JP2001197891A - ｇｐｍ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｇｐｍ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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- C12N9/90—Isomerases (5.)
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ｇｐｍ遺伝子をコードするヌクレオチド配列
ならびにｇｐｍ遺伝子が増幅されたコリネ細菌を用い
て、アミノ酸、特にＬ−リジン生産のための新規の発酵
方法の提供。 【解決手段】 次の群：ａ）コリネバクテリウムグルタ
ミクム（Ｃｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ）由来の特定のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７
０％同一であるポリヌクレオチド、ｂ）該アミノ酸配列
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｃ）ポ
リヌクレオチドａ）又はｂ）に対して相補的なポリヌク
レオチド、及びｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）ｂ）又は
ｃ）の連続する塩基少なくとも１５個を有するポリヌク
レオチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有する
コリネ細菌から単離されたポリヌクレオチドを用いる。
ならびにｇｐｍ遺伝子が増幅されたコリネ細菌を用い
て、アミノ酸、特にＬ−リジン生産のための新規の発酵
方法の提供。 【解決手段】 次の群：ａ）コリネバクテリウムグルタ
ミクム（Ｃｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍ
ｉｃｕｍ）由来の特定のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７
０％同一であるポリヌクレオチド、ｂ）該アミノ酸配列
に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ｃ）ポ
リヌクレオチドａ）又はｂ）に対して相補的なポリヌク
レオチド、及びｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）ｂ）又は
ｃ）の連続する塩基少なくとも１５個を有するポリヌク
レオチドから選択されたポリヌクレオチド配列を有する
コリネ細菌から単離されたポリヌクレオチドを用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はｇｐｍ遺伝子をコー
ドするヌクレオチド配列ならびにｇｐｍ遺伝子が増幅さ
れたコリネ細菌を用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを
生産するための発酵方法に関する。
ドするヌクレオチド配列ならびにｇｐｍ遺伝子が増幅さ
れたコリネ細菌を用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを
生産するための発酵方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸、特にＬ−リジンは、ヒト医学
および製薬工業において、しかしながら特に動物飼料学
において使用される。
および製薬工業において、しかしながら特に動物飼料学
において使用される。
【０００３】アミノ酸をコリネ細菌、特にコリネバクテ
リウムグルタミクム（Crynebacterium glutamicum）の
菌株を発酵によって生産することは公知である。それが
極めて重要であるために、生産方法を改善するための試
みが常になされている。方法の改善は発酵技術、例えば
攪拌および酸素供給を含む方法に関するものであっても
よいし、あるいは栄養媒体の組成、例えば発酵中の糖濃
度であってもよいし、あるいは生成物形態の後処理、例
えばイオン交換クロマトグラフィーによるものであって
もよいし、あるいは微生物自体の固有の生産特性に関す
るものであってもよい。
リウムグルタミクム（Crynebacterium glutamicum）の
菌株を発酵によって生産することは公知である。それが
極めて重要であるために、生産方法を改善するための試
みが常になされている。方法の改善は発酵技術、例えば
攪拌および酸素供給を含む方法に関するものであっても
よいし、あるいは栄養媒体の組成、例えば発酵中の糖濃
度であってもよいし、あるいは生成物形態の後処理、例
えばイオン交換クロマトグラフィーによるものであって
もよいし、あるいは微生物自体の固有の生産特性に関す
るものであってもよい。
【０００４】これら微生物の生産特性は、突然変異法、
選択法および突然変異選択法を用いることによって、抗
代謝物質、例えばリジン アナログＳ−（２−アミノエ
チル）システインに耐性であるか、あるいは調節に重要
な代謝物質に対して要求性であり、かつＬ−リジンを生
産する菌株を得るために改善される。
選択法および突然変異選択法を用いることによって、抗
代謝物質、例えばリジン アナログＳ−（２−アミノエ
チル）システインに耐性であるか、あるいは調節に重要
な代謝物質に対して要求性であり、かつＬ−リジンを生
産する菌株を得るために改善される。
【０００５】また、数年来、組み換えＤＮＡ技術の方法
は、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅させ、かつアミ
ノ酸生産作用を研究することによって、コリネバクテリ
ウムのアミノ酸生産菌株を改善するために使用されてい
る。この課題に関する文献は、すなわちキノシタ（Kino
shita）（“Glutamic Acid Bacteria”, in: Biologyof
Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Ed
s.), Benjamin Cummings, London,UK, 1985, 115〜14
2）、ヒリガー（Hilliger）（BioTec 2, 40〜44(199
1)）、エッゲリング（Eggeling）（Amino Acids 6, 261
〜272 (1994)）、ジェッテンおよびシンスキー（Jetten
and Sinskey）（Critical Reviews in Biotechnology
15, 73〜103 (1995)）およびシャームら（Sahm et al）
（Annals of the New York Academy of Science 782, 2
5〜39 (1996)）によって刊行されている。
は、個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅させ、かつアミ
ノ酸生産作用を研究することによって、コリネバクテリ
ウムのアミノ酸生産菌株を改善するために使用されてい
る。この課題に関する文献は、すなわちキノシタ（Kino
shita）（“Glutamic Acid Bacteria”, in: Biologyof
Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Ed
s.), Benjamin Cummings, London,UK, 1985, 115〜14
2）、ヒリガー（Hilliger）（BioTec 2, 40〜44(199
1)）、エッゲリング（Eggeling）（Amino Acids 6, 261
〜272 (1994)）、ジェッテンおよびシンスキー（Jetten
and Sinskey）（Critical Reviews in Biotechnology
15, 73〜103 (1995)）およびシャームら（Sahm et al）
（Annals of the New York Academy of Science 782, 2
5〜39 (1996)）によって刊行されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、アミ
ノ酸、特にＬ−リジンの発酵生産を改善させるための新
規方法を提供することである。
ノ酸、特にＬ−リジンの発酵生産を改善させるための新
規方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は次のよう
にして達成された。
にして達成された。
【０００８】アミノ酸、特にＬ−リジンはヒト医学、製
薬工業および特に動物飼料学において使用される。した
がって、アミノ酸、特にＬ−リジンを生産するための改
善された新規方法を提供することは、一般的に重要であ
る。
薬工業および特に動物飼料学において使用される。した
がって、アミノ酸、特にＬ−リジンを生産するための改
善された新規方法を提供することは、一般的に重要であ
る。
【０００９】以下にＬ−リジンまたはリジンが挙げられ
る場合には、これは塩基ばかりでなく、塩、例えばリジ
ン一塩酸塩またはリジン硫酸塩の意味として認識され
る。
る場合には、これは塩基ばかりでなく、塩、例えばリジ
ン一塩酸塩またはリジン硫酸塩の意味として認識され
る。
【００１０】本発明は、次の群： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％同
一であるポリヌクレオチド ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）ｂ）またはｃ）の連続す
る塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチドから
選択されたポリヌクレオチド配列を有するコリネ細菌か
ら単離されたポリヌクレオチドを提供する。
ードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％同
一であるポリヌクレオチド ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に対して相補的な
ポリヌクレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）ｂ）またはｃ）の連続す
る塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチドから
選択されたポリヌクレオチド配列を有するコリネ細菌か
ら単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】また、本発明は請求項１に記載のポリヌク
レオチドを提供し、この場合、これは好ましくは次の
群： （ｉ）配列番号１に示されたヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列（ｉ）に対して遺伝子暗号の縮退の範囲内
で一致する配列少なくとも一つ、または（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列とハイブリ
ダイズする配列少なくとも一つ、かつ場合によっては
（ｉｖ）（ｉ）の中立センス突然変異を有する複製可能
なＤＮＡである。
レオチドを提供し、この場合、これは好ましくは次の
群： （ｉ）配列番号１に示されたヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列（ｉ）に対して遺伝子暗号の縮退の範囲内
で一致する配列少なくとも一つ、または（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列とハイブリ
ダイズする配列少なくとも一つ、かつ場合によっては
（ｉｖ）（ｉ）の中立センス突然変異を有する複製可能
なＤＮＡである。
【００１２】また、本発明は、配列番号１に示されたヌ
クレオチド配列を有する、請求項４に記載のポリヌクレ
オチド、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする、請求項６に記載のポリヌクレ
オチド、請求項１に記載のポリペプチドを有するベクタ
ー、特にシャトルベクターまたは図２に示されたプラス
ミドベクターｐＸＫｇｐｍｅｘｐ、かつ前記ベクターを
含むか、またはｐｇｍ遺伝子が増幅された、ホスト細胞
として役立つコリネ細菌を提供する。
クレオチド配列を有する、請求項４に記載のポリヌクレ
オチド、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする、請求項６に記載のポリヌクレ
オチド、請求項１に記載のポリペプチドを有するベクタ
ー、特にシャトルベクターまたは図２に示されたプラス
ミドベクターｐＸＫｇｐｍｅｘｐ、かつ前記ベクターを
含むか、またはｐｇｍ遺伝子が増幅された、ホスト細胞
として役立つコリネ細菌を提供する。
【００１３】さらに、本発明は、配列番号１に相当する
ポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含む適切
な遺伝子ライブラリーを、配列番号１による前記ポリヌ
クレオチドの配列またはこれらのフラグメントを有する
プローブを用いてハイブリダイゼーションすることによ
ってスクリーニングし、かつ前記ＤＮＡ配列を単離する
ことによって得ることが可能なポリヌクレオチド配列か
ら実際になるポリヌクレオチドを提供する。
ポリヌクレオチド配列を有する完全な遺伝子を含む適切
な遺伝子ライブラリーを、配列番号１による前記ポリヌ
クレオチドの配列またはこれらのフラグメントを有する
プローブを用いてハイブリダイゼーションすることによ
ってスクリーニングし、かつ前記ＤＮＡ配列を単離する
ことによって得ることが可能なポリヌクレオチド配列か
ら実際になるポリヌクレオチドを提供する。
【００１４】ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡのためのハ
イブリダイゼーションプローブとして、本発明によるポ
リヌクレオチド配列は、ホスホグリセレートムターゼを
コードするｃＤＮＡｓの全長を単離し、かつｃＤＮＡｓ
またはホスホグリセレートムターゼ遺伝子の配列に対し
て高い類似性を示す配列を有する遺伝子を単離するため
に適している。
イブリダイゼーションプローブとして、本発明によるポ
リヌクレオチド配列は、ホスホグリセレートムターゼを
コードするｃＤＮＡｓの全長を単離し、かつｃＤＮＡｓ
またはホスホグリセレートムターゼ遺伝子の配列に対し
て高い類似性を示す配列を有する遺伝子を単離するため
に適している。
【００１５】さらに、本発明によるポリヌクレオチド配
列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ホス
ホグリセレートムターゼをコードする遺伝子のＤＮＡを
製造するためのプライマーとして適している。
列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ホス
ホグリセレートムターゼをコードする遺伝子のＤＮＡを
製造するためのプライマーとして適している。
【００１６】プローブまたはプライマーとして役立つこ
のようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、好
ましくは少なくとも２０個、かつ特に好ましくは少なく
とも１５個の連続する塩基を有する。また、少なくとも
