KR20060129352A

KR20060129352A - ｚｗｆ 유전자의 증폭을 이용한 Ｌ-아미노산의 제조 방법

Info

Publication number: KR20060129352A
Application number: KR1020067015421A
Authority: KR
Inventors: 스테판 한스; 브리지트 배쓰; 알렉산더 레트; 고르그 티에르바흐; 캐롤린 크로이저; 베티나 하드리히
Original assignee: 데구사 아게
Priority date: 2006-07-28
Filing date: 2004-01-29
Publication date: 2006-12-15

Abstract

본 발명은 a) 적어도 zwf 유전자를 증폭시키는 L-아미노산-생산 세균을 발효시키는 단계; b) L-아미노산을 배지 또는 세균 세포에서 농축시키는 단계; 및 c) 이로써 생산된 L-아미노산을 분리하는 단계를 수행하는 것을 포함하여, 코리네형 세균을 발효시킴으로써 L-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

츠비쉔페르멘트 (Zwischenferment) 유전자, 코리네형 세균, L-리신, L-트레오닌

Description

ｚｗｆ 유전자의 증폭을 이용한 Ｌ-아미노산의 제조 방법 {PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACIDS WITH AMPLIFICATION OF THE ZWF GENE}

본 발명은 zwf 유전자에 의해 암호화된 적어도 츠비쉔페르멘트 (Zwischenferment) 단백질을 증폭시키는 코리네형 (coryneform) 세균을 사용하여, L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌 및 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.

L-아미노산은 동물 영양, 인간 의학 및 제약 산업에 사용되고 있다.

코리네형 세균, 특히 코리네박테륨 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 균주를 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 것은 공지되어 있다. 아미노산은 매우 중요하기 때문에, 그의 제조 방법을 개선시키자 하는 연구가 지속적으로 수행되고 있다. 이러한 방법 상의 개선은 발효 수단, 예를 들어 산소 공급 및 교반, 영양 배지의 조성 (예: 발효 동안의 당 농도), 이온 교환 크로마토그래피 등에 의한 생성물 형태에 대한 후처리, 또는 미생물 자체에 내재된 산출 특성에 관한 것일 수 있다.

돌연변이 유발, 선별 및 돌연변이체 선별 방법을 이용하여 이들 미생물의 산출 특성을 개선시킨다. 항대사물, 예를 들어, 트레오닌 유사체 α-아미노-β-히드 록시발레르산 (AHV), 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 (AEC)에 대해 내성이 있는 균주, 또는 중요한 조절성 대사물에 대한 영양요구성이고 L-아미노산 (예: 트레오닌 또는 리신)을 생산하는 균주가 상기와 같은 방식으로 수득된다.

L-아미노산을 생산하는 코리네박테륨 글루타미쿰 균주를 개선시키기 위하여 수 년 동안 재조합 DNA 기술 방법을 이용하여 왔다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 코리네형 세균을 이용하여 L-아미노산을 발효적으로 제조하기 위한 개선된 신규 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

L-아미노산은 인간 의학 및 제약 산업, 식료품 산업 및 특히 동물 영양에 사용되고 있다. 따라서, 아미노산을 제조하기 위한 개선된 신규 방법을 제공하는 것에 일반적인 관심이 있다.

본 발명은 zwf 유전자의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 적어도 쯔비쉔페르멘트 단백질 (zwf 단백질)을 증폭시키는, 특히 과발현시키는 코리네형 세균을 사용하여, L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-트립토판을 제조하는 방법을 제공한다.

약어 "zwf"는 "쯔비쉔페르멘트 (Zwischenferment)" [참고: Jeffrey H. Miller: A Short Course In Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA, 1992.]에 대한 연상 기호이고, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제로서 지칭되기도 한다.

효소 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제는 NADP를 NADPH로 동시에 환원시킴으로써 글루코스-6-포스페이트를 6-포스포글루코놀락톤으로 산화시키는 것을 촉매한다. 그의 활성은 NADPH 및 각종의 기타 대사물에 의해 억제된다 [참고: Sugimoto and Shiio, Agricultural and Biological Chemistry 51(1), pp. 101-108 (1987)].

이용된 균주는 zwf 유전자를 증폭시키기 전에 이미 L-아미노산을 생산하고 있는 것이 바람직하다.

바람직한 양태들은 청구의 범위에 제시되어 있다.

이와 관련한 용어 "증폭"은, 예를 들어 유전자(들)의 카피 수를 증가시키거나, 단백질 프로모터를 사용하거나 또는 높은 활성을 지닌 상응하는 효소 또는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 대립 유전자를 사용하고, 임의로 이들 조치를 병용함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 미생물에서 하나 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성 상의 증가를 기재한 것이다.

증폭 조치, 특히 과발현시킴으로써, 상응하는 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도를, 야생형 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물 중의 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여, 일반적으로 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500% 이상 최대 1000% 또는 2000% 이하로 증가시킨다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터로부터 L-아미노산을 제조할 수 있다. 이들은 대표적인 코리네형 세균, 특히 코리네박테륨 속이다. 코리네박테륨 속 중에서, 특히 L-아미노산을 생산할 수 있는 능력이 있는 것으로 전문가들에게 공지되어 있는 코리네박테륨 글루타미쿰 종이 언급될 수 있다.

적합한 코리네박테륨 속 균주, 특히 코리네박테륨 글루타미쿰 종은, 예를 들어 공지된 야생형 균주:

코리네박테륨 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032

코리네박테륨 아세토글루타미쿰 (Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806

코리네박테륨 아세토아시도필룸 (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870

코리네박테륨 더모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539

브레비박테륨 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC14067

브레비박테륨 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869

브레비박테륨 디바리카툼 (Brevibacterium divaricatum) ATCC14020이고;

L-아미노산-생산 돌연변이체는, 예를 들어 L-트레오닌-생산 균주:

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC21649

브레비박테륨 플라붐 BB69

브레비박테륨 플라붐 DSM5399

브레비박테륨 락토페르멘툼 FERM-BP 269

브레비박테륨 락토페르멘툼 TBB-10, 및

L-이소류신-생산 균주:

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 14309

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 14310

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 14311

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 15168

코리네박테륨 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871, 및

예를 들어, L-트립토판-생산 균주:

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC21850 및

코리네박테륨 글루타미쿰 KY9218 (pKW9901), 및

예를 들어, L-리신-생산 균주:

코리네박테륨 글루타미쿰 FERM-P1709

브레비박테륨 플라붐 FERM-P 1708

브레비박테륨 락토페르멘툼 FERM-P 1712

코리네박테륨 글루타미쿰 FERM-P 6463

코리네박테륨 글루타미쿰 FERM-P 6464

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC13032

코리네박테륨 글루타미쿰 DM58-1

코리네박테륨 글루타미쿰 DSM12866

로부터 제조한다.

코리네형 세균은, zwf 단백질 또는 zwf 폴리펩티드를 각각 암호화하는 zwf 유전자를 과발현시킨 후에 개선된 방식으로 L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌 및 L-트립토판을 생산한다.

JP-A-09224661에는 브레비박테륨 플라붐 MJ-223 (FERM BP-1497)의 zwf 유전자의 뉴클레오티드 서열이 기재되어 있고, zwf-유전자에 의해 암호화된 단백질을 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제로서 지칭하고 있다. JP-A-09224661에 기재된 서열 정보가 서열 7 및 8에 나타나 있다. JP-A-09224661에는 zwf 폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열이 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu (서열 8)로서 기재되어 있다.

그러나, 이를 확인하는 것은 가능하지 않았다. 대신, 다음 N-말단 아미노산 서열이 밝혀졌다: Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp (서열 10). 암호화 서열을 포함한 상응하는 zwf 유전자의 뉴클레오티드 서열이 서열 9에 나타나 있다. N-위치에서의 메티오닌 잔기는 해독 후 변형 맥락에서 분열시킨 다음, Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp를 N-말단 아미노산 서열로서 수득하였다.

