KR20020097248A

KR20020097248A - ｆａｄＤ15 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열

Info

Publication number: KR20020097248A
Application number: KR1020027014793A
Authority: KR
Inventors: 남포오티리마드하반; 뫼켈베티나; 페페를레발터; 에겔링로타르; 삼헤르만
Original assignee: 데구사 아게; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 2000-05-04
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2002-12-31
Also published as: AU2001273971A1; WO2001083759A1; DE10021831A1; EP1278857A1

Abstract

본 발명은, fadD15 유전자가 증강되어진, 유전자 변형된 코리네형 박테리아; 아실-CoA 신타제를 암호화하는, 코리네형 박테리아로 부터 분리된 폴리뉴클레오티드; 박테리아내에서 fadD15 유전자를 증강시켜 L-아미노산을 발효적으로 제조하는 방법; 및 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서의 당해 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다.

Description

ｆａｄＤ15 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열{Nucleotide sequences which code for the fadD15 gene}

본 발명은, 유전자 변형된 코리네형 박테리아, 아실-CoA 신타제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 아실-CoA 신타제를 암호화하는 fadD15 유전자가 증강된 코리네형 박테리아를 사용하여 아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 제조하는 방법을 제공한다.

아미노산, 특히 L-리신은 사람의 의약 및 약제 산업, 특히 동물의 사료에 사용된다.

아미노산이 코리네형 박테리아 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 통한 발효에 의해 제조될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 아미노산의 지대한 중요성 때문에, 제조 공정을 개선하기 위한 노력이 계속되어 왔다. 제조 공정의 개선은, 발효 기술(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효 동안의 당의 농도), 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산성에 관한 것이다.

돌연변이 유발법, 선택법 및 돌연변이체 선별법을 사용하여 이들 미생물의 생산성을 개선시킬 수 있다. 항대사물질(예: 리신 동족체 S-(2-아미노에틸)-시스테인)에 대해 내성을 갖거나, 또는 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며, L-아미노산(예: L-리신)을 생산하는 균주가 이러한 방법으로 수득된다.

각각의 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 미치는 효과를 연구하여, 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하기 위한 재조합 DNA 기술이 수 년간 이용되어 왔다. 이에 관한 개관 논문은 특히 다음 문헌[참조: Kinoshita "Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger, BioTec 2, 40-44 (1991); Eggeling, Amino Acids 6, 261-272 (1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); 및 Sahm et al., Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 목적은 아미노산, 특히 L-리신의 발효적 생산을 개선하기 위한 신규한 수단을 제공하는 것이다.

아미노산, 특히 L-리신은 사람의 의약 및 약제 산업, 특히 동물 사료에 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-리신을 제조하기 위한 개선된 새로운 방법을 제공하는 것이 전반적 관심의 대상이다.

이후, L-리신 또는 리신이 언급되는 경우, 이는 염기 뿐만 아니라, 예를 들면, 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 설페이트와 같은 염을 의미하는 것이기도 하다.

본 발명은, 아실-CoA 신타제를 암호화하는 fadD15 유전자가 증강된, 유전자변형된 코리네형 박테리아를 제공한다.

이와 관련하여, "증강"이란 용어는, 상응하는 DNA에 의해 암호화된 미생물내의 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 증가시키는 것을 의미한다.

증강은 박테리아 세포의 다양한 조작을 통해 이루어질 수 있다.

증강, 특히 과발현을 달성하기 위하여, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 프로모터 및 조절 영역 또는 구조 유전자 상류의 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 도입되는 발현 카세트도 동일한 방법으로 작용한다. 유도성 프로모터를 이용하여, 발효적 L-리신 또는 L-글루타메이트 생산 과정에서 발현을 추가로 증가시킬 수 있다. 또한, 고 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용할 수 있다. 발현은 또한 m-RNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 향상될 수 있다. 더우기, 효소 활성은 당해 효소의 분해를 방지함으로써 전반적으로 증가된다. 또한, 이들 수단은 원하는 바에 따라 임의로 조합될 수 있다.

본 발명이 제공하는 미생물은, 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산할 수 있다. 이들 미생물의 대표적인 예는 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 속의 박테리아이다. 코리네박테리움 속 중에서도, L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력이 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특히 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종 중에서 적합한 균주로는, 예를 들면, 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870,

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라스세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC 17965,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067,

브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; 및

이로부터 제조된 L-리신-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464, 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715이 있다.