４０個または５０個の塩基対の長さを有するオリゴヌク
レオチドは適している。
のようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、好
ましくは少なくとも２０個、かつ特に好ましくは少なく
とも１５個の連続する塩基を有する。また、少なくとも
４０個または５０個の塩基対の長さを有するオリゴヌク
レオチドは適している。
【００１７】“単離された”はその本来の環境から分離
されたことを意味する。
されたことを意味する。
【００１８】“ポリヌクレオチド”は一般にポリリボヌ
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、これは本発明において未修飾であるか修
飾されたＲＮＡｓまたはＤＮＡｓであることが可能であ
る。
クレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに関
し、この場合、これは本発明において未修飾であるか修
飾されたＲＮＡｓまたはＤＮＡｓであることが可能であ
る。
【００１９】“ポリペプチド”はペプチドであるか、あ
るいはペプチド連鎖を介して２つまたはそれ以上のアミ
ノ酸結合を有するタンパク質であるものとして認識され
る。
るいはペプチド連鎖を介して２つまたはそれ以上のアミ
ノ酸結合を有するタンパク質であるものとして認識され
る。
【００２０】本発明によるポリペプチドは配列番号２の
ポリペプチド、特にホスホグリセレートムターゼの生物
学的活性を有するこれらのもの、かつさらには配列番号
２のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であ
り、好ましくは少なくとも８０％および特に好ましくは
少なくとも９０％〜９５％同一であり、かつ前記活性を
有するものを含む。
ポリペプチド、特にホスホグリセレートムターゼの生物
学的活性を有するこれらのもの、かつさらには配列番号
２のポリペプチドに対して少なくとも７０％同一であ
り、好ましくは少なくとも８０％および特に好ましくは
少なくとも９０％〜９５％同一であり、かつ前記活性を
有するものを含む。
【００２１】さらに、本発明は、詳細にはすでにアミノ
酸を生産し、かつｇｐｍ遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列が増幅され、かつ特に過剰に発現されたコリネ細
菌を用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを生産するため
の発酵方法に関する。
酸を生産し、かつｇｐｍ遺伝子をコードするヌクレオチ
ド配列が増幅され、かつ特に過剰に発現されたコリネ細
菌を用いて、アミノ酸、特にＬ−リジンを生産するため
の発酵方法に関する。
【００２２】“増幅”の用語に関連しては、微生物中で
適切なＤＮＡによってコードされる１つまたはそれ以上
の酵素の細胞内活性を、例えば１つまたは複数の遺伝子
のコピー数を増加させるか、強いプロモーターを用いる
か、あるいは高い活性を有する適切な酵素をコードする
遺伝子を用いて、かつ場合によってはこれらの方法を組
み合わせることによって増加させることを示す。
適切なＤＮＡによってコードされる１つまたはそれ以上
の酵素の細胞内活性を、例えば１つまたは複数の遺伝子
のコピー数を増加させるか、強いプロモーターを用いる
か、あるいは高い活性を有する適切な酵素をコードする
遺伝子を用いて、かつ場合によってはこれらの方法を組
み合わせることによって増加させることを示す。
【００２３】本発明によって提供された微生物は、Ｌ−
アミノ酸、特にはＬ−リジンをグリコース、ショ糖、ラ
クトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン
またはセルロースまたはグリセロールおよびエタノール
から生産することができる。前記微生物はコリネ細菌の
典型的なものであってもよく、特にコリネバクテリウム
属であってもよい。コリネバクテリウムグルタミクム種
は、特にコリネバクテリウム属中で挙げられてもよく、
この場合、これはそのＬ−アミノ酸生産能力に関して当
業者に公知である。
アミノ酸、特にはＬ−リジンをグリコース、ショ糖、ラ
クトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプン
またはセルロースまたはグリセロールおよびエタノール
から生産することができる。前記微生物はコリネ細菌の
典型的なものであってもよく、特にコリネバクテリウム
属であってもよい。コリネバクテリウムグルタミクム種
は、特にコリネバクテリウム属中で挙げられてもよく、
この場合、これはそのＬ−アミノ酸生産能力に関して当
業者に公知である。
【００２４】次の公知の野生型菌株： コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidphilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３
９ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９およ
び ブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０ およびＬ−リジン生産突然変異株またはこれから製造さ
れた菌株、例えば： コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４および コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ ５７１５ は、コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム
グルタミクム種の適した菌株の例である。
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidphilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３
９ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９およ
び ブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０ およびＬ−リジン生産突然変異株またはこれから製造さ
れた菌株、例えば： コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４および コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ ５７１５ は、コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム
グルタミクム種の適した菌株の例である。
【００２５】本発明において、Ｃ．グルタミクムからホ
スホグリセレートムターゼ（EC 5.4.2.1）をコードする
新規ｇｐｍ遺伝子を単離することに成功した。
スホグリセレートムターゼ（EC 5.4.2.1）をコードする
新規ｇｐｍ遺伝子を単離することに成功した。
【００２６】Ｃ．グルタミクムからｇｐｍ遺伝子または
他の遺伝子を単離するための最初の工程は、この微生物
の遺伝子ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ中に構築すること
である。遺伝子ライブラリーの構築は、一般に公知の教
科書および解説書中に記載されている。挙げられてもよ
い例は、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ ＣｌｏｎｅｓＩｎ
ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990）
と題されたウイナッカー（Winnacker）による教科書ま
たはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Cold Spring Harbor L
aboratory Press, 1989）と題されたサンブルックら（S
ambrook et al.）による解説書である。極めて公知の遺
伝子ライブラリーはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｗ３１
１０のものであり、この場合、これはコハラら（Kohara
et al.）によってλベクター中に構築された。ベイス
ら（Bathe et al.）（Molecular and General Genetics
252, 255〜265, 1996）はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ
１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載しており、この
場合、これはコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wa
hl et al., 1987, Proceedings of the National Acade
my of Sciences USA 84, 2160〜2164）を用いて、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16, 1563〜1575）中で
構築された。同様にボルマンら（Boermann et al.）（M
olecular Microbiology 6(3), 317〜326）は、コスミド
ｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291〜298 (1
980)）を用いて、Ｃ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２の遺伝子ライブラリーを記載している。Ｅ．ｃｏｌｉ
中のＣ．グルタミクムの遺伝子ライブラリーは、また、
ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life sciences 25, 807〜818
(1979)）またはｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene 1
9, 259〜268）のようなプラスミドを用いて構築されて
もよい。制限性の欠失および組み換え系の欠失を有する
Ｅ．cｏｌｉ菌株はホストとして特に適しており、この
場合、この例は、グラントら（Grant et al.）（Procee
dingsof the national Academy of sciences USA 87 (1
990) 4645〜4649）によって記載されているＤＨ５αｍ
ｃｒ菌株である。コスミドの方法によってクローン化さ
れた長いＤＮＡフラグメントは、その後に順にシークエ
ンシングに適した市販のベクター中にサブクローニング
されてもよく、かつ後に、例えばサンガーら（Sanger e
t al.）によって記載されたようにシークエンシングさ
れた（Proceedingsof the National Academy of Scienc
es of the United States of America 74,5463〜5467,
1977）。
他の遺伝子を単離するための最初の工程は、この微生物
の遺伝子ライブラリーをＥ．ｃｏｌｉ中に構築すること
である。遺伝子ライブラリーの構築は、一般に公知の教
科書および解説書中に記載されている。挙げられてもよ
い例は、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅ ｔｏ ＣｌｏｎｅｓＩｎ
ｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ（Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990）
と題されたウイナッカー（Winnacker）による教科書ま
たはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Cold Spring Harbor L
aboratory Press, 1989）と題されたサンブルックら（S
ambrook et al.）による解説書である。極めて公知の遺
伝子ライブラリーはＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株Ｗ３１
１０のものであり、この場合、これはコハラら（Kohara
et al.）によってλベクター中に構築された。ベイス
ら（Bathe et al.）（Molecular and General Genetics
252, 255〜265, 1996）はＣ．グルタミクム ＡＴＣＣ
１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載しており、この
場合、これはコスミドベクターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wa
hl et al., 1987, Proceedings of the National Acade
my of Sciences USA 84, 2160〜2164）を用いて、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al.,
1988, Nucleic Acids Research 16, 1563〜1575）中で
構築された。同様にボルマンら（Boermann et al.）（M
olecular Microbiology 6(3), 317〜326）は、コスミド
ｐＨＣ７９（Hohn and Collins, Gene 11, 291〜298 (1
980)）を用いて、Ｃ．グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２の遺伝子ライブラリーを記載している。Ｅ．ｃｏｌｉ
中のＣ．グルタミクムの遺伝子ライブラリーは、また、
ｐＢＲ３２２（Bolivar, Life sciences 25, 807〜818
(1979)）またはｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene 1
9, 259〜268）のようなプラスミドを用いて構築されて
もよい。制限性の欠失および組み換え系の欠失を有する
Ｅ．cｏｌｉ菌株はホストとして特に適しており、この
場合、この例は、グラントら（Grant et al.）（Procee
dingsof the national Academy of sciences USA 87 (1
990) 4645〜4649）によって記載されているＤＨ５αｍ
ｃｒ菌株である。コスミドの方法によってクローン化さ
れた長いＤＮＡフラグメントは、その後に順にシークエ
ンシングに適した市販のベクター中にサブクローニング
されてもよく、かつ後に、例えばサンガーら（Sanger e
t al.）によって記載されたようにシークエンシングさ
れた（Proceedingsof the National Academy of Scienc
es of the United States of America 74,5463〜5467,
1977）。
【００２７】配列番号１として本発明の一部を構成す
る、ｇｐｍ遺伝子をコードするＣ．グルタミクムの新規
ＤＮＡ配列はこの方法で得られた。さらに、相当するタ
