KR20040014489A

KR20040014489A - 코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의한 ｌ-아미노산의생산 방법

Info

Publication number: KR20040014489A
Application number: KR20037013212A
Authority: KR
Inventors: 미케 파르빅; 브리기테 바테; 토마스 헤르만; 아힘 마르크스; 발터 페페를레
Original assignee: 데구사 아게
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-04-04
Publication date: 2004-02-14
Also published as: HUP0303926A3; HUP0303926A2; AU2002316834A1; CN1501979A; AU2002316834A8; DE10117816A1; CN1231591C; EP1377674A2; WO2002086137A3; WO2002086137A2

Abstract

본 발명은 하기 단계들을 수행하는, L-아미노산의 생산 방법에 관한 것이고,

a) 최소한 mqo 유전자가 감쇠되어진, 목적한 L-아미노산을 생성하는 코리네형 박테리아의 발효,

b) 배지내 또는 박테리아의 세포내에서 목적한 L-아미노산의 농축, 및

c) L-아미노산의 단리,

경우에 따라, 목적한 L-아미노산의 생합성 경로의 유전자들이 부가적으로 증강된 박테리아가 사용되거나, 또는 목적한 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사경로의 적어도 일부가 차단되어진 박테리아가 사용된다.

Description

코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의한 Ｌ-아미노산의 생산 방법 {PROCESS FOR THE PRODUCTION OF L-AMINO ACIDS BY FERMENTATION USING CORYNEFORM BACTERIA}

L-아미노산, 특히 L-리신은 인간 의약 및 제약 산업, 식품 산업, 및 아주 특별하게는 동물 사료에 사용된다.

코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주의 발효에 의한 아미노산의 생산이 알려져있다. 그들의 큰 중요성 때문에, 생산 방법들을 개선시키기 위한 시도들이 계속 되어왔다. 상기 방법들에 대한 개선은, 예를 들어, 교반 및 산소 공급과 같은 발효 관련 수단, 또는 예를 들어, 발효중의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 정제, 또는 미생물 자체의 고유 성능에 관한 것이다.

상기 미생물의 성능을 증진시키기 위해서, 돌연변이 방법, 선별법 및 돌연변이체 선별법이 이용되고 있다. 상기 방법들은 예를 들어, 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-시스테인과 같은 항대사산물에 내성이 있거나 또는 조절의 차원에서 중요한 대사산물에 대해 영양요구성이며, L-아미노산을 생산하는 균주를 제공한다.

수 년 동안, 재조합 DNA 기술에 대한 방법들이, 개별적인 아미노산 생합성 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생산에 대한 효과를 연구함으로써, 코리네박테리움 글루타미쿰의 L-아미노산-생산 균주를 개선하기 위해 또한 사용되고 있다.

본 발명은 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 mqo 유전자가 감쇠되어진 코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의해 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산하는 방법을 제공한다.

도 1 : 플라스미드 pXK99Emob의 지도,

도 2 : 플라스미드 pXK99Emobmqo의 지도.

사용된 약어 및 명칭은 하기 의미를 갖는다.

Kan: 이. 콜라이 (E. coli)로부터 유래된 카나마이신 내성 유전자 aph(3')-IIa

BamHI제한효소 BamHI의 절단 부위

HindIII제한효소 HindIII의 절단부위

NcoI제한효소 NcoI의 절단부위

Ptrctrc 프로모터

T1종결 영역 T1

T2종결 영역 T2

lacIq이. 콜라이 (E. coli)의 lac 오페론의 lacIq 억제인자

oriV이. 콜라이 (E. coli) 유래의 복제 기점 ColE1

mobRP4-이동 부위

mqomqo 유전자가 클로닝된 영역

발명의 목적

EP-A-1038969에는, 발효에 의한 L-아미노산의 생산성 개선이 mqo 유전자의 강화, 특히 과발현에 의해 달성될 수 있다는 것이 기재되어 있다.

본 발명자들은 코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의해서, L-아미노산, 특히 L-리신의 개선된 생산 방법에 대해 새로운 기초를 제공하는 것을 목적으로 정하였다.

발명의 설명

L-아미노산 또는 아미노산이 하기에서 언급되는 경우, L-아스파라긴, L-트레오닌, L-세린, L-글루타메이트, L-글리신, L-알라닌, L-시스테인, L-발린, L-메티오닌, L-이소루신, L-루신, L-티로신, L-페닐알라닌, L-히스티딘, L-리신, L-트립토판 및 L-아르기닌의 군으로부터 선택된, 그들의 염을 포함한, 하나 이상의 아미노산을 의미하는 것으로 이해되어져야 한다. L-리신이 특히 바람직하다.

