JP4061769B2 - Ｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術により、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素の遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００４】
一方、アミノ酸の生産量を増加させるために、アミノ酸の取り込み系を破壊する技術がＬ−スレオニンで知られている（Okamoto, K. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61(11), 1877-1882 (1997)）。
【０００５】
Ｌ−グルタミン酸においては、コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−グルタミン酸の取り込み系の遺伝子クラスター（gluABCDオペロン）の構造が知られている（Kronemeyer, W. et al., J. Bacteriol., 177(5), 1152-1158 (1995)）。また、Kronemeyerらは、gluABCDオペロンによるＬ−グルタミン酸取り込み系を欠失した株を作製し、同株を用いてＬ−グルタミン酸の排出について研究しているが、コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−グルタミン酸の排出はgluABCDには依存せず、他の取り込み・排出機構に依存していると結論付けている。さらに、gluABCD以外のＬ−グルタミン酸の取り込み系が報告されている（Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 136, 169-173 (1996)）。これらの報告は少なくともgluABCDオペロンによるＬ−グルタミン酸取り込み系を欠失させても、Ｌ−グルタミン酸の培地中の蓄積量には影響しないことを示唆している。したがって、gluABCDによるＬ−グルタミン酸の取り込み系の破壊によりＬ−グルタミン酸の生産能を向上させようとする試みはなされていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、gluABCDオペロンを欠失させたコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌は、上記先行技術による示唆に反し、高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
（２）前記Ｌ−グルタミン酸の取り込み系がgluABCDオペロンによりコードされるものである（１）の方法。
（３）前記コリネ型細菌はgluABCDオペロンの少なくとも一つの発現産物を欠失したことを特徴とする（２）の方法。
（４）前記コリネ型細菌は少なくともgluAを欠失していることを特徴とする（３）の方法
（５）前記コリネ型細菌はgluA、gluB、gluC及びgluDのすべてを欠失していることを特徴とする（４）の方法。
【０００９】
本発明においてＬ−グルタミン酸生産能とは、本発明に用いるコリネ型細菌を培地に培養したときに、該培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である。
本発明でいうコリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
【００１１】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１２】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
【００１３】
上記のようなコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸の取り込み系を欠失又は低下させることは、突然変異処理又は遺伝子組換え技術を利用して、同取り込み系をコードする遺伝子を変異又は破壊することによって行うことができる。Ｌ−グルタミン酸の取り込み系の欠失又は低下とは、同取り込み系が正常に機能しないことをいい、同取り込み系を構成するタンパク質の少なくとも一つの欠失又は活性の低下であってもよく、二又はそれ以上のタンパク質の欠失又は活性の低下であってもよい。また、ここでタンパク質の欠失とは、タンパク質が全く発現しないこと、及び正常に機能しないタンパク質を発現することの両方を含む。
【００１４】
Ｌ−グルタミン酸の取り込み系をコードする遺伝子の破壊は、相同組換えを利用した遺伝子置換によって行うことができる。同遺伝子の内部を欠失し、取り込み系が正常に機能しないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の正常遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法などがあるが、温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法が好ましい。
【００１５】
Ｌ−グルタミン酸の取り込み系をコードする遺伝子としては、gluABCDオペロン（Kronemeyer, W. et al., J. Bacteriol., 177(5), 1152-1158 (1995)）が知られている。また、gluABCDオペロンよる取り込み系以外のＬ−グルタミン酸の取り込み系も知られている（Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 136, 169-173 (1996)）。破壊するのはいずれの遺伝子であってもよいが、gluABCDオペロンによる取り込み系が好ましい。
【００１６】
gluABCDオペロン又は同オペロン中の各構造遺伝子は、同オペロンの塩基配列が知られているので（GenBank/EMBL/DDBJ Accession X81191）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡから単離することができる。こうして得られる遺伝子断片から一定の領域を制限酵素により切り出し、コード領域又はプロモーター等の発現調節配列の少なくとも一部を欠失させることによって、欠失型遺伝子を作製することができる。
【００１７】