ンパク質のアミノ酸配列は前記の方法によって前記ＤＮ
Ａ配列から導かれた。得られるｇｐｍ遺伝子生成物のア
ミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
る、ｇｐｍ遺伝子をコードするＣ．グルタミクムの新規
ＤＮＡ配列はこの方法で得られた。さらに、相当するタ
ンパク質のアミノ酸配列は前記の方法によって前記ＤＮ
Ａ配列から導かれた。得られるｇｐｍ遺伝子生成物のア
ミノ酸配列は、配列番号２に示されている。
【００２８】また、遺伝暗号の縮退によって配列番号１
から得られるコーディングＤＮＡ配列も、本発明の一部
を構成する。同様に、配列番号１または配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列も、本発明の一部
分を構成する。さらに、アミノ酸の保存的置換、例え
ば、タンパク質中でのグリジンからアラニン、またはア
スパラギン酸からグルタミン酸への置換は、当業者に
“センス突然変異”として公知であり、この場合、これ
はタンパク質の活性において基本的な変更を引き起こす
ことがなく、すなわちこれは機能的に中立である。ま
た、タンパク質のＮ−末端および／またはＣ−末端での
変更は、実際にはその機能を妨げることなく、それどこ
ろかこれを安定化させる。従来技術は、この課題に関す
る情報、すなわちベンバサットら（Ben-Bassat et a
l.）（Journal of Bacteriology 169, 751〜757 (198
7)）、オリーガンら（O’Regan et al.）（Gene 77, 23
7〜251 (1989)）、サーイン・トースら（Sahin-Toth et
al.）（Protein Sciences 3, 240〜247 (1994)）およ
びホチューリら（Hochuli et al.）（Bio/Technology
6, 1321〜1325 (1988)）および遺伝学および分子生物学
の公知の教科書中で見出されるはずである。また、これ
に応じて配列番号２から生じるアミノ酸配列も、本発明
の一部分を形成する。
から得られるコーディングＤＮＡ配列も、本発明の一部
を構成する。同様に、配列番号１または配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列も、本発明の一部
分を構成する。さらに、アミノ酸の保存的置換、例え
ば、タンパク質中でのグリジンからアラニン、またはア
スパラギン酸からグルタミン酸への置換は、当業者に
“センス突然変異”として公知であり、この場合、これ
はタンパク質の活性において基本的な変更を引き起こす
ことがなく、すなわちこれは機能的に中立である。ま
た、タンパク質のＮ−末端および／またはＣ−末端での
変更は、実際にはその機能を妨げることなく、それどこ
ろかこれを安定化させる。従来技術は、この課題に関す
る情報、すなわちベンバサットら（Ben-Bassat et a
l.）（Journal of Bacteriology 169, 751〜757 (198
7)）、オリーガンら（O’Regan et al.）（Gene 77, 23
7〜251 (1989)）、サーイン・トースら（Sahin-Toth et
al.）（Protein Sciences 3, 240〜247 (1994)）およ
びホチューリら（Hochuli et al.）（Bio/Technology
6, 1321〜1325 (1988)）および遺伝学および分子生物学
の公知の教科書中で見出されるはずである。また、これ
に応じて配列番号２から生じるアミノ酸配列も、本発明
の一部分を形成する。
【００２９】同様に、配列番号１または配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は、本発明の一部
分を構成する。最終的には、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって、配列番号１から得られるプライマーを
用いて製造されるＤＮＡ配列は、本発明の一部分を構成
する。このようなオリゴヌクレオチドは典型的には少な
くとも１５個の塩基対の長さを有する。
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は、本発明の一部
分を構成する。最終的には、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）によって、配列番号１から得られるプライマーを
用いて製造されるＤＮＡ配列は、本発明の一部分を構成
する。このようなオリゴヌクレオチドは典型的には少な
くとも１５個の塩基対の長さを有する。
【００３０】従来技術は、すなわちベーリンガー・マン
ハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）（Mannheim, Ge
rmany, 1993）からの解説書“ＤＩＧシステム・ユーザ
ー・ガイド・フォー・フィルターハイブリダイゼーショ
ン（The DIG System Users Guide for Filter Hycricai
zetion ）”およびすなわちリーベルら（Liebl et a
l.）（International Journal of Systematic Bacterio
logy (1991) 41, 255〜260）のハイブリダイゼーション
によって、ＤＮＡ配列の同定に関する指示が見出される
はずである。従来技術は、すなわち、オリゴヌクレオチ
ド合成（Oligonucleotide synthesis）：プラクティカ
ル・アプローチ（practical approach）（IRL Press, O
xford, UK, 1984）と題されたガイトらによる解説書お
よびニュートンおよびグラハム（Newton and Graham）:
ＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Germany, 1994）中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によるＤＮＡ配列の増幅に関する指示が見出される
はずである。
ハイム社（Boehringer Mannheim GmbH）（Mannheim, Ge
rmany, 1993）からの解説書“ＤＩＧシステム・ユーザ
ー・ガイド・フォー・フィルターハイブリダイゼーショ
ン（The DIG System Users Guide for Filter Hycricai
zetion ）”およびすなわちリーベルら（Liebl et a
l.）（International Journal of Systematic Bacterio
logy (1991) 41, 255〜260）のハイブリダイゼーション
によって、ＤＮＡ配列の同定に関する指示が見出される
はずである。従来技術は、すなわち、オリゴヌクレオチ
ド合成（Oligonucleotide synthesis）：プラクティカ
ル・アプローチ（practical approach）（IRL Press, O
xford, UK, 1984）と題されたガイトらによる解説書お
よびニュートンおよびグラハム（Newton and Graham）:
ＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Germany, 1994）中で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によるＤＮＡ配列の増幅に関する指示が見出される
はずである。
【００３１】本発明者らは、ｇｐｍ遺伝子の過剰発現の
後に、コリネ細菌によるアミノ酸、特にＬ−リジンの生
産が改善されることを見出した。
後に、コリネ細菌によるアミノ酸、特にＬ−リジンの生
産が改善されることを見出した。
【００３２】過剰発現は、適切な遺伝子のコピー数の増
加またはプロモーターおよび構造遺伝子の上流に配置さ
れた調節領域またはリボソーム結合部位の突然変異によ
って達成されてもよい。構造遺伝子の上流に組み込まれ
た発現カセットは、同様の方法で作用する。誘導プロモ
ーターは付加的に、Ｌ−リジンの発酵生産を通しての発
現の増加を可能にする。また、ｍＲＮＡの寿命を延長さ
せるための方法は、発現を改善させる。さらに、酵素活
性は、酵素タンパク質の縮退を妨ぐことによって高めら
れる。遺伝子または遺伝子構造物は、可変のコピー数の
プラスミド中に配置されてもよいし、あるいは染色体中
に組み込まれ、かつ増幅されてもよい。あるいは、本発
明中で、培地の組成および培養技術を変更することによ
って遺伝子の過剰発現を達成することも可能である。
加またはプロモーターおよび構造遺伝子の上流に配置さ
れた調節領域またはリボソーム結合部位の突然変異によ
って達成されてもよい。構造遺伝子の上流に組み込まれ
た発現カセットは、同様の方法で作用する。誘導プロモ
ーターは付加的に、Ｌ−リジンの発酵生産を通しての発
現の増加を可能にする。また、ｍＲＮＡの寿命を延長さ
せるための方法は、発現を改善させる。さらに、酵素活
性は、酵素タンパク質の縮退を妨ぐことによって高めら
れる。遺伝子または遺伝子構造物は、可変のコピー数の
プラスミド中に配置されてもよいし、あるいは染色体中
に組み込まれ、かつ増幅されてもよい。あるいは、本発
明中で、培地の組成および培養技術を変更することによ
って遺伝子の過剰発現を達成することも可能である。
【００３３】従来技術は、マーチンら（Martin et a
l.）（Bio/Technology 5, 137〜146 (1987)）、ゲレロ
ら（Guerrero et al.）（Gene 138, 35〜41 (1994)）、
ツチヤおよびモリナガ（Tsuchiya and Morinaga）（Bio
/Technology 6, 428〜430 (1988)）、エイクマンら（Ei
kmanns et al.）（Gene 102, 93〜98 (1991)）、ヨーロ
ッパ特許第０４７２８６９号明細書、米国特許第４６０
１８９３号明細書、シュバルツアーおよびピューラー
（Schwarzer and Puehler）（Bio/Technology 9, 84〜8
7 (1991)）、レインシェイドら（Reinscheid et al.）
（Applied and Enviromental Microbiology 60, 126〜1
32 (1994)）、ラバルレら（LaBarre et al.）（Journal
of Bacteriology 175, 1001〜1007 (1993)）、特許明
細書ＷＯ９６／１５２４６、マルブレスら（Malumbres
et al.）（Gene 134, 15〜24 (1993)）、特開平１０−
２２９８９１、ジェンセンおよびハマー（Jensen and H
ammer）（Biotechnology and Bioengineering 58, 191
〜195 (1998)）およびマクリズ（Makrides）（Microbio
logical Reviews 60, 512〜538 (1996)）の適切な指示
書および遺伝学および分子生物学の公知の教科書中で見
出されるはずである。例えば、本発明によるｇｐｍ遺伝
子はプラスミドによって過剰に発現されている。
l.）（Bio/Technology 5, 137〜146 (1987)）、ゲレロ
ら（Guerrero et al.）（Gene 138, 35〜41 (1994)）、
ツチヤおよびモリナガ（Tsuchiya and Morinaga）（Bio
/Technology 6, 428〜430 (1988)）、エイクマンら（Ei
kmanns et al.）（Gene 102, 93〜98 (1991)）、ヨーロ
ッパ特許第０４７２８６９号明細書、米国特許第４６０
１８９３号明細書、シュバルツアーおよびピューラー
（Schwarzer and Puehler）（Bio/Technology 9, 84〜8
7 (1991)）、レインシェイドら（Reinscheid et al.）
（Applied and Enviromental Microbiology 60, 126〜1
32 (1994)）、ラバルレら（LaBarre et al.）（Journal
of Bacteriology 175, 1001〜1007 (1993)）、特許明
細書ＷＯ９６／１５２４６、マルブレスら（Malumbres
et al.）（Gene 134, 15〜24 (1993)）、特開平１０−
２２９８９１、ジェンセンおよびハマー（Jensen and H
ammer）（Biotechnology and Bioengineering 58, 191
〜195 (1998)）およびマクリズ（Makrides）（Microbio
logical Reviews 60, 512〜538 (1996)）の適切な指示
書および遺伝学および分子生物学の公知の教科書中で見
出されるはずである。例えば、本発明によるｇｐｍ遺伝
子はプラスミドによって過剰に発現されている。
【００３４】適したプラスミドはコリネ細菌中で複製さ
れた前記のものである。数多くの公知のプラスミドベク
ター、例えばｐＺｌ（Menkel et al., Applied and Env
iromental Microbiology (1989) 64, 549〜554）、ｐＥ
ＫＥｘ１（Eikmanns et al.,Gene 102, 93〜98 (199
1)）またはｐＨＳ２−１（Sonnen et al., Gene 107, 6
9〜74 (1991)）は、内在性プラスミドｐＨＭ１５１９、
ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミドベク
ター、例えばｐＣＧ４（US-A-４４８９１６０）、ｐＮ
Ｇ２（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Lett
ers 66, 119〜124(1990)）またはｐＡＧ１（US-A-５１
５８８９１）に基づくものは、同様の方法で使用されて
もよい。
れた前記のものである。数多くの公知のプラスミドベク
ター、例えばｐＺｌ（Menkel et al., Applied and Env
iromental Microbiology (1989) 64, 549〜554）、ｐＥ
ＫＥｘ１（Eikmanns et al.,Gene 102, 93〜98 (199
1)）またはｐＨＳ２−１（Sonnen et al., Gene 107, 6
9〜74 (1991)）は、内在性プラスミドｐＨＭ１５１９、
ｐＢＬ１またはｐＧＡ１に基づく。他のプラスミドベク
ター、例えばｐＣＧ４（US-A-４４８９１６０）、ｐＮ
Ｇ２（Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Lett
ers 66, 119〜124(1990)）またはｐＡＧ１（US-A-５１
５８８９１）に基づくものは、同様の方法で使用されて
もよい。
【００３５】ｇｐｍ遺伝子の過剰発現のために使用する
ことができるプラスミドの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グ
ルタミクム シャトル発現ベクター ｐＸＫｇｐｍｅｘ
ｐである。ベクターは複製エフェクター ｐｅｒ（US-A
-５１７５１０８；Nesvera et al., Journal of Bacter
iology 179, 1525〜1532 (1997)）、Ｅ．Ｃｏｌｉ（Esc