본 발명은,

a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 정도 상동성인 폴리뉴클레오티드,

b) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상 정도 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 박테리아로부터 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 출원과 관련하여, 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명에 따른 서열과 염기 조성 및 서열에 있어서 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 정도 일치하는 경우에, 당해 폴리뉴클레오티드 서열은 본 발명에 따른 서열과 "상동성" 이다. 본 발명에 따르면, "상동성 단백질"은, fadD15 유전자(서열 번호 1)에 의해 암호화된 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상 정도 일치하는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서 이해되며, "일치한다"란 상응하는 아미노산이 동일하거나 이들이 서로 상동성인 아미노산인 것을 의미하는 것으로서 이해된다. 특성, 특히 전하, 소수성, 입체적 특성 등에 있어서 상응하는 이들 아미노산은 "상동성 아미노산"이라고 불리운다.

또한, 본 발명은,

(i) 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전 암호의 축퇴성(degeneration) 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드를 형성하는 하나 이상의 서열, 및 임의로,

(iv) 동일하거나 상동성인 아미노산을 초래하는, 서열 (i)에서의 중성 기능의 돌연변이체를 포함하는 바람직하게는 복제가능한 DNA인, 상기한 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 복제가능한 폴리뉴클레오티드;

서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;

수탁번호 제13249호하에 기탁된 코리네박테리움 글루타미쿰내의 벡터 pJC1fadD15중에 함유된, fadD15 유전자를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 DNA 서열을 함유하는 벡터; 및

상기 벡터를 함유하거나, fadD15 유전자가 증강된 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 박테리아를 제공한다.

또한, 본 발명은, 서열 번호 1에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 완전한 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 제공하며, 이는 상응하는 유전자 라이브러리를 서열 번호 1에 따른 언급된 폴리뉴클레오티드 서열또는 이의 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드화하여 스크리닝하고, 언급된 DNA 서열을 분리함으로써 수득가능하다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은, 아실-CoA 신타제를 암호화하는 전장 cDNA를 분리하고 아실-CoA 신타제 유전자의 서열과 고도로 유사한 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA와의 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은, 아실-CoA 신타제를 암호화하는 DNA의 제조를 위한, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)용 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오티드는 30개 이상, 바람직하게는 최대 30개, 특히 바람직하게는 최대 20개, 특별히 바람직하게는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 40개 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드도 또한 적합하다.

"분리된"이란 천연 환경으로부터 분리되어짐을 의미한다.

"폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미하며, 이들은 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수도 있다.

"폴리펩티드"란 펩티드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 이해된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드로는, 서열 번호 2에 따른 폴리펩티드, 특히 아실운반 단백질(아실-CoA 신타제)의 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드, 및 서열 번호 2에 따른 폴리펩티드와 70% 이상 정도, 바람직하게는 80% 이상 정도, 특히 바람직하게는 90 내지 95% 이상 정도 상동성이고, 위에서 언급한 활성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.

또한, 본 발명은, 특히 이미 아미노산을 생산하며, fadD15 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증강, 특히 과발현된 코리네형 박테리아를 사용하여, 아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 제조하는 방법을 제공한다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 아실-CoA 신타제를 암호화하는 fadD15 유전자(EC 6.2.1.3)가 본 발명에서 최초로 기술된다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 fadD15 유전자 또는 기타 유전자를 분리하기 위하여, 일차적으로 이. 콜라이(E. coli)내에 당해 미생물의 유전자 라이브러리를 작제한다. 유전자 라이브러리의 작제법은 일반적으로 공지된 교과서 및 논문집에 기술되어 있다. 예로써, 교과서[참조: Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Gene and Clone, An Introduction to Genetic Engineering)(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 논문집[참조: Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]이 언급될 수 있다. 익히 공지된 유전자 라이브러리는 문헌[참조: Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 따라 λ 벡터내에 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 유전자 라이브러리이다. 문헌[참조: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996]에는 코스미드 벡터SuperCos I[참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Science USA, 84: 2160-2164]을 이용하여 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]내에 작제한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 문헌[참조: Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)]에는 코스미드 pHC79[참조: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]을 사용하여 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 이. 콜라이내에 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자 라이브러리를 제조하기 위하여, pBR322[참조: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[참조: Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]와 같은 플라스미드를 사용할 수도 있다. 제한-결함 및 재조합-결함인 이. 콜라이 균주가 숙주로서 특히 적합하다. 이러한 균주의 예로는 문헌[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)]에 기술된 균주 DH5αmcr이 있다. 이어서, 코스미드를 이용하여 클로닝한 장쇄 DNA 단편을 서열분석에 적합한 통상의 벡터내에 서브클로닝한 다음, 서열 분석할 수 있다[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74: 5463-5467, 1977].