L-리신 또는 리신이 하기에서 언급되는 경우, 염기 뿐만 아니라, 예를 들어,리신 모노히드로클로리드 또는 리신 술페이트와 같은 염을 의미하는 것으로 이해되어져야 한다.

본 발명은 최소한 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (mqo 유전자)이 감쇠되어진, 특히 차단되거나 또는 낮은 수준으로 발현되는 코리네형 박테리아를 이용한 발효에 의해서 L-아미노산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 하기 단계들이 수행되어지는 발효에 의한 L-아미노산의 생산 방법을 제공한다:

a) 최소한 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 감쇠되어진, 특히 차단되거나 또는 낮은 수준으로 발현되는 L-아미노산-생산 코리네형 박테리아의 발효;

b) 배지내 또는 박테리아 세포내에서 L-아미노산의 농축; 및

c) 발효액 및(또는) 균체의 구성성분들중 선택적으로 일부 또는 전체가 최종 생성물중에 남아있는 목적하는 L-아미노산의 단리.

사용된 균주는 바람직하게는 mqo 유전자의 감쇠 전이라도 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산한다.

바람직한 구현예는 청구의 범위에서 찾아볼 수 있다.

본 명세서에 있어서 용어 "감쇠 (attenuation)" 또는 "감쇠시키다 (attenuate)"는, 예를 들어, 약한 프로모터를 이용하거나 또는 낮은 수준의 활성을 갖는 상응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 이용함으로써, 또는 상응하는 유전자 또는 효소 (단백질)을 불활성화시킴으로써, 및 경우에 따라 상기 방법들을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 미생물내의 하나 이상의 효소 (단백질)의 세포내 활성의 감소 또는 차단을 의미한다.

본 발명에 의해 제공된 미생물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 맥아당, 당밀, 전분, 셀룰로스로부터 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 아미노산을 생성할 수 있다. 그들은 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속의 대표적인 것일 수 있다. 코리네박테리움 속의 경우에 있어서, L-아미노산을 생산하는 능력이 당 분야의 숙련자에게 공지되어 있는, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 종이 특히 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주로는 특히 하기의 공지된 야생형 균주

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테리움 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806

코리네박테리움 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870

코리네박테리움 멜라세콜라 (Corynebacterium melassecola) ATCC17965

코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539

브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067

브레비박테리움 락토퍼멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum) ATCC14020

및 예를 들어, 하기의 L-리신-생성 균주와 같은, 상기 야생형 균주로부터 제조된 L-아미노산-생성 변이체 또는 균주가 있다:

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21513

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21544

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21543

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 4697 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715.

선행 기술 (EP-A-1038969)과는 반대로, 코리네형 박테리아는 mqo 유전자의 감쇠 후 개량된 방법으로 L-아미노산을 생산하는 것으로 밝혀졌다.

코리네박테리움 글루타미쿰의 mqo 유전자의 뉴클레오티드 서열은 몰레나 (Molenar) 등 [Molenaret al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)]에 의해 간행되었고 또한 기탁 번호 AJ 22 4946의 유전자 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 또한 서열 1로 나타내고 상기 단백질의 아미노산 서열은 서열 2로 나타내었다.

언급된 참고문헌에 기재된 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제를 코딩하는 서열들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한 말레이트 퀴논 옥시도리덕타제의 대립유전자를 사용하는 것도 또한 가능한데, 이는 유전자 코드의 다의성 (degeneracy)으로부터 또는 기능면에 있어서 중성인 센스 돌연변이 (sense mutation)에 의해서 형성된다.

감쇠를 달성하기 위해서, mqo 유전자의 발현 또는 유전자 생성물의 촉매성 중 하나를 감소시키거나 차단시킬 수 있다. 상기 두 가지 방법이 선택적으로 조합된다.

유전자 발현은 적절한 방법으로 배양을 수행하거나 또는 유전자 발현의 시그날 구조물의 유전적 변경 (돌연변이)에 의해서 감소될 수 있다. 유전자 발현의 시그날 구조물은, 예를 들어, 억제 유전자, 활성 유전자, 작동 유전자, 프로모터, 감쇠자, 리보솜-결합 부위, 출발 코돈 및 종결자이다. 당 분야의 숙련자는 그에 대한 정보를 예를 들어, 특허 출원 WO 96/15246호, 문헌 [Boyd and Murphy, Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)], 문헌 [Voskuil and Chambliss, Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998)], 문헌 [Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58: 191 (1998)], 문헌 [Pateket al., Microbiology 142: 1297 (1996)], 및 예를 들어, 니퍼의 교과서 (Knippers, "Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) 또는 위내커의 교과서 (Winnacker, "Gene und Klone", VCHVerlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990)과 같은 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 발견할 수 있다.