herichia coli）からのカナマイシン耐性遺伝子ａｐｈ
（３’）−ＩＩａ、複製起点、ｔｒｃプロモーター、停
止領域Ｔ１およびＴ２、ｌａｃＩq遺伝子（Ｅ．ｃｏｌ
ｉのｌａｃオペロンのリプレッサー）およびプラスミド
ｐＴＲＣ９９Ａ（Amann et al. (1988), Gene 69, 301
〜315）のマルチクローニング部位ｍｃｓ（Norrander,
J.M. et al., Gene 26, 101〜106 (1983)）を含めて、
プラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを有する。
ことができるプラスミドの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グ
ルタミクム シャトル発現ベクター ｐＸＫｇｐｍｅｘ
ｐである。ベクターは複製エフェクター ｐｅｒ（US-A
-５１７５１０８；Nesvera et al., Journal of Bacter
iology 179, 1525〜1532 (1997)）、Ｅ．Ｃｏｌｉ（Esc
herichia coli）からのカナマイシン耐性遺伝子ａｐｈ
（３’）−ＩＩａ、複製起点、ｔｒｃプロモーター、停
止領域Ｔ１およびＴ２、ｌａｃＩq遺伝子（Ｅ．ｃｏｌ
ｉのｌａｃオペロンのリプレッサー）およびプラスミド
ｐＴＲＣ９９Ａ（Amann et al. (1988), Gene 69, 301
〜315）のマルチクローニング部位ｍｃｓ（Norrander,
J.M. et al., Gene 26, 101〜106 (1983)）を含めて、
プラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを有する。
【００３６】シャトル発現ベクターｐＸＫｇｐｍｅxＰ
は図２に示されている。
は図２に示されている。
【００３７】さらに、アミノ酸、特にＬ−リジンの生産
のために、ｇｐｍ遺伝子ばかりでなく、特別な生合成経
路、解糖系、アナプレロティック経路、クエン酸回路ま
たはアミノ酸排出系の一つまたはそれ以上の酵素を過剰
に発現することは有利であってもよい。
のために、ｇｐｍ遺伝子ばかりでなく、特別な生合成経
路、解糖系、アナプレロティック経路、クエン酸回路ま
たはアミノ酸排出系の一つまたはそれ以上の酵素を過剰
に発現することは有利であってもよい。
【００３８】したがって、例えば次の群をＬ−リジン生
産のために過剰に発現させてもよい： ●同時に、ジヒドロジピコリネート シンターゼをコー
ドするｄａｐＡ遺伝子（EP-B-０１９７３３５）、また
は ●同時に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992), Jou
rnal of Bacteriology 174, 6076〜6086）、または ●同時に、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする
ｔｐｉ遺伝子（Eikmanns(1992), Journal of Bacteriol
ogy 174, 6076〜6086）、または ●同時に、３−ホスホグリセレート キナーゼをコード
するｐｇｋ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bact
eriology 174, 6076〜6086）、または ●同時に、ピルベートカルボキシラーゼをコードするｐ
ｙｃ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriolo
gy 174, 6076〜6086）、または ●同時に、リジン排出系をコードするｌｙｓＥ遺伝子
（DE-A-１９５４８２２２）、または ●同時に、マレート キノン オキシドレダクターゼを
コードするｍqｏ遺伝子（Molenaar et al. (1998), Eur
opean Journal of Biochemistry 254, 395〜403）、ま
たは ●ｚｗａｌ遺伝子（DE19959328.0, DSM13115）。
産のために過剰に発現させてもよい： ●同時に、ジヒドロジピコリネート シンターゼをコー
ドするｄａｐＡ遺伝子（EP-B-０１９７３３５）、また
は ●同時に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992), Jou
rnal of Bacteriology 174, 6076〜6086）、または ●同時に、トリオースリン酸イソメラーゼをコードする
ｔｐｉ遺伝子（Eikmanns(1992), Journal of Bacteriol
ogy 174, 6076〜6086）、または ●同時に、３−ホスホグリセレート キナーゼをコード
するｐｇｋ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bact
eriology 174, 6076〜6086）、または ●同時に、ピルベートカルボキシラーゼをコードするｐ
ｙｃ遺伝子（Eikmanns (1992), Journal of Bacteriolo
gy 174, 6076〜6086）、または ●同時に、リジン排出系をコードするｌｙｓＥ遺伝子
（DE-A-１９５４８２２２）、または ●同時に、マレート キノン オキシドレダクターゼを
コードするｍqｏ遺伝子（Molenaar et al. (1998), Eur
opean Journal of Biochemistry 254, 395〜403）、ま
たは ●ｚｗａｌ遺伝子（DE19959328.0, DSM13115）。
【００３９】ｇｐｍ遺伝子の増幅に加えて、アミノ酸、
特にＬ−リジンを製造するために、同時に次の群を転写
減衰することも有利であってよい： ●ホスホエノルピルベートカルボキシラーゼをコードす
るｐｃｋ遺伝子（DE 19950409.1, DSM13047）、または ●グリコース６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ遺伝子（US 09/396478, DSM 12969）、または ●ピルベートオキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子
（DE 19951975.7, DSM13114）、または ●ｚｗａ２遺伝子（DE 19959327.2, DSM13113）。
特にＬ−リジンを製造するために、同時に次の群を転写
減衰することも有利であってよい： ●ホスホエノルピルベートカルボキシラーゼをコードす
るｐｃｋ遺伝子（DE 19950409.1, DSM13047）、または ●グリコース６−リン酸イソメラーゼをコードするｐｇ
ｉ遺伝子（US 09/396478, DSM 12969）、または ●ピルベートオキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子
（DE 19951975.7, DSM13114）、または ●ｚｗａ２遺伝子（DE 19959327.2, DSM13113）。
【００４０】また、アミノ酸、特にＬ−リジンを製造す
るために、ｇｐｍ遺伝子を過剰に発現するばかりでな
く、望ましくない２次反応をスイッチオフ（switch of
f）することも有利であってよい（Nakayama: “Breedin
g of Amino Acid Producing Micro-organisms”, in: O
verproduction of Microbial Products, Krumphanzl, S
ikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1
982）。
るために、ｇｐｍ遺伝子を過剰に発現するばかりでな
く、望ましくない２次反応をスイッチオフ（switch of
f）することも有利であってよい（Nakayama: “Breedin
g of Amino Acid Producing Micro-organisms”, in: O
verproduction of Microbial Products, Krumphanzl, S
ikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1
982）。
【００４１】本発明によって製造された微生物は、アミ
ノ酸、特にＬ−リジンを製造するために、連続的にかま
たは断続的に、回分法、半回分法または反復半回分法に
よって培養することができる。公知培養方法の概要はシ
ュミール（Schmiel）による教科書（Bioprozesstechnik
1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Biopro
cess Technology1. Introduction to Bioengineering)
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはス
トーハス（Storhas）による教科書（Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Bioreactors and Periphera
l Equipment)(Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1
994)）で記載されている。
ノ酸、特にＬ−リジンを製造するために、連続的にかま
たは断続的に、回分法、半回分法または反復半回分法に
よって培養することができる。公知培養方法の概要はシ
ュミール（Schmiel）による教科書（Bioprozesstechnik
1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Biopro
cess Technology1. Introduction to Bioengineering)
(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)）またはス
トーハス（Storhas）による教科書（Bioreaktoren und
periphere Einrichtungen (Bioreactors and Periphera
l Equipment)(Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1
994)）で記載されている。
【００４２】使用されるべき培地は特別な菌株の要求を
適切に満たすものでなければならない。種々の微生物の
ための培地の記載は、アメリカン・ソサエティー・フォ
ー・バクテリオロジー（American Society for Bacteri
ology）（Washington DC, USA, 1981）からの解説書
“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”で見出すこと
ができる。使用されてもよい炭素源は糖および炭化水
素、すなわちグルコース、ショ糖、ラクトース、フルク
トース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロー
ス、油および脂肪、すなわち大豆油、ヒマワリ油、落花
生油およびココナッツ油、脂肪酸、すなわちパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノレイン酸、アルコール、例
えばグリセロールおよびエタノール、ならびに有機酸、
例えば酢酸である。これらの物質は別個にかまたは混合
物として使用することができる。使用されてもよい窒素
源は窒素含有有機化合物、例えばペプトン、イーストエ
クストラクト、肉エキス、麦芽エキス、コーン浸漬液、
大豆ミールおよび尿素または無機化合物、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、
炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムである。窒素
源は別個にかまたは混合物として使用することができ
る。使用されてもよいリン源はリン酸、リン酸二水素カ
リウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相当するナト
リウム塩である。培地は金属塩、例えば硫酸マグネシウ
ムまたは硫酸鉄を含んでいなければならず、この場合、
これは成長に必要不可欠なものである。最後に、必須成
長促進物質、例えばアミノ酸およびビタミンを前記物質
に加えて使用することができる。また、適した前駆物質
も培地に添加することができる。前記供給材料は培養に
すべて一度に添加されてもよいし、あるいは培養中に適
切に供給されてもよい。
適切に満たすものでなければならない。種々の微生物の
ための培地の記載は、アメリカン・ソサエティー・フォ
ー・バクテリオロジー（American Society for Bacteri
ology）（Washington DC, USA, 1981）からの解説書
“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”で見出すこと
ができる。使用されてもよい炭素源は糖および炭化水
素、すなわちグルコース、ショ糖、ラクトース、フルク
トース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロー
ス、油および脂肪、すなわち大豆油、ヒマワリ油、落花
生油およびココナッツ油、脂肪酸、すなわちパルミチン
酸、ステアリン酸およびリノレイン酸、アルコール、例
えばグリセロールおよびエタノール、ならびに有機酸、
例えば酢酸である。これらの物質は別個にかまたは混合
物として使用することができる。使用されてもよい窒素
源は窒素含有有機化合物、例えばペプトン、イーストエ
クストラクト、肉エキス、麦芽エキス、コーン浸漬液、
大豆ミールおよび尿素または無機化合物、例えば硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、
炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムである。窒素
源は別個にかまたは混合物として使用することができ
る。使用されてもよいリン源はリン酸、リン酸二水素カ
リウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相当するナト
リウム塩である。培地は金属塩、例えば硫酸マグネシウ
ムまたは硫酸鉄を含んでいなければならず、この場合、
これは成長に必要不可欠なものである。最後に、必須成
長促進物質、例えばアミノ酸およびビタミンを前記物質
に加えて使用することができる。また、適した前駆物質
も培地に添加することができる。前記供給材料は培養に
すべて一度に添加されてもよいし、あるいは培養中に適
切に供給されてもよい。
【００４３】培養のｐＨは塩基性化合物、例えば水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモ
ニア水溶液または酸性化合物、例えばリン酸または硫酸
の適切な使用によって調整される。起泡は起泡抑制剤、
例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを用いて調整され
てもよい。プラスミドの安定性は、適した選択的作用物
質、例えば抗生物質を培地に添加することによって維持
されてもよい。好気条件は酸素または酸素含有ガス混合