fadD15 유전자를 암호화하고, 서열 번호 1로서 본 발명의 구성원인 코리네박테리움 글루타미쿰의 새로운 DNA 서열은 이러한 방법으로 수득되었다. 게다가, 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 상기한 방법에 의해 본 DNA 서열로 부터 유도되었다. fadD15 유전자 생성물의 생성된 아미노산 서열은 서열 번호 2에 제시된다.

또한, 유전 암호의 축퇴성으로 인해 서열 번호 1으로부터 생성된 암호화 DNA 서열도 본 발명의 구성원이다. 마찬가지로, 서열 번호 1 또는 서열 번호 1의 일부와 하이브리드를 형성하는 DNA 서열도 본 발명의 구성원이다. 단백질에서 보존성 아미노산 교체, 즉 글리신의 알라닌으로의 교체 또는 아스파르트산의 글루탐산으로의 교체는, 단백질의 활성을 근본적으로 변화시키지 않는, 즉 기능상 중성인 "센스 돌연변이"로서 당업자들 사이에서 익히 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N 및/또는 C 말단 상의 변화는, 이의 기능을 실질적으로 손상시키지 않거나, 오히려 안정화시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 당업자는, 이와 관련된 정보를 특히 문헌[참조: Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77: 237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3: 240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)], 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다. 상응하는 방식으로 서열 번호 2로부터 수득되는 아미노산 서열도 또한 본 발명의 구성원이다.

마찬가지로, 서열 번호 1 또는 서열 번호 1의 일부와 하이브리드를 형성하는 DNA 서열은 본 발명의 구성원이다. 최종적으로, 서열 번호 1로부터 수득된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 DNA 서열도 또한 본 발명의 구성원이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 15개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

당업자는 하이브리드화에 의한 DNA 서열의 동정에 대한 지침을 문헌["TheDIG System Users Guide for Filter Hybridization" from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993); 및 Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 찾아볼 수 있다. 당업자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 이용한 DNA 서열 증폭에 대한 지침을, 특히 문헌[참조: Gait, Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984); 및 Newton & Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명에 관한 연구중에, 코리네형 박테리아가 fadD15 유전자의 증강 후 아미노산, 특히 L-리신을 향상된 방식으로 생산한다는 것이 밝혀졌다.

연구중에 있는 유전자(들) 작제물은 상이한 복사체 수의 플라스미드내에 존재하거나, 또는 염색체내에 통합되어 증강될 수 있다. 달리, 목적 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양 과정을 변화시킴으로써 성취될 수 있다.

당업자는 이와 관련된 지침을 특히 문헌[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); EP 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 국제특허출원 WO 96/15246; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 특허 공개공보 JP-A-10-229891; Jensen andHammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); 및 Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)], 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.

예로써, 본 발명에 따른 fadD15 유전자는 플라스미드를 이용하여 과발현시켰다.

적합한 플라스미드는 코리네형 박테리아에서 복제되고 발현된 것들이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들면, pZ1[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554], pEKEx1[참조: Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참조: Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)]은 잠재(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기본으로 한다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면, pCG4[참조: US-A-4,489,160], pNG2[참조: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)] 또는 pAG1[참조: US-A-5,158,891]을 기본으로 하는 플라스미드를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.

fadD15 유전자를 과발현시키는데 사용할 수 있는 플라스미드의 예로는 pJC1fadD15(도 1)이 있으며, 이는 이.콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1[참조: Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480]을 기본으로 하며, fadD15 유전자를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 DNA 서열을 함유한다. 이는 균주 DSM5715/pJC1fadD15내에 함유된다.