また、遺伝子の一部を欠失するように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっても、欠失型遺伝子を取得することができる。例えば、配列表の配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーを用いると、５’端側の一部を欠失したgluD遺伝子を得ることができる。また、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用いると、３’端側の一部を欠失したgluA遺伝子を得ることができる。これらのプライマーを用いて取得される欠失型のgluA遺伝子又はgluD遺伝子を用いて遺伝子置換を行うと、gluA遺伝子又はgluD遺伝子を破壊することができる。また、これらの欠失型gluA遺伝子及び欠失型gluD遺伝子を連結し、得られる融合遺伝子を用いて遺伝子置換を行うと、gluA、gluB、gluC及びgluDのすべてを破壊することができる。さらに、配列番号３及び５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて取得されるgluA遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を閉環化すると、内部を欠失し、５’端側領域と３’端側領域がインフレームで連結したgluA遺伝子を含むプラスミドが得られる。同プラスミドを用いて遺伝子置換を行うと、gluA遺伝子のみを破壊することができる。
【００１８】
また、当業者によく知られた方法によって、例示したプライマー以外のプライマーを設計することができ、そのようなプライマーを用いることによってgluABCDオペロン中の任意の構造遺伝子を欠失させることができる。あるいは、gluABCDオペロンのプロモーター等の発現調節配列を欠失させ、同遺伝子が発現しないようにすることによっても、取り込み系を欠失させることができる。
【００１９】
以下に、gluABCD遺伝子クラスター（以下、単に「gluABCD遺伝子」という。）の遺伝子置換について説明するが、同様にしてその任意の構造遺伝子又は発現制御配列を欠失させることができる。
欠失型gluABCD遺伝子を、宿主染色体上のgluABCD遺伝子と置換するには以下のようにすればよい。すなわち、温度感受性複製開始点と欠失型gluABCD遺伝子とクロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温度感受性複製開始点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００２０】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するgluABCD遺伝子配列との組換えを起こし、染色体gluABCD遺伝子と欠失型gluABCD遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製開始点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なgluABCD遺伝子が優性であるので、形質転換株はＬ−グルタミン酸取り込み系を発現する。
【００２１】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型gluABCD遺伝子のみを残すために、２個のgluABCD遺伝子の組換えにより１コピーのgluABCD遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製開始点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なgluABCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型gluABCD遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型gluABCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なgluABCD遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製開始点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド上で細胞内に保持される。このプラスミド上のＤＮＡは、温度感受性複製開始点が機能しない温度で培養すると、細胞から脱落する。いずれの遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残されたかは、染色体上のgluABCD遺伝子の構造をPCR又はハイブリダイゼーション等で調べることによって、確認することができる。
【００２２】
上記のようにして得られるgluABCD遺伝子破壊株は、温度感受性複製開始点が機能する温度（例えば低温）で培養すればgluABCD遺伝子を細胞内に保持し、温度感受性複製開始点が機能しない温度（例えば高温）で培養すればgluABCD遺伝子を欠損する。
【００２３】
コリネ型細菌細胞内で機能する温度感受性複製開始点を有するプラスミドとしては、pHS4、pHSC4、pHS22、pHSC22、pHS23、pHSC23（以上、特公平7-108228号公報参照）等が挙げられる。これらの温度感受性プラスミドはコリネ型細菌細胞中において、約10〜32℃では自律増殖できるが、約34℃以上では自律増殖できない。
【００２４】
尚、上記のようにして染色体上のgluABCD遺伝子を破壊した後は、遺伝子破壊株にｒｅｃＡ-を導入しておくと、低温で培養中にプラスミド上のgluABCD遺伝子が再び染色体へ組み込まれるのを防ぐことができる点で好ましい。
【００２５】
本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下していることに加えて、Ｌ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が増強されていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００２６】
また、本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損されていてもよい。このような酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００２７】
さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ13029株は、1994年9月2日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、1995年8月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が培地に蓄積する。本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下しているので、細胞から培地中に排出されたＬ−グルタミン酸が再び細胞中に取り込まれるのを抑制することができ、その結果、培地中におけるＬ−グルタミン酸の蓄積量が増加する。本発明の方法によれば、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が高くなったときの区間収率（培養中の一定の期間中における糖の消費量に対するＬ−グルタミン酸の蓄積量の増加量の比）の向上が期待できる。特に、発酵中に培地中のＬ−グルタミン酸の濃度が高くなる高生産株を用いる場合には、高い効果が得られる。
【００２９】
