SK17952000A3

SK17952000A3 - Nukleotidové sekvencie kódujúce gén gpm a spôsob fermentatívnej výroby L-aminokyselín

Info

Publication number: SK17952000A3
Application number: SK1795-2000A
Authority: SK
Inventors: Bettina M�Ckel; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa-h�ls aktiengesellschaft
Priority date: 1999-12-02
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2002-02-05
Also published as: JP2001197891A; MXPA00010969A; HU0004782D0; PL344236A1; DE19958160A1; ID28564A; US7306939B2; BR0005699A; HUP0004782A2; EP1104812A1; KR20010062075A; US20020002275A1; ZA200007083B; CN1304999A; CA2325594A1; AU7177300A

Description

Nukleotidové sekvencie kódujúce gén gpm a spôsob fermentatívnej výroby L-amínokyselín

Oblasť techniky

Vynález opisuje nukleotidové ekvencie kódujúce gén gpm. Ďalej vynález opisuje spôsob fermentatívnj výroby aminokyselín, teda zvlášť L-lyzínu za použitia koryneformných baktérií, v ktorých je zosilnený gén gpm.

Doterajší stav techniky

L-amínokyseliny, zvlášť teda L-lyzín, sú významnými surovinami pre humánnu medicínu a farmaceutický priemysel, ale predovšetkým sú používané ako vhodné krmivá pre zvieratá.

Je známe, že tieto aminokyseliny môžu byť vyrobené fermentáciou vhodných kmeňov koryneformných baktérií, zvlášť baktérií druhu Corynebacterium glutamicum. Na zlepšenie spôsobu výroby sa sústavne pracuje vdaka významu, ktorý tieto aminokyseliny majú.

Zlepšenie spôsobu výroby týchto aminokyselín sa môže dosiahnuť prostredníctvom zmeny techniky fermentácie ako napríklad zmenou miešania a prevzdušňovania kyslíkom, alebo zmenou zloženia živného média ako napríklad zmenou koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo zmenou v spôsobe spracovania na výslednú formu napríklad dodatočným čistením pomocou chromatografie na ióntomeniči, či zmenou produkčných vlastností samotného fermentujúceho mikroorganizmu.

Na zlepšenie výknnosti produkčných mikroorganizmov s používajú spôsoby mutagenézy, selekcie a vyhľadávania mutantných klonov. Týmto spôsobom možno získať kmene, ktoré sú odolné k antimetabolitom ako je napríklad analóg lyzínu

S-(2-amínoetyl)-cysteín alebo sú auxotrofné vzhladom k regulačné dôležitým metabolitom a produkujú požadované

L-amínokyseliny.

Už niekolko rokov sa používajú na zlepšenie kmeňov Corynebacterium sp. produkujúcich L-amínokyseliny taktiež spôsoby rekombinantnéj DNA. Prehladné články týkajúce sa tohto problému možno nájsť napríklad u nasledovných autorov: Kinoshita ( Glutamic Acid Bacteria, v knihe : Biology of Industrial Microorganismus, Demain and Solomon (editori), Benjamín Cummings, London, UK, 1985, strana 115 až 142), Hilliger (BioTec, 2, strana 40 až 44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: strana 261 až 272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, strana 73 až 103 (1995)) a Sahm a ďalší (Annuals of the New York Academy of Science 782, strana 25 až 39 (1996)).

Vynález opisuje nové spôsoby fermentatívnej výroby aminokyselín, zvlášť teda L-lyzínu.

Podstata vynálezu

Aminokyseliny, zvlášť ale L-lyzín nachádzajú významné uplatnenie v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale predovšetkým sa používajú ako vhodné krmivá pre zvieratá. Z toho vyplýva všeobecný záujem o vylepšený spôsob výroby aminokyselín, hlavne L-lyzínu.

V nasledujúcom texte je pod pojmom L-lyzín alebo lyzín ponínaná nielen volná báza, ale taktiež jej soli ako napríklad monohydrochlorid lyzínu alebo sulfát lyzínu.

I. Predmetom vynálezu je polynukleoid izolovaný z koryneformných baktérií, ktorý obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, vybratú zo skupiny, ktorú tvoria:

a) polynukleotidy, ktoré sú aspoň zo 70 % identické s polynukleotidom kódujúcim peptid, ktoého aminkyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencii id. č.2,

b) polynukleotidy, kódujúce peptid, ktorý obsahuje amínokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň zo 70 % identická so sekvenciou aminokyselín podlá Sekveňcie id. č. 2,

c) polynukleotidy komplementárne k polynukleotidu podlá

a) alebo podía b), a

d) polynukleotidy, obsahujúce aspoň 15 za sebou idúcich bází z polynukleotidovej sekveňcie podía bodov a), b) alebo c)

II. Predmetom vynálezu je ďalej polynukleotid podía bodu I, pričom vo výhodnej realizácii ide o replikovateínú DNA obsahujúcu:

(i) nukleotidovú sekvenciu podía Sekveňcie id. č. 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii podía bodu (i) vzhladom na degeneráciu genetického kódu alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi so sekvenciami podía bodu (i) alebo (ii), prípadne (iv) funkčné neutrálne mutácie v sekvencii podlá bodu (i) ·

Vynález dalej opisuje:

polynukleotid podlá nároku 4, obsahujúci nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu Sekvencii id. č. 1 polynukleotid podlá nároku 6, kódujúci polypeptid, ktorého amínokyselinová sekvencia obsahuje Sekvenciu id.č. 2, vektor, obsahujúci polynukleotid podlá nároku 1, vo výhodnej realizácii kyvadlový vektor alebo plazmid pXk-gpmexp podlá obrázka 2, koryneformné baktérie slúžiace ako hostiteľské bunky, ktoré obsahujú vektor, alebo v ktorých j zosilnená expresia génu gpm.

Predmetom vynálezu sú taktiež polynukleotidy, ktoré podstatným spôsobom pozostávajú zo sekvencie, ktorú možno získať pomocou hybridizačného skríningu zodpovedajúcej knihovne obsahujúcej úplný gén so sekvenciou podlá Sekvencie id. č. 1, za použitia hybridizačnej sondy, ktorá má rakvenciu podlá Sekvencie id. č.l alebo aspoň jej fragmentu, ako aj izolácie uvedenej sekvencie DNA z knihovne.

Polynukleotidové sekvencie podlá vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, v prípade cDNA na izoláciu sekvencie o úplnej dĺžke (full- lenght) kódujúce fosfoglycerátmutázu a na izoláciu takých cDNA alebo génov, ktoré vykazujú vysokú sekvenčnú homológiu s génom na fosfoglycerátmutázu .

Polynukleotidové sekvencie podlá vynálezu sú ďalej vhodné ako primery prípravy DNA génov kódujúcich fosfoglycerátmutázu pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR).

Oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo primery obsahujú aspoň 30, vo výhodnej realizácii aspoň 20, v úplne zvlášť výhodnej realizácii aspoň 15 po sebe idúcich báz. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy o dĺžke aspoň 40 alebo 50 báz.

V ďalšom texte sa pod nasledujúcimi termínmi chápe:

Izolovaný znamená oddelený od svojho prirodzeného pozadia, respektíve okolia.

Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikovanú RNA alebo DNA alebo modifikovanú RNA alebo DNA.

Pod pojmom polypeptid sa chápe peptid alebo proteín, ktorý obsahuje dve alebo viacero aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.

Polypeptidy podlá vynálezu zahŕňajú polypeptid podlá Sekvencie id. č.:2, a zvlášť také s biologickou aktivitou fosfoglycerátmutázy a tiež také, identické s polypeptidom podlá výhodnej realizácii aspoň z 80 výhoanej realizácii aspoň z 90 polypeptidom podlá Sekvencie id. uvedenú aktivitu.

ktoré sú aspoň zo 70 %

Sekvencie id.č.: 2, vo % identické a vo zvlášť % až 95 % identické s

č.: 2 a ktoré vykazujú

Predmetom vynálezu je d'alej spôsob výroby aminokyselín, zvlášť L-lyzínu, za použitia koryneformných baktérií, hlavne takých, ktoré požadované aminokyseliny už produkujú a v ktorých je zosilnený gpm, hlavne tým, že je zvýšená jeho expresia.

Výrazom zosilnenie sa v tomto prípade chápe zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo niekolkých enzýmov, ktoré sú v mikroorganizme kódované príslušnými DNA, napríklad tým, že sa zvýši počet kópií génu (génov) na bunku, použije sa silný promotor, alebo sa použije gén kódujúci enzým so zvýšenou aktivitou, prípadne kombinácia týchto účinkov.

Predmetom vynálezu sú ďalej mikroorganizmy, ktoré sú schopné vytvárať L-amínokyseliny, zvlášť L-lyzín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerínu a etanolu. Môže ísť o rôzne koryneformné baktérie, zvlášť o baktérie rodu Corynebacterium. Z rodu Corynebacterium je potrebné uviesť predovšetkým baktérie druhu Corynebacterium glutamicum, ktoré sú odborrníkom známe pre svoju schopnosť produkovať L-amínokyseliny.

Vhodnými kmeňmi baktérií rodu Corynebacterium, zvlášť druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad tieto prirodzene sa vyskytujúce kmene:

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a

Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a od nich odvodené mutantné kmene produkujúce L-lyzin, ako napríklad:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1708

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a

Corynebacterium glutamicum DSM5715

Autorom vynálezu sa podarilo izolovať z baktérie C.

glutamicum nový gén gpm, ktorý kóduje enzým fosfoglycerátmutázu (EC 5.4.2.1).

Na izoláciu tohto génu gpm respektíve na izoláciu ďalších génov z baktérií C.glutamicum je potrebné najskôr vytvoriť génovú knihovňu tohto mikroorganizmu v baktériách E.coli. Vytvorenie takejto knihovne je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu Winnacker:Gény a klony: Úvod do genetických technológií (Gene und Klone: Eine Einfuhrung in die Gentechnologie, nakladateístvo Chémia, Weinheim, Nemecko 1990) alebo príručku Sambrook a ďalšie: Laboratórny manuál molekulárneho klonovania (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Príkladom jednej velmi známej knihovne je E. coli K-12 kmeňa W3110 v -vektoroch vytvorená a opíaná Kaharou a ďalšími (viď

Celí 50, strana 495 až 508 (1987)). Bathe a ďalší opisujú (viď Molecular and Generál Genetics, 1996) DNA knihovňu baktérie C. vytvorenú pomocou kozmidu SuperCos

252: strana 255 až 265, glutamicum ATCC13032,

I (Wahl a ďalší 1987,

Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: strana 2160 až 2164) v baktériách E. coli K-12 kmeňa NM554 (viď Raleigh a ďalší 1988, Nucleic Acids Research 16: strana 1563 až 1575). BÓrmann a ďalší. (Molecular Microbiology 6(3), strana 317 až 326)) ďalej opisujú knihovňu baktérií Cory nebacterium glutamicum ATCC13032 vytvorenú za použitia kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, strana 291 až 298 (1980)). Na prípravu DNA knihovne baktérie C. glutamicum v E. coli môžu byt použité taktiež plazmidy ako napríklad pBR322 ( Bolivar, Life Sciences, 25, strana 807 až 818 (1979)) alebo pUC9 (Vieira a ďalší, 1982, Gene, 19: strana 259 až 268). Ako hostitelské sú vhodné zvlášť také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinančne deficientné. Príkladom takého sú bunky kmeňa DH5«^MCR, viď Grant a ďalší National Academy of Sciences 4649. Dlhé fragmenty DNA byť následne použité na vektorov vhodných na sekvenáciu a sekvenované napríklad spôsobom podlá (Proceedings of the National Academy * United States of America, 74: strana 5463 i kmeňa edings strana kozmidov of the

4645 až môžu vhodných *

, ProceUSA, 87 (1990) klonované pomocou subklonovanie do inzerty následne Sangera a ďalších of Sciences of the až 5467, 1977).

Týmto sposobom bola ziskana nová sekvencia DNA kódujúca gén gpm z baktérií C. glutamicum. Táto sekvencia je súčasťou vynálezu a je uvedená ako Sekvencia id. č.íl. Ďalej bola od tejto sekvencie DNA vyššie opísanými spôsobmi odvodená sekvencia aminokyselín zodpovedajúceho proteínu. V sekvencii id. č.: 2 podlá vynálezu aminokyselín proteínu Gpm.

Kódujúe sekvencie DNA, genetického kódu zodpovedajú súčasťou vynálezu. Taktiež je uvedená práve sekvencia ktoré dôsledkom degenerácie

Sekvencii id.č.íl, sú taktiež sú súčasťou vynálezu sekvencie

DNA, ktoré hybridizujú so Sekvenciou id. č.:l alebo s jej časťami. Odborníkom sú ďalej známe konzervatívne zámeny aminokyselín, ako je napríklad zámena glycínu za alanín alebo zámena kyseliny asparagovej za kyselinu glutamovú. Tieto zámeny aminokyselín sa nazývajú sense mutations a vzhladom na to, že nevedú k zásadnej zmene aktivity proteínu, nazývajú sa tiež funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny v Na/lebo C-konci proteínu nemávajú zásadný negatívny vplyv na funkciu proteínu, ba v niektorých prípadoch môže dôjsť aj k jej stabilizácii. Odborník môže nájsť údaje, ktoré to potvrdzujú, okrem iného v práci Ben-Bassata a ďalších v časopise Journal of Bacteriology 169: strana 751 až 757 (1987), 0’Regana a ďalších v časopise Gene 77. strana 237 až 251 (1989), Sahin-Totha a ďalších v časopise Protein Sciences 3: strana 240 až 247 ( 1994), Hochuliho a ďalších v

Bio/Technology 6: strana 1321 až 1325 ( 1988) a v známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie. Amínokyselinové sekvencie, ktoré sú v tomto zmysle analogické sekvencii id. č.: 2 sú taktiež predmetom vynálezu.

