JP2001161380A - ポリヌクレオチド、ｄｎａ、ポリヌクレオチド配列の単離、およびｌ−アミノ酸の発酵生産の方法 - Google Patents
ポリヌクレオチド、ｄｎａ、ポリヌクレオチド配列の単離、およびｌ−アミノ酸の発酵生産の方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産するす
るための、改善された新規の方法を提供する。 【解決手段】 ｅｎｏ遺伝子をコードするヌクレオチド
配列およびｅｎｏ遺伝子が増幅され、特には過剰に発現
されたコリネフォルム細菌を用いる。
るための、改善された新規の方法を提供する。 【解決手段】 ｅｎｏ遺伝子をコードするヌクレオチド
配列およびｅｎｏ遺伝子が増幅され、特には過剰に発現
されたコリネフォルム細菌を用いる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｅｎｏ遺伝子をコ
ードするヌクレオチド配列、およびｅｎｏ遺伝子が増幅
されたコリネフォルム細菌（coryneform bacteria）を
用いてアミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法を
提供する。
ードするヌクレオチド配列、およびｅｎｏ遺伝子が増幅
されたコリネフォルム細菌（coryneform bacteria）を
用いてアミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生産する方法を
提供する。
【０００２】
【従来の技術】アミノ酸、特にＬ−リジンは、ヒト医学
および製薬工業、しかしながら特には動物栄養学におい
て使用される。
および製薬工業、しかしながら特には動物栄養学におい
て使用される。
【０００３】アミノ酸がコリネフォルム細菌、特にコリ
ネバクテリウム グルタミクムの菌株を発酵生産するこ
とは公知である。これが極めて重要であるために、生産
方法を改善するための努力が常になされている。方法の
改善は、発酵方法、例えば、撹拌および酸素の供給、ま
たは栄養培地の組成、例えば発酵中の糖濃度、または、
例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物形態
の後処理、または微生物そのものの固有の生産特性に関
するものであってもよい。
ネバクテリウム グルタミクムの菌株を発酵生産するこ
とは公知である。これが極めて重要であるために、生産
方法を改善するための努力が常になされている。方法の
改善は、発酵方法、例えば、撹拌および酸素の供給、ま
たは栄養培地の組成、例えば発酵中の糖濃度、または、
例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物形態
の後処理、または微生物そのものの固有の生産特性に関
するものであってもよい。
【０００４】突然変異、選択および突然変異選択の方法
は、前記微生物の生産特性を改善するために使用され
る。抗代謝物質、例えばリジン−類似物質 Ｓ−（２−
アミノエチル）−システインに対して耐性であるか、あ
るいは規定の重要なアミノ酸に対して栄養要求性であ
り、かつＬ−リジンを生産する菌株が、この方法で得ら
れる。
は、前記微生物の生産特性を改善するために使用され
る。抗代謝物質、例えばリジン−類似物質 Ｓ−（２−
アミノエチル）−システインに対して耐性であるか、あ
るいは規定の重要なアミノ酸に対して栄養要求性であ
り、かつＬ−リジンを生産する菌株が、この方法で得ら
れる。
【０００５】組み換えＤＮＡ技術の方法は、数年来、個
々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅させることによってア
ミノ酸を生産するコリネバクテリウム菌株を向上させる
ためおよびアミノ酸の生産の効果を調べるために使用さ
れている。これに関する概要の記載は、特に、キノシタ
（Kinoshita）（“Glutamic Acid Bacteria”, in: Bio
logy of Industrial Microorganisms, Demain and Solo
mon(Eds.), BenjaminCummings, London, UK, 1985, 115
-142）、ヒリガー（Hilliger）（BioTec 2, 40-44 (199
1)）、エッゲリング（Eggeling）（Amino Acids 6: 261
-272 (1994)）、ジェッテンおよびシンスキー（Jetten
and Sinskey）（Critical Reviews inBiotechnology 1
5, 73-103 (1995)）およびザームら（Sahm et al.）（A
nnualsof the New York Academy of Science 782, 25-3
9 (1996)）で見出される。
々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅させることによってア
ミノ酸を生産するコリネバクテリウム菌株を向上させる
ためおよびアミノ酸の生産の効果を調べるために使用さ
れている。これに関する概要の記載は、特に、キノシタ
（Kinoshita）（“Glutamic Acid Bacteria”, in: Bio
logy of Industrial Microorganisms, Demain and Solo
mon(Eds.), BenjaminCummings, London, UK, 1985, 115
-142）、ヒリガー（Hilliger）（BioTec 2, 40-44 (199
1)）、エッゲリング（Eggeling）（Amino Acids 6: 261
-272 (1994)）、ジェッテンおよびシンスキー（Jetten
and Sinskey）（Critical Reviews inBiotechnology 1
5, 73-103 (1995)）およびザームら（Sahm et al.）（A
nnualsof the New York Academy of Science 782, 25-3
9 (1996)）で見出される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、アミノ酸、
特にＬ−リジンを、発酵生産するするための改善された
新規の方法を提供する。
特にＬ−リジンを、発酵生産するするための改善された
新規の方法を提供する。
【０００７】
【課題を解決するための手段】アミノ酸、特にＬ−リジ
ンは、ヒト医学、製薬工業および特には動物栄養学にお
いて使用される。したがって、アミノ酸、特にＬ−リジ
ンを生産するための改善された新規の方法を提供するこ
とは、概して重要である。
ンは、ヒト医学、製薬工業および特には動物栄養学にお
いて使用される。したがって、アミノ酸、特にＬ−リジ
ンを生産するための改善された新規の方法を提供するこ
とは、概して重要である。
【０００８】Ｌ−リジンまたはリジンが次のように挙げ
られる場合には、塩基ばかりでなく、塩、例えばリジン
一塩酸塩またはリジン硫酸塩を意味する。
られる場合には、塩基ばかりでなく、塩、例えばリジン
一塩酸塩またはリジン硫酸塩を意味する。
【０００９】本発明は、次の群、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリぺプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
が同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的
なポリヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の連
続する塩基の少なくとも１５個を有するポリヌクレオチ
ド から選択されたポリヌクレオチド配列を有する、コリネ
フォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドを提供す
る。
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
が同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的
なポリヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の連
続する塩基の少なくとも１５個を有するポリヌクレオチ
ド から選択されたポリヌクレオチド配列を有する、コリネ
フォルム細菌から単離されたポリヌクレオチドを提供す
る。
【００１０】また、本発明は、請求項１に記載のポリヌ
クレオチドを提供し、この場合、これは、好ましくは次
の群： （ｉ）配列番号１に示されたヌクレオチド配列または
（ｉｉ）遺伝子暗号の縮退の範囲内で配列（ｉ）に相当
する配列少なくとも一つ、または、（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列とハイブリ
ダイズする配列少なくとも一つ、かつ、場合によって
は、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異を有す
る、複製可能なＤＮＡである。
クレオチドを提供し、この場合、これは、好ましくは次
の群： （ｉ）配列番号１に示されたヌクレオチド配列または
（ｉｉ）遺伝子暗号の縮退の範囲内で配列（ｉ）に相当
する配列少なくとも一つ、または、（ｉｉｉ）配列
（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的な配列とハイブリ
ダイズする配列少なくとも一つ、かつ、場合によって
は、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立センス突然変異を有す
る、複製可能なＤＮＡである。
【００１１】さらに、本発明は、配列番号１に示された
ヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のポリヌク
レオチド、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードする、請求項６に記載のポリヌク
レオチド、ベクター、詳細にはシャトルベクターまたは
プラスミドベクターを有する請求項１に記載のポリペプ
チド、およびホスト細胞として役立つ、ベクターを含有
するコリネフォルム細菌を提供する。
ヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載のポリヌク
レオチド、配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードする、請求項６に記載のポリヌク