효소 단백질의 촉매성에 있어서 변화 또는 감소를 유발하는 돌연변이는 선행기술로부터 공지되어 있는데; 언급될 수 있는 예로는 문헌 [Qiu and Goodman, Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)], 문헌 [Sugimotoet al., Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762 (1997)] 및 문헌 [Moeckel, "Die Threonindehydratase aus Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des Forschungszentrums Juelichs, Juel-2906, ISSN09442952, Juelich, Germany, 1994]의 연구들이 있다. 개요들은, 예를 들어, 하게만의 교과서 (Hagemann, "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)와 같은 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 발견된다.

돌연변이 전이(transition), 전위(transversion), 삽입(insertion) 및 결실(deletion)이 고려되어진다. 효소 활성에 대한 아미노산 치환의 효과에 따라서, 과오 돌연변이 (missense mutation) 또는 무의미 돌연변이 (nonsense mutation) 가 고려된다. 유전자에 있어서 하나 이상의 염기쌍의 삽입 또는 결실은 프레임 이동 돌연변이 (frame shift mutations)를 유발하므로, 그 결과 올바르지 않은 아미노산이 삽입되거나 또는 번역이 조기에 중단된다. 돌연변이의 결과 코딩 영역에 종결코돈이 형성되면, 마찬가지로 번역의 조기 중단을 일반적으로 유발한다.

여러 코돈의 결실은 전형적으로 효소 활성의 완전한 손실을 가져온다. 상기 돌연변이의 생성에 대한 지침은 선행기술의 일부이고, 예를 들어, 니퍼의 교과서 (Knippers, "Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), 비내커의 교과서 (Winnacker, "Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) 또는 하게만의 교과서 (Hagemann, "Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)와 같은, 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 발견될 수 있다.

본 발명은, 서열 3으로 나타낸, mqo 유전자의 대립유전자 672를 제공하고, 상기 대립유전자는 DNA 서열 (서열 1 참조)의 672 위치에서 뉴클레오티드 구아닌 대신에 뉴클레오티드 아데닌을 가지고 있으며, 이로 인해 아미노산 트립토판-224 (서열 2 참조)를 코딩하는 TGG 코돈이 오팔 (TGA) 정지코돈에 의해 치환된 것이다.

본 발명은 또한, 서열 4 로 나타낸, mqo 유전자의 대립유전자 1230를 제공하는데, 상기 대립유전자는 DNA 서열 (서열 1 참조)의 672 위치에서 뉴클레오티드 구아닌 대신에 뉴클레오티드 아데닌을 가지고 있으며, 이로 인해 아미노산 트립토판-224 (서열 2 참조)를 코딩하는 tgg 코돈이 오팔 정지 코돈에 의해 치환되고, 이와 더불어 1230 위치에서 뉴클레오티드 시토신이 티민으로 치환된 것이다.

씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)의 유전자를 돌연변이시키는 통상적인 방법은 문헌 [Schwarzer and Puehler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991)]에 기재된 유전자 붕괴 및 유전자 대체의 방법이다.

유전자 붕괴의 방법에 있어서, 당해 유전자의 코딩 영역의 중앙 부분이숙주(대표적으로 이. 콜라이 (E. coli))내에서 복제가능하지만 씨. 글루타미쿰내에서 복제될 수 없는 플라스미드 벡터내로 클로닝된다. 적합한 벡터로는, 예를 들어, pSUP301 (Simonet al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob 또는 pK19mob (Schaeferet al., Gene 145, 69-73 (1994)), pK18mobsacB 또는 pK19mobsacB (Jaegeret al., Journal of Bacteriology 174:5462-5465 (1992)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269:32678-32684; 미국 특허 제5,487,993호), pCR(등록상표)Blunt (Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernardet al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) 또는 pEM1 (Schrumpfet al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516)이 있다. 유전자의 코딩 영역의 중앙 부분을 함유하는 플라스미드 벡터를 이어서 접합 또는 형질전환에 의해서 씨. 글루타미쿰의 목적하는 균주로 전이시킨다. 접합 방법은, 예를 들어, 문헌 [Schaeferet al., Applied and Environment Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기재되어 있다. 형질전환 방법은, 예를 들어, 문헌 [Thierbachet al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)], 문헌 [Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)] 및 문헌 [Tauchet al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기재되어 있다. 교차 발생에 의한 상동성 재조합 후, 당해 유전자의 코딩 영역은 벡터 서열에 의해서 붕괴되고, 3'- 및 5'- 말단이 결핍된 두 개의 불완전한 대립유전자가 각각 수득된다. 상기 방법은, 예를 들어, 문헌 [Fitzpatricket al., Applied Microbiology andBiotechnology 42, 575-580 (1994)]에 의해서 씨. 글루타미쿰의 recA 유전자를 차단시키는데 사용되고 있다.