Rovnakým spôsobom sú predmetom vynálezu sekvencie DNA, ktoré so Sekvenciou id.č.: 1 alebo jej časťou hybriduzujú. A nakoniec sú predmetom vynálezu sekvencie DNA amplifikované zo Sekvencie id. č.: 1 pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a špecifických primerov. Také oligonukleotidové primery majú typicky dĺžku aspoň 15 párov bází.

Návody na identifikáciu DNA pomocou hybridizácie môžu odborníci nájsť napríklad v príručke The DIG Systém Users Guide for Filter Hybridization (Príručka užívatela systému DIG na hybridizáciu) od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Manheim, Nemecko, 1993) a ďalej v článku Liebl a ďalší. (International Journal of Systematic Bacteriology ( 1991) 41:

strana 255 až 260). Návody na amplifikáciu DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník napríklad v príručke Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (Syntéza oligonukleotidov: praktický prístup, IRL Press, Oxford, Spojené kráľovstvo 1984) a v knihe Newton a Graham:PCR (Akademické nakladateľstvo Spektrum, Heildelberg, Nemecko, 1994).

Pôvodcovia vynálezu odhalili, že zvýšená expresia (over-expression) génu gpm vedie u koryneformných baktérií ku zvýšeniu produkcie aminokyselín, hlavne L-lyzínu.

Túto zvýšenú expresiu možno dosiahnuť rôznymi spôsobmi. Buď možno zvýšiť počet kópií zodpovedajúceho génu alebo možno zaviesť mutáciu do oblasti promotora a regulačnej oblasti alebo do väzobného miesta pre ribozóm, ktoré sa nachádza proti smeru transkripcie štruktúrneho génu.

Rovnakým spôsobom môžu účinkovať expresné kazety zabudované proti smeru transkripcie od štruktúrneho génu. Pomocou induktovateľných promotorov možno dalej zosilniť expresiu v priebehu fermentatívnej produkcie L-lyzínu. Expresiu možno ďalej zlepšiť predĺžením životnosti mRNA v bunke alebo inhibiciou rozkladu enzymatických proteinov. Gény alebo rekombinantné génové konštrukty podľa vynálezu sa pritom nachádzajú v plazmidovom vektore s rôznym počtom kópií na bunku alebo sú integrované v chromozóme a amplifikované. Alternatívne môže byť expresia príslušného génu dalej zvýšená zmenou zloženia média a spôsobu kultivácie.

Návody k tomu môžu odborníci nájsť okrem iného v publikáciách Martin a ďalší (Bio/Technology 5, strana 137 až 146 (1987)), Guerrero a ďalší (Gene 138, strana 35 až 41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, strana 428 až 430 (1988)), Eikmanns a ďalší (Gene 102, strana 93 až 98 (1991)), v Európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v patente USA č.: 4,601,893, v publikáciách Schwarzera a Puhlera (Bio/Technology 9, strana 84 až 87 (1991), Reinscheid a ďalší (Applied and Environmental Microbiology 60, strana 126 až 132 (1994)), LaBarre a ďalší (Journal of Bacteriology 175, strana 1001 až 1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v publikácii Malumbres a ďalší (Gene 134, strana 15 až 24 (1993)), v Japonskej otvorenej (laid open) špecifikácii JP-A-10229891, v publikácii Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, strana 191 až 195 (1998)), v publikácii Makrides Microbiological Reviews 60: strana 512 až 538 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a mlekulárnej biológie.

Expresiu génu gpm možno podía vynálezu zvýšiť napríklad pomocou vhodných plazmidov.

Je výhodné použiť taký plazmid, ktorý sa replikuje v baktériách Corynebacterium glutamicum. Také vektory sú známe zo stavu techniky. Je to napríklad vektor pZl (Menkel a ďalší, Applied and Environmental Microbiology ( 1989) 64: strana 549 až 554), alebo vektor pEKExl (Eikmanns a ďalší, Gene 102 ( 1991), strana 93 až 98), alebo plazmidy pHS2-l (Sonnen a ďalší, Gene 107: strana 69 až 74, (1991)) založený n kryptických plazmidoch pHM1519, pBLl alebo pGAl.Ďalej môžu byť rovnakým spôsobom použité ďalšie plazmidy, ako napríklad tie, ktoré sú založené na vektore pCG4 (US-A 4, 489, 160), alebo na pNG2 (Serwold-Davis a ďalší, FEMS Microbiology Letters 66, strana 119 až 124 (1990)), alebo na plazmide pAGl (US-A 5,158, 891).

Zvýšiť expresiu génu gpm možno napríklad prostredníctvom kyvadlového expresného plazmidu pXKgpmex replikovatelného v E. coli aj v C. glutamicum. Tento vektor obsahuje replikačný počiatok rep z plazmidu pGAl včítane replikačného efektoru rep (vidí US-A-5,175,108, Nesvera a ďalší, Journal of Bacteriology 179, strana 1525 až 1532 (1977)), ďalej obsahuje gén na rezistenciu ku kanamycínu aph (3’ )-IIa z Escherichia coli, replikačný počiatok, promotor trc, oblasť terminátorov TI a T2, gén lacl^ (represor lac-operonu E.coli) a mnohonásobné klonovacie misto (polyliker, mcs-multiple cloning site, Norrander,J.M. a ďalší, Gene 26, strana 101-106 (1983)) z plazmidu pTRC99A (Amann a ďalší, (1988), Gene 69: strana 301 až 315).

Kyvadlový expresný vektor pXKgpmexp je znázornený na obrázku 2.

Okrem zosilnenia génu gpm môže byť pre produkciu aminokyselín a zvlášť teda L-lyzínu ďalej výhodné ešte zosilniť jeden alebo niekolko enzýmov podielajúcich sa na biosyntéze aminokyselín, glykózy, enzýmov zúčastňujúcich sa na doplňovacích (anaplerotických ) biochemických pochodoch, enzýmov z cyklu kyseliny citrónovej alebo proteínov, podielajúcich sa na exporte aminokyselín.