따라서, 본 발명은 서열 9 뉴클레오티드 538 내지 2079에 나타낸 코리네형 세균으로부터의 신규한 zwf 유전자의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

그람-음성 세균, 예를 들어 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) 또는 기타 그람-양성 세균, 예를 들어 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 또는 바실루스 (Bacillus)로부터의 zwf 단백질을 암호화하는 유전자를 임의로 사용할 수 있다.

더욱이, 유전자 암호 축퇴 (degeneracy)로부터 비롯되거나 중성 기능의 센스 돌연변이로 인한 zwf 유전자의 대립 유전자를 사용할 수도 있다.

내인성 유전자, 특히 코리네형 세균으로부터의 내인성 유전자가 바람직하다. "내인성 유전자" 또는 "내인성 뉴클레오티드 서열"은 특정 종 집단에서 입수 가능한 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

증폭 (예: 과발현)을 달성하기 위해, 상응하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나, 또는 단백질 및 조절 영역, 또는 구조 유전자의 리보솜 결합 부위 상단를 돌연변이시킨다. 구조 유전자의 상단에 삽입되는 발현 카세트가 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해, 발효적 L-아미노산 형성 과정에서 발현을 증가시키는 것이 부가적으로 가능하다. 발현은 또한, m-RNA의 수명을 연장시키기 위한 조치에 의해 개선시키기도 한다. 더욱이, 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증가시키기도 한다. 유전자 또는 유전자 구조물은 다양한 수의 카피를 수반하고 있거나 또는 염색체 통합되어 증폭되는 플라스미드에 존재한다. 또 다른 한편, 문제의 유전자의 과발현은 또한, 배지 조성과 배양 과정을 변화시킴으로써 달성할 수 있다.

이와 관련한 지시 사항이 당해 분야의 전문가에 의해 문헌 [참고: Martin et al.(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), European Patent Specification EPS 0 472 869, US Patent 4,601,893, Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), Patent Application WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), Japanese Laid-Open Specification JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)], 및 공지된 유전학 및 분자 생물학 교과서에 보고되었다.

한 예로써, zwf 단백질을 플라스미드의 보조 하에 과발현시켰다. 이를 위해, 도 1에 도시된 이. 콜라이 (E. coli) - 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum) 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 사용하였다. zwf 유전자를 pEC-T18mob2의 KpnI/SalI 절단 부위 내로 혼입시킨 후, 도 2에 도시된 플라스미드 pEC-T18mob2zwf를 형성하였다.

씨. 글루타미쿰에서 복제할 수 있는 기타 플라스미드 벡터, 예를 들어 pEKExl [참고: Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)] 또는 pZ8-1 [참고: EP-B-0 375 889]를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.

본 발명의 기타 국면에서, 서열 10에 나타낸, zwf 유전자 생성물의 아미노산 서열의 위치 369와 373 사이의 부문 및/또는 위치 241과 246 사이의 부문 내에서의 아미노산 교환이, 그의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성, 특히 NADPH (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 환원형)에 의한 억제에 대항한 그의 내성을 증폭시켜 주고, 상응하는 zwf 유전자 또는 zwf 대립 유잔자를 각각 포함하거나 이들에 의해 암호화된 Zwf 단백질을 포함하는 코리네형 세균에 의한 아미노산 (특히, 리신)의 생산을 개선시킨다는 사실이 밝혀졌다. N-말단 위치 내의 메티오닌 잔기는 숙주의 메티오닌 아미노펩티다제에 의해 해독 후 변형 동안 제거할 수 있다.

따라서, 본 발명은 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 Zwf 단백질을 제공한다.

따라서, 본 발명은 추가로, 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

특히, Zwf 단백질의 아미노산 서열 내의 교환은 기타 단백질 생성가능한 아미노산 (예: L-메티오닌)에 대항한 서열 10의 위치 370에서의 L-아르기닌의 교환; 기타 단백질 생성가능한 아미노산 (예: L-알라닌)에 대항한 서열 10의 위치 372에서의 L-발린의 교환; 기타 단백질 생성가능한 아미노산 (예: L-류신 또는 L-세린)에 대항한 서열 10의 위치 242에서의 L-메티오닌의 교환; 기타 단백질 생성가능한 아미노산 (예: L-트레오닌)에 대항한 서열 10의 위치 243에서의 L-알라닌의 교환; 기타 단백질 생성가능한 아미노산에 대항한 서열 10의 위치 244에서의 L-글루탐산의 교환; 및 기타 단백질 생성가능한 아미노산 (예: L-세린)에 대항한 서열 10의 위치 245에서의 L-아스파르트산의 교환으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상 아미노산 교환을 포함한다.

매우 특히, 위치 243에서의 L-알라닌 (서열 10 참고)이 서열 22에 나타낸 바와 같이 L-트레오닌으로 교환되었다. 이러한 단백질은 Zwf (A243T) 단백질로서 지칭되기도 하고, 상기 단백질을 암호화하는 대립 유전자는 zwf (A243T)로서 지칭된다 (서열 21 참고).

더욱이, 위치 370에서의 L-아르기닌 (서열 10 참고)이 서열 29에 나타낸 바와 같이 L-메티오닌으로 교환될 수 있다. 이러한 단백질은 Zwf (R370M) 단백질로서 지칭되기도 하고, 상기 단백질을 암호화하는 대립 유전자는 zwf (R370M)로서 지칭된다 (서열 28 참고).

더욱이, 위치 372에서의 L-발린 (서열 10 참고)이 서열 31에 나타낸 바와 같이 L-알라닌으로 교환될 수 있다. 이러한 단백질은 Zwf (V372A) 단백질로서 지칭되기도 하고, 상기 단백질을 암호화하는 대립 유전자는 zwf (V372A)로서 지칭된다 (서열 30 참고).

더욱이, 위치 242에서의 L-메티오닌 (서열 10 참고)이 서열 33에 나타낸 바와 같이 L-류신으로 교환될 수 있다. 이러한 단백질은 Zwf (M242L) 단백질로서 지칭되기도 하고, 상기 단백질을 암호화하는 대립 유전자는 zwf (M242L)로서 지칭된다 (서열 32 참고).

더욱이, 위치 242에서의 L-메티오닌 (서열 10 참고)이 서열 35에 나타낸 바와 같이 L-세린으로 교환될 수 있다. 이러한 단백질은 Zwf (M242S) 단백질로서 지칭되기도 하고, 상기 단백질을 암호화하는 대립 유전자는 zwf (M242S)로서 지칭된다 (서열 34 참고).

더욱이, 위치 245에서의 L-아스파르트산 (서열 10 참고)이 서열 37에 나타낸 바와 같이 L-세린으로 교환될 수 있다. 이러한 단백질은 Zwf (D245S) 단백질로서 지칭되기도 하고, 상기 단백질을 암호화하는 대립 유전자는 zwf (D245S)로서 지칭된다 (서열 36 참고).

본 발명에 따르는 Zwf 단백질은 본원에 기재된 Zwf 단백질 변이체의 효소적 활성은 실질적으로 변화시키지 않은, 하나 이상 아미노산의 추가의 치환, 결실 또는 삽입물을 함유할 수 있다.

단백질 기능에 대해 중립적이거나 거의 중립적 효과를 나타내는 아미노산의 치환물이 당해 분야에서 보존적 아미노산 교환물로서 공지되어 있다. 방향족 아미노산의 경우에는, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 서로 교환시킬 수 있다. 소수성 아미노산의 경우에는, 류신, 이소류신 및 발린을 서로 교환시킬 수 있다. 극성 아미노산의 경우에는, 글루타민 및 아스파라긴을 서로 교환시킬 수 있다. 염기성 아미노산의 경우에는, 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 서로 교환시킬 수 있다. 산성 아미노산의 경우에는, 아스파르트산 및 글루탐산을 서로 교환시킬 수 있다. 히드록실기 함유 아미노산의 경우에는, 세린 및 트레오닌을 서로 교환시킬 수 있다.