本発明の微生物を用いてＬ−グルタミン酸を製造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３１】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
【００３２】
培養は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３３】
発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は、例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよい。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３５】
＜１＞gluABCD遺伝子破壊用プラスミドの作製
コリネ型細菌のgluABCD遺伝子破壊株を、温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により作製するために、gluABCD遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。
【００３６】
まず、欠失型gluABCD遺伝子を、5'端側を欠失したgluD遺伝子をクローニングし、それに3'端側を欠失したgluA遺伝子を連結することにより作製した。具体的には、コリネ型細菌野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体ＤＮＡから、gluD内に存在するBamHI部位からgluDの約270bp下流までの約300bpの断片を、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をBamHI及びXbaIで消化して得られる断片を、BamHI及びXbaIで消化したpHSG299（宝酒造(株)製）とT4 DNAリガーゼ(宝酒造(株)製)を用いて結合させ、プラスミドpHSGΔgluDを取得した。
【００３７】
次にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体から、gluAの約180bp上流からgluA内に存在するBamHI部位までの約300bpの断片を、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をEcoRI及びBamHIで消化して得られる断片を、EcoRI及びBamHIで消化したpHSGΔgluDとT4 DNAリガーゼを用いて結合させ、プラスミドpHSGΔgluADを取得した。このプラスミドはgluB、gluCを欠失し、gluAとgluDの一部を連結させた構造になっている。
【００３８】
次に、pHSGΔgluADをコリネ型細菌で自律複製可能にするために、コリネ型細菌内で自律複製可能なプラスミド由来の温度感受性複製開始点を、pHSGΔgluAD上にただ一つ存在するHincII切断部位に導入した。具体的には、以下のようにして行った。
【００３９】
温度感受性複製開始点を含むプラスミドpHSC4（特開平5-7491号公報参照）をBamHI及びKpnIで切断し、得られたDNA断片の両末端をBlunting kit（宝酒造(株)製）を用い平滑化し、KpnIリンカー（宝酒造(株)製）を結合させた後セルフライゲーション（自己結合）させて、pKCT4を得た。尚、pHSC4は、次のようにして得られたプラスミドである。pHM1519（K. Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)、特開昭58-77895号公報）由来の複製開始点を持つプラスミドpAJ1844（特開昭58-216199号公報参照）から複製開始点を含むDNA断片を切り出し、エシェリヒア・コリ用プラスミドpHSG298と連結し、シャトルベクターpHK4を得た。このpHK4をヒドロキシルアミン処理し、温度感受性となるように改変されたプラスミドをpHS4を得た。pHS4から温度感受性複製開始点を切り出し、pHSG398に接続してpHSC4を得た。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
【００４０】
上記のようにして得られたpKCT4は、pHSG399のKpnI部位に温度感受性となるように改変されたpHM1519由来の複製開始点が挿入された構造を有する。pKCT4をKpnIで消化して得られる温度感受性複製開始点を含む断片を取得し、この断片を宝酒造（株）製Blunting kitを用い平滑末端化した後、HincIlで切断したpHSGΔgluADに連結し、pTΔADを取得した（図１）。
【００４１】
＜２＞gluA遺伝子破壊用プラスミドの作製
gluA遺伝子が単独で破壊されたコリネ型細菌を作製するために、gluA遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。
【００４２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体DNAから、gluA遺伝子を含む約15O0bpのDNA断片を、配列番号３及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をEcoRIで消化した後、この増幅断片をEcoRIで消化したpHSG299（宝酒造(株)製）とT4 DNAリガーゼ（宝酒造(株)製）を用いて結合させ、プラスミドpHSGgluAを取得した。
【００４３】
次に、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、pHSGgluAを鋳型とするPCRにより、gluA遺伝子の内部領域を除いてgluA遺伝子の5'端領域及び3'端領域及びベクター部分を増幅した。前記プライマーは、BglII認識配列を含むように設計した。増幅断片をBglIIで処理後、T4 DNAリガーゼを用いてセルフライゲーションさせ、プラスミドpHSGΔgluAを取得した。このプラスミドは、gluAのオープン・リーディング・フレーム約730bpのうち、内部の約250bpを欠失し、5'端領域及び3'端領域をインフレームで連結させた構造になっている。
【００４４】
次に、pHSGΔgluAをコリネ型細菌で自律複製可能にするために、コリネ型細菌内で自律複製可能なプラスミド由来の温度感受性複製開始点をpHSGΔgluAにただ一つ存在するKpnI切断部位に導入した。具体的には、pKCT4をKpnIで消化して複製開始点を含むDNA断片を取得し、得られた断片をpHSGΔgluAのKpnI部位に挿入し、pTΔAを取得した（図２）。
【００４５】
＜３＞gluABCD遺伝子破壊株及びgluA遺伝子破壊株の作製
前記のようにして得られた遺伝子破壊用プラスミドpTΔAD及びpTΔAを、野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株に、電気パルス法を用いて導入し、ATCC13869/pTΔAD及びATCC13869/pTΔAを得た。これらの形質転換株を用いて遺伝子破壊を行った。
