SK18332000A3 - Spsob fermentanej vroby l-aminokyseln pouitm koryneformnch baktri - Google Patents

Description

Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín použitím koryneformných baktérií

Oblasť techniky

Predmetom vynálezu je spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-treonínu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zoslabuje gén glyA.

Doterajší stav techniky

L-Aminokyseliny sa používajú vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.

Je známe, že aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérii, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.

Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg treonínu kyselina a-amino-p-hydroxyvalérová (AHV), alebo sú auxotrofné ·· ·· ·· · ·· · • · · · ··· ···· ··· ···· ·· · • · · · · · ···· · · * · • · · · · · ··· ······ ·· · · · · · B vzhľadom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny, napríklad treonin.

Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombznantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich L-aminokyselinu tak, že jednotlivé gény pre biosyntézu aminokyseliny sa amplifikujú a skúma sa účinok na produkciu L-aminokyseliny. Prehľadný článok k tomu sa nachádza medzi iným v Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria, in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (eds.), Benjamín Cummings, Londýn, Veľká Británia, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) a Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)).

Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové základy zlepšených spôsobov fermentačnej výroby L-aminokyselin pomocou koryneformných baktérií.

L-Aminokyseliny sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle, v potravinárskom priemysle a celkom obzvlášť vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby aminokyselín.

Keď sa v nasledovnom texte uvedie L-aminokyselina, mieni sa tým L-treonín alebo L-izoleucín.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je spôsob fermentačnej výroby

·· ··	• ·	•	• · ·
• · · ·	• ·	•	• ·	• ·
• · ·	• ·	• ·	• ·	•
• · · «	• ·	····	• 9 ·	•
• · ·	• ·	•	•	•
···· ··	··	•	• ·	• · ·

L-aminokyselín použitím koryneformných baktérii, v ktorých sa zoslabuje, najmä na nízkej úrovni exprimuje aspoň nukleotidová sekvencia (gén glyA) kódujúca génový produkt glyA, žiadaný produkt sa koncentruje v médiu alebo v bunkách a izoluje sa L-aminokyselina.

Použité kmene prednostne produkujú L-aminokyseliny už pred zoslabením génu glyA.

Prednostné formy uskutočnenia sa nachádzajú v nárokoch.

Pojem „zoslabenie opisuje v tejto súvislosti zníženie alebo elimináciu intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov (proteinov) v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA (tu génom glyA), tým, že sa napríklad použije slabý promótor alebo gén, poprípade alela, ktorá kóduje príslušný enzým s nízkou aktivitou, poprípade sa inaktivuje príslušný gén alebo enzým (proteín) a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.

Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať aminokyseliny z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.

Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú najmä známe kmene divého typu

Corynebacterium glutamicum ATCC13032, «·

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,

Corynebacterium melassecola ATCC17965,

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,

Brevibacterium flavum ATCC14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a

Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-treonín

Corynebacterium glutamicum ATCC21649,

Brevibacterium flavum BB69,

Brevibacterium flavum DSM5399,

Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269,

Brevibacterium lactofermentum TBB-10 a ako napríklad kmene produkujúce L-izoleucín

Corynebacterium glutamicum ATCC 14309,

Corynebacterium glutamicum ATCC 14310,

Corynebacterium glutamicum ATCC 14311,

Corynebacterium glutamicum ATCC 15168,

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871.

Zistilo sa, že koryneformné baktérie po zoslabení génu glyA zlepšeným produkujú spôsobom L-aminokyseliny.

Gén glyA kóduje enzým serínhydroxymetyltransferázu (EC 2.1.2.1). Nukleotidová sekvencia génu glyA sa opísala v japonskom zverejnenom spise JP-A-08107788. Gén glyA opísaný v uvedenom texte sa môže použiť podľa vynálezu. Ďalej sa môžu použiť alely génu glyA, ktoré vyplývajú z degenero5 vateľnosti genetického kódu alebo vznikajú funkčne neutrálnymi mutáciami so zmyslom (sense mutations).

Na dosiahnutie zoslabenia sa môže znížiť alebo vylúčiť buď expresia génu glyA, alebo katalytické vlastnosti génového produku. Poprípade sa obidve tieto opatrenia kombinujú.

Expresia génov sa môže znížiť vhodným uskutočnením kultivácie alebo genetickou zmenou (mutáciou) signálnych štruktúr expresie génov. Signálnymi štruktúrami expresie génov sú napríklad represorové gény, aktivátorové gény, operátory, promótory, atenuátory, väzbové miesta pre ribozómy, iniciačný kodón a terminátory. Údaje k tomu nájde odborník napríklad v patentovej prihláške WO 96/15246, v Boyd a Murphy (Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), vo Voskuil a Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)), v Pátek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici od Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995) alebo Winnacker („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990).

Mutácie, ktoré vedú k zmene, poprípade zoslabeniu katalytických vlastností enzýmových proteínov, sú známe zo stavu techniky; ako príklady sa môžu uviesť práce Qiu a Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al. (Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)) a Móckel („Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms, správa ·· · • ·

Výskumného centra Júlich, Jul-2906, ISSN09442952, Jiilich, Nemecko, 1994). Súborné opisy sa môžu prevziať zo známych učebníc genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Ako mutácie prichádzajú do úvahy tranzície, transverzie, inzercie a delécie. V závislosti od účinku zámeny aminokyselín na enzýmovú aktivitu sa hovorí o mutáciách s pozmeneným zmyslom („missense mutations) alebo mutáciách bez zmyslu („nonsense mutations). Inzercie alebo delécie aspoň jedného páru báz v géne vedú k posunovým mutáciám („frame shift mutations), následkom ktorých sa vkladajú nesprávne aminokyseliny alebo sa predčasne prerušuje translácia. Delécie viacerých kodónov vedú typicky k úplnému zlyhaniu enzýmovej aktivity. Návody na vytvorenie takých mutácií patria do stavu techniky a môžu sa nájsť v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie, ako napríklad v učebnici Knippers („Molekulare Genetik, 6. vydanie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Nemecko, 1995), Winnacker („Gene und Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo Hagemann („Allgemeine Genetik, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

Gén glyA sa napríklad zoslabil odstránením prirodzeného promótora a predradením regulovateľného kontrolného elementu uloženého v protismere. Ako kontrolný element sa použil systém lacl-tac. Aby sa mohlo dosiahnuť vsunutie systému lacl-tac proti smeru chromozómového génu glyA, pripravil sa integraľný plazmid pK18mobglyA' (obrázok 1). Plazmid pK18mobglyA'obsahuje promótor tac (Amann et al., Gene 25: 167-178 (1983); De Boer et al., Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America USA 80: 21-25 (1983)) a priamo v smere promótora tac obsahuje 5'-terminálnu sekvenciu génu glyA znázornenú v SEQ ID No 1. Plazmid obsahuje ďalej gén lacl kódujúci inhibítor Lac (Farabaugh, Náture 274: 765-769 (1978); Stark et al., Gene 51: 255-267 (1987). Sekvencia jednotky lacI-tac-5'glyA je znázornená v SEQ ID No 2. Plazmid pK18mobglyA' je replikovatelný v Escherichia coli, nie však v Corynebacterium glutamicum. Po transformácii a homológnej rekombinácii pomocou „cross over udalosti spôsobujúcej integráciu sa získa intaktná kópia génu glyA, ktorého expresia sa môže kontrolovať, poprípade regulovať protismerne uloženým kontrolným elementom lacl-tac, a inaktívna kópia génu glyA skrátená (truncated) na 3'-konci, vrátane prirodzeného promótora. Sekvencia jednotky lacI-tac-glyA je znázornneá v SEQ ID No