유전자 대체 방법에 있어서, 예를 들어, 결실, 삽입 또는 염기 치환과 같은 돌연변이는 당해 유전자에 있어서 시험관내에서 발생된다. 생성된 대립유전자를, 씨. 글루타미쿰에서는 복제되지 않는 벡터내로 클로닝하고, 이를 이어서 형질전환 또는 접합에 의해서 씨. 글루타미쿰의 목적한 숙주로 전이시킨다. 통합을 유발하는 첫 번째 교차 발생 및 표적 유전자 또는 표적 서열에서의 삭제를 유발하는 적합한 두 번째 교차 발생에 의한 상동 재조합 후, 돌연변이 또는 대립유전자의 도입이 이루어진다.

상기 방법은 예를 들어, 문헌 [Peters-Wendischet al., Microbiology 144, 915-927 (1998)]에 의해서 결실에 의해 씨. 글루타미쿰의 pyc 유전자를 차단시키는데 사용되고 있다. 상기 방법은 문헌 [Schaefer et al., Gene 145: 69-73 (1994)]에 의해서, 예를 들어, 결실을 hom-thrB 유전자 영역내로 도입시키기 위해서 사용되고 있다. 동일한 방법으로, 결실을 문헌 [Schaeferet al., Journal of Bacteriology 176: 7309-7319 (1994)]에 의해서 씨. 글루타미쿰의 cgl 유전자 영역내로 도입시켰다.

결실, 삽입 또는 염기 치환은 이와 같이 mqo 유전자내로 도입될 수 있다.

또한, mqo 유전자를 감쇠시키는 것과 더불어, 당해 생합성 경로, 해당과정, 충전 경로 (anaplerotic pathway), 시트르산 회로, 펜토스 포스페이트 회로, 아미노산 방출계의 하나 이상의 효소 및 경우에 따라 조절 단백질을 증강시키는, 특히과발현시키는 것이 L-아미노산의 생성을 위해서 유리할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "증강 (enhancement)" 또는 "증강시키다 (enhance)"는, 예를 들어, 강력한 프로모터, 또는 높은 수준의 활성을 갖는 상응하는 효소 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 이용하여, 유전자 또는 유전자들의 카피수를 증가시키는 것에 의해서, 및 임의로는 상기 방법들을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해서 코딩되는 미생물내의 하나 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성을 증가시키는 것을 의미한다.

따라서, mqo 유전자를 감쇠시키는 것과 더불어, L-리신의 생성을 위해서, 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 증강될 수 있고, 특히 과발현될 수 있다

ㆍ 피드-백 내성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 유전자 lysC (기탁번호 P26512, EP-B-0387527; EP-A-0699759; WO 00/63388),

ㆍ 디히드로디피콜리네이트 합성효소를 코딩하는 유전자 dapA (EP-B 0 197 335),

ㆍ 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086),

ㆍ 동시에 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자 pyc (DE-A-198 31 609)

ㆍ 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 zwf (JP-A-09224661),

ㆍ 동시에 리신 방출계를 코딩하는 유전자 lysE (DE-A-195 48 222),

ㆍ Zwa1 단백질을 코딩하는 유전자 zwa1 (DE:19959328.0, DSM 13115),

ㆍ 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 tpi (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086), 및

ㆍ 3-포스포글리세레이트 키나아제를 코딩하는 유전자 pgk (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086).

mqo 유전자를 감쇠시키는 것과 더불어, 동시에 하기 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감쇠, 특히 감소시키는 것이 아미노산, 특히 L-리신의 생성을 위해 또한 유리할 수 있다

ㆍ 포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자 pck (DE 199 50 409.1, DSM 13047),

ㆍ 글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 pgi (US 09/396,478, DSM 12969),

ㆍ 피루베이트 옥시다제를 코딩하는 유전자 poxB (DE:1995 1975.7, DSM 13114),

ㆍ Zwa2 단백질을 코딩하는 유전자 zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113).

마지막으로, mqo 유전자를 감쇠시키는 것과 더불어, 목적하지 않은 이차 반응을 차단시키는 것이 아미노산의 생성에 유리할 수 있다 (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK,1982).

