca ctg gtc tac gaa atc gcc gaa gac ggt tcc gta gta aac    852Gly Ile Pro Leu Val Tyr Glu Ile Ala Glu Asp Gly Ser Val Val Asn
210                 215                 220cca ggc ggc acc tac ctc gat cct gag gca gca gca gcc ggc gca gca    900Pro Gly Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Glu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala225                 230                 235                 240gca gta gca aac cag ggt aat aag tagctatttg taggtgagca ctcttcttgc   954Ala Val Ala Asn Gln Gly Asn Lys
            245tttcgtattg ggcgtggtcc tcatgggcct cgccctacct gcgtatacga aaattaaaga 1014tcggat                                                            1020<210>2<211>248<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Thr Asn Gly Lys Leu Ile Leu Leu Arg His Gly Gln Ser Glu Trp1               5                  10                  15Asn Ala Ser Asn Gln Phe Thr Gly Trp Val Asp Val Asn Leu Thr Glu
         20                  25                  30Gin Gly Glu Ala Glu Ala Lys Arg Gly Gly Glu Leu Leu Val Glu Ala
     35                  40                  45Gly Val Leu Pro Gly Val Val Tyr Thr Ser Leu Leu Arg Arg Ala Ile
 50                  55                  60Arg Thr Ala Asn Ile Ala Leu Asn Ala Ala Asp Arg His Trp Ile Pro65                  70                  75                  80Val Ile Arg Asp Trp Arg Leu Asn Glu Arg His Tyr Gly Ala Leu Gln
             85                  90                  95Gly Leu Asp Lys Ala Ala Thr Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Asp Gln Phe
        100                 105                 110Met Glu Trp Arg Arg Ser Tyr Asp Thr Pro Pro Pro Glu Leu Ala Asp
    115                 120                 125Asp Ala Glu Tyr Ser Gln Ala Asn Asp Pro Arg Tyr Ala Asp Leu Asp
130                 135                 140Val Val Pro Arg Thr Glu Cys Leu Lys Asp Val Val Val Arg Phe Val145                 150                 155                 160Pro Tyr Phe Glu Glu Glu Ile Leu Pro Arg Ala Lys Lys Gly Glu Thr
            165                 170                 175Val Leu Ile Ala Ala His Gly Asn Ser Leu Arg Ala Leu Val Lys His
        180                 185                 190Leu Asp Gly Ile Ser Asp Ala Asp Ile Ala Glu Leu Asn Ile Pro Thr
    195                 200                 205Gly Ile Pro Leu Val Tyr Glu Ile Ala Glu Asp Gly Ser Val Val Asn
210                 215                 220Pro Gly Gly Thr Tyr Leu Asp Pro Glu Ala Ala Ala Ala Gly Ala Ala225                 230                 235                 240Ala Val Ala Asn Gln Gly Asn Lys
            245

Claims (20)

1、来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选地为重组的DNA。
3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、权利要求2的多核苷酸，包括如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
5、权利要求2的能复制的DNA，含有
(ⅰ)如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
6、权利要求2的多核苷酸序列，其编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
7、经发酵制备L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，其特征在于进行以下步骤：
a)发酵生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中至少gpm基因或编码其的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
b)富集培养基或细菌细胞中的L-赖氨酸，及
c)分离L-氨基酸。
8、权利要求7的方法，其特征在于所用细菌中所需的L-氨基酸生物合成途径的其它基因被额外扩增。
9、权利要求7的方法，其特征在于所用细菌中，降低L-赖氨酸生成的代谢途径至少被部分关闭。
10、权利要求7的方法，其特征在于使用经质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码gpm基因的核苷酸序列。
11、权利要求7-10任一项的方法，其特征在于使用产生L-赖氨酸的棒状细菌。
12、权利要求8的方法，其特征在于编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因同时过表达。
13、权利要求8的方法，其特征在于赋予S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段同时被扩增。
14、权利要求8的方法，其特征在于编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因同时被过表达。
15、权利要求8的方法，其特征在于编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因同时被过表达。
16、权利要求8的方法，其特征在于编码3-磷酸甘油酸激酶pgk基因同时被过表达。
17、权利要求8的方法，其特征在于编码丙酮酸羧化酶的pyc基因同时被过表达。
18、权利要求1的多核苷酸序列作为引物在通过聚合物链反应(PCR)制备相应于gpm基因功能的基因的DNA中的应用。
19、权利要求1的多核苷酸序列作为杂交探针的应用。
20、通过导入权利要求1或5的能复制的DNA而转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属。
CN00134608A 1999-12-02 2000-12-01 编码gpm基因的新核苷酸序列 Pending CN1304999A (zh)

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