レオチド、ベクター、詳細にはシャトルベクターまたは
プラスミドベクターを有する請求項１に記載のポリペプ
チド、およびホスト細胞として役立つ、ベクターを含有
するコリネフォルム細菌を提供する。
【００１２】また、本発明は、相応する遺伝子ライブラ
リーのハイブリダイゼーションによって、シークエンシ
ングによって得ることが可能なポリヌクレオチド配列を
実際に有するポリヌクレオチドを提供し、この場合、こ
の遺伝子ライブラリーは、配列番号１に相当するポリヌ
クレオチド配列を有する完全な遺伝子、ならびに配列番
号１によって挙げられたポリヌクレオチド配列を含むプ
ローブまたはこれらのフラグメントを含み、かつ前記Ｄ
ＮＡ配列の単離を提供する。
リーのハイブリダイゼーションによって、シークエンシ
ングによって得ることが可能なポリヌクレオチド配列を
実際に有するポリヌクレオチドを提供し、この場合、こ
の遺伝子ライブラリーは、配列番号１に相当するポリヌ
クレオチド配列を有する完全な遺伝子、ならびに配列番
号１によって挙げられたポリヌクレオチド配列を含むプ
ローブまたはこれらのフラグメントを含み、かつ前記Ｄ
ＮＡ配列の単離を提供する。
【００１３】本発明によるポリヌクレオチド配列は、Ｒ
ＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡに対するハイブリダイゼー
ションプローブとして、エノラーゼをコードするｃＤＮ
Ａを全長で単離するために、かつエノラーゼ遺伝子の配
列との高い類似性を有する配列を含む前記ｃＤＮＡまた
は遺伝子を単離するために適している。
ＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡに対するハイブリダイゼー
ションプローブとして、エノラーゼをコードするｃＤＮ
Ａを全長で単離するために、かつエノラーゼ遺伝子の配
列との高い類似性を有する配列を含む前記ｃＤＮＡまた
は遺伝子を単離するために適している。
【００１４】さらに、本発明によるポリヌクレオチド配
列は、エノラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡをポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造するためのプラ
イマーとして適している。
列は、エノラーゼをコードする遺伝子のＤＮＡをポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造するためのプラ
イマーとして適している。
【００１５】プローブまたはプライマーとして役立つこ
のようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、好
ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少なくとも
１５個の連続する塩基を有する。また、少なくとも４０
個または５０個の塩基対の長さを有するオリゴヌクレオ
チドは適している。
のようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、好
ましくは少なくとも２０個、特に好ましくは少なくとも
１５個の連続する塩基を有する。また、少なくとも４０
個または５０個の塩基対の長さを有するオリゴヌクレオ
チドは適している。
【００１６】「単離された」とは、本来の環境から分離
されたことを意味する。
されたことを意味する。
【００１７】概して「ポリヌクレオチド」とは、ポリリ
ボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに
関し、この場合、これらは非修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ
であるか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであ
ってもよい。
ボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドに
関し、この場合、これらは非修飾のＲＮＡまたはＤＮＡ
であるか、あるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであ
ってもよい。
【００１８】「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介し
て２つまたはそれ以上のアミノ酸を有するペプチドまた
はタンパク質を意味するものとして解される。
て２つまたはそれ以上のアミノ酸を有するペプチドまた
はタンパク質を意味するものとして解される。
【００１９】本発明によるポリペプチドは配列番号２に
よるポリペプチド、特にはエノラーゼの生物学的活性を
有するポリペプチドであり、かつ、さらにはこのポリペ
プチドは、配列番号２のポリペプチドに対して少なくと
も７０％が同一であり、かつ好ましくは配列番号２のポ
リペプチドに対して８０％および特には少なくとも９０
％〜９５％が同一であり、かつ挙げられた活性を有する
ものである。
よるポリペプチド、特にはエノラーゼの生物学的活性を
有するポリペプチドであり、かつ、さらにはこのポリペ
プチドは、配列番号２のポリペプチドに対して少なくと
も７０％が同一であり、かつ好ましくは配列番号２のポ
リペプチドに対して８０％および特には少なくとも９０
％〜９５％が同一であり、かつ挙げられた活性を有する
ものである。
【００２０】また、本発明は、特にはすでにアミノ酸を
生産するコリネフォルム細菌を用いて、アミノ酸、特に
Ｌ−リジンを発酵生産する方法に関し、かつ、この方法
において、ｅｎｏ遺伝子をコードするヌクレオチド配列
が増幅され、特には過剰に発現される。
生産するコリネフォルム細菌を用いて、アミノ酸、特に
Ｌ−リジンを発酵生産する方法に関し、かつ、この方法
において、ｅｎｏ遺伝子をコードするヌクレオチド配列
が増幅され、特には過剰に発現される。
【００２１】これに関連して「増幅」の用語は、相応す
るＤＮＡによってコードされる微生物中で、例えば、有
効なプロモーター、あるいは高い活性を有する相応する
酵素をコードする遺伝子を用いて、かつ場合によっては
前記の方法を組み合わせて、一つまたは複数の遺伝子の
コピー数を増加させることによって、一つまたは複数の
酵素の細胞内活性を増加させることを意味する。
るＤＮＡによってコードされる微生物中で、例えば、有
効なプロモーター、あるいは高い活性を有する相応する
酵素をコードする遺伝子を用いて、かつ場合によっては
前記の方法を組み合わせて、一つまたは複数の遺伝子の
コピー数を増加させることによって、一つまたは複数の
酵素の細胞内活性を増加させることを意味する。
【００２２】本発明が提供する微生物は、Ｌ−アミノ
酸、特にはＬ−リジンを、グルコース、ショ糖、ラクト
ース、フルクトース、麦芽糖、糖蜜、デンプン、セルロ
ースまたはグリセロールおよびエタノールから製造する
ことができる。この微生物は、コリネフォルム細菌、特
にはコリネバクテリウム属の典型的なものであってもよ
い。コリネバクテリウム属中で、特にコリネバクテリウ
ム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）種が
挙げられてもよく、この場合、これは、Ｌ−アミノ酸を
生産する能力に関して当業者に公知である。
酸、特にはＬ−リジンを、グルコース、ショ糖、ラクト
ース、フルクトース、麦芽糖、糖蜜、デンプン、セルロ
ースまたはグリセロールおよびエタノールから製造する
ことができる。この微生物は、コリネフォルム細菌、特
にはコリネバクテリウム属の典型的なものであってもよ
い。コリネバクテリウム属中で、特にコリネバクテリウ
ム グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）種が
挙げられてもよく、この場合、これは、Ｌ−アミノ酸を
生産する能力に関して当業者に公知である。
【００２３】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム グルタミクム種の適した菌株は、例えば、次の
公知の野生型菌株、 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３
９ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９およ
び ブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０であり、かつＬ−
リジン生産突然変異株およびこれから製造される菌株、
例えば、 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４および コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ５７１５で
ある。
リウム グルタミクム種の適した菌株は、例えば、次の
公知の野生型菌株、 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム アセトグルタミクム（Corynebact
erium acetoglutamicum） ＡＴＣＣ１５８０６ コリネバクテリウム アセトアシドフィルム（Coryneba
cterium acetoacidophilum） ＡＴＣＣ１３８７０ コリネバクテリウム セルモアミノジェネス（Coryneba
cterium thermoaminogenes） ＦＥＲＭ ＢＰ−１５３
９ コリネバクテリウム メラッセコラ（Corynebacterium
melassecola） ＡＴＣＣ１７９６５ ブレビバクテリウム フラブム（Brevibacterium flavu
m） ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム（Brevib
acterium lactofermentum） ＡＴＣＣ１３８６９およ
び ブレビバクテリウム ジバリカトウム（Brevibacterium
divaricatum） ＡＴＣＣ１４０２０であり、かつＬ−
リジン生産突然変異株およびこれから製造される菌株、
例えば、 コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム ラクトフェルメントウム ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４および コリネバクテリウム グルタミクム ＤＳＭ５７１５で
ある。
【００２４】本発明において、酵素エノラーゼ（EC 4.