【００４６】
具体的には、ATCC13869/pTΔAD及びATCC13869/pTΔAをCM2B液体培地で25℃にて24時間振とう培養した後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2B培地上に撒き、温度感受性複製開始点が機能しない温度である34℃でコロニーを形成した株を、プラスミド組み込み株として取得した。次に、これらの株から、34℃でカナマイシンに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。これらの感受性株の染色体DNAを常法により取得し、PCR及びシークエンスにより染色体上のgluABCD遺伝子及びgluA遺伝子の構造を調べ、これらの遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し、それぞれΔAD株及びΔA株と命名した。
ΔAD株及びΔA株は、各々プライベートナンバーAJ13587及びAJ13588と命名され、１９９９年３月２３日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２７及びＦＥＲＭ Ｐ−１７３２８が付与されている。
【００４７】
＜４＞ΔAD株及びΔA株のＬ−グルタミン酸生産能の評価
ATCC13869株、ΔAD株及びΔA株のＬ−グルタミン酸の生産培養を以下のようにして行った。CM2Bプレート培地にて培養することによってリフレッシュを行ったこれらの菌株を、グルコース80g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.4g、(NH4)2SO4 30g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液15ml、サイアミン塩酸塩 200μg、ビオチン 3μg、及びCaCO3 50g を純水1L中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調製）と、この培地にＬ−グルタミン酸を50g/L添加した培地の２種類の培地において31.5℃にて培養した。培養後に培地中のＬ−グルタミン酸の蓄積量及び51倍希釈した培養液の620nmにおける吸光度を測定した。Ｌ−グルタミン酸無添加培地の結果を表１に、Ｌ−グルタミン酸を添加した培地の結果を表２に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【表２】
【００５０】
これらの結果から、高濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地では、ΔA株及びΔAD株のいずれもＬ−グルタミン酸の蓄積量及び収率が向上していることがわかる。また、ΔA株は、Ｌ−グルタミン酸を添加しない培地でも、Ｌ−グルタミン酸の収率が向上している。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、従来よりも高収率でＬ−グルタミン酸を生産することができる。
【００５２】
【配列表】
【００５３】
【００５４】
【００５５】
【００５６】
【００５７】
【００５８】
【００５９】
【図面の簡単な説明】
【図１】 gluABCD遺伝子破壊用プラスミドpTΔADの構築過程を示す図。
【図２】 gluA遺伝子破壊用プラスミドpTΔAの構築過程を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｌ−グルタミン酸生産菌及びそれを用いた発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタミン酸は、食品、医薬品等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
従来、Ｌ−グルタミン酸は、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するブレビバクテリウム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用いて発酵法により工業生産されている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２１５頁、１９８６年）。これらのコリネ型細菌は、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。
【０００３】
また、組換えＤＮＡ技術により、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素の遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示されている。例えば、特開昭63-214189号公報には、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シンターゼ遺伝子を増強することによって、Ｌ−グルタミン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。
【０００４】
一方、アミノ酸の生産量を増加させるために、アミノ酸の取り込み系を破壊する技術がＬ−スレオニンで知られている（Okamoto, K. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61(11), 1877-1882 (1997)）。
【０００５】
Ｌ−グルタミン酸においては、コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−グルタミン酸の取り込み系の遺伝子クラスター（gluABCDオペロン）の構造が知られている（Kronemeyer, W. et al., J. Bacteriol., 177(5), 1152-1158 (1995)）。また、Kronemeyerらは、gluABCDオペロンによるＬ−グルタミン酸取り込み系を欠失した株を作製し、同株を用いてＬ−グルタミン酸の排出について研究しているが、コリネバクテリウム・グルタミカムのＬ−グルタミン酸の排出はgluABCDには依存せず、他の取り込み・排出機構に依存していると結論付けている。さらに、gluABCD以外のＬ−グルタミン酸の取り込み系が報告されている（Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 136, 169-173 (1996)）。これらの報告は少なくともgluABCDオペロンによるＬ−グルタミン酸取り込み系を欠失させても、Ｌ−グルタミン酸の培地中の蓄積量には影響しないことを示唆している。したがって、gluABCDによるＬ−グルタミン酸の取り込み系の破壊によりＬ−グルタミン酸の生産能を向上させようとする試みはなされていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸の需要の一層の増大に応えるために、高いＬ−グルタミン酸生産能を有する菌株を育種し、より安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、gluABCDオペロンを欠失させたコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸生産菌は、上記先行技術による示唆に反し、高いＬ−グルタミン酸生産能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