hom-thrB 오페론을 복제 또는 증강시키기 위해 예를 들어 문헌[참조:Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기술된 바와 같이, 염색체내로 통합시켜 유전자를 증강시키는데 도움을 줄 수 있는 플라스미드 벡터가 또한 적합하다. 이러한 방법하에서는, 숙주(전형적으로 이. 콜라이)에서는 복제될 수 있으나, 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터내에 완전한 유전자를 클로닝한다. 가능한 벡터의 예로는, pSUP301[참조: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참조: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T[공급원: Promega corporation, Madison, WI, USA] , pCR2.1-TOPO[참조: Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5,487,993], pCR^RBlunt(Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)], 또는 pEM1[참조: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516]이 있다. 이후, 증강시키고자 하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환을 통해 목적하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 전달한다. 접합법은, 예를 들면, 문헌[참조: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술되어 있다. 형질전환법은, 예를 들면, 문헌[참조: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988); Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989); 및 Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어 있다. "교차" 현상에 의한 상동 재조합 후, 생성된 균주는 당해 유전자의 2개 이상의 복사체를 함유한다.

또한, 아미노산, 특히 L-리신의 생산에 있어서, fadD15 유전자에 추가하여, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충대사, 시트르산 사이클 또는 아미노산 이송에 관련된 하나 이상의 효소를 증폭 또는 과발현시키는 것이 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들면, L-리신의 제조를 위해, 하기 유전자로 이루어진 그룹중에 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증강, 특히 과발현 또는 증폭시킬 수 있다:

· 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(EP-B 0 197 335),

· 석시닐 디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

· 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조: Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324],

· 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 트리오즈 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

· 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(DE-A-198 31 609),

· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaaret al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)], 또는

· 리신 이송을 암호화하는 lysE 유전자[참조: DE-A-195 48 222].

fadD15 유전자를 증강시키는 것 이외에, 하기 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 아미노산, 특히 L-리신의 생산에 있어서 유리할 수 있다:

· 포스포엔올 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참조: DE 199 50 409.1, DSM13047], 및/또는

· 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참조: US 09/396,478; DSM12969], 및/또는

· 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[DE 199 51 975.7; DSM 13114].

fadD15 유전자를 과발현시키는 것 외에, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 아미노산, 특히 L-리신의 생산에 있어서 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

아미노산, 특히 L-리신을 생산하기 위하여, 본 발명에 따라 제조된 미생물을 배취 공정(배취 배양), 또는 유가 배양(fed batch)(유가 공정)이나 반복적 유가 공정(반복 공급 공정)에서 연속적 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 개요가 교과서[참조: Chmiel, Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik {Bioprocess Technology 1. Instruction to BioprocessTechnology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)}; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen {Bioreactors and Peripheral Equipment (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)}]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 균주의 요구를 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 내용은 논문집[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology", The American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기재되어 있다.

당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 유지(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(예: 아세트산)이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

질소를 함유하는 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

인산, 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장 물질, 예를 들면, 아미노산 및 비타민이 위에서 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 게다가, 적합한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 상기 출발 물질은 상기 배지에 단일 배취 형태로 가해지거나, 또는 배양 중에 적당한 방식으로 공급될 수 있다.

배지의 pH를 조절하기 위하여, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수), 또는 산 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적합한 방식으로 사용할 수 있다. 소포제, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 발포를 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 가할 수 있다. 호기성 상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 가할 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 리신이 최대로 생성될 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10시간 내지 160시간내에 달성될 수 있다.

L-리신의 분석을, 음이온 교환 크로마토그래피 처리 후, 닌하이드린 유도화를 통해 수행한다[참조: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190].

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁되었다:

ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1fadD15(수탁번호: DSM 13249).

본 발명에 따르는 방법을 사용하여, 아미노산, 특히 L-리신을 발효적으로 제조한다.

본 발명은 구체적 예를 통하여 아래에서 보다 상세히 설명될 것이다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02)으로 부분적으로 절단하였다. DNA 단편을 소하(shrimp) 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)로 탈인산화시켰다. 코스미드 벡터 SuperCos1(구입원: Stratagene, La Jolla, USA, Product Description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code no. 251301)[참조: Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02)으로 절단하고, 마찬가지로 소하 알칼리 포스파타제로 탈인산화시켰다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04)로 절단하였다. 이러한 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032 DNA와 혼합하고, 당해 배취를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리하였다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 Gigapack II XL 팩킹 추출물(Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217)을 사용하여 파아지내에 충전시켰다. 이.콜라이 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]를 감염시키기 위해, 세포를 10mM MgSO₄에 침지시키고, 파아지 현탁액의 분액과 혼합하였다. 세포를 100㎍/ℓ의 앰피실린을 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology, 1: 190] 상에 플레이팅하여, 코스미드 라이브러리의 감염 및 역가측정을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 밤새 37℃에서 항온처리한 후, 각각의 재조합체 클론을 선별하였다.