Produkcia L-lyzínu môže byť podlá vynálezu zvýšená napríklad súčasným zosilnením expresie:

«génu dapA, ktorý kóduje dihydrodipikolinát syntázu (viď EP-B 0 197 10 335), alebo •génu gap, ktorý kóduje glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu (viď Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086), alebo •génu tpi, ktorý kóduje triosafosfát izomerázu ( viď Eikmanns ( 1992) Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086), alebo •génu pgk, ktorý kóduje 3-fosfoglycerát kinázu ( viď Eikmanns ( 1992) Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086), alebo •génu pyc, ktorý kóduje pyruvát karboxylázu (viď Eikmanns ( 1992), Journal of Bacteriology 174: strana 6076 až 6086), aleb •génu lysE, ktorý kóduje proteín podieľajúci sa na exporte lyzínu (viď DE-A-195 48 222), alebo •génu mqo, ktorý kóduje malát:chinon oxidoreduktázu ( viď Molenaar a ďalší ( 1998) European Journal of Biochemistry 254, strana 395 až 403), alebo •génu gpm (DE: 19959328.0, DSM 13115)

Okrem zosilnenia expresie génu gpm môže byť pre produkciu aminokyselín, zvlášť L-lyzínu výhodné súčasné zoslabenie expresie:

•génu pck, ktorý kóduje fosfopyruvát-karboxykinázu (viď DE 199 50 409.1, DSM 13047), alebo •génu pgi, ktorý kóduje glukóza-6-fosfát izomerázu ( viď US 09/396, 478, DSM 12969, alebo •génu poxB, ktorý kóduje pyruvát oxidázu ( viď DE:

19951975.7, DSM 13114), alebo •génu zwa ( viď DE: 19959327.2, DSM 13113).

Okrem zýšenej expresie génu gpm, môže byť ďalej pre produkciu aminokyselín podlá vynálezu, zvlášť ale L-lyzínu, výhodné ešte inhibovať nežiadúce vediajsie reakcie ( viď Nakayama: Breeding of amino Acid Producing Micro-organisms (Pestovanie mikroorganizmov produkujúcich aminokyseliny) v knihe: Overproduction of Microbial Products, (Výroba mikrobiálnych produktov) editrov Krumphanzla, Sikyty a Vanka, Academic Press, Londýn, Spojené královstvo, 1982).

Mikroorganizmy podlá vynálezu môžu byť za účelom produkcie aminokyselín, a hlavne L-lyzínu, kultivované kontinuálnym spôsobom, alebo spôsobmi diskontinuálnymi, či už vsádkovou (batoh) kultiváciou alebo vsádkovou kultiváciou s prítokom živín ( fed batoh) alebo vsádkovou kultiváciou s opakovaným pridaním živín (repeated fed batch). Prehlad známych spôsobov kultivácie je uvedený v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Úvod do biotechník, nakladatelstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenie, nakladatelstvo Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).

Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené v príručke Manual of Methods for Generál Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú bakteriológiu) vydaný Americkou bakteriologickou spoločnosťou (Američan Society for Bacteriology), Washington D.C., USA, v roku 1981. Ako zdroje uhlíka môžu byť použité cukry a uhlohydráty ako napríkld glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza, oleje a tuky ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk, mastné kyseliny, ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy ako napríklad glycerín a etanol a organické kyseliny ako napríklad kyselina octová. Tieto látky môžu byt použité buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje dusíka sa môžu použiť zlúčeniny obsahujúce organický dusík ako napríklad pepton, kvasničný extrakt, masový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múčka a močovina alebo anorganické zlúčeniny ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka sa môžu použiť buď jednotlivo alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu možno použiť hydrogénfosforečnan alebo dihydrogénfosforečnan draselný alebo zodpovedajúce sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nevyhnutné pre rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A nakoniec môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohatené o esenciálne rastové látky ako napríklad o aminokyseliny a o vitamíny. Na zvýšenie tvorby aminokyselín možno kultivačné médium Uvedené zložky sa môžu začiatku, alebo vhodným ešte obohatiť o ich prekurzory. pridať do média jednorázovo na spôsobom počas kultivácie.

Na kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité kyseliny, ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný a amoniak alebo kyslé zlúčeniny, ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potláčajúcich tvorbu peny, ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržať prostredníctvom vhodného selekčného činidla, napríklad antibiotika. Vhodné aérobné podmienky možno udržiavať privádzaním kyslíka alebo kyslík obsahujúce zmesi plynov, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na pestovanie baktérií sa normálne pohybuje od 20®C do 45 a výhodne od 25θ C do 40°C. Doba kultivácie by mala byť taká, aby sa dosiahlo maximum tvorby lyzínu. Toto maximum sa obyčajne dosiahne behom 10 až 160 hodín.

Analýza produkovaného L-lyzínu sa môže realizovať pomocou ióntomeničovej chromatografie na anexe s následnou derivatizáciou pomocou ninhydrínu, tak ako je opísané v práci Spackmana a ďalších (Analytical Chemistry, 30, (1958), strana 1190).

Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunečných kultúr (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen-DSMZ, Braunschweig SRN) podlá ustanovení Budapeštianskej zmluvy:

•baktérie Corynebacterium glutamicum kmeňa DSM715/ pXKgpmexp pod číslom DSM 13456 •baktérie Corynebacterium glutamicum kmeňa DSM5715/ pEC-XK pod číslom DSM 13455.

Spôsob podlá vynálezu možno použiť na fermentatívnu výrobu aminokyselín, zvlášť L-lyzínu.

Príklady realizácie vynálezu

Vynález bude ďalej vysvetlený v nasledujúcich príkladoch

Príklad 1: Príprava kozmidovej genómovej knihovne baktérie

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 r - r

Chromozomálna DNA baktéria orynebacterium glutamicum ATCC 13032 bola najskôr izolovaná a čiastočne naštiepená ( viď Tauch a ďalší (1995),Plazmid 33: strana 168 až 179) reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č.: 27-0913-02). Izolované DNA fragmenty boli defosforylované alkalickou fosfotázou z morských garnátov (shrimp alkaline phosphotase, Roche Molecular

Biochemícals, Manheim, Nemecko, kozmidu SuperCos I (viď Wahl a katalógové č: 1758250). DNA ďalší, (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences

USA 84: strana 2160 až 2164) získaného od firmy Cosmid Vector Kit, reštrikčným enzýmom

Stratagene (La Jolla, USA, SuperCosI katalógové č. 251301) bola naštiepená Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg,

Nemecko, katalógové č. 27-0948-02) a taktiež defosforylovaná alkalickou fosfotázou. Potom bola kozmidová DNA naštiepená reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-086804. Takto získané fragmenty kozmidovej DNA boli zmiešané s fragmentárni genómovej DNA

Corynebacterium glutamicum ATCC13032 a potom spojené pomocou T4-DNA ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0870-04).

Ligačná zmes bola potom zabalená do fágových častíc pomocou zabalovacieho extraktu Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL Packing Extract, katalógové č. 200217). Tieto fágové častice boli použité na infekciu E.coli kmeňa NM554 ( viď Raleigh a ďalší. 1988, Nucleic Acid Res. 16: strana 1563 až 1575). Bunky boli resuspendované v 10 mM MgSO4 a zmiešané s alikvotom fágovej suspenzie. Infekcia a titrácia kozmidovej knihovne bola zrealizovaná podlá príručky Sambrooka a ďalších ( 1989), Molecular Cloning: A. laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bunky boli vysiate na LB-agar ( viď Lennox, 1955, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 100 Aig/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri teplote 37° C boli vybraté jednotlivé rekombinantné klony.