3. SEQ ID No 4 znázorňuje známu aminokyselinovú sekvenciu génového produktu glyA. Pridaním vhodných koncentrácií analógu laktózy izopropyltiogalaktozidu (Furste et al., Gene 48: 119-131 (1986)) sa môže expresia génu glyA kontrolovať, poprípade sa môže znížiť, poprípade nastaviť celulárny obsah serínhydroxymetyltransferázy.

Ďalšie návody a vysvetlenia k integračnej mutagenéze sa nachádzajú napríklad v Schwarzer a Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) alebo Fitzpatrick et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 42, 575-580 (1994)).

Príkladom kmeňa koryneformných baktérií produkujúceho aminokyselinu so zoslabeným génom glyA je producent treoninu Corynebacterium glutamicum DM368-2::pK18mobglyA'.

Prídavné môže byť pre produkciu aminokyselín výhodné prídavné k zoslabeniu génu glyA zosilniť jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, cyklu kyseliny citrónovej alebo exportu aminokyseliny.

Takto sa na výrobu L-treonínu napríklad môže zvýšene exprimovať:

• súčasne gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) alebo alela hom^dr kódujúca „feed back rezistentnú homoseríndehydrogenázu (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)) a/alebo • súčasne gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)) alebo • súčasne gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (PetersWendisch et al., Microbiology 144, 915-927 (1998)) alebo • súčasne gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395 - 403 (1998)) alebo • súčasne gén thrE kódujúci export treonínu (DE 199 41 478.5; DSM 12840).

Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín výhodné okrem génu glyA súčasne zoslabiť gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE

199 50 409.1, DSM 13047) a/alebo • gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu (DE 199 51 975.7; DSM 13114) .

Napokon môže byť pre produkciu aminokyselín výhodné okrem zoslabenia génu glyA vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).

Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for Generál Bacteriology od Američan Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina stearová, kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes. Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroje fosforu sa môžu používať kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné • · · · · • · ···· · • · · ·· ·· ·· • v • · · • ·

soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu prídavné k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené vsádzkové suroviny sa môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.

Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa ku kultúre kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota pri kultivácii je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä približne 25 °C až 40 °C. Kultivácia prebieha tak dlho, kým sa nevytvorí maximum požadovaného produktu. Tento cieľ sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.

Metódy stanovenia L-aminokyselín sú známe zo stavu techniky. Analýza sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958),

1190), alebo sa môže uskutočňovať pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC), ako sa opisuje v Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

Nasledovný mikroorganizmus bol uložený v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy:

• kmeň Escherichia coli DH5amcr/pK18mobglyA' ako DSM 13170.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.

Izolácia plazmidovej DNA z Escherichia coli a všetky techniky reštrikcie, úpravy Klenowovou a alkalickou fosfatázou sa uskutočnili podľa Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Transformácia Escherichia coli sa uskutočnila, pokial sa neopisuje inak, podľa Chung et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1989) 86: 2172-2175).

Príklad 1

Klonovanie a sekvenovanie génu glyA z Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Gén glyA sa klonoval v klonovacom vektore pUC18 E. coli (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko). Klonovanie sa uskutočňovalo v dvoch krokoch. Najskôr sa polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) amplifikoval gén z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 prostredníctvom nasledovného oligonukleotidového ·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···· · • · · · · · ···· ·· ·· *

··· priméru odvodeného z japonského zverejneného spisu JP-A08107788 .

glyAl-forward (dopredu):

5'-GCT TGC AGC GTT TTG CTC TGC C-3' glyAl-reverse (naspäť):

5'-ACC CGT AAC CTC TTC CAC ATA GG-3'

PCR reakcia sa uskutočňovala v 30 cykloch v prítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátov (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μΜ príslušného oligonukleotidu, 100 ng chromozómovej DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 objemu 10-krát koncentrovaného reakčného tlmivého roztoku a 2,6 jednotiek tepelne stabilnej zmesi Taq-/Pwo-DNA-polymerázy (Expand High Fidelity PCR Systém od firmy Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko) v zariadení Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) za nasledovných podmienok: 30 sekúnd pri 94 °C, 1 minúta pri 64 °C a 3 minúty pri 68 °C.

Amplifikovaný fragment s veľkosťou približne 1,7 kb sa potom následne ligoval pomocou SureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) podľa údajov výrobcu do štiepneho miesta Smal vektora pUC18. Pomocou celkovej ligačnej zmesi sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al·., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na karbenicilín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 μg/mL karbenicilínu. Zo 7 transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúmali ·· · • · · • · · · • · ···· · • · · ·· · ·· ·

na prítomnosť 1,7 kb PCR-fragmentu ako inzertu. Takto vzniknutý rekombinantný plazmíd sa ďalej označuje ako pUC18glyA.

Nukleotidová sekvencia PCR-fragmentu s veľkosťou 1,7 kb v plazmide pUC18glyA sa stanovila podľa dideoxymetódy ukončenia reťazca od Sangera et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Na to sa celý inzert pUC18glyA sekvenoval pomocou nasledovných primérov.

Univerzálny primér:

5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'

Reverzný primér:

5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'

Získané nukleotidové sekvencie sa analyzovali pomocou programového balíka Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, USA). Analýza poskytla identifikáciu otvoreného čítacieho rastra s dĺžkou 1 302 bp. Príslušný gén sa označil ako gén glyA. Príslušný génový produkt obsahuje 434 aminokyselín a je znázornený ako SEQ ID No 4.