（２）前記Ｌ−グルタミン酸の取り込み系がgluABCDオペロンによりコードされるものである（１）の方法。
（３）前記コリネ型細菌はgluABCDオペロンの少なくとも一つの発現産物を欠失したことを特徴とする（２）の方法。
（４）前記コリネ型細菌は少なくともgluAを欠失していることを特徴とする（３）の方法
（５）前記コリネ型細菌はgluA、gluB、gluC及びgluDのすべてを欠失していることを特徴とする（４）の方法。
【０００９】
本発明においてＬ−グルタミン酸生産能とは、本発明に用いるコリネ型細菌を培地に培養したときに、該培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積する能力をいう。
【００１０】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌である。
本発明でいうコリネ型細菌としては、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第8版599頁（1974）に定義されている一群の微生物であり、好気性，グラム陽性，非抗酸性，胞子形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合された細菌を含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリウム属細菌を含む。Ｌ−グルタミン酸の製造に好適に用いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示すものが挙げられる。
【００１１】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス）
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
【００１２】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ＡＴＣＣ１３８７０
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ＡＴＣＣ１５８０６
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ＡＴＣＣ２１５１１
コリネバクテリウム・カルナエ ＡＴＣＣ１５９９１
コリネバクテリウム・グルタミカム ＡＴＣＣ１３０２０、１３０３２、１３０６０
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１５９９０
コリネバクテリウム・メラセコーラ ＡＴＣＣ１７９６５
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３９）
コリネバクテリウム・ハーキュリス ＡＴＣＣ１３８６８
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ＡＴＣＣ１４０２０
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ＡＴＣＣ１４０６８
ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム） ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ＡＴＣＣ１３８２５
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ＡＴＣＣ１４０６６
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ＡＴＣＣ１９２４０
ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・アンモニアゲネス） ＡＴＣＣ６８７１
ブレビバクテリウム・アルバム ＡＴＣＣ１５１１１
ブレビバクテリウム・セリヌム ＡＴＣＣ１５１１２
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ＡＴＣＣ１５３５４
【００１３】
上記のようなコリネ型細菌のＬ−グルタミン酸の取り込み系を欠失又は低下させることは、突然変異処理又は遺伝子組換え技術を利用して、同取り込み系をコードする遺伝子を変異又は破壊することによって行うことができる。Ｌ−グルタミン酸の取り込み系の欠失又は低下とは、同取り込み系が正常に機能しないことをいい、同取り込み系を構成するタンパク質の少なくとも一つの欠失又は活性の低下であってもよく、二又はそれ以上のタンパク質の欠失又は活性の低下であってもよい。また、ここでタンパク質の欠失とは、タンパク質が全く発現しないこと、及び正常に機能しないタンパク質を発現することの両方を含む。
【００１４】
Ｌ−グルタミン酸の取り込み系をコードする遺伝子の破壊は、相同組換えを利用した遺伝子置換によって行うことができる。同遺伝子の内部を欠失し、取り込み系が正常に機能しないように改変した遺伝子（欠失型遺伝子）を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の正常遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、染色体上の遺伝子を破壊することができる。このような相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法などがあるが、温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法が好ましい。
【００１５】
Ｌ−グルタミン酸の取り込み系をコードする遺伝子としては、gluABCDオペロン（Kronemeyer, W. et al., J. Bacteriol., 177(5), 1152-1158 (1995)）が知られている。また、gluABCDオペロンよる取り込み系以外のＬ−グルタミン酸の取り込み系も知られている（Burkovski, A. et al., FEMS Microbiology Letters, 136, 169-173 (1996)）。破壊するのはいずれの遺伝子であってもよいが、gluABCDオペロンによる取り込み系が好ましい。
【００１６】