실시예 2

fadD15 유전자의 분리 및 서열분석

각 콜로니의 코스미드 DNA를, 제조업자의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고,제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Product No. 27-0913-02)로 부분적으로 절단하였다. DNA 단편을 소하 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈인산화시켰다. 겔 전기영동으로 분리한 후, 크기가 1500 내지 2000bp 범위내인 코스미드 단편을 QiaExII Gel 추출 키트(Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)로 분리하였다. 서열분석용 벡터 pZero-1(공급원: Invitrogen, Groningen, Holland, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01)의 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04)으로 절단하였다. 서열분석용 벡터 pZero-1내로의 코스미드 단편의 연결을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하는데, 이 경우 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 항온처리하였다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 전기천공[참조: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters 123: 343-7]에 의해 이.콜라이 균주 DH5αMCR[참조: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649]내에 도입하여 형질전환시키고, 제오신 50㎍/ml를 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology, 1: 190) 상에 플레이팅하였다. 재조합체 클론의 플라스미드 제조는 Biorobot 9600(Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행하였다. 서열 분석은 문헌[참조: Sanger et al., 1977, Proceedingsof the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄-종결법을 문헌[참조: Zimmermann et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 1067]에 기술된 바와 같이 변형시켜 수행하였다. "RR dRhodamin 터미네이터 사이클 서열분석 키트"(구입원: PE Applied Biosystems; Product No. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용하였다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열형성 반응의 분석을, "ABI Prism 377" 서열분석기(구입원: PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)를 사용하여 "Rotiphoresis NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드" 겔(29:1)(Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany)에서 수행하였다.

이어서, 수득된 미처리 서열 데이터를 스타덴(Staden) 프로그램 패키지[참조: 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231] 버젼 97-0을 사용하여 처리하였다. pZero-1 유도체의 각각의 서열을 연속 콘티그(contig)로 어셈블링하였다. 컴퓨터-지원된 암호화 영역 분석을 XNIP 프로그램[참조: Staden, 1986, Nucleic Acids Research. 14: 217-231]을 사용하여 수행하였다. 추가 분석을, "국립 생명공학 정보 센터"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 비-중복성 데이터뱅크에 대해 "BLAST 서치 프로그램"[참조: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research. 25: 3389-3402]을 사용하여 수행하였다.

수득된 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1에 제시되어 있다. 당해 뉴클레오티드 서열의 분석을 통해, fadD15 유전자라 불리우는 1857개 염기 쌍의 개방형 판독 프레임이 밝혀졌다. fadD15 유전자는 619개 아미노산의 단백질(서열 번호 2)를 암호화한다.

실시예 3

fadD15 유전자의 클로닝

코리네박테리움 글루타미쿰 13032로 부터 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al., 1995, Plasmid 33:168-179]에 기재된 바와 같이 분리하였다. fadD15 유전자를 수반하는 DNA 단편을 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 증폭시켰다. 이를 위하여, 아래의 프라이머를 사용하였다:

5'-TGA TTG GTG CAG ATA TAA GAA GTT-3'

5'-CAG CGA AGC GTG TTG GT-3'

제시된 프라이머를, MWG 바이오테크(Biotech)(Ebersberg, Germany)에 의해 합성하고, 이들을 사용하여 PCR 반응을 문헌[참조: Innis et al., PCR protocol. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 당해 프라이머를 사용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 fadD15 유전자를 수반하는 크기가 2160bp인 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다.

겔 전기영동에 의해 분리한 후, PCR 단편을 QiaExII 겔 추출 키트(Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로즈 겔로 부터 분리하였다.

벡터 pUC18[참조: Norrander et al., Gene (26) 101-106 (1983)]을 제한 엔도뉴클리아제 SmaI으로 완전히 절단하고, 소하 알칼리 포스파타제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250]로 탈인산화시켰다.