2.1.11）をコードするＣ．グルタミクムのｅｎｏ遺伝子
を単離することに成功した。
2.1.11）をコードするＣ．グルタミクムのｅｎｏ遺伝子
を単離することに成功した。
【００２５】Ｃ．グルタミクムのｅｎｏ遺伝子またはさ
らには他の遺伝子を単離するために、この微生物の遺伝
子ラブラリーは最初にＥ．Ｃｏｌｉ中に入れられる。遺
伝子ライブラリーの段取りは、概して公知の教科書およ
び解説書中に示されている。ウィナッカー（Winnacke
r）による教科書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ、Ｅ
ｉｎｅ Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｅ
ｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ［Genes and Clones, An Int
roduction to Genetic Engineering］（Verlag Chemie,
Weinheim, Germany, 1990）またはサンブルックら（Sa
mbrook et al.）による解説書：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）
を例として挙げることができる。よく知られた遺伝子ラ
イブラリーは、コハラら（Kohara et al.）によってλ
ベクター中に入れられたＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株
Ｗ３１１０のものである（Cell 50, 495-508 (198
7)）。ベイスら（Bathe et al.）（Molecular and Gene
ral Genetics, 252: 255-265, 1996）は、Ｃ．グルタミ
クム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載
しており、この場合、これはコスミドベクター Ｓｕｐ
ｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al., 1987, Proceedings of th
e National Academy of Sciences USA, 84: 2160-216
4）を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２株 ＮＭ５５４
（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:
1563-1575）中に入れられた。次に、ボルマンら（Boer
mann et al.）（Molecular Mivrobiology 6 (3), 317-3
26）は、コスミドｐＨC７９（Hohn andCollins）（Gene
11, 291-298 (1980)）を用いてのＣ．グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載してい
る。Ｅ．Ｃｏｌｉ中でＣ．グルタミクムの遺伝子ライブ
ラリーを製造するために、また、プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1
979)）またはｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene, 1
9:259-268）を使用することも可能である。適したホス
トは、詳細には、制限欠陥物および複製欠陥物であるこ
れらのＥ．Ｃｏｌｉ菌株である。これらの例はＤＨ５α
mcr菌株であり、この場合、これはグラントら（Grant e
t al.,）によって記載されている（Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-
4649）。その後に、コスミドによってクローン化された
長いＤＮＡフラグメントは、順にサブクローニングさ
れ、引き続いて例えばサンガーら（Sanger et al.）に
よって示された、シークエンシングに適した常用のベク
ター中でシークエンシングされる（Proceedings of the
National Academy of Sciences of United States of A
merica, 74: 5463-5467, 1977）。
らには他の遺伝子を単離するために、この微生物の遺伝
子ラブラリーは最初にＥ．Ｃｏｌｉ中に入れられる。遺
伝子ライブラリーの段取りは、概して公知の教科書およ
び解説書中に示されている。ウィナッカー（Winnacke
r）による教科書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ、Ｅ
ｉｎｅ Ｅｉｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｅ
ｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ［Genes and Clones, An Int
roduction to Genetic Engineering］（Verlag Chemie,
Weinheim, Germany, 1990）またはサンブルックら（Sa
mbrook et al.）による解説書：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）
を例として挙げることができる。よく知られた遺伝子ラ
イブラリーは、コハラら（Kohara et al.）によってλ
ベクター中に入れられたＥ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株
Ｗ３１１０のものである（Cell 50, 495-508 (198
7)）。ベイスら（Bathe et al.）（Molecular and Gene
ral Genetics, 252: 255-265, 1996）は、Ｃ．グルタミ
クム ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載
しており、この場合、これはコスミドベクター Ｓｕｐ
ｅｒＣｏｓＩ（Wahl et al., 1987, Proceedings of th
e National Academy of Sciences USA, 84: 2160-216
4）を用いて、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｋ−１２株 ＮＭ５５４
（Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:
1563-1575）中に入れられた。次に、ボルマンら（Boer
mann et al.）（Molecular Mivrobiology 6 (3), 317-3
26）は、コスミドｐＨC７９（Hohn andCollins）（Gene
11, 291-298 (1980)）を用いてのＣ．グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子ライブラリーを記載してい
る。Ｅ．Ｃｏｌｉ中でＣ．グルタミクムの遺伝子ライブ
ラリーを製造するために、また、プラスミド、例えばｐ
ＢＲ３２２（Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1
979)）またはｐＵＣ９（Viera et al., 1982, Gene, 1
9:259-268）を使用することも可能である。適したホス
トは、詳細には、制限欠陥物および複製欠陥物であるこ
れらのＥ．Ｃｏｌｉ菌株である。これらの例はＤＨ５α
mcr菌株であり、この場合、これはグラントら（Grant e
t al.,）によって記載されている（Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-
4649）。その後に、コスミドによってクローン化された
長いＤＮＡフラグメントは、順にサブクローニングさ
れ、引き続いて例えばサンガーら（Sanger et al.）に
よって示された、シークエンシングに適した常用のベク
ター中でシークエンシングされる（Proceedings of the
National Academy of Sciences of United States of A
merica, 74: 5463-5467, 1977）。
【００２６】ｅｎｏ遺伝子をコードし、かつ、配列番号
１として本発明の構成部分となっているＣ．グルタミク
ムの新規ＤＮＡ配列は、この方法で得られた。さらに、
相応するタンパク質のアミノ酸配列は、前記の方法によ
って本発明のＤＮＡ配列から導かれた。ｅｎｏ遺伝子生
成物の得られるアミノ酸配列は、配列番号２中に示され
る。
１として本発明の構成部分となっているＣ．グルタミク
ムの新規ＤＮＡ配列は、この方法で得られた。さらに、
相応するタンパク質のアミノ酸配列は、前記の方法によ
って本発明のＤＮＡ配列から導かれた。ｅｎｏ遺伝子生
成物の得られるアミノ酸配列は、配列番号２中に示され
る。
【００２７】また、配列番号１から、遺伝暗号の縮退に
よって生じるコーディングＤＮＡ配列は本発明の構成部
分である。同様に、配列番号１または配列番号１の一部
分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は、本発明の構成部
分である。保存的なアミノ酸配列の置換、例えば、タン
パク質中でのグリシンとアラニン、またはアスパラギン
酸とグルタミン酸との置換は、タンパク質の活性におい
て根本的な変更を引き起こさない、すなわち中立機能の
「センス突然変異」として当業者に公知である。さら
に、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端上の変換
は、これらの機能を実際には損なわないか、あるいはそ
れどころか安定化させうることも公知である。これに関
する情報は、当業者によって、すなわち、ベン・バサッ
トら（BenBassat et al.）（Journal of Bacteriology
169: 751-757 (1987)）、オリーガンら（O′Regan et a
l.）（Gene 77: 237-251 (1989)）、サーイン・トース
ら（Sain-Toth et al.）（Protein Sciences 3:240-247
(1994)）、ハチウリら（Hochuli et al.）（Bio/Techn
ology 6: 1321-1325 (1988)）および遺伝子学ならびに
分子生物学の公知の教科書で見出すことができる。ま
た、配列番号２から相応する方法で得られるアミノ酸配
列は、本発明の構成部分である。
よって生じるコーディングＤＮＡ配列は本発明の構成部
分である。同様に、配列番号１または配列番号１の一部
分とハイブリダイズするＤＮＡ配列は、本発明の構成部
分である。保存的なアミノ酸配列の置換、例えば、タン
パク質中でのグリシンとアラニン、またはアスパラギン
酸とグルタミン酸との置換は、タンパク質の活性におい
て根本的な変更を引き起こさない、すなわち中立機能の
「センス突然変異」として当業者に公知である。さら
に、タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端上の変換
は、これらの機能を実際には損なわないか、あるいはそ
れどころか安定化させうることも公知である。これに関
する情報は、当業者によって、すなわち、ベン・バサッ
トら（BenBassat et al.）（Journal of Bacteriology
169: 751-757 (1987)）、オリーガンら（O′Regan et a