Príklad 2

Konštrukcia vektora na zníženú expresiu glyA

Z plazmidu pUC18glyA opísaného v príklade 1 sa pomocou reštrikčných enzýmov EcoRI a Tfil vyštiepil fragment DNA s veľkosťou 1 418 bp, ktorý obsahuje gén glyA bez vlastnej promótorovej oblasti. 5'- a 3'-konce tohto fragmentu sa ·· · ·· ·· ·* · • · · · · · · • · · · ·· · • · · · · · ····· • · · · ·♦ ···· ·· ·· · ·· •· •· •· ·· upravili Klenowovým enzýmom. Výsledný fragment DNA sa ligoval s defosforylovaným vektorom pVWEx2, ktorý bol predtým pomocou BamHI linearizovaný a upravený Klenowovým enzýmom (Wendisch, „Physiologische und NMR-spektroskopische Untersuchungen zur in vivo-Aktivität zentraler Stoffwechselwege im Wildstamm und in rekombinanten Stámmen von Coorynebacterium glutamicum, správa Výskumného centra Julich, Jul-3397, ISSN09442952, Julich, Nemecko, 1997), aby gén glyA s rovnakou orientáciou ležal bezprostredne za promótorom tac vektora, indukovatelným pomocou izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG). Pomocou celkovej ligačnej zmesi sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na tetracyklín na agarových platniach LB obsahujúcich 15 gg/mL tetracyklínu. Z 12 transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúmali na prítomnosť 1 418 bp fragmentu ako inzertu so správnou orientáciou vzhľadom na promótor tac. Takto vzniknutý rekombinantný plazmid sa v ďalšom texte označuje pVWEx2glyA.

Z plazmidu pVWEx2glyA sa potom polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pomocou nasledovných oligonukleotidových primérov amplifikoval fragment DNA, ktorý obsahuje lacl, gén pre represor promótora tac, promótor tac a prvých 438 bp klonovaného génu glyA z Corynebacterium glutamicum. glyA2-forward (dopredu) (s pripojenou rozpoznávacou sekvenciou EcoRI, vyznačenou podčiarknutím):

5'-CCG GAA TTC TCA CTG CCC GCT TTC CAG TC-3' ·· ·· ·· · ·· ···· ···.! J ··· ····· · • · · · · · ···· · · · ··· ····· ···· ·· ·· ··· glyA2-reverse (naspäť) (s pripojenou rozpoznávacou sekvenciou BamHI, vyznačenou podčiarknutím) 5'-CGG GAT CCC AGC TTT CCG GAG AAG TTC AAC-3'

PCR reakcia sa uskutočňovala v 30 cykloch v prítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátov (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μΜ príslušného oligonukleotidu, 100 ng plazmidovej DNA pVWEx2glyA, 1/10 objemu 10-krát koncentrovaného reakčného tlmivého roztoku a 2,6 jednotiek tepelne stabilnej zmesi Taq-/Pwo-DNA-polymerázy (Expand High Fidelity PCR Systém od firmy Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko) v zariadení Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) za nasledovných podmienok: 30 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 58 °C a 2 minúty pri 72 °C.

Amplifikovaný fragment s veľkosťou približne 2,0 kb sa potom natrávil pomocou EcoRI a BamHI, izoloval pomocou NucleoSpin Extract 2 in 1 Kit od firmy Macherey-Nagel (Duren, Nemecko) podľa údajov výrobcu a potom ligoval do defosforylovaného vektora pK18mob (Schäfer et al., Gene (1994) 145: 69-73), taktiež štiepeného pomocou EcRI a BamHI. Pomocou celkovej ligačnej zmesi sa kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) transformoval. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 gg/mL kanamycínu. Z 12 transformantov sa preparovali plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúmali na prítomnosť 2,0 kb PCR-fragmentu ako inzertu. Takto vzniknutý rekombinantný plazmid sa ďalej označuje pK18mobglyA' (viď obrázok 1) .

·· · ·· ·· • · ·· • ·· • ·· · • ·· ···· ·· • ·· « · ·· • ····· • ·· ·· * ·· · • ··· • ·· • · ♦· • ·· ·····

Príklad 3

Konštrukcia kmeňa Corynebacterium glutamicum

ATCC13032::pK18mobglyA' so zníženou, regulovateľnou expresiou glyA

Elektroporáciou (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) sa prázdny vektor pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549554) a plazmid pK18mobglyA' opísaný v príklade 2 vložili do kmeňa divého typu Corynebacterium glutamicum ATCC13032 (Abe et al., Journal of Generál and Applied Microbiology (1967) 13: 279-301).

Po transformácii pomocou pZl sa transformanty identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycín na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 pg/mL kanamycínu (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299304). Z 3 transformantov sa pripravili plazmidy a reštrikčnou analýzou preskúmali na prítomnosť prázdneho vektora pZl. Týmto spôsobom vznikol kontrolný kmeň Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pZl.

Po transformácii s pK18mobglyA' sa musel plazmid integrovať homológnou rekombináciou klonovaného 5'-konca glyA do chromozómu Corynebacterium glutamicum ATCC13032. Získané klony rezistentné na kanamycín sa identifikovali na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 gg/mL kanamycínu a 1 mM izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG) (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Správna integrácia pK18mobglyA' v chromozóme sa preskúmala v 2 získaných integračných mutantoch polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) pomocou nasledovných oligonukleotidových klonov.

·· · • · · • · · · • · ···· • · · ·· ·

999 ·· ·· • · · · • ·· • · ·· • ·· ···· ·· ·· •·

Reverzný primér (RSP):

5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3' glyA2-reverzný:

5'-CGG GAT CCC AGC TTT CCG GAG AAG TTC AAC-3'

PCR reakcia sa uskutočňovala v 30 cykloch v prítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátov (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μΜ príslušného oligonukleotidu, 100 ng chromozómovej DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pK18mobglyA', 1/10 objemu 10-krát koncentrovaného reakčného tlmivého roztoku a 2,6 jednotiek tepelne stabilnej zmesi Taq-/Pwo-DNApolymerázy (Expand High Fidelity PCR Systém od firmy Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko) v zariadení Thermocycler (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) za nasledovných podmienok: 30 sekúnd pri 94 °C, 30 sekúnd pri 48 °C a 2 minúty pri 72 °C. Týmto spôsobom vznikol kmeň Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pK18mobglyA', v ktorom sa nachádza gén glyA pod kontrolou promótora tac indukovatelr.ého izopropyl-p-D-tiogalaktozidom (IPTG) .

Príklad 4

Stanovenie serínhydroxymetyltransferázovej aktivity kódovanej génom glyA v kmeni Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pK18mobglyA'

Na získanie surových extraktov na stanovenie serínhydroxymetyltransferázovej aktivity kódovanej génom glyA sa kmene C. glutamicum ATCC13032/pZl a C. glutamicum ATCC13032::pK18mobglyA', opísané v príklade 3, 14 hodín pri 30 °C predbežne kultivovali v 100 mL mozgovo-srdcového infúzneho média (Difco Laboratories, Detroit, USA) s 25 μς • e ··

9 99

99

9 99

9· ···· ·· • 9 9 · · · • 9 · · ··

9 9

9

kanamycínu na 1 mL a 100 μΜ izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG). Následne sa bunky jedenkrát premyli 0,9% (w/v (hmotnosť/objem)) roztokom chloridu sodného a touto suspenziou sa naočkovalo 100 mL média CgXII tak, aby ODeoo (optická hustota pri 600 nm) bola 0,5. Médium bolo identické s médiom opísaným v Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), obsahovalo však prídavné 25 μg kanamycínu na 1 mL a 0, 10 alebo 100 μΜ izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG). Zloženie média opísaného Keilhauerom et al. je uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Zloženie média CGXII