物、例えば空気を培養に装入することによって維持され
る。培養温度は通常２０℃〜４５℃および好ましくは２
５℃〜４０℃である。培養はＬ−リジン形成が最大に達
するまで続けられる。この目的は通常１０時間〜１６０
時間内に達成される。
ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモ
ニア水溶液または酸性化合物、例えばリン酸または硫酸
の適切な使用によって調整される。起泡は起泡抑制剤、
例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを用いて調整され
てもよい。プラスミドの安定性は、適した選択的作用物
質、例えば抗生物質を培地に添加することによって維持
されてもよい。好気条件は酸素または酸素含有ガス混合
物、例えば空気を培養に装入することによって維持され
る。培養温度は通常２０℃〜４５℃および好ましくは２
５℃〜４０℃である。培養はＬ−リジン形成が最大に達
するまで続けられる。この目的は通常１０時間〜１６０
時間内に達成される。
【００４４】Ｌ−リジンは後のニンヒドリン誘導体化を
含むアニオン交換クロマトグラフィーによって、スパッ
クマンら（Spackman et al.）（Analytical Chemistry
30 (1958) 1190）によって記載されているように分析さ
れてもよい。
含むアニオン交換クロマトグラフィーによって、スパッ
クマンら（Spackman et al.）（Analytical Chemistry
30 (1958) 1190）によって記載されているように分析さ
れてもよい。
【００４５】次の微生物は、ドイチェ・ザンムルング・
フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツエルクルト
ウーレン（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen u
nd Zellkulturen（DSMZ）, Brunswick, Germany）（Ger
man Collection of Microorganisms and Cell Cultre
s）に、ブタプスト条約に基づいて１７．０４．２００
０で寄託された： ●ＤＳＭ１３４５６として、コリネバクテリウム グル
タミクム菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＸＫｇｐｍｅｘｐ ●ＤＳＭ１３４５５として、コリネバクテリウム グル
タミクム菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＫ 本発明による発酵方法は、アミノ酸、特にＬ−リジンの
生産のために使用される。
フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツエルクルト
ウーレン（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen u
nd Zellkulturen（DSMZ）, Brunswick, Germany）（Ger
man Collection of Microorganisms and Cell Cultre
s）に、ブタプスト条約に基づいて１７．０４．２００
０で寄託された： ●ＤＳＭ１３４５６として、コリネバクテリウム グル
タミクム菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＸＫｇｐｍｅｘｐ ●ＤＳＭ１３４５５として、コリネバクテリウム グル
タミクム菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ−ＸＫ 本発明による発酵方法は、アミノ酸、特にＬ−リジンの
生産のために使用される。
【００４６】
【実施例】本発明は、実施例を用いて以下により詳細に
例証される。
例証される。
【００４７】例１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）（19
55, Plasmid 33, 168〜179）によって示されたように単
離し、かつ制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmaci
a, Freiburg, Germany, product description Sau3AI,
code no. 27-0913-02）で部分的に切断した。ＤＮＡフ
ラグメントをエビ アルカリホスファターゼ（shrinp a
lkaline phosphatase）（Roche Molecular Biochemical
s, Mannheim, Germany, product description SAP, cod
e no. 1758250）で脱リン酸化した。ストラタジーン社
（Stratagene）から得られた、コスミドベクターＳｕｐ
ｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ（Wahlet al. (1987) Proceeding
s of the National Academy of Sciences USA 84, 2160
〜2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia, Fr
eiburg, Germany, product description XbaI, code n
o. 27-0948-02）で切断し、かつさらにエビ アルカリ
ホスホターゼ（shrimp alkaline phosphatase）で脱リ
ン酸化した。その後に、コスミドＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg,Germany, prod
uct description BamHI, code no. 27-0868-04）で切断
した。この方法で処理されたコスミドＤＮＡを、処理さ
れたＡＴＣＣ１３０３２ＤＮＡと混合させ、かつこの混
合物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersham Pharmacia, Frei
burg, Germany, product description T4 DNA ligase,
code no. 27-0870-04）で処理した。ライゲーション混
合物をその後にギガパックＩＩ ＸＬ パッキングエク
ストラクト（Stratagene, La Jolla, USA, product des
cription GigapackII XL Packing Extract, code no. 2
00217）を用いてファージ中にパッケージングした。
Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988,
Nucleic acidsResearch 16, 1563〜1575）の感染のため
に、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ4中へ入れ、かつファー
ジ懸濁液のアリコートと混合した。感染およびコスミド
ライブラリーの滴定をザンブルックら（Sambrool et a
l.）によって示されたように実施し（1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r）、この場合、この細胞をアンピシリン１００ｍｇ／
ｌを含むＬＢアガー（Lennox,1955, Virology1, 190）
に播いた。３７℃で一晩に亘る培養の後に、組み換え単
一クローンを選択した。
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）（19
55, Plasmid 33, 168〜179）によって示されたように単
離し、かつ制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmaci
a, Freiburg, Germany, product description Sau3AI,
code no. 27-0913-02）で部分的に切断した。ＤＮＡフ
ラグメントをエビ アルカリホスファターゼ（shrinp a
lkaline phosphatase）（Roche Molecular Biochemical
s, Mannheim, Germany, product description SAP, cod
e no. 1758250）で脱リン酸化した。ストラタジーン社
（Stratagene）から得られた、コスミドベクターＳｕｐ
ｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ（Wahlet al. (1987) Proceeding
s of the National Academy of Sciences USA 84, 2160
〜2164）を制限酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia, Fr
eiburg, Germany, product description XbaI, code n
o. 27-0948-02）で切断し、かつさらにエビ アルカリ
ホスホターゼ（shrimp alkaline phosphatase）で脱リ
ン酸化した。その後に、コスミドＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg,Germany, prod
uct description BamHI, code no. 27-0868-04）で切断
した。この方法で処理されたコスミドＤＮＡを、処理さ
れたＡＴＣＣ１３０３２ＤＮＡと混合させ、かつこの混
合物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersham Pharmacia, Frei
burg, Germany, product description T4 DNA ligase,
code no. 27-0870-04）で処理した。ライゲーション混
合物をその後にギガパックＩＩ ＸＬ パッキングエク
ストラクト（Stratagene, La Jolla, USA, product des
cription GigapackII XL Packing Extract, code no. 2
00217）を用いてファージ中にパッケージングした。
Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株ＮＭ５５４（Raleigh et al., 1988,
Nucleic acidsResearch 16, 1563〜1575）の感染のため
に、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ4中へ入れ、かつファー
ジ懸濁液のアリコートと混合した。感染およびコスミド
ライブラリーの滴定をザンブルックら（Sambrool et a
l.）によって示されたように実施し（1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbo
r）、この場合、この細胞をアンピシリン１００ｍｇ／
ｌを含むＬＢアガー（Lennox,1955, Virology1, 190）
に播いた。３７℃で一晩に亘る培養の後に、組み換え単
一クローンを選択した。
【００４８】例２ ｇｐｍ遺伝子の単離およびシークエンシング 単一コロニーのコスミドＤＮＡをキアプレップ スピン
ミニプレップ キット（Qiaprep Spin Miniprep ki
t）（製品番号27106, Quiagen, Hilden, Germany）を用
いて製品取り扱い説明書に従って単離し、かつ部分的に
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freibur
g, Germany, 製品番号27-0913-02）で切断した。ＤＮＡ
フラグメントをエビ アルカリホスファターゼ（shrimp
alkalinephosphatase）（Roche Molecular Biochemica
ls, Mannheim, Germany, productdescription SAP, 製
品番号1758250）で脱リン酸化した。ゲル電気泳動によ
る分離の後に、１５００ｂｐ〜２０００ｂｐの大きさの
範囲のコスミドフラグメントを、ＱｉａＥＸＩＩゲル抽
出キット（QiaEXII Gel Extraction kit）（製品番号２
００２１, Qiagen, Hilden, Germany）で単離した。イ
ンビトロジェン社（Invitrogen）（Groningen, The Net
herlands, product description Zero Background Clon
ing kit, 製品番号K2500-01）から得られたシークエン
シングベクターｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（Amersham Pharmacis, Freiburg,Germany, prod
uct description BamHI, 製品番号27-0868-04）で切断
した。コスミドフラグメントのシークエンシングベクタ
ーｐＺｅｒｏ−１へのライゲーションをザンブルックら
（Sambrook et al.）（1989, Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor）によって記載
されたように実施し、この場合、このＤＮＡ混合物をＴ
４リガーゼ（Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany）
で一晩に亘って培養した。このライゲーション混合物を
その後にＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 199
0, Proceedings of the National Academy ofSciences
USA 87, 4645〜4649）中に電気穿孔(Tauch et al. 199
4, FEMS Microbiol. Letters 123, 343〜７)によって装
入し、かつゼオシン５０ｍｇ／ｌを含有しているＬＢア
ガー（Lenox, 1955, Virology1, 190）上に播いた。組
み換えクローンのプラスミド製造をバイオロボット９６
００（Biorobot 9600）（製品番号900200, Qiagen, Hil
den, Germany）で実施した。シークエンシングをツイメ
ルマンら（Zimmermann et al.）（1990, Nucleic acids
Research 18, 1067）による修正を含む、サンガーら
（Sanger et al.）（1977, Proceedings of the Nation
al Academy of Science USA 74, 5463〜5467）のジデオ
キシ連鎖停止法によって実施した。ＰＥアプライド・バ
イオシステム（PE Applied Biosystems）（製品番号403
044, Weiterstadt, Germany）による“ＲＲ ｄローダ
ミン・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・