l.）（Gene 77: 237-251 (1989)）、サーイン・トース
ら（Sain-Toth et al.）（Protein Sciences 3:240-247
(1994)）、ハチウリら（Hochuli et al.）（Bio/Techn
ology 6: 1321-1325 (1988)）および遺伝子学ならびに
分子生物学の公知の教科書で見出すことができる。ま
た、配列番号２から相応する方法で得られるアミノ酸配
列は、本発明の構成部分である。
【００２８】同様に、配列番号１または配列番号１の一
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の構成部
分である。最終的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によって、配列番号１からのプライマーを用いて製造さ
れるＤＮＡ配列は、本発明の構成部分である。このよう
なオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１５の
塩基対の長さを有する。
部分とハイブリダイズするＤＮＡ配列も本発明の構成部
分である。最終的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
によって、配列番号１からのプライマーを用いて製造さ
れるＤＮＡ配列は、本発明の構成部分である。このよう
なオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも１５の
塩基対の長さを有する。
【００２９】ハイブリダイゼーションによって同定され
るＤＮＡ配列の教示は、当業者によって、すなわち、ベ
ーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim Gmb
H, Mannheim, Germany, 1993）からの解説書「Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏ
ｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」およ
びリーブルら（Liebl et al.）（International Journa
l of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260）
中で見出されてもよい。
るＤＮＡ配列の教示は、当業者によって、すなわち、ベ
ーリンガー・マンハイム社（Boehringer Mannheim Gmb
H, Mannheim, Germany, 1993）からの解説書「Ｔｈｅ
ＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏ
ｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」およ
びリーブルら（Liebl et al.）（International Journa
l of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260）
中で見出されてもよい。
【００３０】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて
のＤＮＡ配列の増幅に関する教示は、当業者によって見
出されてもよく、すなわち、解説書中で、ガイト（Gai
t）によって:Ｏｌｉｇｏｎｕcｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓ
ｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａ
ｃｈ（IRL Press, Oxford, UK, 1984）およびニュート
ンおよびグラハム（Newton and Graham）:ＰＣＲ（Spek
trum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 199
4）中で見出されてもよい。
のＤＮＡ配列の増幅に関する教示は、当業者によって見
出されてもよく、すなわち、解説書中で、ガイト（Gai
t）によって:Ｏｌｉｇｏｎｕcｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓ
ｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａ
ｃｈ（IRL Press, Oxford, UK, 1984）およびニュート
ンおよびグラハム（Newton and Graham）:ＰＣＲ（Spek
trum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 199
4）中で見出されてもよい。
【００３１】コリネフォルム細菌がアミノ酸、特にＬ−
リジンを、改善された方法で、ｅｎｏ遺伝子の過剰発現
（over-expression）の後に生産することが見出され
た。
リジンを、改善された方法で、ｅｎｏ遺伝子の過剰発現
（over-expression）の後に生産することが見出され
た。
【００３２】過剰発現を達成するために、相応する遺伝
子のコピー数を増加させるか、あるいは、構造遺伝子の
上流のプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結
合部位を変異させてもよい。構造遺伝子の上流に組み込
まれた発現カセットは、同様に作用する。誘導プロモー
ターによって、付加的に、一連の発酵によるＬ−リジン
の生産中で発現を増加させることが可能である。同様に
発現は、ｍ−ＲＮＡの寿命を延ばす方法によって改善さ
れる。さらに、酵素活性は酵素タンパク質の分解を防ぐ
ことによって増加する。遺伝子または遺伝子構造物は、
プラスミド中で異なるコピー数で存在していてもよい
か、あるいは染色体中に組み込まれ、かつ増幅されてい
てもよい。また、本発明の遺伝子の過剰発現は、培地の
組成および培養方法を変更することによって達成するこ
とができる。
子のコピー数を増加させるか、あるいは、構造遺伝子の
上流のプロモーターおよび調節領域またはリボソーム結
合部位を変異させてもよい。構造遺伝子の上流に組み込
まれた発現カセットは、同様に作用する。誘導プロモー
ターによって、付加的に、一連の発酵によるＬ−リジン
の生産中で発現を増加させることが可能である。同様に
発現は、ｍ−ＲＮＡの寿命を延ばす方法によって改善さ
れる。さらに、酵素活性は酵素タンパク質の分解を防ぐ
ことによって増加する。遺伝子または遺伝子構造物は、
プラスミド中で異なるコピー数で存在していてもよい
か、あるいは染色体中に組み込まれ、かつ増幅されてい
てもよい。また、本発明の遺伝子の過剰発現は、培地の
組成および培養方法を変更することによって達成するこ
とができる。
【００３３】これに関連する教示は、当業者によって、
すなわち、マーチンら（Martin etal.）（Bio/Technolo
gy 5, 137-146 (1987)）、ガルレロら（Guerrero et a
l.）（Gene 138, 35-41 (1994)）、ツチヤおよびモリナ
ガ（Tsuchiya and Morinaga）（Bio/Technology 6, 428
-430 (1988)）、エイクマンズら（Eikmanns et al.）
（Gene 102, 93-98 (1991)）、ヨーロッパ特許明細書
ＥＰＳ ０４７２８６９、米国特許第４６０１８９３号
明細書、シュバルツアーおよびピューラー（Schwarzer
and Puehler）（Bio/Technology 9，84-87 (1991)）、
レインシェイドら（Reinscheid et al.）（Applied and
Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)）、
ラバルレら（Labarre et al.）（Journal of Basteriol
ogy 175,1001-1007 (1993)）、特許出願 ＷＯ９６／１
５２４６、マランブレスら（Malumbres et al.）（Gene
134, 15-24 (1993)）、特開平１０−２２９８９１号公
報、ジェンセンおよびハマー（Jensen and Hammer）（B
iotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (199
8)）、マクライデス（Makrides）（MicrobiologicalRev
iews 60: 512-538 (1996)）および遺伝子学および分子
生物学の公知の教科書中で見出されてもよい。
すなわち、マーチンら（Martin etal.）（Bio/Technolo
gy 5, 137-146 (1987)）、ガルレロら（Guerrero et a
l.）（Gene 138, 35-41 (1994)）、ツチヤおよびモリナ
ガ（Tsuchiya and Morinaga）（Bio/Technology 6, 428
-430 (1988)）、エイクマンズら（Eikmanns et al.）
（Gene 102, 93-98 (1991)）、ヨーロッパ特許明細書
ＥＰＳ ０４７２８６９、米国特許第４６０１８９３号
明細書、シュバルツアーおよびピューラー（Schwarzer
and Puehler）（Bio/Technology 9，84-87 (1991)）、
レインシェイドら（Reinscheid et al.）（Applied and
Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)）、
ラバルレら（Labarre et al.）（Journal of Basteriol
ogy 175,1001-1007 (1993)）、特許出願 ＷＯ９６／１
５２４６、マランブレスら（Malumbres et al.）（Gene
134, 15-24 (1993)）、特開平１０−２２９８９１号公
報、ジェンセンおよびハマー（Jensen and Hammer）（B
iotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (199
8)）、マクライデス（Makrides）（MicrobiologicalRev
iews 60: 512-538 (1996)）および遺伝子学および分子
生物学の公知の教科書中で見出されてもよい。
【００３４】例証として、本発明によるｅｎｏ遺伝子
を、プラスミドを用いて過剰に発現させた。適したプラ
スミドは、コリネフォルム細菌中で複製される前記のも
のである。多くの公知のプラスミドベクター、例えばｐ
Ｚ１（Menkel et al., Appliedand Environmental Micr
obiology (1989) 64: 549-554）、ｐＥＫＥｘ１（Eikma
nns et al., Gene 102: 93-98 (1991)）またはｐＨＳ２
−１（Sonnen et al.,Gene 107: 69-74 (1991)）は、潜
在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１
に基づく。他のプラスミドベクター、例えばｐＣＧ４
（ＵＳ−Ａ ４４８９１６０）、またはｐＮＧ２（Serw
old-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 11
9-124 (1990)）、またはｐＡＧ１（米国特許出願公開第
５１５８８９１号明細書）に基づくものを、同様に使用
することができる。
を、プラスミドを用いて過剰に発現させた。適したプラ
スミドは、コリネフォルム細菌中で複製される前記のも
のである。多くの公知のプラスミドベクター、例えばｐ