Zložka	Koncentrácia
(NH4)2SO4	20 g/L
Močovina	5 g/L
KH2PO4	1 g/L
k2hpo4	1 g/L
MgSO4.7H2O	0,25 g/L
Kyselina 3-morfolinopropánsulfónová	42 g/L
CaCl2	10 mg/L
FeSO4.7H2O	10 mg/L
MnSO4.H2O	10 mg/L
ZnSO4.7H2O	1 mg/L
CuSO4	0,2 mg/L
NiCl2.6H2O	0,02 mg/L
Biotín	0,2 mg/L
Glukóza	40 g/L
Kyselina protokatechová	30 mg/L

·· ·· • · 4· • ·· • ·· • ·· ···· ·· ·· a • · · • a · · • · ····· t t · • a a aa a • · ·· a t t • 44 4 • · · ·· ···

Kultivácia obidvoch kmeňov sa uskutočňovala pri 30 °C.

Po 10 hodinách sa bunky jedenkrát premyli 50mM tlmivým roztokom zloženým z kyseliny 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazínetánsulfónovej a hydroxidu sodného (pH 7,0), odstredili (10 minút pri 5 000 otáčok za minútu pomocou Minifuge RF od firmy Heraeus, Osterode, Nemecko) a resuspendovali v 200mM tlmivom roztoku zloženom z kyseliny 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazinetánsulfónovej a hydroxidu sodného (pH 7,0) tak, aby konečný objem bol 5 mL. K tejto suspenzii buniek sa pridalo 50 μΐ 2mM roztoku pyridoxál-5-fosfátu a 50 μΐ lOOmM roztoku ditiotreitolu a bunky sa rozbili. Rozbitie buniek sa uskutočnilo pri 0 °C pomocou ultrazvukového dezintegrátora (Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA; trvanie pôsobenia ultrazvuku 6 minút, šírka pulzu 100 %, intenzita ultrazvuku 2,5). Po úprave ultrazvukom sa úlomky buniek oddelili odstredenim (30 minút pri 4 °C a

000 otáčok za minútu v chladenej centrifúge Sigma 202 MK od firmy Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Nemecko). Supernatant sa ako surový extrakt zbavený buniek použil priamo na stanovenie enzýmovej aktivity.

Stanovenie proteínov v surových extraktoch zbavených buniek sa uskutočnilo fotometrický podlá Bensadouna a Weinsteina (Analytical Biochmistry (1976) 70: 241-250). Obsah proteínov sa pritom stanovil pomocou kalibračnej krivky vytvorenej pomocou hovädzieho sérového albumínu ako štandardu.

Na stanovenie aktivity serínhydroxymetyltransferázy v surových extraktoch zbavených buniek sa použil diskontinuálny enzýmový test, pri ktorom sa kvantifikoval glycín vytvorený zo substrátu treonínu. Reakčné vzorky sa 15 minút pri 37 °C inkubovali v nasledovnej zmesi (modifikované podlá ·· ·

9 9

9 9 9

9 9999

9 9

9 •· •· •· ·· ···

Scrimgeoura a Huennekensa, Methods in Enzymology (1962), zv. V: 838-843, Academic Press): 20 mM treonínu, 200 μΜ pyridoxál-5-fosfátu, 900 μΜ tetrahydrofolátu, 100 mM tlmivého roztoku zloženého z kyseliny 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazinetánsulfónovej a hydroxidu sodného (pH 7,0) a 1,0 až 1,5 mg proteínu (zo surového extraktu) vo výslednom objeme 1 mL. Reakcia sa prerušila pridaním 0,25 objemu 25% (w/v (hmotnosť/objem)) roztoku kyseliny trichlóroctovej, vzorky sa inkubovali 15 minút pri 0 °C a denaturovaný protein sa odstredil (15 minút pri 4 °C a 13 000 otáčok za minútu v chladenej centrifúge Sigma 202 MK od firmy Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Nemecko). Kvantitatívne stanovenie glycínu zo supernatantu, vytvoreného v enzýmovom teste, sa uskutočnilo pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC) (Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 11671174). Použil sa prístroj HPLC série HP1100 (HewlettPackard, Waldbronn, Nemecko) s pripojeným fluorescenčným detektorom (G1321A); riadenie systému a vyhodnotenie údajov sa uskutočnilo pomocou HP-Chem-Station (Hewlett-Packard).

μι analyzovaného roztoku aminokyseliny sa zmiešal v automatickej derivatizácii v predkolóne s 20 μΣ hotového činidla orto-ftalaldehyd/2-merkaptoetanol (Pierce Európe BV, Oud-Beijerland, Holandsko). Pritom vzniknuté fluoreskujúce tiosubstituované izoindoly (Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482) sa delili v kombinovanej predkolóne (40x4 mm Hypersil ODS 5) a hlavnej kolóne (Hypersil ODS 5, obidve kolóny od firmy CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Nemecko) s gradientovým programom s pribúdajúcou nepolárnou fázou (metanol). Polárnym eluentom bol acetát sodný (0,lM, pH 7,2); prietok bol 0,8 mL za minútu. Fluorescenčná detekcia derivatizovaných aminokyselín sa uskutočňovala pri excitačnej vlnovej dĺžke 230 nm a emisnej vlnovej dĺžke 450 nm. Koncentrácie glycínu sa ·· · • · · • · · · • · ···· • · · ·· · ·* ·· • ·· • ·· • ·· · • ·· ··· ·· ·· · • ··· • ·· • · ·· • ·· ····· vypočítali porovnaním s externým štandardom a asparagínom ako prídavným interným štandardom.

Výsledky enzýmového testu s treonínom ako substrátom sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Kmeň	Koncentrácia IPTG (μΜ)	Serínhydroxymetyltransferázová aktivita (nmol glycin/minúta/mg proteínu)
ATCC13032/pZl	0	0,9
ATCC13032::pK18mobglyA'	0	0,3
	10	0,7
	100	1,6

Príklad 5

Konštrukcia kmeňa Brevibacterium flavum

DM368-2::pK18mobglyA' so zníženou, regulovateľnou expresiou glyA

Elektroporáciou (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) sa prázdny vektor pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549554) a plazmid pK18mobglyA' opísaný v príklade 2 vložili do kmeňa Brevibacterium flavum DM368-2 produkujúceho treonín. Kmeň DM368-2 sa opisuje v EP-B-0 385 940 a je uložený ako DSM5399.