Príklad 2: Izolácia a sekvenovanie génu gpm

Najskôr bola vyizolovaná kozmidová DNA jednej dobre oddelenej kolónie pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kitu ( kat. č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá inštrukcií výrobcu a tie boli potom čiastočne naštiepená reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 270913-02). Získané fragmenty DNA boli defosforylované alkalickou fosfotázou (Roche Molecular Biochemicals,Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). Po elektroforetickej separácii nasledovala izolácia fragmentov kozmidu o velkosti medzi 1500 a 2000 bp pomocou kitu QiaExII Gel Extraction Kit ( katalógové č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko).

Potom bol reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg,Nemecko, katalógové č.: 27-0868-04) naštiepený sekvenčný vektor pZero-1 od firmy Invitrogen (Groningen, Nizozemsko, katalógové č. K2500-01). Ligácia fragmentov kozmidu do sekvenčného vektora pZero-1 bola urobená podlá príručky Sambrook a ďalší ( 1989, Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom bola zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) inkubovaná cez noc. Ligačné zmesi boli potom elektroporáciou (Tauch a ďalší 1994, FEMS Microbiol Letters, 123. strana 343 až 347) transformované baktérie E. coli kmeňa DH5 *CMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87., strana 4645 až 4649). Transformované baktérie boli vysiate a LB-agar (Lennox, 1995, Virology, 1: strana

190) s prídavkom 50 xig/ml zeocínu.

Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov bola realizovaná pomocou zariadenia Biorobot 9600 ( katalógové číslo 900200, Qiagen, Hilden,Nemecko). Dideoxy-terminačné sekvenovanie plazmidov (Sanger a d’alší. 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: strana 5463 až 5467) s modifikáciami podľa Zimmermanna a ďalších ( 1990, Nucleic Acids Research, 18: strana 1067) bolo realizované s využitím sekvenčného kitu RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od firmy PE Applied Biosystems ( katalógové číslo 403044, Weiterstadt, Nemecko). Elektroforetická separácia a analýza sekvenčnej reakcie bola realizovaná na géli Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid ( 29 : 1) ( katalógové číslo A124.1, Roth, Karlsruhe, Nemecko) v prístroji ABI Prism 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).

Získané hrubé sekvenačné dáta boli spracované pomocou

Research, sekvencie balíka programového

14: strana 217 až derivátov plazmidu Počítačová kontigu. realizovaná programom Research, 14: strana zrealizované programom Nucleic Acids Research, redundantnej databáze knihovni USA (National

Staden ( 1986, Nucleic Acids 231) verzia 97-0. Jednotlivé pZerol boli zostavené analýza kódujúcich > XNIP (Staden, 1986, 217 až 231). Ďalšie BLAST (Altschul a 25: strana 3389 až 3402), proti NCBI uloženej v národnej lekárskej Library of Medicíne).

do súvislého oblastí

Nucleic analýzy ďalší bola

Acids boli

1997, neTakto bola získaná nukleotidová sekvencia, ktorá je uvdená vo vynáleze ako Sekvencia id. č.:l. Analýza tejto nukleotidovéj sekvencie odhalila jeden otvorený čítací rámec o veľkosti 744 párov báz, ktorý bol označený ako gén gpm. Tento gén kóduje polypeptid o veľkosti 248 aminokyselín, ktorý je súčasťou vynálezu ako Sekvencia id. č. 2.

Príklad 3: Príprava kyvadlového expresného vektoru pXKgmexp na zosilnenie génu gpm v baktériách C. glutamicum

3.1 Klonovanie génu gpm

Spôsobom podlá Eikmannsa a ďalších (Microbiology 140: strana 1817 až 1828 ( 1994) bola z baktérií C. glutamicum kmeňa ATCC 13032 izolovaná chromozomílna DNA. Na základe sekvencie génu gpm baktérie C. glutamicum známej z príkladu 2 boli vybraté nasledujúce oligonukleotidy na polymerázovú reťazovú reakciu (PCR):

• Gpm ( exl.l): 5* TAA AGT AAA CTA GTA CC 3’ •Gpm ( ex 2): 5* CTA CTT ATT ACC CTG GTT T 3’

Uvedené primery boli syntetizované firmou ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Nemecko). Bola urobená štandardná PCR podlá Innisa a ďalších (PCR protocols: A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) s plymerázou Pwo od firmy Roche Diagnostics GmbH (Manheim, Nemecko). Pomocou polymerázovej reťazovej reakcie bol izolovaný asi 0,77 kb dlhý fragment DNA, obsahujúci gén gpm.

0,77 kb dlhý fragment bol vyizolovaný z agarózového gélu pomocou kitu QiaExII Gel Extraction Kit ( katlógové č. 20021 , Qiagen, Hilden Nemecko).

3.2 Konštrukcia kyvadlového vektora pEC-XK99E

Konštrukcia kyvadlového vektora pEC-XK99E na expresiu v baktériách E.coli aj C. glutamicum vychádzala zo stavu techniky.

Vektor obsahuje ten replikačný začiatok rep z plazmidu pGAl včítane efektoru replikácie per ( viď US-A-5, 175, 108, Nesvera a ďalší, Journal of Bacteriology 179, strana 1525 až 1532, 1997)), ďalej obsahuje gén na rezistenciu ku kanamycínu aph(3 )-IIa z baktérií Escherichia coli, replikačný začiatok, promotor trc, oblasť terminátorov TI a T2, gén lacl^q(represor lac-operonu z baktérií E.coli) a mnohonásobné klonovacie miesto (polyliker, mcs- multiple cloning site, Norrander, J.M. a ďalší, Gene 26, strana 101-106 ( 1983)) z plazmidu pTRC99A (Amann a ďalší, ( 1988), strana 301 až 315).

Skonštruovaný kyvadlový vektor pEC-XK99E na expresiu v baktériách E.coli a C.glutamicum bol elektroporáciou (Liebl a ďalší (1989) FEMS Microbiology Letters 53: strana 299 až 303) prenesený do baktérií C.glutamicum DSM5715.

Selekcia transformantov bola zrealizovaná na LBHIS agare skladajúceho sa z 18,5 g/1 infúzneho média z mozgov a sŕdc, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 kvasnicového extraktu Bacto, 5 g/1 NaCI a 18 g/1 Bacto-agaru, s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu. V tomto médii boli baktérie inkubované 2 dni pri 33° C.