Ｚ１（Menkel et al., Appliedand Environmental Micr
obiology (1989) 64: 549-554）、ｐＥＫＥｘ１（Eikma
nns et al., Gene 102: 93-98 (1991)）またはｐＨＳ２
−１（Sonnen et al.,Gene 107: 69-74 (1991)）は、潜
在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１
に基づく。他のプラスミドベクター、例えばｐＣＧ４
（ＵＳ−Ａ ４４８９１６０）、またはｐＮＧ２（Serw
old-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 11
9-124 (1990)）、またはｐＡＧ１（米国特許出願公開第
５１５８８９１号明細書）に基づくものを、同様に使用
することができる。
【００３５】さらに、アミノ酸、特にＬ−リジンを生産
するために、ｅｎｏ遺伝子の他に、特別な生合成経路、
解糖系、補充反応（anaplesis）、クエン酸サイクルま
たはアミノ酸排出（export）系の一つまたはそれ以上の
酵素を過剰に発現することは有利であってもよい。
するために、ｅｎｏ遺伝子の他に、特別な生合成経路、
解糖系、補充反応（anaplesis）、クエン酸サイクルま
たはアミノ酸排出（export）系の一つまたはそれ以上の
酵素を過剰に発現することは有利であってもよい。
【００３６】したがって、例えばＬ−リジンの生産のた
めに、 ●同時に、ジヒドロジピコリネートシンターゼ（EP-B 0
197335）をコードするｄａｐＡ遺伝子、または ●同時に、グリセルアルデヒド ３−リン酸 デヒドロ
ゲナーゼをコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992).
Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、または ●同時に、トリオース リン酸 イソメラーゼをコード
するｔpｉ遺伝子（Eikmanns (1992). Journal of Bacte
riology 174: 6076-6086）、または ●同時に、３−ホスホグリセレート キナーゼをコード
するｐｇｋ遺伝子（Eikmanns (1992). Journal of Bact
eriology 174: 6076-6086）、または ●同時に、ピルベート カルボキシラーゼをコードする
ｐｙｃ遺伝子（Eikmanns(1992). Journal of Bacteriol
ogy 174: 6076-6086）、または ●同時に、リジンの排出（export）をコードするｌｙｓ
Ｅ遺伝子（ドイツ特許出願公開第１９５４８２２２号明
細書）が過剰に発現されてもよい。
めに、 ●同時に、ジヒドロジピコリネートシンターゼ（EP-B 0
197335）をコードするｄａｐＡ遺伝子、または ●同時に、グリセルアルデヒド ３−リン酸 デヒドロ
ゲナーゼをコードするｇａｐ遺伝子（Eikmanns (1992).
Journal of Bacteriology 174: 6076-6086）、または ●同時に、トリオース リン酸 イソメラーゼをコード
するｔpｉ遺伝子（Eikmanns (1992). Journal of Bacte
riology 174: 6076-6086）、または ●同時に、３−ホスホグリセレート キナーゼをコード
するｐｇｋ遺伝子（Eikmanns (1992). Journal of Bact
eriology 174: 6076-6086）、または ●同時に、ピルベート カルボキシラーゼをコードする
ｐｙｃ遺伝子（Eikmanns(1992). Journal of Bacteriol
ogy 174: 6076-6086）、または ●同時に、リジンの排出（export）をコードするｌｙｓ
Ｅ遺伝子（ドイツ特許出願公開第１９５４８２２２号明
細書）が過剰に発現されてもよい。
【００３７】ｅｎｏ遺伝子の過剰発現に加えて、アミノ
酸、特にＬ−リジンを生産するために、望ましくない副
反応を取り除くことはさらに有利である（Nakayama:“B
reeding of Amino Acid Producing Micro-organisms”,
in: Overproduction of Microbial Products, Krumpha
nzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982）。
酸、特にＬ−リジンを生産するために、望ましくない副
反応を取り除くことはさらに有利である（Nakayama:“B
reeding of Amino Acid Producing Micro-organisms”,
in: Overproduction of Microbial Products, Krumpha
nzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London,
UK, 1982）。
【００３８】本発明によって製造された微生物は、回分
法（回分培養）または半回分法（半回分培養）または反
復半回分法（反復半回分培養）で、アミノ酸、特にはＬ
−リジンを生産する目的のために、連続的にか、あるい
は非連続的に培養することができる。公知の培養方法の
概要は、クミール（Chmiel）による教科書（Bioprozess
technik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik
［Bioprocess Technology 1. ］ Introduction to Bio
process Technology (Gustav Fischer Verlag,Stuttgar
t, 1991) )またはストーハス（Storhas）による教科書
(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen ［Bioreac
tors and Peripheral Equipment］(Vieweg Verlag, Bra
unschweig/ Wiesbaden, 1994）)中に記載されている。
法（回分培養）または半回分法（半回分培養）または反
復半回分法（反復半回分培養）で、アミノ酸、特にはＬ
−リジンを生産する目的のために、連続的にか、あるい
は非連続的に培養することができる。公知の培養方法の
概要は、クミール（Chmiel）による教科書（Bioprozess
technik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik
［Bioprocess Technology 1. ］ Introduction to Bio
process Technology (Gustav Fischer Verlag,Stuttgar
t, 1991) )またはストーハス（Storhas）による教科書
(Bioreaktorenund periphere Einrichtungen ［Bioreac
tors and Peripheral Equipment］(Vieweg Verlag, Bra
unschweig/ Wiesbaden, 1994）)中に記載されている。
【００３９】使用されるべき培地は、適した方法で、個
々の菌株の要求を満たすものでなければならない。種々
の微生物に対する培地の記載は、アメリカン・ソサエテ
ィー・フォー・バクテリオロジー(American Society fo
r General Bacteriology)（Washington D.C., USA, 198
1）の解説書「Manual of Methods for General Bacteri
ology」に含まれる。糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、麦芽糖、糖
蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば
大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、脂
肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノレ
イン酸、アルコール、例えばグリセロールおよびエタノ
ール、および有機酸、例えば酢酸は、炭素源として使用
することができる。前記物質は、別個にか、あるいは混
合物として使用されていてもよい。有機窒素含有化合
物、例えばペプトン、イーストエクストラクト、肉エキ
ス、麦芽エキス、コーン浸漬液、大豆粉および尿素、あ
るいは無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムお
よび硝酸アンモニウムは、窒素源として使用することが
できる。窒素源は、別個にか、あるいは混合物として使
用されてもよい。リン酸、リン酸二水素カリウムまたは
リン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩
は、リン源として使用されてもよい。培地は、さらに、
成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫
酸鉄を含有していなければならない。最終的には、必須
成長物質、例えばアミノ酸およびビタミンは前記物質に
加えて使用することができる。さらに、適した前駆物質
は培地に添加されてもよい。挙げられた出発物質は、一
回分の形で培養物に添加されるか、あるいは適した方法
で培養の間に供給されてもよい。
々の菌株の要求を満たすものでなければならない。種々
の微生物に対する培地の記載は、アメリカン・ソサエテ
ィー・フォー・バクテリオロジー(American Society fo
r General Bacteriology)（Washington D.C., USA, 198
1）の解説書「Manual of Methods for General Bacteri
ology」に含まれる。糖および炭水化物、例えばグルコ
ース、ショ糖、ラクトース、フルクトース、麦芽糖、糖
蜜、デンプンおよびセルロース、油および脂肪、例えば
大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびココナッツ油、脂
肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノレ
イン酸、アルコール、例えばグリセロールおよびエタノ
ール、および有機酸、例えば酢酸は、炭素源として使用
することができる。前記物質は、別個にか、あるいは混
合物として使用されていてもよい。有機窒素含有化合
物、例えばペプトン、イーストエクストラクト、肉エキ
ス、麦芽エキス、コーン浸漬液、大豆粉および尿素、あ
るいは無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムお
よび硝酸アンモニウムは、窒素源として使用することが
できる。窒素源は、別個にか、あるいは混合物として使
用されてもよい。リン酸、リン酸二水素カリウムまたは
リン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩
は、リン源として使用されてもよい。培地は、さらに、
成長に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫
酸鉄を含有していなければならない。最終的には、必須
成長物質、例えばアミノ酸およびビタミンは前記物質に
加えて使用することができる。さらに、適した前駆物質
は培地に添加されてもよい。挙げられた出発物質は、一