예를 들어, 효소적 활성을 억제제 NADPH의 존재 하에 대략 2.5 내지 3.5% 미만 또는 2.5 내지 4.5% 미만 정도 변화시키는 것은 실질적으로 상이하지 않은 것으로 간주할 수 있다. 예를 들어, 미하엘리스 (Michaelis) 상수 (K_M) 또는 최대 속도 (V_max) 또는 기타 결합 상수와 같은 기타 파라미터의 경우에는, 대략 5, 10, 25, 50, 100, 150 또는 200% 미만 정도의 차이 또는 300 또는 400%와 같이 심지어 그 보다 더 큰 차이 역시 실질적으로 상이하지 않은 것으로 간주될 수도 있다.

따라서, Zwf (A243T) 단백질은 적어도, 서열 22의 위치 241 내지 246에서의 아미노산에 상응하는 Thr Met Thr Glu Asp Ile, 바람직하게는 서열 22의 위치 235 내지 250에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 서열 22의 위치 225 내지 260에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열, 및 보다 더 바람직하게는 서열 22의 위치 210 내지 270에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

유사하게, Zwf 단백질 변이체 Zwf (M242L), Zwf (M242S) 및 Zwf (D245)는 적어도, 서열 33, 35 및 37의 위치 237 내지 250에서의 아미노산의 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 33, 35 및 37의 위치 227 내지 260에서의 아미노산의 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 서열 33, 35 및 37의 위치 217 내지 270에서의 아미노산의 아미노산 서열, 및 보다 더 바람직하게는 서열 33, 35 및 37의 위치 202 내지 285에서의 아미노산의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

유사하게, Zwf 단백질 변이체 Zwf (R370M) 및 Zwf (V372A)은 적어도, 서열 29 및 31의 위치 365 내지 377에서의 아미노산의 아미노산 서열, 서열 29 및 31의 위치 355 내지 387에서의 아미노산의 아미노산 서열, 서열 29 및 31의 위치 345 내지 397에서의 아미노산의 아미노산 서열, 및 서열 29 및 31의 위치 325 내지 417에서의 아미노산의 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

더욱이, Zwf 단백질 변이체는 서열 10의 위치 1 내지 10에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열, 서열 10의 위치 1 내지 16에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열, 서열 10의 위치 1 내지 20에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열, 및 서열 10의 위치 1 내지 30에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 N-말단 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

추가로, 결실 및 발현 분석 결과, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 단백질(들)의 30개 N-말단 아미노산에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 각각 결실시키면, 효소적 활성이 상실된다는 사실이 밝혀졌다. 이들 30개 N-말단 아미노산은 예를 들어, 서열 10의 위치 1 내지 30에 상응하거나, 또는 서열 22, 29, 31, 33, 35 또는 37에 상응한다.

용어 단백질 생성가능한 아미노산은 미생물, 식물, 동물 및 인간의 천연 발생적 단백질에서 발견되는 아미노산을 의미한다. 이들 아미노산에는 L-글리신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-이소류신, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-메티오닌, L-프롤린, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, L-아스파라긴, L-글루타민, L-아스파르트산, L-글루탐산, L-아르기닌, L-리신, L-히스티딘 및 L-셀레노시스테인이 포함된다.

위치 243에서의 L-알라닌을 L-트레오닌으로 대체하는 것은, 서열 9의 위치 1264에서의 뉴클레오염기 구아닌을 아데닌으로 대체시킴으로써 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 구아닌 아데닌 전이는 또한, 서열 21의 위치 1034에 나타나 있다. 서열 9의 위치 1264 및 서열 21의 위치 1034는 둘 다, zwf 유전자 및 zwf (A243T) 대립 유전자의 암호화 서열 (이러한 경우에는 출발 코돈 GTG의의 첫 번째 G가 위치 1이다)의 위치 727에 상응한다.

zwf (A243T) 대립 유전자의 내부 절편이 서열 23에 나타나 있다. 이는 서열 21의 위치 898 내지 1653에 상응한다.

이러한 본 발명의 국면에 따르는 Zwf 단백질의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성은 야생형 단백질과 비교해서 특히 NADPH에 의한 억제에 대해 내성이 있거나 덜 감수성이다. 대략 260 μM (μ는 마이크로를 의미한다) NADPH 농도에 노출되면, 잔류 활성은 돌연변이체 단백질을 포함하는 균주에서 부가 NADPH의 부재 하의 활성과 비교해서 30% 또는 35% 이상, 바람직하게는 40%, 45% 또는 50% 이상이다. 대략 400 μM NADPH 농도에 노출되면, 잔류 활성은 부가 NADPH의 부재 하의 활성과 비교해서 20% 이상, 바람직하게는 25% 이상이다.

상기 돌연변이물 또는 대립 유전자를 유도시키기 위한 돌연변이 유발은, 문헌 [참고: the Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981]에 기재된 바와 같은, 예를 들어 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 또는 자외선과 같은 돌연변이 유발원을 사용하여 세균성 세포에 대한 통상적인 돌연변이 유발 방법에 의해 수행할 수 있다. 그 다음, 적당한 돌연변이체를 분리하고, 예를 들어 서열 분석 방법 또는 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성 측정 방법에 의해 확인한다.

따라서, 본 발명은 적어도 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 Zwf 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 코리네형 세균 또는 돌연변이체를 제공한다.

코리네박테륨 글루타미쿰 DM658은 이러한 코리네형 세균에 대한 한 예이다. 이는 돌연변이 유발, 선별 및 스크리닝을 수 차례 주행한 후 수득하였는데, 이는 위치 243에서의 L-알라닌을 L-트레오닌으로 대체시키고 서열 22에 나타낸, 서열 10의 아미노산 서열을 갖는 Zwf 단백질 [Zwf (A243T)]을 암호화하는 zwf 대립 유전자 [zwf (A243T)]를 그의 염색체 내에 함유하고 있다.

돌연변이 유발은 폴리뉴클레오티드에 대한 시험관내 방법, 예를 들어 히드록실아민으로 처리 방법 [참고: Molecular and General Genetics 145, 101 pp. (1978)]; 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드로 처리하는 방법 [참고: T.A. Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993]; 문헌 [참고: the manual by Newton and Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994)]에 기재된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR); 또는 "급속 변화 부위-지시된 돌연변이 유발 키트" [공급처: Stratagene (La Jolla, California, USA)] 또는 당해 분야에 공지된 유사한 방법을 사용하여 문헌 [참고: Strategies 9(3), 3-4 (1996)]에 기재된 방법을 사용함으로써 수행할 수도 있다.

상응하는 대립 유전자 또는 돌연변이체를 서열 분석하고, 이들을 씨. 글루타미쿰의 lysA 유전자의 경우에는, 예를 들어 문헌 [참고: Schwarzer and Puehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))]에 기재된 바와 같거나, 또는 씨. 글루타미쿰의 pyc 유전자의 경우에는 문헌 [참고: Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998))]에 기재된 바와 같이 유전자 대체 방법에 의해 적당한 균주의 염색체 내로 재조합에 의해 도입한다.

따라서, 본 발명은 적어도 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 본 발명에 따르는 Zwf 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 코리네형 세균을 제공한다.

코리네박테륨 글루타미쿰 DSM5715zwf2_A243T는 이러한 균주에 대한 한 예이다. 이는 균주 DM658의 zwf 대립 유전자, 즉 zwf (A243T)의 돌연변이를 그의 염색체 내에 포함하고 있다.

코리네박테륨 글루타미쿰 균주 DM1697_zwfD245S는 이러한 균주에 대한 또 다른 예이다. 이는 시험관내 돌연변이 유발에 의해 수득한 zwf 대립 유전자 zwf (D245S)의 돌연변이를 그의 염색체 내에 포함하고 있다.