• a	··	··	•	·· ·
• ·	• ·	• ·	•	• ·	··
•	a	•	• ·	• ·	• ·	•
•	• ·	• · ·	····	• · ·	•
•	•	•	• e	•	• ·	•
····	··	··	•	··	···

Po transformácii pomocou pZl sa transformanty identifikovali na základe svojej rezistencie na kanamycin na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 pg/mL kanamycínu (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299304). Z 3 transformantov sa pripravili plazmidy a reštrikčnou analýzou preskúmali na prítomnosť prázdneho vektora pZl. Týmto spôsobom vznikol kontrolný kmeň Brevibacterium flavum DM368-2/pZl.

Po transformácii pomocou pK18mobglyA' sa musel plazmid integrovať homológnou rekombináciou klonovaného 5'-konca glyA do chromozómu Brevibacterium flavum DM368-2. Získané klony rezistentné na kanamycin sa identifikovali na agarových platniach LBHIS obsahujúcich 15 gg/mL kanamycínu a 1 mM izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG) (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Správna integrácia pK18mobglyA' v chromozóme sa preskúmala v 4 získaných integračných mutantoch polymerázovou reťazovou reakciou (PCR), ako už bolo opísané v príklade 3, so 100 ng chromozómovej DNA z Brevibacterium flavum DM368-2::pK18mobglyA' ako templátom. Týmto spôsobom vznikol kmeň Brevibacterium flavum DM368-2::pK18mobglyA', v ktorom sa nachádza gén glyA pod kontrolou promótora tac indukovateľného izopropyl-p-Dtiogalaktozidom (IPTG).

Príklad 6

Stanovenie serinhydroxymetyltransferázovej aktivity kódovanej génom glyA v kmeni Brevibacterium flavum DM368-2::pK18mobglyA'

Získanie surových extraktov na stanovenie serínhydroxymetyltransferázovej aktivity kódovanej génom glyA v kmeňoch ··

B. flavum DM368-2/pZl a B. flavum DM368-2::pK18mobglyA', opísaných v príklade 5, sa uskutočnilo tak, ako sa už opísalo v príklade 4. Stanovenie proteinov v získaných surových extraktoch zbavených buniek a diskontinuálny enzýmový test, pri ktorom sa kvantifikuje glycín vytvorený zo substrátu treonínu, sa taktiež uskutočnili tak, ako sa už opísalo v príklade 4.

Výsledky tohto enzýmového testu s treonínom ako substrátom sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3

Kmeň	Koncentrácia IPTG (μΜ)	Serínhydroxymetyltransferázová aktivita (nmol glycín/minúta/mg proteinu)
DM368-2/pZl	0	1,6
DM368-2::pK18mobglyA'	0	<0,1
	10	0,8
	100	1,7

Príklad 7

Príprava L-treonínu pomocou Brevibacterium flavum

Na preskúmanie tvorby treonínu sa kmene B. flavum DM368-2/pZl a DM368-2::pK18mobglyA', opísané v príklade 5, predbežne kultivovalil4 hodín pri 30 °C v 100 mL mozgovosrdcového infúzneho média (Difco Laboratories, Detroit, USA) s 25 gg kanamycínu na 1 mL a 100 μΜ izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG). Následne sa bunky jedenkrát premyli 0,9% (w/v (hmotnosť/objem)) roztokom chloridu sodného a touto suspenziou sa naočkovalo 60 mL média CgXII tak, aby Οϋεοο (optická hustota pri 600 nm) bola 0,5. Médium bolo identické s médiom opísaným v Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), obsahovalo však prídavné 25 μς kanamycínu na mL a 0, 10 alebo 100 μΜ izopropyl-p-D-tiogalaktozidu (IPTG).

Kultivácia obidvoch kmeňov sa uskutočňovala 72 hodín pri 30 °C. Po 48 a 72 hodinách sa odobrali vzorky a bunky sa krátko odstreďovali (5 minút pri 13 000 otáčok za minútu pomocou Biofuge pico od firmy Heraeus, Osterode, Nemecko).

Kvantitatívne stanovenie extracelulárnych koncentrácií aminokyseliny v supernatante z kultivácie sa uskutočňovalo pomocou HPLC v obrátenej fáze (reversed phase HPLC) (Lindroth et al., Analytical chemistry (1979) 51: 11671174), ako sa už opísalo v príklade 4. Koncentrácie treonínu sa vypočítali porovnaním s externým štandardom a asparaginom ako doplnkovým interným štandardom.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 4.

Tabuľka 4

Kmeň	Koncentrácia	L-Treonín
	IPTG		(g/D
	μΜ	48 hodín	72 hodín
DM368-2/pZl	0	1,27	1,32
DM368-2::pK18mobglyA'	10	1,32	1,44
	0	1,41	1, 60

·· ·· ·· · • · · · · · · • · · · · · · • · ··· ······ • · · · · · ···· ·· ·· ·

Prehľad obrázkov na výkresoch

Priložený je nasledovný obrázok:

Obrázok 1: Mapa plazmidu pK18mobglyA' .

Dĺžkové údaje treba chápať ako približné údaje.

Použité skratky a značky majú nasledovný význam:

BamHI:	reštrikčná endonukleáza	z	Bacillus
	amyloliquefaci en s
BglII:	reštrikčná endonukleáza	z	Bacillus globigii
BstEII:	reštrikčná endonukleáza	z	Bacillus

stearothermophilus

EcoRI:	reštrikčná	endonukleáza	z	Escherichia	coli
EcoRV:	reštrikčná	endonukleáza	z	Escherichia	coli
HindlII:	reštrikčná	endonukleáza	z	Haemophilus	influenzae
Sací:	reštrikčná	endonukleáza	zo Streptomyces

achromogenes kan: gén pre rezistenciu na kanamycín lac^q: gén pre represor tac-promótora Ptac

Ptac: tac-promótor glyA': 5'-úsek génu pre serinhydroxymetyltransferázu glyA2-reverse: primér na preskúmanie integrácie

RSP: reverzný štandardný primér na preskúmanie integrácie

Protokol sekvencii <110> Degussa-Huls AG

Forschungszentrum Júlich GmbH <120> spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín použitím koryneformných baktérii <130> 990200 BT <140>

<141>

<160> 4 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 438 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220>

<221> N_región <222> (1)..(438) <223> 5'glyA <400> 1 atgaccgatg cccaccaagc ggacgatgtc cgttaccagc cactgaacga gcttgatcct60 gaggtggctg ctgccatcgc tggggaactt gcccgtcaac gcgatacatt agagatgatc120 gcgtctgaga acttcgttcc ccgttctgtt ttgcaggcgc agggttctgt tcttaccaat180 aagtatgccg agggttaccc tggccgccgt tactacggtg gttgcgaaca agttgacatc240 attgaggatc ttgcacgtga tcgtgcgaag gctctcttcg gtgcagagtt cgccaatgtt300 cagcctcact ctggcgcaca ggctaatgct gctgtgctga tgactttggc tgagccaggc360 gacaagatca tgggtctgtc tttggctcat ggtggtcact tgacccacgg aatgaagttg420 aacttctccg gaaagctg438 <210> 2 <211> 2000 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: lacI-tac-5'glyA <220>