回分の形で培養物に添加されるか、あるいは適した方法
で培養の間に供給されてもよい。
【００４０】塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水溶液、
あるいは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は、適し
た方法でｐＨの調整のために使用されてもよい。起泡抑
制剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルは、泡の形
成を調整するために使用されてもよい。選択的作用を有
する適した物質、例えば抗生物質は、プラスミドの安定
性を保持するために培地に添加されてもよい。好気性条
件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、
例えば空気が、培養物中に挿入されていてもよい。培養
物の温度は、通常２０℃〜４５℃であり、かつ好ましく
は２５℃〜４０℃である。培養はリジンの最大量が形成
されるまで続けられる。この目標は、通常、１０時間〜
１６０時間以内に達成される。
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水溶液、
あるいは酸性化合物、例えばリン酸または硫酸は、適し
た方法でｐＨの調整のために使用されてもよい。起泡抑
制剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルは、泡の形
成を調整するために使用されてもよい。選択的作用を有
する適した物質、例えば抗生物質は、プラスミドの安定
性を保持するために培地に添加されてもよい。好気性条
件を維持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、
例えば空気が、培養物中に挿入されていてもよい。培養
物の温度は、通常２０℃〜４５℃であり、かつ好ましく
は２５℃〜４０℃である。培養はリジンの最大量が形成
されるまで続けられる。この目標は、通常、１０時間〜
１６０時間以内に達成される。
【００４１】Ｌ−リジンの分析は、陰イオンクロマトグ
ラフィーならびに引き続いてのニンヒドリン誘導体化
（ninhydrin derivatization）によって、スパックマン
ら（Spackman et al.）(Analytical Chemistry, 30, (1
958), 1190)によって記載されているように実施されて
もよい。
ラフィーならびに引き続いてのニンヒドリン誘導体化
（ninhydrin derivatization）によって、スパックマン
ら（Spackman et al.）(Analytical Chemistry, 30, (1
958), 1190)によって記載されているように実施されて
もよい。
【００４２】本発明による方法は、アミノ酸、特にＬ−
リジンの発酵生産のために使用される。
リジンの発酵生産のために使用される。
【００４３】
【実施例】本発明は、実施例を用いて以下により詳細に
説明される。
説明される。
【００４４】例１ コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）（19
55, Plasmid 33: 168-179）によって記載されているよ
うに単離し、かつ、部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで切
断した（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Pro
duct Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02）。Ｄ
ＮＡフラグメントをエビアルカリホスファターゼ( shri
mp alkaline phosphatase )（Roche Molecular Biochem
icals, Mannheim, Germany, Product Description SAP,
Code no. 1758250）を用いて脱リン酸化した。ストラ
タジーン社（stratagene）から得られる、コスミドベク
ターＳｕｐｅｒＣｏｓ１（Wahl et al. (1987) Proceed
ings of the National Academy of Sciences USA 84: 2
160-2164）のＤＮＡ(La Jolla, USA, Product Descript
ion SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301)
を、制限酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia,Freiburg,
Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-09
48-02）によって切断し、かつ同様にエビアルカリホス
ファターゼを用いて脱リン酸化した。その後にコスミド
ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia,
Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code
no. 27-0868-04）で切断した。この方法で処理された
コスミドＤＮＡを、処理されたＡＴＣＣ１３０３２ＤＮ
Ａと混合し、かつ回分をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersham
Pharmacia, Freiburg,Germany, Product Description
T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04）で処理した。そ
の後に、ライゲーション混合物を、ギガパックＩＩ Ｘ
Ｌ パッキングエクストラクト（GigaPack II, XL, Pac
king Extracts）（Stratagene, La Jolla, USA, Produc
t Description Gigapack II XL Packing Extract, Code
no. 200217）を用いてファージ中に詰込んだ。Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ菌株 ＮＭ５５４（Raleighet al. 1988, Nuclei
c Acid Research 16: 1563-1575）の感染のために、細
胞を１０ｍＭ ＭｇＳｏ4中に入れ、かつファージ懸濁
液のアリコートと混合した。コスミドライブラリーの感
染およびタイター（titering）を、サンブルックら（Sa
mbrook et al）（1989, Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor）によって記載された
ように実施し、その際、細胞はアンピシリン１００μｇ
／ｍｌを含有するＬＢアガー（Lennox 1955, virology,
1:190）上にまいた（plate out）。３７℃での一晩に
亘る培養後に、組み換え単一クローンを選択した。
２からのゲノミックコスミド遺伝子ライブラリーの製造 コリネバクテリウム グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡをタウチら（Tauch et al.）（19
55, Plasmid 33: 168-179）によって記載されているよ
うに単離し、かつ、部分的に制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで切
断した（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Pro
duct Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02）。Ｄ
ＮＡフラグメントをエビアルカリホスファターゼ( shri
mp alkaline phosphatase )（Roche Molecular Biochem
icals, Mannheim, Germany, Product Description SAP,
Code no. 1758250）を用いて脱リン酸化した。ストラ
タジーン社（stratagene）から得られる、コスミドベク
ターＳｕｐｅｒＣｏｓ１（Wahl et al. (1987) Proceed
ings of the National Academy of Sciences USA 84: 2
160-2164）のＤＮＡ(La Jolla, USA, Product Descript
ion SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301)
を、制限酵素ＸｂａＩ（Amersham Pharmacia,Freiburg,
Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-09
48-02）によって切断し、かつ同様にエビアルカリホス
ファターゼを用いて脱リン酸化した。その後にコスミド
ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Amersham Pharmacia,
Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code
no. 27-0868-04）で切断した。この方法で処理された
コスミドＤＮＡを、処理されたＡＴＣＣ１３０３２ＤＮ
Ａと混合し、かつ回分をＴ４ＤＮＡリガーゼ（Amersham
Pharmacia, Freiburg,Germany, Product Description
T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04）で処理した。そ
の後に、ライゲーション混合物を、ギガパックＩＩ Ｘ
Ｌ パッキングエクストラクト（GigaPack II, XL, Pac
king Extracts）（Stratagene, La Jolla, USA, Produc
t Description Gigapack II XL Packing Extract, Code
no. 200217）を用いてファージ中に詰込んだ。Ｅ．Ｃ
ｏｌｉ菌株 ＮＭ５５４（Raleighet al. 1988, Nuclei
c Acid Research 16: 1563-1575）の感染のために、細
胞を１０ｍＭ ＭｇＳｏ4中に入れ、かつファージ懸濁
液のアリコートと混合した。コスミドライブラリーの感
染およびタイター（titering）を、サンブルックら（Sa
mbrook et al）（1989, Molecular Cloning: A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor）によって記載された
ように実施し、その際、細胞はアンピシリン１００μｇ
／ｍｌを含有するＬＢアガー（Lennox 1955, virology,
1:190）上にまいた（plate out）。３７℃での一晩に
亘る培養後に、組み換え単一クローンを選択した。
【００４５】例２ ｅｎｏ遺伝子の単離およびシークエンシング 単一コロニーのコスミドＤＮＡを、キアプレップ スピ
ン ミニプレップ キット（Qiaprep Spin Miniprep Ki
t）（Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany）
を用いて、製品使用書に従って単離し、かつ、部分的に
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freibur