Plazmidová DNA bola z transformovaných baktérií izolovaná obvyklým spôsobom ( viď Petr-Wendisch a ďalší 1998, Microbiology 144, strana 915 až 927). Potom bola plazmidová D A naštiepená reštrikčnou endonukleázou HindlII a velkosť fragmentov overená elektroforézou na agarózovom géli.

Získaný plazmid bol označený pEC-XK99E ( viď obrázok 1).

Tento plazmid bol elektroporáciou vložený do baktérií C.

glutamicum kmeňa DSM5715, získaný kmeň bol pomenovaný

DSM5715/pEC-XK99E a uložený pod číslom DSM 13455 v Nemeckej zbierke pre mikroorganizmy a bunečné kultúry (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podlá pravidiel Budapeštianskej zmluvy.

3.3 Klonovanie génu gpm do kyvadlového vektora pEC-XK99E na použitie v baktériách E.coli a C. glutamicum

Ako vektor bol použitý kyvadlový plazmid pEC-XK99E na použitie v baktériách E. coli a c. glutamicum opísaný v príklade 3.2. Plazmidová DNA bola úplne naštiepená reštrikčným enzýmom EC1136II a potom defosforylovaná alkalickou fosfotázou z morských garnátov (Roche Diagnostics GmbH, Manhnheim, Nemecko, katalógové č. 1758250).

K takto pripravenému vektoru pEC-XK99E bol pridaný v príklade 3.1 opísaný, 0,77 kb dlhý PCR fragment, obsahujúci gén gpm. Obe časti boli spojené pomocou T4-DNA-ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Ligačná zmes bola použitá na kmeňa DH5ot (Hanahan, v knihe:

Nemecko, kat.č.27-0870-04). transformáciu buniek E.coli DNA cloning : A practical approach, zväzok 1, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA).

Selekcia klonov s plazmidom bola realizovaná na LB agare (Lennox, 1995, Virology, 1: strana 190) s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu. Po inkubácii trvajúcej cez noc pri teplote 37° c boli selektované jednotlivé rekombinantné klony. Plazmidová DNA jednej takej kolónie bola izolovaná kitom Qiaprep Spin Miniprep ( kat. č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá návodu výrobcu a potom naštiepená reštrikčnými enzýmami EcoRI a Xbal. Velkosti získaných fragmentov a totožnosť plazmidu bola potom overená elektrofosforézou na agarózovom géli. Získaný plazmid bol pomenovaný pXKgpmexp a je znázornený na obrázku 2.

Príklad 4: Transformácia baktérií kmeňa DSM5715 pomocou plazmidu pXKgpmexp

Bakteriálny kmeň DSM5715 bol pomocou elektroporácie (Liebl a ďalší (1989) FEMS Microbiology Letters 53: strana 299 až 303) transformovaný plazmidom pXKgpmexp. Selekcia transformantov bola zrealizovaná na LBHIS agare skladajúceho sa z 18,5 g/1 infúzneho média z mozgov a sŕdc, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu,2,5 g/1 kvasnicového extraktu Bacto, 5 g/1 NaCI a 18 g/1 Bacto-agaru, s prídavkom 25 mg/1 kanamycínu V tomto médiu boli baktérie inkubované 2 dni pri 33° C. Plazmidová DNA bola z transformovaných baktérií izolovaná obvyklým spôsobom ( viď Petr-Wendisch a ďalší 1998, Microbiology 144, strana 915 až 927). Potom bola plazmidová DNA naštiepená reštrikčnými endonukleázami EcoRI a Xbal a veľkosť fragmentov otvorená elektroforézou na agarózovom géli. Výsledný kmeň bol označený DSM5715/pXKgpmexp.

Nasledujúci mikroorganizmus bol uložený v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunečných kultúr (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen -DSMZ, Braunschweig, SRN) podľa ustanovení Budapeštianskej zmluvy:

•baktéria Corynebacterium glutamicum kmeňa DSM715/ pXKgpmexp pod číslom DSM 13456.

Prílad 5: Produkcia lyzínu

Kmeň baktérií C.glutamicum DSM5715/pXKgpmexp získaný v príklade 4 bol kultivovaný vo vhodnom živnom médiu a po tejto kultivácii bol stanovený obsah lyzínu v kultivačnom médiu.

Baktérie tohto kmeňa boli najskôr vysiate na agarovú platňu so zodpovedajúcim antibiotikom ( agar s vývarom z mozgu a srdca (Brain-Heart agar )) s prídavkom kanamycínu ( 25 mg/1) a inkubované 24 hodín pri 33° c. Z tejto agarózovej platne bolo naočkované inokulum ( 10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Ako médium pre toto inokulum bolo použité komplexné médium CglII.

Médium CglII
NaCI	2,5 g/l
Bacto pepton	10 g/l
Kvasnicový extrakt Bacto	10 g/l
Glukóza (autoklávovaná zvlášť)	2 % (w/v)
hodnota pH upravená na pH 7,4

K tomuto médiu bol pridaný knamycín ( 25 mg/1). Inokulum bolo inkubované 16 hodín pri 33° C a 240 otáčkach/ min na trepačke. Týmto inokulom bola naočkovaná hlavná produkčná kultúra. Počiatočný OD (660 nm) hlavnej produkčnej kultúry po pridaní inokula robila 0,1. Ako živné médium sa použilo médium MM.

Médium MM
CSL (Corn Steep Liguor)	5 g/l

MOPS ( kyselina morfolinopropansulfonová	20 g/1
Glukóza ( klávovaná oddelene)	50 g/1
Soli:
(nh₄)₂so₄)	25 g/1
kh₂po₄	0,1 g/1
MgSO₄*7 H₂O	1,0 g/1
CaCl/2 H₂O	10 mg/1
FeSO₄*7 H₂O	10 mg/1
MnSO₄* H₂O	5,0 mg/1
Biotín ( sterilné filtrovaný)	0,3 mg/1
Tiamín*HCl ( sterilné filtrovaný)	0,2 mg/1
Leucín ( sterilné filtrovaný)	0,1 g/1
CaCO₃	25 g/1

CSL, MOPS a roztok soli bol upravený vodným roztokom amoniaku na pH=7 a autoklávovaný. Potom sa pridali sterilné roztoky substrátov a vitamínov, ako aj suchý autoklávovaný CaCO₃.

Kultivácia prebiehala v 10 ml média v 100 ml

Erlenmeyerovej banke s retardérom. K médiu bolo priadné 25 mg/1 kanamycínu. Počas kultivácie bola udržiavaná teplota 33° C a 80 % vzdušná vlhkosť.

Po 72 hodinách bola zmeraná OD pri vlnovej dĺžke 660 nm na digitálnom spektrofotometri Biomek 1000 (Beckmann GmbH, Mníchov). Množstvo vyprodukovaného lyzínu bolo stanovené na amínokyselinovom analyzátore firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) pomocou chromatografie na iontomeniči a s následnou ninhydrínovou detekciou.