<221> gén <222> Doplnok ((6)..(1097)) <223> lacl <220>

<221> Promótor , <222> (1391)..(1434) <223> tac <220>

<221> N_region • · ···· ·· <222> (1562)..(1999) <223> 5'glyA <400> 2 aattctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg60 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc120 agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag180 cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt tgacggcggg240 atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg300 cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc360 agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac420 atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat480 ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc540 gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca600 tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga660 acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg720 atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg780 ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta840 atcgccccga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc900 agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc960 gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc1020 acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact1080 ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga1140 aaggttttgc accattcgat ggtgtcaacg taaatgcatg ccgcttcgcc ttcgcgcgcg1200 aattgcaagc tgatccgggc ttatcgactg cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc1260 agccatcgga agctgtggta tggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc1320 tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac ggttctggca1380 aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg tggaattgtg1440 agcggataac aatttcacac aggaaacaga attaaaagat atgaccatga ttacgccaag1500 cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcattcgtct tgtgaaaggt tagctgacct1560 gatgaccgat gcccaccaag cggacgatgt ccgttaccag ccactgaacg agcttgatcc1620 tgaggtggct gctgccatcg ctggggaact tgcccgtcaa cgcgatacat tagagatgat1680 cgcgtctgag aacttcgttc cccgttctgt tttgcaggcg cagggttctg ttcttaccaa1740 taagtatgcc gagggttacc ctggccgccg ttactacggt ggttgcgaac aagttgacat1800 cattgaggat cttgcacgtg atcgtgcgaa ggctctcttc ggtgcagagt tcgccaatgt1860 tcagcctcac tctggcgcac aggctaatgc tgctgtgctg atgactttgg ctgagccagg1920 cgacaagatc atgggtctgt ctttggctca tggtggtcac ttgacccacg gaatgaagtt1980 gaacttctcc ggaaagctgg2000 <210> 3 <211> 2866 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: lacI-tac-glyA-tac-glyA <220>

<221> gén <222> Doplnok . :((6) ..(1097)) <223> lacl <220>

<221> Promótor <222> (1391)..(1434) <223> tac <220>

·· ·· · ·· ···· ··· ·· ··· · · · · ·· • · · · · · ···· · · · • · · ··· · · ···· ·· ·· · ·· ··· <221> CDS <222> (1562)..(2863) <223> glyA <400> 3

aattctcact	gcccgctttc	cagtcgggaa	acctgtcgtg	ccagctgcat	taatgaatcg	60
gccaacgcgc	ggggagaggc	ggtttgcgta	ttgggcgcca	gggtggtttt	tcttttcacc	120
agtgagacgg	gcaacagctg	attgcccttc	accgcctggc	cctgagagag	ttgcagcaag	180
cggtccacgc	tggtttgccc	cagcaggcga	aaatcctgtt	tgatggtggt	tgacggcggg	240
atataacatg	agctgtcttc	ggtatcgtcg	tatcccacta	ccgagatatc	cgcaccaacg	300
cgcagcccgg	actcggtaat	ggcgcgcatt	gcgcccagcg	ccatctgatc	gttggcaacc	360
agcatcgcag	tgggaacgat	gccctcattc	agcatttgca	tggtttgttg	aaaaccggac	420
atggcactcc	agtcgccttc	ccgttccgct	atcggctgaa	tttgattgcg	agtgagatat	480
ttatgccagc	cagccagacg	cagacgcgcc	gagacagaac	ttaatgggcc	cgctaacagc	540
gcgatttgct	ggtgacccaa	tgcgaccaga	tgctccacgc	ccagtcgcgt	accgtcttca	600
tgggagaaaa	taatactgtt	gatgggtgtc	tggtcagaga	catcaagaaa	taacgccgga	660
acattagtgc	aggcagcttc	cacagcaatg	gcatcctggt	catccagcgg	atagttaatg	720
atcagcccac	tgacgcgttg	cgcgagaaga	ttgtgcaccg	ccgctttaca	ggcttcgacg	780
ccgcttcgtt	ctaccatcga	caccaccacg	ctggcaccca	gttgatcggc	gcgagattta	840
atcgccgcga	caatttgcga	cggcgcgtgc	agggccagac	tggaggtggc	aacgccaatc	900
agcaacgact	gtttgcccgc	cagttgttgt	gccacgcggt	tgggaatgta	attcagctcc	960
gccatcgccg	cttccacttt	ttcccgcgtt	ttcgcagaaa	cgtggctggc	ctggttcacc	1020
acgcgggaaa	cggtctgata	agagacaccg	gcatactctg	cgacatcgta	taacgttact	1080
ggtttcacat	tcaccaccct	gaattgactc	tcttccgggc	gctatcatgc	cataccgcga	1140
aaggttttgc	accattcgat	ggtgtcaacg	taaatgcatg	ccgcttcgcc	ttcgcgcgcg	1200
aattgcaagc	tgatccgggc	ttatcgactg	cacggtgcac	caatgcttct	ggcgtcaggc	1260
agccatcgga	agctgtggta	tggctgtgca	ggtcgtaaat	cactgcataa	ttcgtgtcgc	1320
tcaaggcgca	ctcccgttct	ggataatgtt	ttttgcgccg	acatcataac	ggttctggca	1380
aatattctga	aatgagctgt	tgacaattaa	tcatcggctc	gtataatgtg	tggaattgtg	1440
agcggataac	aatttcacac	aggaaacaga	attaaaagat	atgaccatga	ttacgccaag	1500

cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tcattcgtct tgtgaaaggc tagctgacct 1560 • · ····

1609 aac

Asn g atg acc gat gcc cac caa gcg gac gat gtc cgt tac cag cca ctg Met Thr Asp Ala His Gin Ala Asp Asp Val Arg Tyr Gin Pro Leu 15 10 15