gluABCDオペロン又は同オペロン中の各構造遺伝子は、同オペロンの塩基配列が知られているので（GenBank/EMBL/DDBJ Accession X81191）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、コリネ型細菌の染色体ＤＮＡから単離することができる。こうして得られる遺伝子断片から一定の領域を制限酵素により切り出し、コード領域又はプロモーター等の発現調節配列の少なくとも一部を欠失させることによって、欠失型遺伝子を作製することができる。
【００１７】
また、遺伝子の一部を欠失するように設計したプライマーを用いてＰＣＲを行うことによっても、欠失型遺伝子を取得することができる。例えば、配列表の配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーを用いると、５’端側の一部を欠失したgluD遺伝子を得ることができる。また、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用いると、３’端側の一部を欠失したgluA遺伝子を得ることができる。これらのプライマーを用いて取得される欠失型のgluA遺伝子又はgluD遺伝子を用いて遺伝子置換を行うと、gluA遺伝子又はgluD遺伝子を破壊することができる。また、これらの欠失型gluA遺伝子及び欠失型gluD遺伝子を連結し、得られる融合遺伝子を用いて遺伝子置換を行うと、gluA、gluB、gluC及びgluDのすべてを破壊することができる。さらに、配列番号３及び５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて取得されるgluA遺伝子を含むプラスミドを鋳型として、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を閉環化すると、内部を欠失し、５’端側領域と３’端側領域がインフレームで連結したgluA遺伝子を含むプラスミドが得られる。同プラスミドを用いて遺伝子置換を行うと、gluA遺伝子のみを破壊することができる。
【００１８】
また、当業者によく知られた方法によって、例示したプライマー以外のプライマーを設計することができ、そのようなプライマーを用いることによってgluABCDオペロン中の任意の構造遺伝子を欠失させることができる。あるいは、gluABCDオペロンのプロモーター等の発現調節配列を欠失させ、同遺伝子が発現しないようにすることによっても、取り込み系を欠失させることができる。
【００１９】
以下に、gluABCD遺伝子クラスター（以下、単に「gluABCD遺伝子」という。）の遺伝子置換について説明するが、同様にしてその任意の構造遺伝子又は発現制御配列を欠失させることができる。
欠失型gluABCD遺伝子を、宿主染色体上のgluABCD遺伝子と置換するには以下のようにすればよい。すなわち、温度感受性複製開始点と欠失型gluABCD遺伝子とクロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等の薬剤に耐性を示すマーカー遺伝子とを挿入して組換えＤＮＡを調製し、この組換えＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、温度感受性複製開始点が機能しない温度で形質転換株を培養し、続いてこれを薬剤を含む培地で培養することにより、組換えＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた形質転換株が得られる。
【００２０】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するgluABCD遺伝子配列との組換えを起こし、染色体gluABCD遺伝子と欠失型gluABCD遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製開始点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。したがって、この状態では正常なgluABCD遺伝子が優性であるので、形質転換株はＬ−グルタミン酸取り込み系を発現する。
【００２１】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型gluABCD遺伝子のみを残すために、２個のgluABCD遺伝子の組換えにより１コピーのgluABCD遺伝子を、ベクター部分（温度感受性複製開始点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なgluABCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型gluABCD遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型gluABCD遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なgluABCD遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製開始点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド上で細胞内に保持される。このプラスミド上のＤＮＡは、温度感受性複製開始点が機能しない温度で培養すると、細胞から脱落する。いずれの遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残されたかは、染色体上のgluABCD遺伝子の構造をPCR又はハイブリダイゼーション等で調べることによって、確認することができる。
【００２２】
上記のようにして得られるgluABCD遺伝子破壊株は、温度感受性複製開始点が機能する温度（例えば低温）で培養すればgluABCD遺伝子を細胞内に保持し、温度感受性複製開始点が機能しない温度（例えば高温）で培養すればgluABCD遺伝子を欠損する。
【００２３】
コリネ型細菌細胞内で機能する温度感受性複製開始点を有するプラスミドとしては、pHS4、pHSC4、pHS22、pHSC22、pHS23、pHSC23（以上、特公平7-108228号公報参照）等が挙げられる。これらの温度感受性プラスミドはコリネ型細菌細胞中において、約10〜32℃では自律増殖できるが、約34℃以上では自律増殖できない。
【００２４】
尚、上記のようにして染色体上のgluABCD遺伝子を破壊した後は、遺伝子破壊株にｒｅｃＡ-を導入しておくと、低温で培養中にプラスミド上のgluABCD遺伝子が再び染色体へ組み込まれるのを防ぐことができる点で好ましい。
【００２５】
本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下していることに加えて、Ｌ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素の活性が増強されていてもよい。このようなＬ−グルタミン酸生合成を触媒する酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルトースビスリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ等がある。