Výsledok tohto pokusu je uvedený v tabulke 1.

Kmeň

DSM5715

DSM5715/pXKgpmexp

OD(660)

6,8

7,3

Lyzín-HCl (g/1)

13,68

14,35

Opis obrázkov;

Obrázok 1: Reštrikčná mapa plazmidu pEC-XK99E.

Obrázok 2: Reštrikčná mapa plazmidu pXKgpmexp. Použité skratky a označenia majú nasledujúci význam:

Tet: gén na rezistenciu k tetracyklínu per: gén kontrolujúci počet kópií plazmidu pGAl oriE:plazmidový replikačný počiatok z baktérií E.coli rep: plazmidový replikačný počiatok z plazmidu pGAl baktérie C.glutamicum per: gén kontrolujúci počet kópií plazmidu pGAl

Ptrc:promotor trc z plazmidu pTRC99A

TI, T2:terminátory TI a T2 z plazmidu pTRC99A laclq:gén kódujúci represor lac operónu Kan: gén na rezistenciu ku kanamycínu gpm: gén gpm z baktérie C.glutamicum

EcoRI:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	EcoRI
EC1136II:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	EC1136II
HindlII:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	HindlII
Kpnl:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Kpnl
Sali:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Sali
Smal:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Smal
Pstl:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Pstl
BamHI:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	BamHI
Ncol:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Ncol
Xbal:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Xmal
Xmal:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Xmal
Sací:	cielové	miesto	reštrikčného	enzýmu	Sací.

Opis sekvencií

INFORMÁCIE O SEKVENCIÍ ID.Č.l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DÍiŽKA: 1020 párov báz (B) TYP: deoxyribonukleová kyselina (C) POČET VLÁKIEN : dve (D) TOPOLÓGIA: lineárna (vi) Pôvod:

(A) ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) POLOHA : 181 .. 924 (xi) OPIS SEKVENCIE ID.Č. 1:

acgcgcatca gaatgggtga accgccgcac agctatcgtc gaaacgcatc acggctaagt agacgccgtc gaacacgcca gctgtacaac gacgctattg aaacgcgcgt cgtggaacat gaacattctc ctgggcggcc 60 ccaacgaaaa tgtcgacggt 120 aaagtggcaa actagtacct 180

atg act

aac Asn

gga Gly

aaa Lys 5

ttg att

ctt Leu

cgt Arg 10

cac ggt

cag Gin

age gaa

tgg Trp

228

Met 1

Thr

Leu

íle

His

Gly

Ser

Glu 15

aac

gca

tcc

aac

cag

ttc

act

gga

tgg

gtc

gac

gtc

aat

ctg

acc

gaa

276

Asn

Ala

Ser

Asn

Gin

Phe

Thr

Gly

Trp

Val

Asp

Val

Asn

Leu

Thr

Glu

20

25

30

cag

ggt

gag

get

gag

gcc

aag

cgc

gga

ggc

gaa

ctc

gtc

gag

gca

324

Gin

Gly

Glu

Ala

Glu

Ala

Lys

Arg

Gly

Glu

Leu

Val

Glu

Ala

35

40

45

ggc

gtc

ctc

cca

ggc

gtt

gta

tac

acc

tcc

ttg

ctg

cgt

cgc

gcg

atc

372

Gly

Val

Leu

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Ser

Leu

Arg

Ala

íle

50

55

60

cgc

act

gca

aac

atc

gca

ctg

aac

get

gca

gac

cgc

cac

tgg

atc

cca

420

Arg

Thr

Ala

Asn

íle

Ala

Leu

Asn

Ala

Asp

Arg

His

Trp

íle

Pro

65

70

75

80

gtg

atc

cgc

gac

tgg

cgc

ctc

aac

gag

cgt

cac

tac

ggc

gca

ctg

cag

468

Val

íle

Arg

Asp

Trp

Arg

Leu

Asn

Glu

Arg

His

Tyr

Gly

Ala

Leu

Gin

85

90

95

ggc

ctt

gac

aag

get

gca

acc

aag

gaa

aaa

tac

ggc

gac

cag

ttc

516

Gly

Leu

Asp

Lys

Ala

Thr

Lys

Glu

Lys

Tyr

Gly

Asp

Gin

Phe

100

105

110

atg gaa

tgg cgc cgc

tcc tac gac acc cca cca

cca Pro

gag Glu 125

ctc Leu

gcg Ala

gat Asp

564

Met

Glu

Trp 115

Arg Arg

Ser Tyr

Asp Thr 120

Pro

gac

gca

gag

tac

tcc

cag

gca

aat

gac

cct

cgt

tac

gcg

gac

ctc

gac

612

Asp

Ala

Glu

Tyr

Ser

Gin

Ala

Asn

Asp

Pro

Arg

Tyr

Ala

Asp

Leu

Asp

130

135

140

gta

gtt

cca

cgc

acc

gaa

tgc

ctc

aag

gac

gtt

gtg

gtt

cgt

ttt

gtt

660

Val

Pro

Arg

Thr

Glu

Cys

Leu

Lys

Asp

Val

Arg

Phe

Val

145

150

155

160

cct

tac

ttc

gag

gaa

atc

ctg

cca

cgc

gca

aag

ggc

gaa

acc

708

Pro

Tyr

Phe

Glu

íle

Leu

Pro

Arg

Ala

Lys

Gly

Glu

Thr

165

170

175

gtc

ctc

atc

gca

cac

ggc

aac

tcc

ctg

cgt

gcg

ctg

gtt

aag

cac

756

Val

Leu

íle

Ala

His

Gly

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Leu

Val

Lys

His

180

185

190

ctt

gac

ggc

atc

tcc

gat

get

gat

atc

gca

gag

ctc

aac

atc

cca

acc

804

Leu

Asp

Gly

íle

Ser

Asp

Ala

Asp

íle

Ala

Glu

Leu

Asn

íle

Pro

Thr

195

200

205

ggc

atc

cca

ctg

gtc

tac

gaa

atc

gcc

gaa

gac

ggt

tcc

gta

aac

852

Gly

íle

Pro

Leu

Val

Tyr

Glu

íle

Ala

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Asn

210

215

220

cca

ggc

acc

tac

ctc

gat

cct

gag

gca

gcc

ggc

gca

900

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Asp

Pro

Glu

Ala

Gly

Ala

225

230

235

240

gca

gta

gca

aac

cag

ggt

aat

aag

tagctatttg

taggtgagca ctcttcttgc

954

Ala

Val

Ala

Asn

Gin

Gly

Asn

Lys

245 tttcgtattg ggcgtggtcc tcatgggcct cgccctacct gcgtatacga aaattaaaga 1014 tcggat

1020

Imormácie o sekvencií ID. č 2:

/k/ DÍŽJLA: 248 aminokyselín /£/ TYP : protein /0/ ORGANIZMUS: Corynobacterium glutamicum /xi/ OPIS SEKVENCIE ID.C 2:

Met 1

Thr

Asn

Gly

Lys 5

Leu

íle

Leu

Arg 10

His

Gly

Gin

Ser

Glu 15

Trp

Asn

Ala

Ser

Asn 20

Gin

Phe

Thr

Gly

Trp 25

Val

Asp

Val

Asn

Leu 30

Thr

Glu

Gin

Gly

Glu 35

Ala

Glu

Ala

Lys

Arg 40

Gly

Glu

Leu

Leu 45

Val

Glu

Ala

Gly

Val 50

Leu

Pro

Gly

Val

Val 55

Tyr

Thr

Ser

Leu

Leu 60

Arg

Ala

íle

Arg 65

Thr Ala

Asn

íle Ala Leu Asn Ala Ala Asp Arg

His

Trp

íle

Pro 80

70

75

Val

íle

Arg

Asp

Trp

Arg

Leu

Asn

Glu

Arg

His

Tyr

Gly

Ala

Leu

Gin

85

90

95

Gly

Leu

Asp

Lys

Ala

Thr

Lys

Glu

Lys

Tyr

Gly

Asp

Gin

Phe

100

105

110

Met

Glu

Trp

Arg

Ser

Tyr

Asp

Thr

Pro

Glu

Leu

Ala

Asp

115

120

125

Asp

Ala

Glu

Tyr

Ser

Gin

Ala

Asn

Asp

Pro

Arg

Tyr

Ala

Asp

Leu

Asp

130

135

140

Val

Pro

Arg

Thr

Glu

Cys

Leu

Lys

Asp

Val

Arg

Phe

Val

145

150

155

160

Pro

Tyr

Phe

Glu

íle

Leu

Pro

Arg

Ala

Lys

Gly

Glu

Thr

165

170

175

Val

Leu

íle

Ala

His

Gly

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Leu

Val

Lys

His

180

185

190

Leu

Asp

Gly

íle

Ser

Asp

Ala

Asp

íle

Ala

Glu

Leu

Asn

íle

Pro

Thr

195

200

205

Gly

íle

Pro

Leu

Val

Tyr

Glu

íle

Ala

Glu

Asp

Gly

Ser

Val

Asn

210

215

220

Pro

Gly

Thr

Tyr

Leu

Asp

Pro

Glu

Ala

Gly

Ala

225

230

235

240

Ala

Val

Ala

Asn

Gin

Gly

Asn

Lys

245 γν Φϊδ-Ζιοσο

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polynukleotid pochádzajúci z koryneformných baktérií, ktorý obsahuje polynukleotidovú sekvenciu, vybratú zo skupiny tvorenej:

(a) polynukleotidom, ktorý je aspoň zo 70 % identický s polynukleotidom kódujúcim polypeptid, ktorého amínokyselinová sekvencia je uvedená v Sekvencii id.č. 2, (b) polynukleotidom kódujúcim polypeptid, ktorý ob sahuje amínokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň zo 70 % identická so sekvenciou aminokyselín podlá Sekvencie id. č. 2, (c) polynukleotidom komplementárnym k polynukleotidu podlá a) alebo podlá b), (d) polynukleotidom obsahujúcim aspoň 15 za sebou idúcich báz z polynukleotidovej sekvencie podlá bodov a, b alebo c.
2. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorý je schopný replikácie v koryneformných baktériách, výhodne ide o rekombinantú DNA.
3. Polynukleotid podlá nároku 1, ktorý je tvorený DNA.
4. Polynukleotid podlá nároku 2, obsahujúci nukleotidovú sekvenciu podlá Sekvencie id. č.: 1.
5. Replikovatelné DNA podlá nároku 2, ktorá obsahuje:

(i) nukleotidovú sekvenciu podlá Sekvencie id.č.:

1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii podlá bodu (i) vzhladom na degeneráciu genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciou komplementárnou k sekvencii podlá bodu (i) alebo (ii) a prípadne (iv) funkčne neutrálne mutácie v sekvencii podlá bodu (i).
6. Poynukleotid podlá nároku 2, ktorý kóduje polypeptid, ktorého amínokyselinová sekvencia obsahuje Sekvenciu id.č.:2.
7. Spôsob výroby L-amínokyselín, zvlášť ale L-lyzínu, vyznačujúci sa tý m, že sa urobia nasledujúce kroky:

a) fermentujú sa mikroorganizmy, v ktorých je prinajmenšom zosilnený gén gpm, vo výhodnej realizácii je zvýšená jeho expresia

b) kultivačné médium alebo vlastné bakteriálne bunky sa obohatia o požadovanú L-amínokyselinu, a

c) izoluje sa požadovaná L-amínokyselina .
8. Spôsob podlá nároku 7, vyznačujúci sa t ý m, že sa použijú baktérie, v ktorých sú dodatočne zosilnené ešte ďalšie gény z biosyntetickej dráhy požadovanej L-amínokyseliny.
9. Spôsob podlá nároku 8,vyznačujúci sa tým, že sa použijú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne inhibujú metablické dráhy, ktoré znižujú produkciu L-lyzínu.
10. Spôsob podlá nároku 7,vyznačujúci sa tým, že sa použije bakteriálny kmeň transformovaný plazmidom, pričom tento plazmid obsahuje nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu gén gpm.
11. Spôsob podlá nárokov 7 až 10,vyznačuj úci s a t ý m, že sa použijú koryneformné baktérie produkujúce L-lyzín.
12. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa t ý m, že sa súčasne zvýši expresia génu dapA kódujúceho dihydrodipikolinát syntetázu.
13. Spôsob podlá nároku 8,vyznačujúci sa t ý m,že súčasne zosilnie fragment DNA, ktorý prepožičiava rezistenciu k S-(2-amínoetyl)-cysteínu.
14. Spôsob podlá nároku 8,vyznačujúci sa tým, že sa súčasne zvýši expresia génu gap kódujúceho glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu.
15. Spôsob podlá nároku 8, vyznačujúci sa t ý m, že sa súčasne zvýši expresia génu tpi kódujúceho triosafosfát izomerázu.
16. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že sa súčasne zvýši expresia génu pgk, kódujúceho 3-fosfoglycerát kinázu.
17. Spôsob podľa nároku 8,vyznačujúci sa t ý m,že sa súčasne zvýši expresia génu pyc, kódujúceho pyruvát karboxylázu.
18. Použitie nukleotidových sekvencií podľa nároku 1 ako primerov na prípravu DNA génov s rovnakou funkciou ako gén opcA, pomocou polymerázovej reťazovej reakcie.
19. Použitie polynukleotidovej sekvencie podľa nároku 1 ako hybridizačnej sondy.
20. Koryneformné mikroorganizmy, zvlášť z rodu Corynebacterium transformované replikovateľnou DNA podľa nároku 1 alebo 5.