이러한 방법으로 수득된 약 2160 bp의 PCR 단편을 준비된 벡터 pUC18과 혼합하고, 당해 배취를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, Code no.27-0870-04)로 처리하였다. 당해 연결 배취를 이.콜라이 균주 DH5α[참조: Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]에서 형질전환시켰다. 앰피실린 100mg/l을 함유하는 LB 아가(Lennox, 1995, Virology, 1:190)상에서 형질전환 배취를 플레이팅시켜, 플라스미드-수반 세포를 선별하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 개개의 재조합 클론을 선별하였다. Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, Quiagen, Hilden, Germany)를 제조자의 지침에 따라 사용하여, 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하여, 제한 효소 EcoRI으로 절단한 후, 당해 플라스미드를 아가로즈 겔 전기영동으로 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pUC18fadD15로 명명하였다.

실시예 4

벡터 pJC1내에서의 fadD15의 클로닝

실시예 3에 기술된 플라스미드 pUC18fadD15를 효소 EcoRI 및 SalI으로 완전히 절단하여 이로 부터 fadD15 유전자를 분리하였다. 크기가 2201bp인 fadD15 단편을, QiaExII 겔 추출 키트(Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로즈 겔로 부터 분리하였다.

이.콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1(Cremer et al., 1990,Molecular and General Genetics 220: 478-80)를 벡터로서 사용하였다. 이 플라스미드를 제한효소 BamHI으로 완전히 절단하고, 클레노우(Klenow) 폴리머라제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 처리한 다음, 소하 알칼리 포스파타제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈인산화시켰다.

이러한 방법으로 수득된 fadD15 단편을 준비된 벡터 pJC1과 혼합하고, 당해 배취를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T-4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리하였다. 당해 연결 배취를 이.콜라이 균주 DH5α[참조: Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]에서 형질전환시켰다. 카나마이신 50mg/l을 함유하는 LB 아가(Lennox, 1995, Virology, 1:190)상에서 형질전환 배취를 플레이팅시켜, 플라스미드-수반 세포를 선별하였다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 개개의 재조합 클론을 선별하였다. Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, Quiagen, Hilden, Germany)를 제조자의 지침에 따라 사용하여, 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하여, 제한 효소 XbaI으로 절단한 후, 당해 플라스미드를 아가로즈 겔 전기영동으로 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pJC1fadD15로 명명하였다.

실시예 5

플라스미드 pJC1fadD15를 사용한 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715의 형질전환

균주 DSM5715를, 문헌[참조: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]에 기술된 전기천공 방법을 사용하여 플라스미드 pJC1fadD15로 형질전환시켰다. 당해 형질전환체를, 카나마이신 25mg/ℓ가 보충된, 뇌-심장 주입 브로쓰 18.5g/ℓ, 0.5M 소르비톨, 박토-트립톤 5g/ℓ, 박토-효모 추출물 2.5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ 및 박토-아가 18g/ℓ를 포함하는 LBHIS 아가 상에서 선별하였다. 항온처리를 2일 동안 33℃에서 수행하였다.

플라스미드를 통상의 방법[참조: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]으로 형질전환체로 부터 분리하고, 제한 엔도뉴클리아제 XbaI으로 절단한 다음, 당해 플라스미드를 아가로즈 겔 전기영동으로 확인하였다. 수득된 균주를 DSM5715/pJC1fadD15로 명명하였다.

ㆍ 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1fadD15(수탁번호: DSM 13249)

실시예 6

리신의 제조

실시예 5에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pJC1fadD15를리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양한 다음, 배양 상청액 중의 리신 함량을 측정하였다.

이를 위하여, 당해 균주를 일차적으로 상응하는 항생제(카나마이신(25mg/ℓ)을 함유하는 뇌-심장 아가)와 함께 아가 플레이트 상에서 24시간 동안 33℃에서 항온처리하였다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩하였다(100ml 원추형 플라스크당 10ml 배지). 완전 배지 CgIII을 예비배양용 배지로서 사용하였다.

Cg III 배지:

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙시킴) 2%(w/v)

pH는 7.4로 조정되었다.

카나마이신(25mg/ℓ)을 이에 첨가하였다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 16시간 동안 33℃에서 항온처리하였다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 상기 예비배양물로부터 주 배양물을 시딩하였다. MM 배지를 주 배양에 사용하였다.