상응하는 대립 유전자는 또한, hom-thrB 오페론의 경우에는, 예를 들어 문헌 [참고: Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60(1), 126-132 (1994)]에 기재된 바와 같은 유전자 중복 방법, 또는 ask 유전자의 경우에는 문헌 [참고: Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (1995)]에 기재된 바와 같은 유전자 중복 방법에 의해 적당한 균주의 염색체 내로 도입할 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로, 적어도 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 Zwf 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네형 세균을 제공한다.

코리네박테륨 글루타미쿰 DSM5715::pK18mobsacB_zwf (A243T)는 이러한 균주에 대한 한 예이다. 이는 균주 zwf (A243T) 대립 유전자를 함유하는 분리된 DNA를 그의 염색체 내에 포함하고 있다.

대립 유전자는 또한, 플라스미드, 유도성 프로모터, 또는 당해 분야에 공지된 기타 모든 방법을 사용하여, 상기 언급된 바와 같은 모든 방법에 의해 과발현시킬 수도 있다.

이로써 수득된 균주를 아미노산의 발효적 생산을 위해 사용한다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 zwf 유전자 또는 대립 유전자를 증폭시키는 것 이외에도, 특정한 생합성 경로, 당분해, 보존, 펜토스 포스페이트 경로, 당 흡수 또는 아미노산 외수송의 하나 이상의 효소를 증폭시켜 L-아미노산을 제조하는 것이 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들어 특히 L-트레오닌을 제조하기 위해서는, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시킬 수 있다:

· 호모세린 데히드로게나제를 암호화하는 hom 유전자 [참고: Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)] 또는 "피드백 내성" 호모세린 데히드로게나제를 암호화하는 hom^dr 대립 유전자 [참고: Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)],

· 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제를 암호화하는 gap 유전자 [참고: Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자 [참고: Peters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)],

· 말레이트:퀴논 옥시도-리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자 [참고: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

· 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자 [European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Germany)의 승인 번호 AB023377],

· 6-포스포글루코네이트 데히드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자 [참고: JP-A-9-224662],

· 트레오닌 외수송 단백질을 암호화하는 thrE 유전자 [참고: DE 199 41 478.5; DSM 12840],

· zwa1 유전자 [참고: DE 199 59 328.0; DSM 13115],

· 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자 [참고: DE: 199 41 478.5].

따라서, 예를 들어 특히 L-리신을 제조하기 위해서는, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시킬 수 있다:

· 디히드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자 [참고: EP-B 0 197 335],

· 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자 [참고: Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324],

· 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제를 암호화하는 gap 유전자 [참고: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자 [참고: DE-A-198 31 609],

· 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자 [참고: European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Germany)의 승인 번호 AB023377],

· 리신 외수송 단백질을 암호화하는 lysE 유전자 [참고: DE-A-195 48 222],

· zwa1 유전자 [참고: DE 199 59 328.0; DSM 13115],

· 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자 [참고: DE 199 47 791.4].

내인성 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.

L-아미노산을 동시에 제조하기 위해서는, 본 발명의 zwf 유전자 또는 대립 유전자를 증폭, 특히 과발현시키는 것 이외에도, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 감쇠, 특히 결실시키는 것이 또한 유리할 수 있다:

· 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자 [참고: DE 199 50 409.1; DSM 13047),

· 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자 [참고: US 09/396,478, DSM 12969],

· 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자 [참고: DE 199 51 975.7; DSM 13114],

· zwa2 유전자 [참고: DE: 199 59 327.2; DSM 13113].

이와 관련하여, 용어 "감쇠"는 특정 미생물 중의 하나 이상의 효소 또는 단백질의 세포내 활성 또는 농도를 감소 또는 저해시키는 것을 의미하는데, 이러한 효소 또는 단백질은 예를 들어, 약한 프로모터를 사용하거나, 또는 활성이 낮은 상응하는 효소 또는 단백질을 암호화하거나 상응하는 효소 또는 단백질을 불활성화시키는 유전자 또는 대립 유전자를 사용함으로써, 임의로 이들 조치를 조합함으로써 상응하는 DNA에 의해 암호화된다.

감쇠 조치에 의해, 상응하는 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도가, 야생형 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도, 또는 출발 미생물 중의 효소 또는 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여, 일반적으로 0 내지 75%, 0 내지 50%, 0 내지 25%, 0 내지 10% 또는 0 내지 5% 정도 감소된다.

Zwf 단백질을 증폭, 특히 과발현시키는 것 이외에도, L-아미노산을 제조하기 위해서는 바람직하지 못한 부반응을 제거하는 것이 추가로 바람직할 수 있다 [참고: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라서 제조된 미생물은 L-아미노산 생산을 위해, 배치식 공정 (배치 배양), 공급 배치식 공정 (공급 공정) 또는 반복 공급 배치식 공정 (반복 공급 공정)으로 연속적으로 또는 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 관한 요약이 다음 교과서 [참고: Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 다음 교과서 [참고: Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기재되어 있다.

사용될 배양 배지는 적합한 방식으로 특정한 미생물의 요구 사항을 충족시켜야만 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 설명은 다음 문헌에 포함되어 있다 [참고: Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]. 당 및 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예를 들어 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알코올, 예를 들어 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어 아세트산을 탄소원으로서 사용할 수 있다. 이들 물질을 개별적으로 사용하거나 혼합물로서 사용할 수 있다. 유기 질소 함유 화합물, 예를 들어 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 담금액, 콩가루 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예를 들어 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 질소원으로서 사용할 수 있다.

질소원을 개별적으로 사용하거나 혼합물로서 사용할 수 있다. 인산이수소 칼륨 또는 인산수소 이칼륨, 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 인 공급원으로서 사용할 수 있다. 배양 배지는 성장에 필요한 금속 염, 예를 들어 황산마그네슘 또는 황산철을 추가로 포함해야만 한다. 최종적으로, 상기 언급된 물질 이외에도, 필수 성장 물질, 예를 들어 아미노산 및 비타민을 이용할 수 있다. 적합한 전구체를 배양 배지에 부가할 수도 있다. 언급된 출발 물질을 단일 배치 형태로 배양물에 부가하거나, 또는 배양 동안 적합한 방식으로 공급할 수 있다.

염기성 화합물, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 또는 산성 화합물, 예를 들어 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 이용하여 pH를 제어할 수 있다. 소포제, 예를 들어 지방산 폴리글리콜 에스테르를 이용하여 기포 발생을 제어할 수 있다. 선택적인 작용을 하는 적합한 물질, 예를 들어 항생제를 배지에 가하여 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지시키기 위해, 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물에 도입한다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 최대량의 L-아미노산이 형성될 때까지 배양을 지속한다. 이러한 목표는 10시간 내지 16시간 내에 통상 도달한다.

따라서, 본 발명은 추가로,

a) 쯔비쉔페르멘트 단백질을 암호화하는 적어도 zwf 유전자를 과발현시키는 아미노산 생산 균주를 발효시키는 단계; 및

b) 아미노산을 배지 또는 세균 세포 내에 농축시키는 단계

를 포함하여 [여기서, 쯔비쉔페르멘트 단백질은 적어도, 서열 22의 위치 241 내지 246에서의 아미노산에 상응하는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 10 아미노산 1 내지 10 또는 서열 10 아미노산 2 내지 10의 N-말단 아미노산 서열을 임의로 포함한다], 코리네형 세균을 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로,

a) 적어도 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 Zwf 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아미노산 생산 세균을 발효시키는 단계; 및

b) 아미노산을 배지 또는 세균 세포 내에 농축시키는 단계

를 포함하여, 코리네형 세균을 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로,

a) 적어도 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 Zwf 단백질을 암호화하는 분리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아미노산 생산 세균을 발효시키는 단계; 및

b) 아미노산을 배지 또는 세균 세포 내에 농축시키는 단계

그 다음, 아미노산을 상기 배지 또는 세균 세포로부터 분리할 수 있다.

본 발명의 조치들을 이용하여, 생성물 농도 (용적당 생성물), 생성물 수율 (소모된 탄소원당 형성된 생성물), 생성물 형성 (용적 및 시간당 형성된 생성물), 또는 기타 공정 파라미터 및 이들의 조합 파라미터 측면에서 발효 공정의 성능 또는 세균의 성능을 0.5% 이상, 1% 이상 또는 2% 이상 개선시킬 수 있다.