キット（RR dRhodamine Terminator Cycle Sequencing
kit）”を使用した。ゲル電気泳動による分離およびシ
ークエンシング反応の分析を“ローチホレース ＮＦ
アクリルアミド／ビスアクリルアミド（Rotiohorese NF
acrylamide/bisacrylamide）”ゲル（２９：１）（商
品番号A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany）中で、ＰＥ
アプライド・バイオシステムズ社（Weiterstadt, Germa
ny）からの“ＡＢＩ プリズム３７７（ABI Prism 37
7）”シークエンサーを用いて実施した。
ミニプレップ キット（Qiaprep Spin Miniprep ki
t）（製品番号27106, Quiagen, Hilden, Germany）を用
いて製品取り扱い説明書に従って単離し、かつ部分的に
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freibur
g, Germany, 製品番号27-0913-02）で切断した。ＤＮＡ
フラグメントをエビ アルカリホスファターゼ（shrimp
alkalinephosphatase）（Roche Molecular Biochemica
ls, Mannheim, Germany, productdescription SAP, 製
品番号1758250）で脱リン酸化した。ゲル電気泳動によ
る分離の後に、１５００ｂｐ〜２０００ｂｐの大きさの
範囲のコスミドフラグメントを、ＱｉａＥＸＩＩゲル抽
出キット（QiaEXII Gel Extraction kit）（製品番号２
００２１, Qiagen, Hilden, Germany）で単離した。イ
ンビトロジェン社（Invitrogen）（Groningen, The Net
herlands, product description Zero Background Clon
ing kit, 製品番号K2500-01）から得られたシークエン
シングベクターｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ（Amersham Pharmacis, Freiburg,Germany, prod
uct description BamHI, 製品番号27-0868-04）で切断
した。コスミドフラグメントのシークエンシングベクタ
ーｐＺｅｒｏ−１へのライゲーションをザンブルックら
（Sambrook et al.）（1989, Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Cold Spring Harbor）によって記載
されたように実施し、この場合、このＤＮＡ混合物をＴ
４リガーゼ（Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany）
で一晩に亘って培養した。このライゲーション混合物を
その後にＥ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Grant, 199
0, Proceedings of the National Academy ofSciences
USA 87, 4645〜4649）中に電気穿孔(Tauch et al. 199
4, FEMS Microbiol. Letters 123, 343〜７)によって装
入し、かつゼオシン５０ｍｇ／ｌを含有しているＬＢア
ガー（Lenox, 1955, Virology1, 190）上に播いた。組
み換えクローンのプラスミド製造をバイオロボット９６
００（Biorobot 9600）（製品番号900200, Qiagen, Hil
den, Germany）で実施した。シークエンシングをツイメ
ルマンら（Zimmermann et al.）（1990, Nucleic acids
Research 18, 1067）による修正を含む、サンガーら
（Sanger et al.）（1977, Proceedings of the Nation
al Academy of Science USA 74, 5463〜5467）のジデオ
キシ連鎖停止法によって実施した。ＰＥアプライド・バ
イオシステム（PE Applied Biosystems）（製品番号403
044, Weiterstadt, Germany）による“ＲＲ ｄローダ
ミン・ターミネーター・サイクル・シークエンシング・
キット（RR dRhodamine Terminator Cycle Sequencing
kit）”を使用した。ゲル電気泳動による分離およびシ
ークエンシング反応の分析を“ローチホレース ＮＦ
アクリルアミド／ビスアクリルアミド（Rotiohorese NF
acrylamide/bisacrylamide）”ゲル（２９：１）（商
品番号A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany）中で、ＰＥ
アプライド・バイオシステムズ社（Weiterstadt, Germa
ny）からの“ＡＢＩ プリズム３７７（ABI Prism 37
7）”シークエンサーを用いて実施した。
【００４９】その後に得られた粗配列データーを、スタ
ーデン・プログラミング・パッケージ（Staden program
ing package）（1986, Nucleic Acids Research 14, 21
7〜231）、バージョン９７−０を用いて実施した。ｐＺ
ｅｒｏ−１誘導体の個々の配列をまとまりのあるコンテ
ィグに組み立てた。コンピューター処理されたコーディ
ング領域の分析をＸＮＩＰプログラムによって実施した
（Staden, 1986, Ｎucleic Acids Research 14, 217〜2
31）。他の分析を“BLAST search programs”（Altschu
l et al., 1997, Nucleic Acids Research 25, 3389〜3
402）を用いて、“ナショナル・センター・フォー・バ
イオテクノロジー・インフォメーション（Natinal Cent
er for Biotechnology Information）”（NCBI, Bethes
da, MD,USA）の非冗長的なデータバンクに対して実施し
た。
ーデン・プログラミング・パッケージ（Staden program
ing package）（1986, Nucleic Acids Research 14, 21
7〜231）、バージョン９７−０を用いて実施した。ｐＺ
ｅｒｏ−１誘導体の個々の配列をまとまりのあるコンテ
ィグに組み立てた。コンピューター処理されたコーディ
ング領域の分析をＸＮＩＰプログラムによって実施した
（Staden, 1986, Ｎucleic Acids Research 14, 217〜2
31）。他の分析を“BLAST search programs”（Altschu
l et al., 1997, Nucleic Acids Research 25, 3389〜3
402）を用いて、“ナショナル・センター・フォー・バ
イオテクノロジー・インフォメーション（Natinal Cent
er for Biotechnology Information）”（NCBI, Bethes
da, MD,USA）の非冗長的なデータバンクに対して実施し
た。
【００５０】得られたヌクレオチド配列は配列番号１に
示されている。ヌクレオチド配列の分析によって７４４
塩基対の転写解読枠を生じ、この場合、これはｇｐｍ遺
伝子と呼称された。ｇｐｍ遺伝子は２４８個のアミノ酸
のタンパク質をコードする。
示されている。ヌクレオチド配列の分析によって７４４
塩基対の転写解読枠を生じ、この場合、これはｇｐｍ遺
伝子と呼称された。ｇｐｍ遺伝子は２４８個のアミノ酸
のタンパク質をコードする。
【００５１】例３ Ｃ．グルタミクム中のｇｐｍ遺伝子増幅のためのシャト
ル発現ベクターｐＸＫｇｍｐｅｘｐの製造。
ル発現ベクターｐＸＫｇｍｐｅｘｐの製造。
【００５２】３．１．ｇｐｍ遺伝子のクローニング 染色体ＤＮＡをエイクマンら（Eikmanns et al.）（Mic
robiology 140, 1817〜1828 (1994)）の方法によって、
菌株ＡＴＣＣ１３０３２から単離した。例２からのＣ．
グルタミクムに関して公知のｇｐｍ遺伝子の配列に基づ
いて、次のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応
のために選択した：
robiology 140, 1817〜1828 (1994)）の方法によって、
菌株ＡＴＣＣ１３０３２から単離した。例２からのＣ．
グルタミクムに関して公知のｇｐｍ遺伝子の配列に基づ
いて、次のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応
のために選択した：
【００５３】
【外１】
【００５４】示されたプライマーをＡＲＫサイエンティ
フィック社バイオシステムズ（ARKScientific GmbH Bio
systems）（Darmstadt, Germany）によって合成し、か
つＰＣＲをイニスら（Innis et al.）の標準ＰＣＲ法
（PCR protocols. A guide tomethods and application
s, 1990, Academic Press）によって、ロシュ ダイア
グノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH）からのＰ
ｗｏポリメラーゼを用いて実施した。ポリメラーゼ連鎖
反応を用いて、プライマーはｇｐｍ遺伝子を有する約
０．７７ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅させた。
フィック社バイオシステムズ（ARKScientific GmbH Bio
systems）（Darmstadt, Germany）によって合成し、か
つＰＣＲをイニスら（Innis et al.）の標準ＰＣＲ法
（PCR protocols. A guide tomethods and application
s, 1990, Academic Press）によって、ロシュ ダイア
グノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH）からのＰ
ｗｏポリメラーゼを用いて実施した。ポリメラーゼ連鎖
反応を用いて、プライマーはｇｐｍ遺伝子を有する約
０．７７ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅させた。
【００５５】約０．７７ｋｂのｇｐｍ遺伝子をアガロー
スゲルからＱｉａＥＸＩＩゲル抽出キット（QiaEXII Ge
l Extraction kit）（製品番号20021, Qiagen, Hilden,
Germany）を用いて単離した。
スゲルからＱｉａＥＸＩＩゲル抽出キット（QiaEXII Ge
l Extraction kit）（製品番号20021, Qiagen, Hilden,
Germany）を用いて単離した。
【００５６】３．２．シャトルベクターｐＥＣ−ＸＫ９
９Ｅの構築 Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミクムシャトルベクターｐＥ
Ｃ−ＸＫ９９Ｅを従来技術に従って構築した。ベクター
は、複製作動体ｐｅｒ（US-A-5175108; Nesvera et a
l., Journal of Bacteriology 179, 1525〜1532 (199
7)）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Escherichia coli）からのカナマ
イシン耐性遺伝子ａｐｈ（３’）−ＩＩａ（Beck et a
l. (1982), Gene 19, 327〜336）、複製起点、ｔｒｃプ
ロモーター、停止領域Ｔ１およびＴ２、ｌａｃＩq遺伝
子（Ｅ．Ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのリプレッサー）お
よびプラスミドｐＴＲＣ９９Ａ（Amann et al. (1988),
Gene69, 301〜315）のマルチクローニング部位ｍｃｓ
（Norrander, J.M. et al., Gene 26, 101〜106 (198
3)）を含めて、プラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを
有する。
９Ｅの構築 Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミクムシャトルベクターｐＥ
Ｃ−ＸＫ９９Ｅを従来技術に従って構築した。ベクター
は、複製作動体ｐｅｒ（US-A-5175108; Nesvera et a
l., Journal of Bacteriology 179, 1525〜1532 (199
7)）、Ｅ．ｃｏｌｉ（Escherichia coli）からのカナマ
イシン耐性遺伝子ａｐｈ（３’）−ＩＩａ（Beck et a
l. (1982), Gene 19, 327〜336）、複製起点、ｔｒｃプ
ロモーター、停止領域Ｔ１およびＴ２、ｌａｃＩq遺伝
子（Ｅ．Ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのリプレッサー）お
よびプラスミドｐＴＲＣ９９Ａ（Amann et al. (1988),
Gene69, 301〜315）のマルチクローニング部位ｍｃｓ
（Norrander, J.M. et al., Gene 26, 101〜106 (198
3)）を含めて、プラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐを
有する。
【００５７】構築されたＥ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミク
ムシャトルベクターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅを、電気穿孔
（Libebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters 5
3, 299〜303）によってＣ．グルタミクムＤＳＭ５７１
５にトランスファーした。形質転換体は、脳−心臓浸出
ブロス １８．５ｇ／ｌ、０．５Ｍソルビトール、バク
ト トリプシン ５ｇ／ｌ、バクト イーストエクスト
ラクト ２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌおよびバク
ト アガー １８ｇ／ｌを含有するＬＢＨＩＳアガー上
で選択し、この場合、これはカナマイシン ２５ｍｇ／
ｌが補われていた。培養を３３℃で２日間に亘って実施
した。
ムシャトルベクターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅを、電気穿孔
（Libebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters 5
3, 299〜303）によってＣ．グルタミクムＤＳＭ５７１
５にトランスファーした。形質転換体は、脳−心臓浸出
ブロス １８．５ｇ／ｌ、０．５Ｍソルビトール、バク
ト トリプシン ５ｇ／ｌ、バクト イーストエクスト