g, Germany, Product Description Sau3AI, Product N
o. 27-0913-02）で切断した。ＤＮＡフラグメントをエ
ビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemi
cals, Mannheim, Germany, ProductDescription SAP, P
roduct No. 1758250）で脱リン酸化した。ゲル電気泳動
による分離後に、１５００〜２０００ｂｐの大きさの範
囲のコスミドフラグメントを、ＱｉａＥｘＩＩゲル抽出
キット（QiaExII Gel Extraction Kit）（ProductNo. 2
0021, Quiagen, Hilden, Germany）で単離した。インビ
トロジェン社（Invitrogen）（Groningen, The Netherl
ands, Prouct Description Zero Background Cloning k
it, Product No. K2500-01）から得られたシークエンシ
ングベクター ｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡを、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, P
roduct Description BamHI, Product No. 27-0868-04）
で切断した。シークエンシングベクター ｐＺｅｒｏ−
１中のコスミドフラグメントのライゲーションを、サン
ブルックら（Sambrook et al.）(1989, Molecular Clon
ing: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)によ
って示されたように実施し、この場合、このＤＮＡ混合
物を、Ｔ４リガーゼ（Pharmacia Biotech, Freiburg, G
ermany）を用いて一晩に亘って培養する。その後に、こ
のライゲーション混合物を、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株 ＤＨ５
αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of National Aca
demy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649）中に電気穿
孔（Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 12
3: 343-7）し、ゼオシン５０μｇ（zeocin）／ｍｌを含
有するＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1: 190）
上にまいた。組み換えクローンのプラスミド製造を、Ｂ
ｉｏｒｏｂｏｔ ９６００（Product No. 900200, Qiag
en, Hilden, Germany）で実施した。シークエンシング
を、ツイマールマンら（Zimmermann et al.）(1990, Nu
cleic Acids Research, 18: 1067)による修正を含む、
サンガーら（Sanger et al.）のジデオキシ連鎖停止法
（dideoxy chain-stopping methods）（1977, Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences U.S.A., 7
4: 5463-5467）によって実施した。ＰＥアプライド バ
イオシステムズ（PE Applied Biosystems ）からの“Ｒ
Ｒ ｄローダミン ターミネーター サイクル シーク
エンシング キット（ＲＲ dRhodamin Terminator Cycl
e Sequencing kit）”を使用した( Product No. 40304
4, Weiterstadt, Germany)。ゲル電気泳動による分離お
よびシークエンシング反応の分析を、“ローチホレシス
ＮＦ アクリルアミド／ビスアクリルアミド（Rotiph
oresis NF Acrylamide/Bisacrylamide）”ゲル（２９：
１）（Product No. A 124.1, Roth, Karlsruhe, German
y）上で、ＰＥ アプライド バイオシステムズからの
“ABI Prism 377”シークエンサー（Weiterstadt, Grma
ny）を用いて実施した。
ン ミニプレップ キット（Qiaprep Spin Miniprep Ki
t）（Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany）
を用いて、製品使用書に従って単離し、かつ、部分的に
制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Amersham Pharmacia, Freibur
g, Germany, Product Description Sau3AI, Product N
o. 27-0913-02）で切断した。ＤＮＡフラグメントをエ
ビアルカリホスファターゼ（Roche Molecular Biochemi
cals, Mannheim, Germany, ProductDescription SAP, P
roduct No. 1758250）で脱リン酸化した。ゲル電気泳動
による分離後に、１５００〜２０００ｂｐの大きさの範
囲のコスミドフラグメントを、ＱｉａＥｘＩＩゲル抽出
キット（QiaExII Gel Extraction Kit）（ProductNo. 2
0021, Quiagen, Hilden, Germany）で単離した。インビ
トロジェン社（Invitrogen）（Groningen, The Netherl
ands, Prouct Description Zero Background Cloning k
it, Product No. K2500-01）から得られたシークエンシ
ングベクター ｐＺｅｒｏ−１のＤＮＡを、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, P
roduct Description BamHI, Product No. 27-0868-04）
で切断した。シークエンシングベクター ｐＺｅｒｏ−
１中のコスミドフラグメントのライゲーションを、サン
ブルックら（Sambrook et al.）(1989, Molecular Clon
ing: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)によ
って示されたように実施し、この場合、このＤＮＡ混合
物を、Ｔ４リガーゼ（Pharmacia Biotech, Freiburg, G
ermany）を用いて一晩に亘って培養する。その後に、こ
のライゲーション混合物を、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株 ＤＨ５
αＭＣＲ（Grant, 1990, Proceedings of National Aca
demy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649）中に電気穿
孔（Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 12
3: 343-7）し、ゼオシン５０μｇ（zeocin）／ｍｌを含
有するＬＢアガー（Lennox, 1955, Virology, 1: 190）
上にまいた。組み換えクローンのプラスミド製造を、Ｂ
ｉｏｒｏｂｏｔ ９６００（Product No. 900200, Qiag
en, Hilden, Germany）で実施した。シークエンシング
を、ツイマールマンら（Zimmermann et al.）(1990, Nu
cleic Acids Research, 18: 1067)による修正を含む、
サンガーら（Sanger et al.）のジデオキシ連鎖停止法
（dideoxy chain-stopping methods）（1977, Proceedi
ngs of the National Academy of Sciences U.S.A., 7
4: 5463-5467）によって実施した。ＰＥアプライド バ
イオシステムズ（PE Applied Biosystems ）からの“Ｒ
Ｒ ｄローダミン ターミネーター サイクル シーク
エンシング キット（ＲＲ dRhodamin Terminator Cycl
e Sequencing kit）”を使用した( Product No. 40304
4, Weiterstadt, Germany)。ゲル電気泳動による分離お
よびシークエンシング反応の分析を、“ローチホレシス
ＮＦ アクリルアミド／ビスアクリルアミド（Rotiph
oresis NF Acrylamide/Bisacrylamide）”ゲル（２９：
１）（Product No. A 124.1, Roth, Karlsruhe, German
y）上で、ＰＥ アプライド バイオシステムズからの
“ABI Prism 377”シークエンサー（Weiterstadt, Grma
ny）を用いて実施した。
【００４６】得られた粗配列データを、その後にスター
デン・プログラム・パッケージ（Staden program packa
ge) (1986, Nucleic Acids Research,14:217-231）バー
ジョン９７−０を用いて続行した。ｐＺｅｒｏｌ誘導体
の個々の配列は組み立てられ、連続的なコンティグを生
じた。コンピューターにアシストされたコーディング領
域の分析を、ＸＮＩＰプログラム（Staden, 1986, Nucl
eic Acids Research,14: 217-231）を用いておこなっ
た。さらなる分析を、“ＢＬＡＳＴ検索プログラム”
（Altschul et al.,1997, Nucleic acids Research, 2
5: 3389-3402 ）を用いて、“ナショナルセンター・フ
ォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（Nati
onal Center for Biotechnology Information）”(NCB
I, Betheda, MD, USA）の重複のないデータバンク（non
-redundant databank）に対して実施した。
デン・プログラム・パッケージ（Staden program packa
ge) (1986, Nucleic Acids Research,14:217-231）バー
ジョン９７−０を用いて続行した。ｐＺｅｒｏｌ誘導体
の個々の配列は組み立てられ、連続的なコンティグを生
じた。コンピューターにアシストされたコーディング領
域の分析を、ＸＮＩＰプログラム（Staden, 1986, Nucl
eic Acids Research,14: 217-231）を用いておこなっ
た。さらなる分析を、“ＢＬＡＳＴ検索プログラム”
（Altschul et al.,1997, Nucleic acids Research, 2
5: 3389-3402 ）を用いて、“ナショナルセンター・フ
ォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（Nati
onal Center for Biotechnology Information）”(NCB