본 발명에 따라 생성된 미생물은 또한 본 발명의 일부를 형성하고, L-아미노산의 생성을 목적으로, 회분식 방법 또는 유가식 또는 반복 유가식 방법에 의해서 연속적으로 또는 비연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양방법의 개요는 크밀 (Chmiel)의 교과서 (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) 또는 스토르하스 (Storhas)의 교과서 (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))에 기재되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방법으로 당해 균주에 대한 요건을 충족해야 한다. 다양한 미생물을 위한 배양 배지의 서술은 편람 ["Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾을 수 있다.

탄소원으로서, 예를 들어, 포도당, 자당, 유당, 과당, 맥아당, 당밀, 전분 및 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 예를 들어, 대두유, 해바라기 오일, 땅콩유 및 코코넛유와 같은 오일 및 지방, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산, 예를 들어, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜, 및 예를 들어, 아세트산과 같은 유기산이 사용될 수 있다. 상기 물질들은 각각 또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다.

질소원으로서, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 콩가루 및 우레아와 같은 유기 질소-함유 화합물, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 화합물이 사용될 수 있다. 질소원은 각각 또는 혼합물의 형태로 사용될 수 있다.

인 공급원으로서, 인산, 인산 이수소 칼륨 또는 인산 수소 이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염들이 사용될 수 있다. 배양 배지는 또한 예를 들어, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속의 염을 함유하여야 하고, 이는 성장에 필수적이다. 마지막으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 상기 언급된 물질들과 더불어 사용될 수 있다. 적합한 전구체들이 또한 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 물질들은 단일 배치(batch)의 형태로 배양액에 첨가될 수 있고, 또는 그들은 배양중에 적합한 방법으로 공급될 수 있다.

배양액의 pH 수치를 조절하기 위해서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물이 적절하게 사용된다. 거품의 발생을 제어하기 위해서, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제가 사용될 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해서, 예를 들어, 항생물질과 같이 선별작용을 하는 적합한 물질이 배지에 첨가될 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해서, 산소 또는 예를 들어, 공기와 같은 산소를 함유하는 기체 혼합물이 배양액내로 도입된다. 배양의 온도는 정상적으로 20 ℃ 내지 45 ℃이고, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 목적하는 생성물의 최대량이 형성될 때까지 배양을 계속한다. 상기 목적은 10 시간 내지 160 시간의 기간내에서 통상적으로 달성된다.

L-아미노산을 측정하는 방법은 선행기술로부터 공지되어 있다. 분석은 문헌 [Spackmanet al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기재된 바와 같이 음이온-교환 크로마토그래피에 이은 닌히드린 유도체화에 의해서 수행될 수 있고, 또는 문헌 [Lindrothet al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기재된 바와 같이 역상 HPLC에 의해서 수행될 수 있다.

본 발명은 실시예를 이용하여 하기에서 보다 상세하게 설명된다.

실시예 1

씨. 글루타미쿰에서 mqo 유전자의 IPTG-유도 발현을 위한 발현벡터 pXK99Emobmqo의 제조

1.1 mqo 유전자의 클로닝

균주 ATCC 13032로부터, 염색체 DNA를 아이크만스 (Eikmanns) 등의 방법 (Microbiology 140: 1817-1828 (1994))에 의해서 단리하였다. 씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 mqo 유전자의 서열을 기초로하여, 하기 올리고뉴클레오티드를 중합효소 연쇄 반응을 위해 선택하였다 (서열 5 및 서열 6 참조).

mqo_oP1:

5'- GAGGA TCCGCA GAG AAC TCG CGG AGA TA-3'

mqo_hind:

5'- CTAAG CTTCGT AGC GAG CCT TGA TGT AT-3'

프라이머는, 증폭된 단편이 프로모터 영역없이 천연 리보솜 결합 부위로 시작되는 불완전한 유전자, 및 mqo 유전자의 전반부 영역을 함유하도록 선택하였다.더욱이, 프라이머 mqo_oP1은 제한효소 BamHI의 절단 부위를 위한 서열을 함유하고, 프라이머 mqo_hind는 제한효소 HindIII의 절단 부위를 함유하며, 이는 상기 나타낸 뉴클레오티드 서열에 있어서 밑줄로 표시된다.

상기 나타낸 프라이머들은 MWG-바이오텍(Biotech) AG (Ebersberg, Germany)에 의해 합성되었고, PCR 반응은 로슈 다이아그노스틱스 (Roche Diagnostics) GmbH (Mannheim, Germany)로부터 시판되는 Pwo-중합효소를 사용하여 인니스 (Innis) 등의 표준 PCR 방법 (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)으로 수행하였다. 중합효소 연쇄 반응의 도움으로, 프라이머들은 크기가 468 bp이고, 천연 리보솜 결합 부위를 포함하는 불완전한 mqo 유전자를 가진 DNA 단편을 증폭시킬 수 있었다.