L-아미노산의 분석은 문헌 [참고: Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기재된 바와 같이, 후속 닌히드린 유도체화를 수반하면서 음이온 교환 크로마토그래피함으로써 수행할 수 있거나, 또는 문헌 [참고: Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)]에 기재된 바와 같이 역상 HPLC함으로써 수행할 수 있다.

다음 미생물들이 순수한 배양물로서 다음 수탁 기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)]에 기탁되었다:

· 에스케리챠 콜라이 K-12 DH5α/pEC-T18mob2는 부다페스트 조약에 따라서 2000년 1월 20일자로 DSM 13244로서 기탁되었다.

· 코리네박테륨 글루타미쿰 DM658은 1993년 1월 27일에 장기간 저장을 위해 DSM 7431로서 기탁되었고; 이러한 기탁은 2002년 10월 17일자로 부다페스트 조약에 따르는 기탁으로 전환시켰다.

· 코리네박테륨 글루타미쿰 DSM5715zwf2_A243T는 부다페스트 조약에 따라서 2002년 10월 11일자로 DSM 15237로서 기탁되었다.

· 코리네박테륨 글루타미쿰 DM1697_zwfD245S는 부다페스트 조약에 따라서 2003년 5월 23일자로 DSM 15632로서 기탁되었다.

도 1은 플라스미드 pEC-T18mob2의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pEC-T18mob2zwf의 지도이다.

도 3은 플라스미드 pAMC1의 지도이다.

도 4는 플라스미드 pMC1의 지도이다.

도 5는 플라스미드 pCR2.1poxBint의 지도이다.

도 6은 플라스미드 pK18mobsacB_zwf (A243T)의 지도이다.

도 7은 플라스미드 pK18mobsacB_zwf의 지도이다.

도 8은 플라스미드 pK18mobsacB_zwf (D245S)의 지도이다.

도 9는 플라스미드 pCRBluntII_AB1CD1의 지도이다.

도 10은 플라스미드 pK18mobsacB_zwfdelta90bp의 지도이다.

도 11은 플라스미드 pCRBluntII_zwfL의 지도이다.

도 12는 플라스미드 pCRBluntII_zwfS의 지도이다.

도 13은 플라스미드 pZ8-1_zwfL의 지도이다.

도 14는 플라스미드 pZ8-1_zwfS의 지도이다.

언급된 염기쌍 수는 재현 가능성 맥락에서 수득한 대략적인 수치이다.

도 1 및 2:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

oriV: 이. 콜라이의 플라스미드-암호화 복제 기점

RP4mob: 플라스미드를 가동시키기 위한 mob 영역

rep: 씨. 글루타미쿰 플라스미드 pGAl로부터의 플라스미드-암호화 복제 기점

per: pGAl로부터의 카피 수를 제어하기 위한 유전자

lacZ-alpha: β-갈락토시다제 유전자의 lacZα 유전자 단편 (N-말단)

lacZalpha': lacZα 유전자 단편의 5'-말단

'lacZalpha: lacZα 유전자 단편의 5'-말단

도 3 및 4:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

Neo r: 네오마이신/카나마이신 내성

ColEl ori: 플라스미드 ColEl의 복제 기점

CMV: 시토메갈로바이러스 프로모터

lacP: 락토스 프로모터

pgi: 포스포글루코스 이소머라제 유전자

lacZ: β-갈락토시다제 유전자의 일부

SV40 3' 스플라이스: 원숭이 바이러스 40의 3' 스플라이스 부위

SV40 polyA: 원숭이 바이러스 40의 폴리아데닐화 부위

fl(-)ori: 필라멘트상 파아지 fl의 복제 기점

SV40 ori: 원숭이 바이러스 40의 복제 기점

kan r: 카나마이신 내성

pgi 삽입물: pgi 유전자의 내부 단편

ori: 플라스미드 pBGS8의 복제 기점

도 5:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

ColEl ori: 플라스미드 ColEl의 복제 기점

lacZ: laczα 유전자 단편의 클로닝 잔존물

f1 ori: 파아지 fl의 복제 기점

KmR: 카나마이신 내성

ApR: 앰피실린 내성

poxBint: poxB 유전자의 내부 단편

도 6:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

RP4mob: 전이를 위한 복제 기점 (oriT)을 수반하는 mob 영역

KanR: 카나마이신 내성 유전자

oriV: 복제 기점 V

zwf (A243T): zwf (A243T) 대립 유전자

sacB: sacB 유전자

도 7 및 8:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

zwf: zwf 유전자

zwf (D245S): zwf (D245S) 대립 유전자

oriV: 복제 기점 V

RP4mob: 전이를 위한 복제 기점 (oriT)을 수반하는 mob 영역

KanR: 카나마이신 내성 유전자

sacB: sacB 유전자

XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위

PstI: 제한 효소 PstI의 절단 부위

도 9 및 10:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

deltazwf90: zwf 대립 유전자의 90 bp를 함유하는 클로닝된 DNA 단편

Kan: 카나마이신 내성 유전자

pUC ori: 복제 기점

sacB: sacB 유전자

RP4mob: 전이를 위한 복제 기점 (oriT)을 수반하는 mob 영역

oriV: 복제 기점 V

XbaI: 제한 효소 XbaI의 절단 부위

도 11 및 12:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

zwfL: zwf 대립 유전자의 클로닝된 DNA 단편

zwfS: zwf 대립 유전자의 90 bp 결실을 함유하는 클로닝된 DNA 단편

Km: 카나마이신 내성 유전자

pUC origin: 복제 기점

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

도 13 및 14:

사용된 약어는 다음 의미를 갖는다:

zwfL: zwf 대립 유전자의 클로닝된 DNA 단편

Km: 카나마이신 내성 유전자

rrnB-종결인자: 전사의 종결

Ptac: 프로모터

rep: 복제 기점

SalI: 제한 효소 SalI의 절단 부위

각종 제한 효소 (예: BamHI, EcoRI 등)에 대한 약어의 의미는 선행 기술로부터 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [참고: Kessler and Hoeltke (Gene 47, 1-153 (1986) or Roberts et al. (Nucleic Acids Research 27, 312-313 (1999)]에 기재되어 있다.

다음 실시예는 본 발명을 추가로 예시할 것이다. 사용된 분자 생물학 기술, 예를 들어 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 처리, 연결, 에스케리챠 콜라이의 표준 형질전환 등이 (달리 언급되지 않는 한) 문헌 [참고: Sambrook et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratories, USA)]에 기재되어 있다.

실시예 1

Zwf 단백질의 발현

1.1 플라스미드 pEC-T18mob2의 제조

이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 선행 기술에 따라서 구축하였다. 이 벡터는 복제 효과기 per을 포함한 플라스미드 pGAl의 복제 영역 rep [참고: US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525- 1532 (1997)], 플라스미드 pAG1의 테트라사이클린 내성-부여 tetA(Z) 유전자 [참고: US-A-5,158,891; the National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA)에 승인 번호 AF121000로 유전자 라이브러리 등록함], 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV [참고: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)], lac 프로모터와 다발성 클로닝 부위 (mcs)를 포함한 lacZα 유전자 단편 [참고: Norrander et al. Gene 26, 101-106 (1983)] 및 플라스미드 RP4의 mob 영역 [참고: Simon et al., (1983) Bio/Technology 1: 784-791]를 함유하고 있다. 구축된 벡터를 이. 콜라이 균주 DH5α [참고: Brown (ed.) Molecular Biology Labfax, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK, 1991]에서 형질전환시켰다. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 5 mg/l 테트라사이클린을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (QIAprep Spin Miniprep Kit; 공급처: Qiagen)의 도움 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 EcoRI 및 HindIII로 제한하고 후속 아가로스 겔 전기영동 (0.8%)함으로써 검사하였다.