gag Glu

ctt Leu

gat Asp

cct gag gtg get get

gcc atc

get ggg gaa ctt gcc

cgt Arg

1657

Pro 20

Glu

Val

Ala

Ala

Ala 25

íle

Ala

Gly

Glu

Leu 30

Ala

•

caa

ege

gat

aca

tta

gag

atg

atc

gcg

tct

gag

aac

ttc

gtt

CCC

cgt

1705

Gin

Arg

Asp

Thr

Leu

Glu

Met

íle

Ala

Ser

Glu

Asn

Phe

Val

Pro

Arg

35

40

45

tct

gtt

ttg

cag

gcg

cag

ggt

tct

gtt

ctt

acc

aat

aag

tat

gcc

gag

1753

Ser

Val

Leu

Gin

Ala

Gin

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Asn

Lys

Tyr

Ala

Glu

50

55

60

ggt

tac

cct

ggc

ege

cgt

tac

tac

ggt

ggt

tgc

gaa

caa

gtt

gac

atc

1801

Gly

Tyr

Pro

Gly

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Gly

Cys

Glu

Gin

Val

Asp

íle

65

70

75

80

att

gag

gat

ctt

gca

cgt

gat

cgt

gcg

aag

get

ctc

ttc

ggt

gca

gag

1849

íle

Glu

Asp

Leu

Ala

Arg

Asp

Arg

Ala

Lys

Ala

Leu

Phe

Gly

Ala

Glu

85

90

95

ttc

gcc

aat

gtt

cag

cct

cac

tct

ggc

gca

cag

get

aat

get

get

gtg

1897

Phe

Ala

Asn

Val

Gin

Pro

His

Ser

Gly

Ala

Gin

Ala

Asn

Ala

Ala

Val

100

105

110

ctg

atg

act

ttg

get

gag

cca

ggc

gac

aag

atc

atg

ggt

ctg

tct

ttg

1945

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Glu

Pro

Gly

Asp

Lys

íle

Met

Gly

Leu

Ser

Leu

115

120

125

get

cat

ggt

ggt

cac

ttg

acc

cac

gga

atg

aag

ttg

aac

ttc

tcc

gga

1993

Ala

His

Gly

Gly

His

Leu

Thr

His

Gly

Met

Lys

Leu

Asn

Phe

Ser

Gly

130

135

140

aag

ctg

tac

gag

gtt

gtt

gcg

tac

ggt

gtt

gat

cct

gag

acc

atg

cgt

2041

Lys

Leu

Tyr

Glu

Val

Val

Ala

Tyr

Gly

Val

Asp

Pro

Glu

Thr

Met

Arg

•

145

150

155

160

gtt

gat

atg

gat

cag

gtt

cgt

gag

att

get

ctg

aag

gag

cag

cca

aag

2089

Val

Asp

Met

Asp

Gin

Val

Arg

Glu

íle

Ala

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Lys

•

165

170

175

gta

att

atc

get

ggc

tgg

tct

gca

tac

cct

ege

cac

ctt

gat

ttc

gag

2137

Val

íle

íle

Ala

Gly

Trp

Ser

Ala

Tyr

Pro

Arg

His

Leu

Asp

Phe

Glu

180

185

190

get

ttc

cag

tct

att

get

gcg

gaa

gtt

ggc

gcg

aag

ctg

tgg

gtc

gat

2185

Ala

Phe

Gin

Ser

íle

Ala

Ala

Glu

Val

Gly

Ala

Lys

Leu

Trp

Val

Asp

195

200

205

atg

get

cac

ttc

get

ggt

ctt

gtt

get

get

ggt

ttg

cac

cca

age

cca

2233

Met

Ala

His

Phe

Ala

Gly

Leu

Val

Ala

Ala

Gly

Leu

His

Pro

Ser

Pro

210

215

220

• · ····

gtc Val 225

cct Pro

tac tet gat

gtt Val 230

gtt Val

tet Ser

tcc Ser

act Thr

gtc Val 235

cac His

aag Lys

act Thr

ttg Leu

ggt Gly 240

2281

Tyr Ser

Asp

gga

cct

cgt

tcc

ggc

atc

att

ctg

get

aag

cag

gag

tac

gcg

aag

aag

2329

Gly

Pro

Arg

Ser

Gly

íle

íle

Leu

Ala

Lys

Gin

Glu

Tyr

Ala

Lys

Lys

245

250

255

ctg

aac

tet

tcc

gta

ttc

cca

ggt

cag

cag

ggt

ggt

cct

ttg

atg

cac

2377

Leu

Asn

Ser

Ser

Val

Phe

Pro

Gly

Gin

Gin

Gly

Gly

Pro

Leu

Met

His

260

265

270

gca

gtt

get

gcg

aag

get

act

tet

ttg

aag

att

get

ggc

act

gag

cag

2425

Ala

Val

Ala

Ala

Lys

Ala

Thr

Ser

Leu

Lys

íle

Ala

Gly

Thr

Glu

Gin

275

280

285

ttc

cgt

gac

cgt

cag

get

ege

acg

ttg

gag

ggt

get

ege

att

ctt

get

2473

Phe

Arg

Asp

Arg

Gin

Ala

Arg

Thr

Leu

Glu

Gly

Ala

Arg

íle

Leu

Ala

290

295

300

gag

cgt

ctg

act

get

tet

gat

gcg

aag

gcc

get

ggc

gtg

gat

gtc

ttg

2521

Glu

Arg

Leu

Thr

Ala

Ser

Asp

Ala

Lys

Ala

Ala

Gly

Val

Asp

Val

Leu

305

310

315

320

acc

ggt

ggc

act

gat

gtg

cac

ttg

gtt

ttg

get

gat

ctg

cgt

aac

tcc

2569

Thr

Gly

Gly

Thr

Asp

Val

His

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

Leu

Arg

Asn

Ser

325

330

335

cag

atg

gat

ggc

cag

cag

gcg

gaa

gat

ctg

ctg

cac

gag

gtt

ggt

atc

2617

Gin

Met

Asp

Gly

Gin

Gin

Ala

Glu

Asp

Leu

Leu

His

Glu

Val

Gly

íle

340

345

350

act

gtg

aac

cgt

aac

gcg

gtt

cct

ttc

gat

cct

cgt

cca

cca

atg

gtt

2665

Thr

Val

Asn

Arg

Asn

Ala

Val

Pro

Phe

Asp

Pro

Arg

Pro

Pro

Met

Val

355

360

365

act

tet

ggt

ctg

cgt

att

ggt

act

cct

gcg

ctg

get

acc

cgt

ggt

ttc

2713

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

íle

Gly

Thr

Pro

Ala

Leu

Ala

Thr

Arg

Gly

Phe

370

375

380

gat

att

cct

gca

ttc

act

gag

gtt

gca

gac

atc

att

ggt

act

get

ttg

2761

Asp

íle

Pro

Ala

Phe

Thr

Glu

Val

Ala

Asp

íle

íle

Gly

Thr

Ala

Leu

385

390

395

400

get

aat

ggt

aag

tcc

gca

gac

att

gag

tet

ctg

cgt

ggc

cgt

gta

gca

2809

Ala

Asn

Gly

Lys

Ser

Ala

Asp

íle

Glu

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Val

Ala

405

410

415

aag

ctt

get

gca

gat

tac

cca

ctg

tat

gag

ggc

ttg

gaa

gac

tgg

acc

2857

Lys

Leu

Ala

Ala

Asp

Tyr

Pro

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Glu

Asp

Trp

Thr

420 425 430 atc gtc taa

2866 íle Val <210> 4 <211> 434

<212> PRT <400> 4

Met 1

Thr Asp Ala

His 5

Gin Ala

Asp

Asp

Val Arg Tyr Gin Pro Leu

Asn

10

15

Glu

Leu

Asp

Pro

Glu

Val

Ala

Ala

Ala

íle

Ala

Gly

Glu

Leu

Ala

Arg

20

25

30

Gin

Arg

Asp

Thr

Leu

Glu

Met

íle

Ala

Ser

Glu

Asn

Phe

Val

Pro

Arg

35

40

45

Ser

Val

Leu

Gin

Ala

Gin

Gly

Ser

Val

Leu

Thr

Asn

Lys

Tyr