크기가 468 bp인 mqo 단편을 제한효소 BamHI 및 HindIII로 절단한 다음 QiaExII 겔 추출 키트 (제품 번호 20021, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 아가로스 겔로부터 단리시켰다.

1.2 발현 벡터 pXK99Emob의 제조

IPTG-유도성 발현 벡터 pXK99Emob를 선행 기술에 따라서 제조하였다. 상기 벡터는 에세리치아 콜라이 (Escherichia coli) 발현 벡터 pTRC99A (Amannet al., Gene 69: 301-315 (1988))를 근거로 하고, 락토스 유도체 IPTG (이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드)의 첨가에 의해 유도될 수 있는 trc 프로모터, 종결 영역 T1 및 T2, 이. 콜라이 (E. coli) 유래의 복제 기점 ColE1, lacI^q유전자 (이. 콜라이(E. coli) 유래의 lac 오페론의 억제인자), 다중 클로닝 부위 (mcs) (Norrander, J.M.et al., Gene 26, 101-106 (1983)), 이. 콜라이 (E. coli) 유래의 카나마이신 내성 유전자 aph(3')-IIa (Beck et al. (1982), Gene 19: 327-336) 및 클로닝 벡터 pK18mobsacB 유래의 RP4-이동-부위 (Schaefer et al., Gene 14: 69-73 (1994))를 함유한다.

벡터 pXK99Emob는 유전자의 발현을 조절하는데, 특히 코리네형 박테리아에 있어서 감쇠된 발현을 수행하는데 매우 적합하다는 것이 밝혀졌다. 벡터 pXK99Emob는 이. 콜라이 (E. coli) 발현 벡터이고, 유전자의 증강된 발현을 위해 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 사용될 수 있다.

상기 벡터는 코리네형 박테리아 내에서 독립적으로 복제될 수 없기 때문에, 이는 염색체내로 통합된 경우에만 세포내에서 유지된다. 상기 벡터의 이러한 특이성은, 상응하는 유전자의 전반부로부터 유래된 유전자 부분을 개시 코돈 및 천연 리보솜 결합 부위를 함유하는 벡터에 클로닝한 다음, 상기 벡터를 코리네형 박테리아, 특히 씨. 글루타미쿰 내로 통합시킨 후 유전자의 조절된 발현을 위해 유용하다. 유전자 발현은 계량된 양의 IPTG를 영양 배지에 첨가함으로써 조절된다. 0.5 μM 내지 10 μM IPTG의 양은 상응하는 유전자를 매우 약하게 발현시키는 효과를 가지며, 10 μM 내지 100 μM의 양은 상응하는 유전자의 정상적인 발현을 약간 감쇠시키는 효과가 있다.

제조된 이. 콜라이 (E. coli) 발현 벡터 pXK99Emob를 전기천공법 (Tauchet al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-347)에 의해 이. 콜라이 (E. coli)DH5αmcr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649)내로 전이시켰다. 형질전환체의 선별은 50 mg/l 카나마이신이 추가공급된 LB 아가 (Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^ndEd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)상에서 수행하였다.

플라스미드 DNA를 통상적인 방법 (Peters-Wendischet al., 1998, Microbiology, 144, 915-927)에 의해서 형질전환체로부터 단리하였고, 제한효소 NcoI으로 절단한 다음, 아가로스 겔 전기영동에 의해서 플라스미드를 확인하였다.

상기 방법으로 수득된 플라스미드 작제물을 pXK99Emob (도 1)이라 명명하였다. 이. 콜라이 (E. coli) 균주 DH5αmcr 내로의 플라스미드 pXK99Emob의 전기천공법에 의해 수득된 균주를 이. 콜라이 (E. coli) DH5alphamcr/pXK99Emob라 명명하였다.

1.3 이. 콜라이 (E. coli) 발현 벡터 pXK99Emob 내로의 mqo 단편의 클로닝

실시예 1.2에 기재된 이. 콜라이 (E. coli) 발현 벡터 pXK99Emob를 벡터로서 사용하였다. 상기 플라스미드의 DNA를 제한효소 BamHI 및 HindIII로 완전히 절단한 다음 새우 알칼라인 포스파타제 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 제품명 SAP, 제품 번호 1758250)로 탈인산화시켰다.