이 플라스미드는 pEC-T18mob2로 칭하였고, 이는 도 1에 도시되어 있다. 이는 균주 에스케리챠 콜라이 K-12 균주 DH5αpEC-T18mob2의 형태로 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)]에 DSM 13244로서 기탁되었다.

1.2 플라스미드 pEC-T18mob2zwf의 제조

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 유전자를 먼저, 다음 올리고뉴클레오티드 프라이머를 통하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)함으로써 증폭시켰다:

zwf-정배향 (서열 11):

5' - TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG - 3'

zwf-역배향 (서열 12):

5' - CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG - 3'.

PCR 반응을 다음 조건 하에 더모사이클러 (Thermocycler) (공급처: PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA)에서, 각 경우에 있어 1 μM의 상응하는 올리고뉴클레오티드, 코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 100 나노그램 (ng) 염색체성 DNA, 1/10 용적 10배 반응 완충액 및 2.6 단위의 열-안정한 Taq-/Pwo-DNA 폴리머라제 혼합물 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany로부터의 Expand High Fidelity PCR System) 중에서, 200 μM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)의 존재 하에 30 주기로 수행하였다: 94℃에서 30초, 64℃에서 1분 및 68℃에서 3분.

연속해서, 크기가 약 1.8 kb인 증폭된 단편을 제조업자의 지시에 따라서 슈어클론 (SureClone) 연결용 키트 (공급처: Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)의 도움 하에 벡터 pUC18의 SmaI 절단 부위 내로 연결하였다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr [참고: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]를 완전한 연결 배치로 형질전환시켰다. 50 ㎍/ml 카베니실린을 함유하는 LB-한천 판 상에서 그들의 카베니실린 내성의 보조 하에 형질전환체를 확인하였다. 이러한 형질전환체 중의 7개로부터 플라스미드를 제조하고, 삽입물로서 1.8 kb PCR 단편이 존재하는지를 제한 분석함으로써 검사하였다. 이러한 방식으로 형성된 재조합 플라스미드가 pUC18zwf로서 다음에 지칭된다.

pEC-T18mob2zwf를 구축하기 위해, pUC18zwf를 KpnI 및 SalI로 분해시키고, 생성물을 제조업자의 지시에 따라서 뉴클레오스핀 (NucleoSpin) 추출용 키트 [공급처: Macherey-Nagel (Dueren, Germany)]의 보조 하에 분리시킨 다음, KpnI 및 SalI로 분해시키고 탈인산화시킨 바 있는 벡터 pEC-T18mob2와 연결시켰다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr [참고: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649]를 완전한 연결 배치로 형질전환시켰다. 5 ㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 LB-한천 판 상에서 그들의 테트라사이클린 내성의 보조 하에 형질전환체를 확인하였다. 이러한 형질전환체 중의 12개로부터 플라스미드를 제조하고, 삽입물로서 1.8 kb PCR 단편이 존재하는지를 제한 분석함으로써 검사하였다. 이러한 방식으로 분리된 재조합 플라스미드 중의 하나가 pEC-T18mob2zwf로 칭해진다 (도 2).

실시예 2

증폭된 zwf 유전자를 수반한 아미노산 생산자의 제조

L-리신-함유 균주 코리네박테륨 글루타미쿰 DSM5715은 EP-B-0435132에 기재되어 있고, L-트레오닌 생산 균주 브레비박테륨 플라붐 DSM5399는 EP-B-0385940에 기재되어 있다. 양 균주는 부다페스트 조약에 따라서 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] in Braunschweig (Germany)]에 기탁되었다.

2.1 균주 DSM5715/pEC-T18mob2zwf 및 DSM5399/pEC-T18mob2zwf의 제조

균주 DSM5715 및 DSM5399를, 문헌 [참고: Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]에 기재된 전기천공 방법을 이용하여 플라스미드 pEC-T18mob2zwf로 형질전환시켰다. 형질전환체의 선별은 5 mg/l 테트라사이클린을 보충시킨 바 있는, 18.5 g/1 뇌-심장 침출 배지, 0.5 M 솔비톨, 5 g/1 박토-트립톤 (Bacto-tryptone), 2.5 g/1 박토-효모 추출물, 5 g/1 NaCl 및 18 g/1 박토-한천을 포함하는 LBHIS 한천 상에서 수행하였다. 33℃에서 2일 동안 항온 배양을 수행하였다.

각 경우에 있어 통상적인 방법 [참고: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]에 의해 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 이를 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 KpnI로 절단한 다음, 후속 아가로스 겔 전기영동함으로써 플라스미드를 검사하였다. 이러한 방식으로 수득된 균주는 DSM5715/pEC-T18mob2zwf 및 DSM5399/pEC-T18mob2zwf로 칭해졌다.

2.2 L-트레오닌의 제조

실시예 2.1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5399/pEC-T18mob2zwf를 트레 오닌 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상등액 중의 트레오닌 함량을 결정하였다.

이를 위해, 상기 균주를 먼저, 상응하는 항생제를 수반한 한천 판 [테트라사이클린 (5 mg/1)을 수반한 뇌-심장 한천] 상에서 33℃ 하에 24시간 동안 항온 배양하였다. 이러한 한천 판 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩하였다 (100 ml 원뿔형 플라스크 중의 10 ml 배지). 완전 배지 Cg III을 예비배양을 위한 배지로서 사용하였다.

배지 Cg III

NaCl 2.5 g/1

박토-펩톤 10 g/l

박토-효모 추출물 10 g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 2% (w/v)

pH는 7.4가 되도록 하였다.

테트라사이클린 (5 mg/1)을 이에 가하였다. 예비배양물을 진탕기 상에서 240 rpm으로 33℃ 하에 16시간 동안 항온 배양하였다. 주 배양물을 이러한 예비배양물로부터 시딩하여 주 배양물의 초기 OD (660 nm)이 0.1이 되도록 하였다. 배지 MM을 주 배양에 사용하였다.

배지 MM

CSL (옥수수 담금액) 5 g/1

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 50 g/1

(NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂P0₄ 0.1 g/1

MgS0₄ * 7H₂O 1.0 g/1

CaCl₂ * 2H₂O 10 mg/1

FeS0₄ * 7H₂O 10 mg/l

MnS0₄ * H₂0 5.0 mg/1

바이오틴 (멸균-여과시킴) 0.3 mg/1

티아민 * HC1 (멸균-여과시킴) 0.2 mg/l

L-류신 (멸균-여과시킴) 0.1 g/1

CaC0₃ 25 g/l

수성 암모니아를 이용하여 CSL, MOPS 및 염 용액을 pH 7이 되도록 하고, 오토클레이빙하였다. 그 다음, 멸균성 기질 및 비타민 용액을 가할 뿐만 아니라 CaCO₃을 무수 상태로 오토클레이빙하였다.

조절판이 있는 100 ml 원뿔형 플라스크에서 10 ml 용적으로 배양을 수행하였다. 테트라사이클린 (5 mg/1)을 가하였다. 배양을 33℃ 및 80% 대기 습도 하에 수행하였다.

72시간 후, 바이오멕 (Biomek) 1000 (공급처: Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 660 nm 파장 측정치에서 OD를 결정하였다. 형성된 트레오닌의 양을, 닌히드린 탐지를 수반하는 포스트-칼럼 유도체화 및 이온 교환 크로마토그래피함으로써 아미노산 분석기 [공급처: Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)]를 이용하여 결정하였다.

실험 결과가 표 1에 나타나 있다:

균주	OD (660 nm)	L-트레오닌 (g/l)
DSM5399	12.3	0.74
DSM5399/pEC-T18mob2zwf	10.2	1.0

2.3 L-리신의 제조

실시예 2.1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pEC-T18mob2zwf를 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상등액 중의 리신 함량을 결정하였다.

배지 Cg III

NaCl 2.5 g/1

박토-펩톤 10 g/l

박토-효모 추출물 10 g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 2% (w/v)

pH는 7.4가 되도록 하였다.