Ala

Glu

50

55

60

Gly

Tyr

Pro

Gly

Arg

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Gly

Cys

Glu

Gin

Val

Asp

íle

65

70

75

80

íle

Glu

Asp

Leu

Ala

Arg

Asp

Arg

Ala

Lys

Ala

Leu

Phe

Gly

Ala

Glu

85

90

95

Phe

Ala

Asn

Val

Gin

Pro

His

Ser

Gly

Ala

Gin

Ala

Asn

Ala

Ala

Val

100

105

110

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Glu

Pro

Gly

Asp

Lys

íle

Met

Gly

Leu

Ser

Leu

115

120

125

Ala

His

Gly

Gly

His

Leu

Thr

His

Gly

Met

Lys

Leu

Asn

Phe

Ser

Gly

130

135

140

Lys

Leu

Tyr

Glu

Val

Val

Ala

Tyr

Gly

Val

Asp

Pro

Glu

Thr

Met

Arg

145

150

155

160

Val

Asp

Met

Asp

Gin

Val

Arg

Glu

íle

Ala

Leu

Lys

Glu

Gin

Pro

Lys

165

170

175

Val

íle

íle

Ala

Gly

Trp

Ser

Ala

Tyr

Pro

Arg

His

Leu

Asp

Phe

Glu

180

185

190

Ala

Phe

Gin

Ser

íle

Ala

Ala

Glu

Val

Gly

Ala

Lys

Leu

Trp

Val

Asp

195

200

205

Met

Ala

His

Phe

Ala

Gly

Leu

Val

Ala

Ala

Gly

Leu

His

Pro

Ser

Pro

210

215

220

Val

Pro

Tyr

Ser

Asp

Val

Val

Ser

Ser

Thr

Val

His

Lys

Thr

Leu

Gly

225

230

235

240

Gly

Pro

Arg

Ser

Gly

íle

íle

Leu

Ala

Lys

Gin

Glu

Tyr

Ala

Lys

Lys

245

250

255

Leu

Asn

Ser

Ser

Val

Phe

Pro

Gly

Gin

Gin

Gly

Gly

Pro

Leu

Met

His

260

265

270

Ala

VaL

Ala

Ala

Lys

Ala

Thr

Ser

Leu

Lys

íle

Ala

Gly

Thr

Glu

Gin

275

280

285

Phe

Arg

Asp

Arg

Gin

Ala

Arg

Thr

Leu

Glu

Gly

Ala

Arg

íle

Leu

Ala

290 295 300 • · · • ···· ·· ··

Glu 305

Arg

Leu

Thr Ala Ser Asp 310

Ala Lys Ala Ala 315

Gly

Val

Asp

Val

Leu 320

Thr

Gly

Gly

Thr

Asp

Val

His

Leu

Val

Leu

Ala

Asp

Leu

Arg

Asn

Ser

325

330

335

Gin

Met

Asp

Gly

Gin

Gin

Ala

Glu

Asp

Leu

Leu

His

Glu

Val

Gly

íle

340

345

350

•

Thr

Va.L

Asn

Arg

Asn

Ala

Val

Pro

Phe

Asp

Pro

Arg

Pro

Pro

Met

Val

355

360

365

*

Thr

Ser

Gly

Leu

Arg

íle

Gly

Thr

Pro

Ala

Leu

Ala

Thr

Arg

Gly

Phe

370

375

380

Asp

Ile

Pro

Ala

Phe

Thr

Glu

Val

Ala

Asp

íle

íle

Gly

Thr

Ala

Leu

385

390

395

400

Ala

Asn

Gly

Lys

Ser

Ala

Asp

íle

Glu

Ser

Leu

Arg

Gly

Arg

Val

Ala

405

410

415

Lys

Leu

Ala

Ala

Asp

Tyr

Pro

Leu

Tyr

Glu

Gly

Leu

Glu

Asp

Trp

Thr

420

425

430

Ile Val

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledovné kroky:

   a) fermentácia koryneformných baktérií produkujúcich žiadanú L-aminokyselinu, v ktorých sa zoslabuje aspoň gén glyA,

   b) koncentrovanie žiadaného produktu v médiu alebo v bunkách baktérií a

   c) izolácia L-aminokyseliny.
2. 2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny.
3. 3. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sú aspoň čiastočne eliminované metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu • žiadanej L-aminokyseliny.
4. 4. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa znižuje expresia polynukleotidu, ktorý kóduje gén glyA.
5. 5. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa zoslabujú katalytické vlastnosti polypeptidu (enzýmového proteinu), ktorý je kódovaný polynukleotidom glyA.

   ·· ···· φ • φ φ · ·· · • φ φ · ·· φ • φ φ φ φ φ φφφφ· φ φ φ φ φ· •ΦΦΦ φφ ·Φφ ··
6. 6. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na dosiahnutie zoslabenia sa používa spôsob integračnej mutagenézy pomocou vektora pK18mobglyA' znázorneného na obrázku 1 a uloženého v E. coli ako DSM * 13170.

   * 7. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-treonínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zvýšene exprimuje alebo amplifikuje jeden alebo viac génov vybraných zo skupiny zahŕňajúcej
7. 7.1 gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu,

   7.2 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,

   7.3 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,

   7.4 gén mqo kódujúci malát-chinónoxidoreduktázu,

   7.5 gén thrE kódujúci export treonínu.
8. 8. Spôsob podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa na výrobu L-treonínu fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov vybraných zo skupiny zahŕňajúcej

   8.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,

   8.2 gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu.

   ·· ·· ·· · ·· ···· · · ··· ··· · · · ··· • · · · · · ···· · · · ··· · · ··· ···· ·· ·· · ·· ···
9. 9. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.
10. 10. Koryneformné baktérie, v ktorých sa zoslabuje gén » glyA.

    *
11. 11. Vektor pK18mobglyA' znázornený na obrázku 1 a uložený v E. coli ako DSM 13170.
12. 12. Izolovaný polynukleotid obsahujúci (i) nukleotidovú sekvenciu jednotky lacI-tac-5'glyA znázornenú v SEQ ID No. 2 alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencií (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sekvenciami komplementárnymi k sekvenciám (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
13. 13. Izolovaný polynukleotid obsahujúci (i) nukleotidovú sekvenciu jednotky lacI-tac-glyA znázornenú v SEQ ID No. 3 alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencií (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá hybridizuje so sek36 ·· ·· ·· • · · · · · e ι ι ·· • · · · ··

    9 9 9 99

    9999 9999 • · ···· venciami komplementárnymi k sekvenciám (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).