【００２６】
また、本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下あるいは欠損されていてもよい。このような酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
【００２７】
さらに、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌に、界面活性剤等のビオチン作用抑制物質に対する温度感受性変異を付与することにより、過剰量のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質の非存在下でＬ−グルタミン酸を生産させることができる（WO96/06180号参照）。このようなコリネ型細菌としては、WO96/06180号に記載されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ13029が挙げられる。AJ13029株は、1994年9月2日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番号FERM P-14501として寄託され、1995年8月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5189が付与されている。
【００２８】
Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌を好適な培地で培養すれば、Ｌ−グルタミン酸が培地に蓄積する。本発明に用いるコリネ型細菌は、Ｌ−グルタミン酸の取り込み系が欠失又は低下しているので、細胞から培地中に排出されたＬ−グルタミン酸が再び細胞中に取り込まれるのを抑制することができ、その結果、培地中におけるＬ−グルタミン酸の蓄積量が増加する。本発明の方法によれば、培地中のＬ−グルタミン酸濃度が高くなったときの区間収率（培養中の一定の期間中における糖の消費量に対するＬ−グルタミン酸の蓄積量の増加量の比）の向上が期待できる。特に、発酵中に培地中のＬ−グルタミン酸の濃度が高くなる高生産株を用いる場合には、高い効果が得られる。
【００２９】
本発明の微生物を用いてＬ−グルタミン酸を製造するのに用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、シュクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００３０】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、アンモニア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００３１】
無機イオンとしては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。有機微量栄養素としては、ビタミンＢ1などの要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有させることが望ましい。
【００３２】
培養は、振とう培養、通気撹拌培養等による好気的条件下で１６〜７２時間実施するのがよく、培養温度は３０℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜９に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００３３】
発酵液からのＬ−グルタミン酸の採取は、例えばイオン交換樹脂法、晶析法等によることができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、分離させるか、または中和晶析させればよい。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３５】
＜１＞gluABCD遺伝子破壊用プラスミドの作製
コリネ型細菌のgluABCD遺伝子破壊株を、温度感受性プラスミドを用いた相同組換え法により作製するために、gluABCD遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。
【００３６】
まず、欠失型gluABCD遺伝子を、5'端側を欠失したgluD遺伝子をクローニングし、それに3'端側を欠失したgluA遺伝子を連結することにより作製した。具体的には、コリネ型細菌野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体ＤＮＡから、gluD内に存在するBamHI部位からgluDの約270bp下流までの約300bpの断片を、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をBamHI及びXbaIで消化して得られる断片を、BamHI及びXbaIで消化したpHSG299（宝酒造(株)製）とT4 DNAリガーゼ(宝酒造(株)製)を用いて結合させ、プラスミドpHSGΔgluDを取得した。
【００３７】
次にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体から、gluAの約180bp上流からgluA内に存在するBamHI部位までの約300bpの断片を、配列番号３及び４に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をEcoRI及びBamHIで消化して得られる断片を、EcoRI及びBamHIで消化したpHSGΔgluDとT4 DNAリガーゼを用いて結合させ、プラスミドpHSGΔgluADを取得した。このプラスミドはgluB、gluCを欠失し、gluAとgluDの一部を連結させた構造になっている。
【００３８】
次に、pHSGΔgluADをコリネ型細菌で自律複製可能にするために、コリネ型細菌内で自律複製可能なプラスミド由来の温度感受性複製開始点を、pHSGΔgluAD上にただ一つ存在するHincII切断部位に導入した。具体的には、以下のようにして行った。
【００３９】
温度感受性複製開始点を含むプラスミドpHSC4（特開平5-7491号公報参照）をBamHI及びKpnIで切断し、得られたDNA断片の両末端をBlunting kit（宝酒造(株)製）を用い平滑化し、KpnIリンカー（宝酒造(株)製）を結合させた後セルフライゲーション（自己結合）させて、pKCT4を得た。尚、pHSC4は、次のようにして得られたプラスミドである。pHM1519（K. Miwa et al., Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)、特開昭58-77895号公報）由来の複製開始点を持つプラスミドpAJ1844（特開昭58-216199号公報参照）から複製開始点を含むDNA断片を切り出し、エシェリヒア・コリ用プラスミドpHSG298と連結し、シャトルベクターpHK4を得た。このpHK4をヒドロキシルアミン処理し、温度感受性となるように改変されたプラスミドをpHS4を得た。pHS4から温度感受性複製開始点を切り出し、pHSG398に接続してpHSC4を得た。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。