MM 배지:

CSL(옥수수 침지액)5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산)20g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙시킴)50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O1.0g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O10mg/ℓ

FeSO₄* 7H₂O10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O5.0mg/ℓ

비오틴(멸균 여과)0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(멸균 여과)0.2mg/ℓ

L-루신(멸균 여과)0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염 용액의 pH를 암모니아수를 사용하여 pH 7로 조정한 다음, 오토클레이빙시켰다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액, 및 무수-상태로 오토클레이빙시킨 CaCO₃를 첨가하였다.

배플이 장착된 100ml의 원추형 플라스크당 10ml 용량으로 배양을 수행하였다. 카나마이신(25mg/ℓ)을 첨가하였다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양을 수행하였다.

24시간 후, Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여,측정 파장 660nm에서 OD를 측정하였다. 생성된 리신의 양을, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 포스트-컬럼(post-column) 유도화에 의해 측정하였다.

실험 결과는 표 1에 제시되어 있다.

균주	OD (660nm)	리신HCl(g/ℓ)
DSM5715/pJC1fadD15	12.4	8.25
DSM5715	11.9	7.8

실시예 7

성장 특성의 개선

실시예 4에서 수득된 플라스미드 pJCfadD15를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 ATCC 13032의 형질전환에 사용하였다. 이 균주를 실시예 5에 기술된 바와 같이 형질전환시키고, 실시예 5에 기술된 바와 같이 제한 분해 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해 조사하였다. 수득된 균주 ATCC 13032/pJCfadD15를 성장 측정에 적합한 영양 배지에서 배양하고 다양한 온도에서 성장을 측정하였다.

이를 위하여, 실시예 6에 기술된 바와 같이, 균주를 일차적으로 상응하는 항생제(카나마이신(50mg/ℓ)을 함유하는 뇌-심장 아가)와 함께 아가 플레이트 상에서 24시간 동안 30℃에서 항온처리하였다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩하였다(100ml의 원추형 플라스크당 10ml 배지). 실시예 6에 기술된 완전 배지 CgIII을 예비배양용 배지로서 사용하였다. 카나마이신(25mg/ℓ)을 이에 첨가하였다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 16시간 동안 30℃에서 항온처리하였다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.7이 되도록 상기 예비배양물로부터 주 배양물을 시딩하였다. MM 배지를 주 배양에 사용하였다.

MM 배지:

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 42g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙시킴) 40g/ℓ

(NH₄)₂SO₄20g/ℓ

KH₂PO₄1.0g/ℓ

K₂HPO₄1.0g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O 0.25g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄* 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O 10mg/ℓ

ZnSO₄* H₂O 1mg/ℓ

CuSO₄0.2mg/ℓ

NiCl₂* 6H₂O 0.02mg/ℓ

비오틴(멸균 여과) 0.2mg/ℓ

프로토카테쿠산(멸균 여과) 30mg/ℓ

MOPS 및 염 용액의 pH를 암모니아수를 사용하여 pH 7로 조정한 다음, 오토클레이빙시켰다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액을 첨가하였다.

배플이 장착된 500ml의 원추형 플라스크당 60ml 용량으로 배양을 수행하였다. 카나마이신(25mg/ℓ)을 첨가하였다. 40℃에서 배양을 수행하였다.

Ultrospec 3000(Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)을 사용하여, 측정 파장 660nm에서 OD를 측정하였다. 실험 결과는 도 2에 제시되어 있다.

특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 7.1에 따라 발행된 원 기탁에 관한 수탁증

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33790 할레 칸트슈트라쎄 2

I.미생물의 동정
기탁자가 정한 동정 표시:DSM 5715/pJC1fadD15	국제기탁기관에 의한수탁번호 : DSM 13249
II. 과학적 성질 및/또는 분류학상의 위치
상기 I란의 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다.( × ) 과학적 성질( × ) 분류학상의 위치(해당되는 경우 ×로 표시)
III. 수령 및 수탁
본 국제기탁기관은 2000년 1월 20일(원기탁일)¹에 수령된 상기 I란의 미생물을 수탁한다.
IV. 전환 요구서의 수령
상기 I란의 미생물은 (원기탁일)에 본 국제기탁기관에 의해 수령되었고 원 기탁물의부다페스트 조약하의 기탁물로의 전환 요구서는 본 기관에 의해 (전환요구서 수령일)에수령되었다.
V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하주소 : 데-38124 브라운쉬바이크마쉐로더 벡 1베	국제기탁기관을 대표하는 권한을 갖는 사람(들)또는 증명관(들)의 서명(들) :서 명날짜 : 2000년 1월 25일

1. 규칙 6.4(d)가 적용되는 경우, 이 날짜는 국제기탁기관의 자격이 획득된 날짜이다.