ラクト ２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌおよびバク
ト アガー １８ｇ／ｌを含有するＬＢＨＩＳアガー上
で選択し、この場合、これはカナマイシン ２５ｍｇ／
ｌが補われていた。培養を３３℃で２日間に亘って実施
した。
【００５８】プラスミドＤＮＡを慣例の方法（Peters-W
endisch et al., 1998, Microbiology 144, 915〜927）
によって一つの形質転換体から単離し、かつ制限エンド
ヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断し、かつプラスミド
を後のアガロースゲル電気泳動によって確認した。
endisch et al., 1998, Microbiology 144, 915〜927）
によって一つの形質転換体から単離し、かつ制限エンド
ヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断し、かつプラスミド
を後のアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００５９】得られるプラスミド構造物をｐＥＣ−ＸＫ
９９Ｅと呼称した（図１）。プラスミドｐＥＣ−ＸＫ９
９ＥをＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７１５へ電気穿孔
によって装入することによって得られた菌株をＤＳＭ５
７１５／ｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅと呼称し、かつドイチェ・
ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント
・ツエルクルトウーレン（DSMZ, Brunswick, Germany）
（German Collectionof Microorganisms and Cell Cukt
ure）のＤＳＭ１３４５５として、ブタペスト条約に基
づいて寄託した。
９９Ｅと呼称した（図１）。プラスミドｐＥＣ−ＸＫ９
９ＥをＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７１５へ電気穿孔
によって装入することによって得られた菌株をＤＳＭ５
７１５／ｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅと呼称し、かつドイチェ・
ザンムルング・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント
・ツエルクルトウーレン（DSMZ, Brunswick, Germany）
（German Collectionof Microorganisms and Cell Cukt
ure）のＤＳＭ１３４５５として、ブタペスト条約に基
づいて寄託した。
【００６０】３．３．Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミクム
シャトルベクターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ中のｇｐｍのクロ
ーニング。
シャトルベクターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅ中のｇｐｍのクロ
ーニング。
【００６１】使用されたベクターは、例３．２に記載さ
れたＥ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミクムシャトルベクター
ｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅであった。このプラスミドのＤＮＡ
を制限酵素Ｅｃｌｌ３６ＩＩで十分に切断し、かつその
後にエビ アルカリホスファターゼ（shrimp alkaline
phosphatase）（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Ge
rmany, product description SAP, 製品番号１７５８２
５０）で脱リン酸化した。
れたＥ．ｃｏｌｉ／Ｃ．グルタミクムシャトルベクター
ｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅであった。このプラスミドのＤＮＡ
を制限酵素Ｅｃｌｌ３６ＩＩで十分に切断し、かつその
後にエビ アルカリホスファターゼ（shrimp alkaline
phosphatase）（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,Ge
rmany, product description SAP, 製品番号１７５８２
５０）で脱リン酸化した。
【００６２】ＰＣＲ法によって得られ、例３．１で記載
された０．７７ｋｂのｇｐｍ遺伝子を、製造されたベク
ターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅと混合し、かつこの混合物をＴ
４ＤＮＡリガーゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Ge
rmany, product descriptionT4 DNA ligase, code no.
27-0870-04）で処理した。ライゲーション混合物をＥ．
ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α（Hanahan, in: DNA cloning. A
practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Was
hington DC, USA）に形質転換した。プラスミド含有細
胞を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢアガー（Le
nnox, 1955,Virology 1, 190）上に形質転換体混合物を
播くことによって選択した。３７℃で一晩に亘る培養の
後に、組み換え単一クローンを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを製品取り扱い説明書に従って、キアプレップ・ス
ピン・ミニプレップ・キット（Qiaprep Spin Miniprep
kit）（製品番号27106, Qiagen, Hilden, Germany）を
用いて一つの形質転換体から単離し、かつ後のアガロー
スゲル電気泳動によってプラスミドを確認するために、
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した。得られ
たプラスミドをｐＸＫｇｐｍｅｘｐと呼称した。これは
図２に示されている。
された０．７７ｋｂのｇｐｍ遺伝子を、製造されたベク
ターｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅと混合し、かつこの混合物をＴ
４ＤＮＡリガーゼ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Ge
rmany, product descriptionT4 DNA ligase, code no.
27-0870-04）で処理した。ライゲーション混合物をＥ．
ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５α（Hanahan, in: DNA cloning. A
practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Was
hington DC, USA）に形質転換した。プラスミド含有細
胞を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢアガー（Le
nnox, 1955,Virology 1, 190）上に形質転換体混合物を
播くことによって選択した。３７℃で一晩に亘る培養の
後に、組み換え単一クローンを選択した。プラスミドＤ
ＮＡを製品取り扱い説明書に従って、キアプレップ・ス
ピン・ミニプレップ・キット（Qiaprep Spin Miniprep
kit）（製品番号27106, Qiagen, Hilden, Germany）を
用いて一つの形質転換体から単離し、かつ後のアガロー
スゲル電気泳動によってプラスミドを確認するために、
制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断した。得られ
たプラスミドをｐＸＫｇｐｍｅｘｐと呼称した。これは
図２に示されている。
【００６３】例４ プラスミドｐＸＫｇｐｍｅｘｐを含む菌株ＤＳＭ５７１
５の形質転換。
５の形質転換。
【００６４】菌株ＤＳＭ５７１５を、電気穿孔法を用い
てリーブルら（Liebl et al.）(FEMS Microbiology Let
ters 53, 299〜303 (1989) )によって記載されたよう
に、プラスミドｐＸＫｇｐｍｅｘＰで形質転換した。形
質転換体を、脳−心臓浸出ブロス １８．５ｇ／ｌ、
０．５Ｍソルビトール、バクト トリプシン ５ｇ／
ｌ、バクト イーストエクストラクト ２．５ｇ／ｌ、
ＮａＣｌ ５ｇ／ｌおよびバクト アガー １８ｇ／ｌ
から成るＬＢＨＩＳアガー上で選択し、この場合、この
アガーはカナマイシン２５ｍｇ／ｌが補われている。培
養は３３℃で２日間に亘って実施した。
てリーブルら（Liebl et al.）(FEMS Microbiology Let
ters 53, 299〜303 (1989) )によって記載されたよう
に、プラスミドｐＸＫｇｐｍｅｘＰで形質転換した。形
質転換体を、脳−心臓浸出ブロス １８．５ｇ／ｌ、
０．５Ｍソルビトール、バクト トリプシン ５ｇ／
ｌ、バクト イーストエクストラクト ２．５ｇ／ｌ、
ＮａＣｌ ５ｇ／ｌおよびバクト アガー １８ｇ／ｌ
から成るＬＢＨＩＳアガー上で選択し、この場合、この
アガーはカナマイシン２５ｍｇ／ｌが補われている。培
養は３３℃で２日間に亘って実施した。
【００６５】プラスミドＤＮＡを慣例の方法（Peters-W
edisch et al., 1998, Microbiology 144, 915〜927）
によって一つの形質転換体から単離し、かつ制限エンド
ヌクレースＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、かつプ
ラスミドを後のアガロースゲル電気泳動によって確認し
た。得られた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＸＫｇｐｍｅｘ
ｐと呼称した。
edisch et al., 1998, Microbiology 144, 915〜927）
によって一つの形質転換体から単離し、かつ制限エンド
ヌクレースＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断し、かつプ
ラスミドを後のアガロースゲル電気泳動によって確認し
た。得られた菌株をＤＳＭ５７１５／ｐＸＫｇｐｍｅｘ
ｐと呼称した。
【００６６】次の微生物を、ドイチェ・ザンムルング・
フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツエルクルト
ウーレン（DSMZ, Brunswick, Germany）(German Collec
tionof Microorganisms and Cell Cultures）にブタペ
スト条約に基づいて寄託した： ●ＤＳＭ１３４５６としてのコリネグルタミウム グル
タミクム菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＸＫｇｐｍｅｘｐ 例５ リジンの製造 例４で得られたＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７１５／
ｐＸＫｇｐｍｅｘｐをリジン生産に適した栄養媒体中で
培養し、かつ培養懸濁液中のリジン含量を測定した。
フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツエルクルト
ウーレン（DSMZ, Brunswick, Germany）(German Collec
tionof Microorganisms and Cell Cultures）にブタペ
スト条約に基づいて寄託した： ●ＤＳＭ１３４５６としてのコリネグルタミウム グル
タミクム菌株ＤＳＭ５７１５／ｐＸＫｇｐｍｅｘｐ 例５ リジンの製造 例４で得られたＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７１５／
ｐＸＫｇｐｍｅｘｐをリジン生産に適した栄養媒体中で
培養し、かつ培養懸濁液中のリジン含量を測定した。
【００６７】これは、最初に、適切な抗生物質を含むア
ガープレート（カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含む脳
−心臓アガー）上で３３℃で２４時間に亘って培養する
こよによって実施した。このアガープレート培養を前培
養（１００ｍｌのコニカルフラスコ中の媒地１０ｍｌ）
への接種に使用した。完全培地ＣｇＩＩＩを前培養の培
地として使用した。
ガープレート（カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含む脳
−心臓アガー）上で３３℃で２４時間に亘って培養する
こよによって実施した。このアガープレート培養を前培
養（１００ｍｌのコニカルフラスコ中の媒地１０ｍｌ）
への接種に使用した。完全培地ＣｇＩＩＩを前培養の培
地として使用した。
【００６８】 培地ＣｇＩＩＩ ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ バクト ペプトン １０ｇ／ｌ バクト イーストエクストラクト １０ｇ／ｌ グルコース（別個にオートクレーブしたもの） ２％（ｗ／ｖ） ｐＨを７．４に調整した。
【００６９】カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加し
た。前培養を３３℃で１６時間に亘って、２４０ｒｐｍ
で振とう器上で培養した。この前培養を主培養への接種
に使用し、主培養は最初のＯＤ（６６０ｎｍ）０．１で
あった。ＭＭ培地を主培養のために使用した。
た。前培養を３３℃で１６時間に亘って、２４０ｒｐｍ
で振とう器上で培養した。この前培養を主培養への接種
に使用し、主培養は最初のＯＤ（６６０ｎｍ）０．１で
あった。ＭＭ培地を主培養のために使用した。
【００７０】 ＭＭ培地 ＣＳＬ（コーン浸漬液） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコース（別個にオートクレーブしたもの） ５０ｇ／ｌ （ＮＨ4）2ＳＯ4 ２５ｇ／ｌ ＫＨ2ＰＯ4 ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ５．０ｍｇ／ｌ ビオチン（濾過滅菌したもの） ０．３ｍｇ／ｌ チアミン・ＨＣｌ（濾過滅菌したもの） ０．２ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン（濾過滅菌したもの） ０．１ｇ／ｌ ＣａＣｏ3 ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳおよび塩溶液をアンモニア水溶液でｐ