【００４０】
上記のようにして得られたpKCT4は、pHSG399のKpnI部位に温度感受性となるように改変されたpHM1519由来の複製開始点が挿入された構造を有する。pKCT4をKpnIで消化して得られる温度感受性複製開始点を含む断片を取得し、この断片を宝酒造（株）製Blunting kitを用い平滑末端化した後、HincIlで切断したpHSGΔgluADに連結し、pTΔADを取得した（図１）。
【００４１】
＜２＞gluA遺伝子破壊用プラスミドの作製
gluA遺伝子が単独で破壊されたコリネ型細菌を作製するために、gluA遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。
【００４２】
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869の染色体DNAから、gluA遺伝子を含む約15O0bpのDNA断片を、配列番号３及び５に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするPCRで増幅し、この増幅断片をEcoRIで消化した後、この増幅断片をEcoRIで消化したpHSG299（宝酒造(株)製）とT4 DNAリガーゼ（宝酒造(株)製）を用いて結合させ、プラスミドpHSGgluAを取得した。
【００４３】
次に、配列番号６及び７に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、pHSGgluAを鋳型とするPCRにより、gluA遺伝子の内部領域を除いてgluA遺伝子の5'端領域及び3'端領域及びベクター部分を増幅した。前記プライマーは、BglII認識配列を含むように設計した。増幅断片をBglIIで処理後、T4 DNAリガーゼを用いてセルフライゲーションさせ、プラスミドpHSGΔgluAを取得した。このプラスミドは、gluAのオープン・リーディング・フレーム約730bpのうち、内部の約250bpを欠失し、5'端領域及び3'端領域をインフレームで連結させた構造になっている。
【００４４】
次に、pHSGΔgluAをコリネ型細菌で自律複製可能にするために、コリネ型細菌内で自律複製可能なプラスミド由来の温度感受性複製開始点をpHSGΔgluAにただ一つ存在するKpnI切断部位に導入した。具体的には、pKCT4をKpnIで消化して複製開始点を含むDNA断片を取得し、得られた断片をpHSGΔgluAのKpnI部位に挿入し、pTΔAを取得した（図２）。
【００４５】
＜３＞gluABCD遺伝子破壊株及びgluA遺伝子破壊株の作製
前記のようにして得られた遺伝子破壊用プラスミドpTΔAD及びpTΔAを、野生株であるブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869株に、電気パルス法を用いて導入し、ATCC13869/pTΔAD及びATCC13869/pTΔAを得た。これらの形質転換株を用いて遺伝子破壊を行った。
【００４６】
具体的には、ATCC13869/pTΔAD及びATCC13869/pTΔAをCM2B液体培地で25℃にて24時間振とう培養した後、25μg/mlのカナマイシンを含むCM2B培地上に撒き、温度感受性複製開始点が機能しない温度である34℃でコロニーを形成した株を、プラスミド組み込み株として取得した。次に、これらの株から、34℃でカナマイシンに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。これらの感受性株の染色体DNAを常法により取得し、PCR及びシークエンスにより染色体上のgluABCD遺伝子及びgluA遺伝子の構造を調べ、これらの遺伝子が欠失型に置換されていることを確認し、それぞれΔAD株及びΔA株と命名した。
ΔAD株及びΔA株は、各々プライベートナンバーAJ13587及びAJ13588と命名され、１９９９年３月２３日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１７３２７及びＦＥＲＭ Ｐ−１７３２８が付与されている。
【００４７】
＜４＞ΔAD株及びΔA株のＬ−グルタミン酸生産能の評価
ATCC13869株、ΔAD株及びΔA株のＬ−グルタミン酸の生産培養を以下のようにして行った。CM2Bプレート培地にて培養することによってリフレッシュを行ったこれらの菌株を、グルコース80g、KH2PO4 1g、MgSO4・7H2O 0.4g、(NH4)2SO4 30g、FeSO4・7H2O 0.01g、MnSO4・7H2O 0.01g、大豆加水分解液15ml、サイアミン塩酸塩 200μg、ビオチン 3μg、及びCaCO3 50g を純水1L中に含む培地（KOHを用いてpH8.0に調製）と、この培地にＬ−グルタミン酸を50g/L添加した培地の２種類の培地において31.5℃にて培養した。培養後に培地中のＬ−グルタミン酸の蓄積量及び51倍希釈した培養液の620nmにおける吸光度を測定した。Ｌ−グルタミン酸無添加培地の結果を表１に、Ｌ−グルタミン酸を添加した培地の結果を表２に示す。
【００４８】
【表１】
【表２】
これらの結果から、高濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地では、ΔA株及びΔAD株のいずれもＬ−グルタミン酸の蓄積量及び収率が向上していることがわかる。また、ΔA株は、Ｌ−グルタミン酸を添加しない培地でも、Ｌ−グルタミン酸の収率が向上している。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、従来よりも高収率でＬ−グルタミン酸を生産することができる。
【００５２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 gluABCD遺伝子破壊用プラスミドpTΔADの構築過程を示す図。
【図２】 gluA遺伝子破壊用プラスミドpTΔAの構築過程を示す図。
Claims (3)
- gluA またはgluABCDオペロンの発現量が低下し、かつＬ−グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌をL-グルタミン酸を含む培地に培養し、培地中にＬ−グルタミン酸を生成蓄積させ、該培地からＬ−グルタミン酸を採取することを特徴とするＬ−グルタミン酸の製造法。
- 前記コリネ型細菌は gluAを欠失していることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 前記コリネ型細菌はgluA、gluB、gluC及びgluDのすべてを欠失していることを特徴とする請求項１記載の方法。
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