I, Betheda, MD, USA）の重複のないデータバンク（non
-redundant databank）に対して実施した。
【００４７】得られたヌクレオチド配列は、配列番号１
に示されている。ヌクレオチド配列の分析は、１２７５
塩基対の転写解読枠を示し、この場合、これはｅｎｏ遺
伝子と呼称された。ｅｎｏ遺伝子は４２５アミノ酸のタ
ンパク質をコードする。
に示されている。ヌクレオチド配列の分析は、１２７５
塩基対の転写解読枠を示し、この場合、これはｅｎｏ遺
伝子と呼称された。ｅｎｏ遺伝子は４２５アミノ酸のタ
ンパク質をコードする。
【００４８】
【００４９】
【外１】
【００５０】
【外２】
【００５１】
【外３】
【００５２】
【外４】
【００５３】
【外５】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/04 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ヴァルター プフェッフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33 (72)発明者 トーマス ヘルマン ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト ツィ ルコンシュトラーセ ８ (72)発明者 アルフレート ピューラー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト アム ヴァルトシュレスヒェン ２ (72)発明者 イェルン カリノヴスキー ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト レン バッハシュトラーセ 19 (72)発明者 ブリギッテ バーテ ドイツ連邦共和国 ザルツコッテン ツヴ ィーテン １
Claims (17)
- 【請求項１】 次の群、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％
が同一であるポリヌクレオチド ｂ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０
％が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）またはｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的
なポリヌクレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の連
続する塩基少なくとも１５個を有するポリヌクレオチド から選択されたポリヌクレオチド配列を有する、コリネ
フォルム細菌から単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、好ましくはコリネ
フォルム細菌中で複製能力を有する組み換えＤＮＡであ
る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号１に示された核酸配列を有す
る、請求項２に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 次の群、（ｉ）配列番号１に示されたヌ
クレオチド配列、または（ｉｉ）遺伝暗号の縮退の範囲
内で配列（ｉ）に相当する配列の少なくとも一つ、また
は（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に対して相補的
な配列とハイブリダイズする配列の少なくとも一つ、お
よび場合によっては、（ｉｖ）（ｉ）中の機能中立セン
ス突然変異を有する、複製能力を有する、請求項２に記
載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードする、請求項２に記載のポリヌクレオ
チド配列。 - 【請求項７】 Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを発酵生
産する方法において、次の工程、 ａ）少なくともｅｎｏ遺伝子またはこの遺伝子をコード
するヌクレオチド配列が増幅され、特には過剰に発現さ
れるＬ−リジンを生産するコリネフォルム細菌を発酵さ
せ、 ｂ）培地または細菌の細胞中のＬ−アミノ酸を濃縮し、
かつ、 ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離する ことを特徴とする、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−リジンを発
酵生産する方法。 - 【請求項８】 望ましいＬ−アミノ酸の生合成経路の他
の遺伝子が付加的に増幅されている細菌を使用する、請
求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 Ｌ−リジンの形成を減少させる代謝経路
が、少なくとも部分的に取り除かれている細菌を使用す
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 プラスミドベクターで形質転換された
菌株を使用し、かつこのプラスミドベクターがｅｎｏ遺
伝子をコードするヌクレオチド配列を運搬する、請求項
７に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−リジンを生産するコリネフォルム
細菌を使用する、請求項７から１０までのいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１２】 ジヒドロジピコリネートシンターゼを
コードするｄａｐＡ遺伝子を同時に過剰に発現させる、
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 Ｓ−（２−アミノエチル）−システイ
ン耐性を付与するＤＮＡフラグメントを同時に増幅させ
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１４】 グリセルアルデヒド ３−リン酸をコ
ードするｇａｐ遺伝子を同時に過剰に発現させる、請求
項８に記載の方法。 - 【請求項１５】 トリオース リン酸 イソメラーゼを
コードするｔｐｉ遺伝子を同時に過剰に発現させる、請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１６】 ３−リン酸 グリセレート キナーゼ
をコードするｐｇｋ遺伝子を同時に過剰に発現させる、
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１７】 ピルベート カルボキシラーゼをコー
ドするｐｙｃ遺伝子を同時に過剰に発現させる、請求項
８に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19947791A DE19947791A1 (de) | 1999-10-05 | 1999-10-05 | Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19947791.4 | 1999-10-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001161380A true JP2001161380A (ja) | 2001-06-19 |
Family
ID=7924467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000305110A Pending JP2001161380A (ja) | 1999-10-05 | 2000-10-04 | ポリヌクレオチド、ｄｎａ、ポリヌクレオチド配列の単離、およびｌ−アミノ酸の発酵生産の方法 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1090998A1 (ja) |
| JP (1) | JP2001161380A (ja) |
| KR (1) | KR20010050840A (ja) |
| CN (1) | CN1290750A (ja) |
| AU (1) | AU6135900A (ja) |
| BR (1) | BR0004643A (ja) |
| CA (1) | CA2319716A1 (ja) |
| DE (1) | DE19947791A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0003893A2 (ja) |
| ID (1) | ID27338A (ja) |
| MX (1) | MXPA00009077A (ja) |
| PL (1) | PL342986A1 (ja) |
| RU (1) | RU2000125061A (ja) |
| SK (1) | SK14582000A3 (ja) |
| ZA (1) | ZA200005409B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008526196A (ja) * | 2004-12-30 | 2008-07-24 | シージェイ コーポレーション | 外来のｎａｄｐ依存的グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むエシェリキア種またはコリネバクテリウム種の微生物、およびこれらを用いてｌ−リジンを生産する方法 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6797509B1 (en) | 1999-07-09 | 2004-09-28 | Degussa-Huls Ag | Nucleotide sequences which code for the tal gene |
| WO2002022668A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-21 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the roda gene |
| AU2001287682A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-26 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences coding for the ftsx gene |
| DE10046625A1 (de) * | 2000-09-20 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das ndkA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| DE10145043A1 (de) * | 2001-09-13 | 2003-04-03 | Degussa | Verfahren und Herstellung von Feinchemikalien |
| DE10210527A1 (de) | 2002-03-09 | 2003-09-18 | Degussa | Allele des aceA-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US20070092951A1 (en) | 2005-03-24 | 2007-04-26 | Degussa Ag | Alleles of the zwf gene from coryneform bacteria |
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