PCR에 의해 수득되고 제한효소 BamHI 및 HindIII로 절단된, 실시예 1.1에 기재된 크기 약 458 bp의 mqo 단편을 상기 제조된 벡터 pXK99Emob와 혼합하고, 상기배치를 T4 DNA 리가아제 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명 T4-DNA-Ligase, 코드 번호 27-0870-04)로 처리하였다. 상기 라이게이션 배치를 이. 콜라이 (E. coli) 균주 DH5αmcr로 형질전환시켰다 (Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). 상기 형질전환 배치를 50 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 아가 (Lennox, 1955, Virology, 1:190)상에서 플레이팅함으로써 플라스미드를 지닌 세포를 선별하였다. 37 ℃에서 하룻밤 항온배양한 후, 각각의 재조합 클론을 선별하였다. 플라스미드 DNA를, 제조자의 지시에 따라서 퀴아프렙 스핀 미니프렙 킷트 (Qiaprep Spin Miniprep Kit; 제품 번호 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 형질전환체로부터 단리하고, 제한효소 BamHI 및 HindIII로 절단한 다음 아가로스 겔 전기영동에 의해서 플라스미드를 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pXK99Emobmqo라 명명하였다. 이를 도 2에 나타내었다.

하기 미생물을 부다페스트 조약에 의해 기탁기관 DSMZ (Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에 2002년 2월 15일에 순수한 배양액으로 기탁하였다 :

- 기탁번호 DSM 14815로서 에세리치아 콜라이 (Escherichia coli) DH5alphamcr/pXK99Emobmqo (= DH5αmcr/pXK99Emobmqo).

실시예 2

씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715의 게놈내로 벡터 pXK99Emobmqo의 통합

실시예 1에서 언급된 벡터 pXK99Emobmqo를 균주 씨. 글루타미쿰 DSM5715에 토치 (Tauch) 등의 전기천공법 (Tauchet al., 1989 FEMS Microbiology Letters 123: 343-347)으로 전기천공시켰다. 상기 벡터는 DSM5715 내에서 독립적으로 복제할 수 없고, 염색체 내로 통합될 때에만 세포내에서 유지된다. 통합된 pXK99Emobmqo를 가진 클론의 선별은, 15 mg/l 카나마이신 및 IPTG (1 mM)이 추가공급된 LB 아가상에 전기천공 배치를 플레이팅함으로써 수행하였다 (Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^ndEd., Cold Spring Harbor, New York, 1989).

DSM5715의 mqo-유전자가 염색체 내에 삽입된, 실시예 1 에서 언급된 플라스미드 pXK99Emobmqo를 가진 선별된 카나마이신-내성 클론을 DSM5715::pXK99Emobmqo라 명명하였다.

실시예 3

리신의 제조

실시예 2에서 수득된 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pXK99Emobmqo를 리신의 생산에 적합한 영양 배지내에서 배양하고, 배양 상층액내의 리신 함량을 측정하였다. IPTG 의 첨가에 의해서, trc 프로모터에 의해 조절되는, mqo 유전자의 감쇠된 발현이 일어난다.

이를 위해서, 상기 균주를 우선 해당 항생물질을 포함하는 아가 플레이트 (카나마이신 (25 mg/l) 및 IPTG (10 μM)을 함유하는 브레인-하트 아가)상에서 33℃로 24 시간 동안 항온배양시켰다. 상기 아가 플레이트 배양을 시작으로, 예비배양액을 시딩하였다 (100 ml 원추형 플라스크내의 10 ml 배지). 완전 배지 Cg III가 예비배양을 위한 배지로서 사용되었다.

Cg III 배지

NaCl2.5 g/l

박토-펩톤10 g/l

박토-효모 추출물10 g/l

포도당 (별도로 오토클레이브됨)2％ (w/v)

pH를 pH 7.4 로 맞추었다.

카나마이신 (25 mg/l) 및 IPTG (10 μM)를 상기에 첨가하였다. 상기 예비배양액을 진탕기상에서 240 rpm으로 33 ℃에서 16 시간 동안 항온배양하였다. 예비배양액의 OD (660 nm)는 0.5였다. 상기 예비배양액 500 ㎕를 주배양액 내로 이동접종하였다. 상기 예비배양액으로부터 IPTG-함유 배지의 이동에 의해서, 주배양액에서의 IPTG 농도는 약 0.5 μM이었다. 배지 MM이 주배양을 위해 사용되었다.