배지 MM

CSL (옥수수 담금액) 5 g/1

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 58 g/1

(NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂P0₄ 0.1 g/1

MgS0₄ * 7H₂O 1.0 g/1

CaCl₂ * 2H₂O 10 mg/1

FeS0₄ * 7H₂O 10 mg/l

MnS0₄ * H₂0 5.0 mg/1

바이오틴 (멸균-여과시킴) 0.3 mg/1

티아민 * HC1 (멸균-여과시킴) 0.2 mg/l

L-류신 (멸균-여과시킴) 0.1 g/1

CaC0₃ 25 g/l

72시간 후, 바이오멕 1000 (공급처: Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 660 nm 파장 측정치에서 OD를 결정하였다. 형성된 리신의 양을, 닌히드린 탐지를 수반하는 포스트-칼럼 유도체화 및 이온 교환 크로마토그래피함으로써 아미노산 분석기 [공급처: Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)]를 이용하여 결정하였다.

실험 결과가 표 2에 나타나 있다:

균주	OD (660 nm)	L-리신 HCl (g/l)
DSM5715	10.8	16.0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7.2	17.1

실시예 3

코리네박테륨 글루타미쿰 균주 AS019의 유전자 라이브러리 구축

코리네박테륨 글루타미쿰 균주 AS019의 DNA 라이브러리 [참고: Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)]를 문헌 [참고: O'Donohue (O'Donohue, M. (1997) The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National University of Ireland, Galway]에 기재된 바와 같이, λ Zap 익스프레스 (Express™) 시스템 [참고: Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600]을 이용하여 구축하였다. λ Zap 익스프레스 키트는 공급처 [Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037]로부터 구입하고, 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. AS019-DNA를 제한 효소 Sau3A로 분해시킨 다음, λ Zap 익스프레스™ 암스로 처리하고 탈인산화시킨 BamHI에 연결하였다.

실시예 4

pgi 유전자의 클로닝 및 서열 분석

4.1 클로닝

문헌 [참고: Kupor and Fraenkel, (Journal of Bacteriology 100: 1296-1301 (1969)]에 기재된 바와 같이 pgi 및 pgl 유전자 내의 돌연변이를 수반하는 에스케리챠 콜라이 균주 DF1311를, 실시예 3에 기재된 AS019 λ Zap 익스프레스™ 플라스미드 라이브러리 대략 500 ng으로 형질전환시켰다. 형질전환체에 대한 선별은 카나마이신을 50 mg/l의 농도로 함유하는 M9 최소 배지 [참고: Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, USA] 상에서 수행하고, 37℃에서 48시간 동안 항온 배양하였다. 플라스미드 DNA를 문헌 [참고: Birnboim and Doly (Nucleic Acids Research 7: 1513-1523 (1979)]에 따라서 1개의 형질전환체로부터 분리하고, 이를 pAMCl로 명명하였다 (도 3).

4.2 서열 분석

pAMCl의 클로닝된 삽입물을 서열 분석하기 위해, 착색 형광성 태그로 시차적으로 표지시킨 프라이머를 사용하여 문헌 [참고: Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467 (1977)]의 방법을 적용하였다. 이는 ABI 프리즘 (prism) 310 유전자 분석기 [공급처: Perkin Elmer Applied Biosystems (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, U.S.A)], 및 다음 키트 [ABI prism Big Dye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit] (공급처: Perkin Elmer)를 사용하여 수행하였다.

만능 정배향 및 M13 역배향 프라이머 [공급처: Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, AL1 3AW, UK)]를 사용하여 초기 서열 분석을 수행하였다:

만능 정배향 프라이머: GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C (서열 13)

M13 역배향 프라이머: GGA AAC AGC TAT GAC CAT G (서열 14)

이로써 수득된 서열로부터 연속해서 내부 프라이머를 고안하였는데, 이로써 완전한 pgi 유전자를 추론할 수 있었다. 내부 프라이머의 서열은 다음과 같다:

내부 프라이머 1 (서열 15): GGA AAC AGG GGA GCC GTC

내부 프라이머 2 (서열 16): TGC TGA GAT ACC AGC GGT

이어서, 수득된 서열을, 애플 매킨토시 (Apple Macintosh) 컴퓨터 상에서 DNA 스트라이더 (Strider) 프로그램 [참고: Marck, (1988). Nucleic Acids Research 16: 1829-1836] 버젼 1.0을 시용하여 분석하였다. 이러한 프로그램으로 인해, 제한 부위 활용, 개방 판독 프레임 분석 및 코돈 활용 결정과 같은 분석을 수행할 수 있었다. 이로써 수득된 DNA 서열과 EMBL 및 유전자은행 데이터베이스 중의 DNA 서열 간의 연구 조사는 BLAST 프로그램 [참고: Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402]을 이용하여 달성하였다. 클러스탈 (Clustal) V 및 클러스탈 W 프로그램 [참고: Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244]을 사용하여, DNA 및 단백질 서열을 정렬하였다.

이로써 수득된 서열이 서열 1에 나타나 있다. 수득된 뉴클레오티드 서열에 관한 분석 결과, 1650개 염기 쌍의 개방 판독 프레임이 밝혀졌는데, 이를 pgi 유전자로 명명하였다. 이는 서열 2에 나타낸 550개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

실시예 5

pgi 유전자를 통합 돌연변이 유발시키기 위한 통합 벡터의 제조

pgi 유전자의 내부 절편은, 주형으로서 코리네박테륨 글루타미쿰 AS019 [참고: Heery and Dunican, (1993) Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799]로부터 분리된 게놈성 DNA를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)함으로써 증폭시켰다. 사용된 pgi 프라이머는 다음과 같다:

정배향 프라이머: ATG GAR WCC AAY GGH AA (서열 17)

역배향 프라이머: YTC CAC GCC CCA YTG RTC (서열 18)

R=A+G; Y=C+T; W=A+T; H=A+T+C.

PCR 파라미터는 다음과 같다: 35 주기

94℃에서 1분

47℃에서 1분

72℃에서 30초

1.5 mM MgCl₂

대략 150-200 ng DNA 주형.

이로써 수득된 PCR 생성물을, 숙주로서 균주 이. 콜라이 JM109 [참고: Yanisch-Perron et al., 1985. Gene, 33: 103-119]를 사용하여 시판용 pGEM-T 벡터 [공급처: Promega Corp. (Promega UK, Southampton.)] 내로 클로닝하였다. 이러한 PCR 생성물의 서열이 서열 3에 나타나 있다. 이어서, 클로닝된 삽입물을 EcoRI 단편으로서 절단시키고, EcoRI로 예비처리시킨 플라스미드 pBGS8 [참고: Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)]에 연결하였다. 사용된 제한 효소는 공급처 [Boehringer Mannheim UK Ltd., (Bell Lane, Lewes East Sussex BN71LG, UK.)]로부터 수득하고, 제조업자의 지시에 따라서 사용하였다. 그 다음, 이. 콜라이 JM109를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고, IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드), XGAL (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-갈락토피라노시드) 및 카나마이신을 각각 1 mM, 0.02% 및 50 mg/l로 보충시킨 루리아 (Luria) 한천 상에서 전자형질전환체를 선별하였다.

한천 판을 37℃에서 12시간 동안 항온 배양하였다. 플라스미드 DNA를 1개의 형질전환체로부터 분리하고, EcoRI, BamHI 및 SalI를 이용한 제한 효소 분석에 의해 성상 확인한 다음, 이를 pMC1로 명명하였다 (도 4).

플라스미드 pMC1은 에스케리챠 콜라이 균주 DH5α/pMC1의 형태로 부다페스트 조약에 따라서 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 DSM 12969로서 기탁하였다.