Claims

아실-CoA 신타제를 암호화하는 fadD15 유전자가 증강된 유전자 변형된 코리네형 박테리아.
제1항에 있어서, 출발 박테리아(야생형)가, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰 ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸 ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539, 코리네박테리움 멜라스세콜라 ATCC 17965, 브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 ATCC 13869 및 브레비박테리움 디바리카툼 ATCC 14020로 이루어진 그룹중에서 선택되거나, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715로 이루어진 그룹중에서 선택된, 유전자 변형된 코리네형 박테리아.
제1항에 있어서, fadD15 유전자의 증강을, 유전자의 과발현에 의해, 특히 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 판독 프레임상에서 강한 프로모터 또는 조절 영역을 선택하거나, 프로모터, 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시키거나, 구조 유전자상에 적당한 발현 카세트를 도입하거나, 유도성 프로모터를 도입하거나, 상응하는 mRNA의 수명을 연장시키거나, 발현된 단백질의 분해를 감소시키는 방법에 의해, 또는 가능한 이들 수개의 조합에 의해 수행하는, 유전자 변형된 코리네형 박테리아.
제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 균주가, fadD15 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 플라스미드 벡터에 의해 형질전환된, 유전자 변형된 코리네형 박테리아.
제1항 내지 제4항중의 어느 한 항에 있어서, 유전자형이 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 13249에 해당하는, 유전자 변형된 코리네형 박테리아.
a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하거나 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 정도 상동성인 폴리뉴클레오티드,

b) 서열 번호 2의 아미노산 서열과 70% 이상 정도 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹중에서 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 박테리아로부터 분리된 폴리뉴클레오티드.
제6항에 있어서, 코리네형 박테리아에서 복제능이 있는, 바람직하게는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오티드.
제6항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오티드.
제7항에 있어서,

(i) 서열 번호 1에 제시된 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전 암호의 축퇴성(degeneration) 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드를 형성하는 하나 이상의 서열, 및 임의로,

(iv) 상동성 아미노산을 초래하는, 서열 (i)에서의 중성 기능의 돌연변이체를 포함하는, 복제능이 있는 DNA인 폴리뉴클레오티드.
제7항, 제8항 또는 제9항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열.
a) 적어도 fadD15 유전자 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증강된, 특히 과발현된, L-아미노산을 생산하는 코리네형 박테리아를 발효시키는 단계,

b) 배지 또는 박테리아 세포내에서 L-아미노산을 농축시키는 단계, 및

c) L-아미노산을 분리하는 단계를 수행함을 포함하여, L-아미노산을 발효적으로 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 제1항 내지 제5항중의 어느 한 항에서 청구된 균주를 사용하는 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 단백질을 암호화하는 또 다른 유전자를 박테리아에서 추가로 증강시키는 방법.
제11항 내지 제13항중의 어느 한 항에 있어서, 목적하는 아미노산의 생성을 감소시키는 대사 경로를 박테리아에서 적어도 부분적으로 제거하는 방법.
제11항 내지 제14항중의 어느 한 항에 있어서, 제조된 아미노산이 L-리신인 방법.
제11항 내지 제15항중의 어느 한 항에 있어서,

a) 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

b) 석시닐 디아미노피멜레이트 데석시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자,

c) 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

d) 트리오즈 포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자,

e) 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

f) 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자,

g) 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

h) 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자, 또는

i) 리신 이송을 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증강된, 특히 과발현되거나 증폭된 박테리아를 발효시켜 리신을 제조하는 방법.
제11항 내지 제16항중의 어느 한 항에 있어서,

a) 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

b) 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자 및

c) 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 박테리아를 발효시켜 L-리신을 제조하는 방법.
아실-CoA 신타제를 암호화하는 유전자의 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 제조하기 위한 프라이머로서, 제6항에서 청구된 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 용도.
fadD15 유전자의 서열과 고도의 상동성을 갖는 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서, 제6항에서 청구된 폴리뉴클레오티드 서열의 용도.