MM 배지

CSL (옥수수 침지액)5 g/l

MOPS (모르폴리노프로판술폰산)20 g/l

포도당 (별도로 오토클레이브됨)50 g/l

염:

(NH₄)₂SO₄25 g/l

KH₂PO₄0.1 g/l

MgSO₄ㆍ7 H₂O1.0 g/l

CaCl₂ㆍ2 H₂O10 mg/l

FeSO₄ㆍ7 H₂O10 mg/l

MnSO₄ㆍH₂O5.0 mg/l

바이오틴 (멸균-여과)0.3 mg/l

티아민ㆍHCl (멸균-여과)0.2 mg/l

루이신 (멸균-여과)0.1 g/l

CaCO₃25 g/l

상기 CSL, MOPS 및 염 용액을 암모니아수를 이용하여 pH 7로 조정하여 오토클레이브하였다. 멸균 물질 및 비타민 용액을 이어서 첨가하고, 건조 상태로 오토클레이브된 CaCO₃를 첨가하였다.

100 ml의 홈이 패인 원추형 플라스크내에서 10 ml 부피로 배양을 수행하였다. 카나마이신 (25 mg/l)을 첨가하였다. 33 ℃ 및 80 ％ 대기 습도에서 배양을 수행하였다.

72 시간 후, 바이오멕 (Biomek) 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 이용하여 660 nm의 측정 파장에서 OD를 측정하였다. 형성된 리신의 양을 이온교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출을 이용한 컬럼 후 유도체화에 의해 에펜도르프 바이오트로닉 (Eppendorf-BioTronik; Hamburg, Germany)에서 시판되는 아미노산 분석기를 이용하여 측정하였다.

실험의 결과를 표 1에 나타내었다.

균주	OD(660 nm)	리신 HClg/l
DSM5715	6.8	12.82
DSM5715::pXK99Emobmqo	6.4	14.85

Claims

a) 최소한 mqo 유전자가 감쇠되어진, 목적한 L-아미노산을 생산하는 코리네형 박테리아 (coryneform bacteria)를 발효시키는 단계,

b) 배지내 또는 박테리아의 세포 내에서 목적한 생성물을 농축시키는 단계, 및

c) 발효액 및(또는) 균체의 구성성분들중 선택적으로 일부 또는 전체가 최종 생성물중에 남아있는 목적한 L-아미노산을 단리하는 단계

를 수행하는 것을 포함하는, 발효에 의한 L-아미노산, 특히 L-리신의 생산 방법.
제 1 항에 있어서, 목적한 L-아미노산의 생합성 경로의 유전자들이 부가적으로 증강된 박테리아가 사용되는 방법.
제 1 항에 있어서, 목적한 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로중 적어도 일부가 차단된 박테리아가 사용되는 방법.
제 1 항에 있어서, mqo 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 mqo가 코딩하는 폴리펩티드 (효소 단백질)의 촉매성이 감소된 것인 방법.
제 1 항에 있어서, L-리신의 생산을 위해,

6.1 피드-백 내성 아스파테이트 키나아제를 코딩하는 유전자 lysC,

6.2 디히드로디피콜리네이트 합성효소를 코딩하는 유전자 dapA,

6.3 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 gap,

6.4 피루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자 pyc,

6.5글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자 zwf,

6.6 동시에 리신 방출계를 코딩하는 유전자 lysE,

6.7 Zwa1 단백질을 코딩하는 유전자 zwa1,

6.8 트리오스 포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 tpi, 및

6.9 3-포스포글리세레이트 키나아제를 코딩하는 유전자 pgk

의 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증강된, 특히 과발현된 코리네형 미생물을 발효시키는 방법.
제 1 항에 있어서, L-아미노산의 생산을 위해,

7.1포스포에놀 피루베이트 카르복시키나아제를 코딩하는 유전자 pck,

7.2글루코스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자 pgi,

7.3피루베이트 옥시다제를 코딩하는 유전자 poxB, 또는

7.4Zwa2 단백질을 코딩하는 유전자 zwa2

의 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 코리네형 미생물을 발효시키는 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 종의 미생물이 사용되는 방법.
적어도 mqo 유전자가 감쇠된 형태로 존재하는 코리네형 박테리아.
제 9 항에 있어서, 감쇠가 결실, 역위 (inversion), 전이 또는 전위 돌연변이에 의한 것인 코리네형 박테리아.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, mqo 유전자가 종결 코돈을 함유하는 코리네형 박테리아.
제 11 항에 있어서, 특히 오팔 (opal) 형태의 종결 코돈이 서열 2의 아미노산 서열의 224 위치를 따라 위치하는 코리네형 박테리아.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 3에 따른 mqo 대립유전자를 함유하는 코리네형 박테리아.
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 4에 따른 mqo 대립유전자를 함유하는 코리네형 박테리아.
기탁기관 DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures, Brunswick, Germany)에 DSM 14815로 기탁된 에세리치아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 DH5alphamcr/pXK99Emobmqo (= DH5αmcr/pXK99Emobmqo).