Ｈ７に調整し、かつオートクレーブした。滅菌された物
質およびビタミン溶液ならびに乾式オートクレーブした
ＣａＣｏ3をその後に添加した。
Ｈ７に調整し、かつオートクレーブした。滅菌された物
質およびビタミン溶液ならびに乾式オートクレーブした
ＣａＣｏ3をその後に添加した。
【００７１】培養をバッフル付きの１００ｍｌのコニカ
ルフラスコ中に１０ｍｌの量で実施した。カナマイシン
（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で、かつ大
気湿度８０％で実施した。
ルフラスコ中に１０ｍｌの量で実施した。カナマイシン
（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培養を３３℃で、かつ大
気湿度８０％で実施した。
【００７２】７２時間の後に、ＯＤをバイオメク１００
０（Biomek 1000）（Beckmann Instruments GmbH, Muni
ch）を用いて６６０ｎｍの波長で測定した。形成された
リジンの量を、エッペンドルフ・ビオトロニク社（Eppe
ndorf-BioTronik）（Hamburg, Germany）からのアミノ
酸分析器で、イオン交換クロマトグラフィーおよびニン
ヒドリン検出を含むポストカラム誘導体化（postcolumn
derivatization）によって測定した。
０（Biomek 1000）（Beckmann Instruments GmbH, Muni
ch）を用いて６６０ｎｍの波長で測定した。形成された
リジンの量を、エッペンドルフ・ビオトロニク社（Eppe
ndorf-BioTronik）（Hamburg, Germany）からのアミノ
酸分析器で、イオン交換クロマトグラフィーおよびニン
ヒドリン検出を含むポストカラム誘導体化（postcolumn
derivatization）によって測定した。
【００７３】試験結果は第１表に示されている。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【配列表】
【外２】
【００７６】
【外３】
【００７７】
【外４】
【図１】プラスミドｐＥＣ−ＸＫ９９Ｅの制限地図
【図２】プラスミドｐＸＫｇｐｍｅｘｐの制限地図
ｐｅｒ：ｐＧＡ１からのコピー数調節遺伝子、ｏｒｉ
Ｅ：Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド暗号化複製起点、ｒ
ｅｐ：Ｃ．グルタミクムプラスミドｐＧＡ１からのプラ
スミド暗号化複製起点、Ｐｔｒｃ：ｐＴＲＣ９９Ａから
のｔｒｃプロモーター、Ｔ１、Ｔ２：ｐＴＲＣ９９Ａか
らの停止領域１および２、ｌａｃＩｑ：ｌａｃオペロン
のリプレッサー遺伝子、ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝
子、ｇｐｍ：Ｃ．グルタミクムからのｇｐｍ遺伝子、Ｅ
ｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位、Ｅｃｌｌ３
６ＩＩ：制限酵素Ｅｃｌｌ３６ＩＩの切断部位、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位、Ｋｐｎ
Ｉ：制限酵素ＫｐｎＩの切断部位、ＳａｌＩ：制限酵素
ＳａｌＩの切断部位、ＳｍａＩ：制限酵素ＳｍａＩの切
断部位、ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの切断部位、Ｂａ
ｍＨＩ：制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位、ＮｃｏＩ：制
限酵素ＮｃｏＩの切断部位、ＸｂａＩ：制限酵素Ｘｂａ
Ｉの切断部位、ＸｍａＩ：制限酵素ＸｍａＩの切断部
位、ＳａｃＩ：制限酵素ＳａｃＩの切断部位。
Ｅ：Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミド暗号化複製起点、ｒ
ｅｐ：Ｃ．グルタミクムプラスミドｐＧＡ１からのプラ
スミド暗号化複製起点、Ｐｔｒｃ：ｐＴＲＣ９９Ａから
のｔｒｃプロモーター、Ｔ１、Ｔ２：ｐＴＲＣ９９Ａか
らの停止領域１および２、ｌａｃＩｑ：ｌａｃオペロン
のリプレッサー遺伝子、ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝
子、ｇｐｍ：Ｃ．グルタミクムからのｇｐｍ遺伝子、Ｅ
ｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位、Ｅｃｌｌ３
６ＩＩ：制限酵素Ｅｃｌｌ３６ＩＩの切断部位、Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ：制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの切断部位、Ｋｐｎ
Ｉ：制限酵素ＫｐｎＩの切断部位、ＳａｌＩ：制限酵素
ＳａｌＩの切断部位、ＳｍａＩ：制限酵素ＳｍａＩの切
断部位、ＰｓｔＩ：制限酵素ＰｓｔＩの切断部位、Ｂａ
ｍＨＩ：制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位、ＮｃｏＩ：制
限酵素ＮｃｏＩの切断部位、ＸｂａＩ：制限酵素Ｘｂａ
Ｉの切断部位、ＸｍａＩ：制限酵素ＸｍａＩの切断部
位、ＳａｃＩ：制限酵素ＳａｃＩの切断部位。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15）
Claims (20)
- 【請求項１】 次の群： ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一
であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド、 ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に相補的なポリヌ
クレオチド、および ｄ）ポリヌクレオチド配列ａ）、ｂ）またはｃ）の連続
する塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチドか
ら選択されたポリヌクレオチド配列を有するコリネ細菌
から単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 コリネ細菌中で複製可能な組み換えＤＮ
Ａである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示されたような核酸配列を
有する、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 次の群： （ｉ）配列番号１に示されたヌクレオチド配列、または
（ｉｉ）配列（ｉ）と遺伝暗号の縮退の範囲内で一致す
る配列少なくとも一つ、または（ｉｉｉ）配列（ｉ）ま
たは（ｉｉ）に相補的な配列とハイブリダイズする配列
少なくとも一つ、かつ場合によっては（ｉｖ）（ｉ）の
中立センス突然変異を有する、請求項２に記載の複製可
能なＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌ
クレオチド配列。 - 【請求項７】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンの発酵生
産方法において、次の工程： ａ）少なくともｇｐｍ遺伝子またはこれをコードするヌ
クレオチド配列が増幅され、かつ特には過剰に発現され
た、Ｌ−リジンを生産するコリネ細菌を発酵させ、 ｂ）媒地または細菌の細胞中でＬ−アミノ酸を濃縮さ
せ、かつ ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離することが実施されることを特
徴とする、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンの発酵生産方
法。 - 【請求項８】 望ましいＬ−アミノ酸の生合成経路の他
の遺伝子が付加的に増殖された細菌を使用する、請求項
７に記載の方法。 - 【請求項９】 Ｌ−リジンの形成を減少させる代謝経路
が少なくとも部分的にスイッチオフされる、請求項７に
記載の方法。 - 【請求項１０】 プラスミドベクターで形質転換された
菌株が使用され、かつプラスミドベクターがｇｐｍ遺伝
子をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項７に
記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−リジンを生産するコリネ細菌が使
用される、請求項７から１０までのいずれか１項に記載
の方法。 - 【請求項１２】 ジヒドロジピコリネート シンターゼ
をコードするｄａｐＡ遺伝子が同時に過剰に発現され
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 Ｓ−（２−アミノエチル）システイン
耐性を付与するＤＮＡフラグメントが同時に増幅され
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１４】 グリセルアルデヒド ３−リン酸デヒ
ドロゲナーゼをコードするｇａｐ遺伝子が同時に過剰に
発現される、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１５】 トリオースリン酸イソメラーゼをコー
ドするｔｐｉ遺伝子が同時に過剰に発現される、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１６】 ３−ホスホグリセレートキナーゼをコ
ードするｐｇｋ遺伝子が同時に過剰に発現される、請求
項８に記載の方法。 - 【請求項１７】 ピルベート カルボキシラーゼをコー
ドするＰｙｃ遺伝子が同時に過剰に発現される、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１８】 ポリメラーゼ連鎖反応によって、ｏｐ
ｃＡ遺伝子に相当する活性を改善させる、遺伝子のＤＮ
Ａを製造するためのプライマーとしての、請求項１に記
載のポリヌクレオチド配列の使用。 - 【請求項１９】 ハイブリダイゼーションプローブとし
ての、請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の使用。 - 【請求項２０】 請求項１から５までのいずれか１項に
記載の複製可能なＤＮＡを導入することによって形質転
換される、コリネフォルム微生物、特にコリネバクテリ
ウム属。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19958160A DE19958160A1 (de) | 1999-12-02 | 1999-12-02 | Neue für das gpm-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19958160.6 | 1999-12-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001197891A true JP2001197891A (ja) | 2001-07-24 |
Family
ID=7931210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000363631A Pending JP2001197891A (ja) | 1999-12-02 | 2000-11-29 | ｇｐｍ遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7306939B2 (ja) |
| EP (1) | EP1104812A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001197891A (ja) |
| KR (1) | KR20010062075A (ja) |
| CN (1) | CN1304999A (ja) |
| AU (1) | AU7177300A (ja) |
| BR (1) | BR0005699A (ja) |
| CA (1) | CA2325594A1 (ja) |
| DE (1) | DE19958160A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0004782A2 (ja) |
| ID (1) | ID28564A (ja) |
| MX (1) | MXPA00010969A (ja) |
| PL (1) | PL344236A1 (ja) |
| SK (1) | SK17952000A3 (ja) |
| ZA (1) | ZA200007083B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10128780A1 (de) * | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen |
| CN106434733B (zh) * | 2016-08-01 | 2019-09-27 | 江南大学 | 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655149B2 (ja) * | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―リジンの製造法 |
| AU746542B2 (en) * | 1998-03-18 | 2002-05-02 | Ajinomoto Co., Inc. | L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid |
| JP4061769B2 (ja) * | 1999-03-25 | 2008-03-19 | 味の素株式会社 | Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| MXPA01012842A (es) * | 1999-06-25 | 2002-07-09 | Basf Ag | Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteinas involucradas en el metabolismo del carbono y la produccion de energia. |
| US7270984B1 (en) * | 1999-06-25 | 2007-09-18 | Basf Aktiengesellschaft | Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
1999
- 1999-12-02 DE DE19958160A patent/DE19958160A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-03 EP EP00123955A patent/EP1104812A1/de not_active Withdrawn
- 2000-11-08 MX MXPA00010969A patent/MXPA00010969A/es unknown
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