실시예 6

리신 생산자 DSM 5715에서 pgi 유전자의 통합 돌연변이 유발

실시예 5에 언급된 벡터 pMC1을 코리네박테륨 글루타미쿰 DSM 5715에서 문헌 [참고: Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시켰다. 균주 DSM 5715는 AEC-내성 리신 생산자이다. 벡터 pMC1은 DSM 5715에서 독립적으로 복제할 수 없고, 이것이 DSM 5715의 염색체 내로 통합된 경우에만 세포 내에 유지된다. 염색체 내로 통합된 pMC1을 수반한 클론의 선별은 전기천공 배치를, 15 mg/l 카나마이신으로 보충시킨 바 있는 LB 한천 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 상에 도말함으로써 수행하였다.

통합을 탐지하기 위해, 내부 pgi 단편 (실시예 5)을 문헌 [참고: "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" of Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)]의 방법에 의해 Dig 혼성화 키트 [공급처: Boehringer Mannheim]를 이용하여 표지시켰다. 형질전환체의 염색체성 DNA를 문헌 [참고: Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법에 의해 분리하고, 각 경우에 있어 제한 효소 SalI, SacI 및 HindIII로 절단하였다. 이로써 형성된 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리시키고, Dig 혼성화 키트 (공급처: Boehringer)를 이용하여 68℃에서 혼성화하였다. 이러한 방식으로, 플라스미드 pMC1이 균주 DSM 5715의 염색체성 pgi 유전자 내에 삽입되었다는 것이 밝혀졌다. 이 균주는 DSM5715::pMC1로 칭해졌다.

실시예 7

리신 제조에 대한, pgi 유전자를 동시 제거하면서 zwf 유전자를 과발현시킨 효과

7.1 균주 DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf의 제조

실시예 1.2에서 언급한 벡터 pEC-T18mob2zwf를 코리네박테륨 글루타미쿰 DSM 5715::pMC1에서 문헌 [참고: Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시켰다. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 전기천공 배치를, 15 mg/l 카나마이신 및 5 mg/l 테트라사이클린으로 보충시킨 바 있는 LB 한천 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 상에 도말함으로써 수행하였다. 통상적인 방법 [참고: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]에 의해 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 이를 제한 효소 KpnI 및 SalI로 처리한 다음, 후속 아가로스 겔 전기영동함으로써 검사하였다. 이러한 방식으로 수득된 균주는 DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf로 칭해졌다.

7.2 리신의 제조

실시예 7.1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf를 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상등액 중의 리신 함량을 결정하였다.

이를 위해, 상기 균주를 먼저, 상응하는 항생제를 수반한 한천 판 [테트라사이클린 (5 mg/1) 및 카나마이신 (5 mg/l)을 수반한 뇌-심장 한천] 상에서 33℃ 하에 24시간 동안 항온 배양하였다. 비교용 균주 배양물은 항생제에 대한 그들의 내성에 따라서 보충시켰다. 이러한 한천 판 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩하였다 (100 ml 원뿔형 플라스크 중의 10 ml 배지). 완전 배지 Cg III을 예비배양을 위한 배지로서 사용하였다.

배지 Cg III

NaCl 2.5 g/1

박토-펩톤 10 g/l

박토-효모 추출물 10 g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 2% (w/v)

pH는 7.4가 되도록 하였다.

테트라사이클린 (5 mg/1) 및 카나마이신 (5 mg/l)을 이에 가하였다. 예비배양물을 진탕기 상에서 240 rpm으로 33℃ 하에 16시간 동안 항온 배양하였다. 주 배양물을 이러한 예비배양물로부터 시딩하여 주 배양물의 초기 OD (660 nm)이 0.1이 되도록 하였다. 배지 MM을 주 배양에 사용하였다.

배지 MM

CSL (옥수수 담금액) 5 g/1

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 50 g/1

(NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂P0₄ 0.1 g/1

MgS0₄ * 7H₂O 1.0 g/1

CaCl₂ * 2H₂O 10 mg/1

FeS0₄ * 7H₂O 10 mg/l

MnS0₄ * H₂0 5.0 mg/1

바이오틴 (멸균-여과시킴) 0.3 mg/1

티아민 * HC1 (멸균-여과시킴) 0.2 mg/l

L-류신 (멸균-여과시킴) 0.1 g/1

CaC0₃ 25 g/l

조절판이 있는 100 ml 원뿔형 플라스크에서 10 ml 용적으로 배양을 수행하였다. 테트라사이클린 (5 mg/1) 및 카나마이신 (5 mg/l)을 가하였다. 배양을 33℃ 및 80% 대기 습도 하에 수행하였다.

실험 결과가 표 3에 나타나 있다:

균주	OD (660 nm)	L-리신 HCl (g/l)
DSM5715	7.3	14.3
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7.1	14.6
DSM5715::pMC1/pECTmob2zwf	10.4	15.2

실시예 8

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테륨 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체성 DNA를 문헌 [참고: Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179)]에 기재된 바와 같이 분리하고, 제한 효소 Sau3AI (공급처: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Decription Sau3AI, 제품 번호 27-0913-02)로 부분적으로 절단시켰다. 쉬림프 (shrimp) 알칼리성 포스파타제 [공급처: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, 제품 번호 1758250]를 이용하여 DNA 단편을 탈인산화시켰다. 다음 공급처 [Stratagene (La Jolla, USA, Product Description SuperCosl Cosmid Vektor Kit, 제품 번호 251301)]로부터 수득한 코스미드 벡터 SuperCosl [참고: Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 Xbal (공급처: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, 제품 번호 27-0948-02)로 절단시키고, 또한 쉬림프 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시켰다.

이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI (공급처: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, 제품 번호 27-0868-04)로 절단시켰다. 이러한 방식으로 처리시킨 코스미드 DNA를 상기 처리시킨 ATCC13032 DNA와 혼합하고, 배치를 T4 DNA 리가제 (공급처: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, 제품 번호 27-0870-04)로 처리하였다. 그 다음, 연결 혼합물을 기파팩 (Gigapack) II XL 패킹 추출물 (공급처: Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract, 제품 번호 200217)의 보조 하에 파아지에 패킹하였다. 이. 콜라이 균주 NM554 [참고: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575]를 감염시키기 위해, 세포를 10 mM MgS0₄에 흡수시키고, 분취량의 파아지 현탁물과 혼합하였다. 코스미드 라이브러리의 감염 및 역가 측정을 문헌 [참고: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기재된 바와 같이 수행하였는데, 세포를 LB 한천 [참고: Lennox, 1955, Virology, 1: 190] + 100 ㎍/ml 앰피실린 상에서 도말하였다. 37℃에서 밤새 항온 배양한 후, 재조합 개별 클론을 선별하였다.

실시예 9

poxB 유전자의 분리 및 서열 분석

개개 집락의 코스미드 DNA (실시예 7)를 제조업자의 지시에 따라서 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 [제품 번호 27106; 공급처: Qiagen, Hilden, Germany]를 이용하여 분리시키고, 제한 효소 Sau3AI [Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, 제품 번호 27-0913-02]로 부분적으로 절단하였다. 쉬림프 알칼리성 포스파타제 (공급처: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, 제품 번호 1758250)를 사용하여 DNA 단편을 탈인산화시켰다. 겔 전기영동에 의해 분리시킨 후, 크기 범위가 1500 내지 2000 bp인 코스미드 단편을 QiaExii 겔 추출용 키트 [제품 번호 20021; 공급처: Qiagen, Hilden, Germany]를 이용하여 분리시켰다. 다음 공급처 [Invitrogen (Groningen, Holland, Product Description Zero Background Cloning Kit, 제품 번호 K2500-01)]로부터 수득한 서열 분석용 벡터 pZero-1의 DNA를 제한 효소 BamHI (공급처: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, 제품 번호 27-0868-04)로 절단하였다. 이러한 서열 분석용 벡터 pZero-1 내에서의 코스미드 단편의 연결은 문헌 [참고: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기재된 바와 같이 수행하였는데, DNA 혼합물을 T4 리가제 (공급처: Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 항온 배양하였다.

그 다음, 이러한 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR [참고: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649] 내로 전기천공하고 [참고: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7], 50 ㎍/ml 제오신을 수반하는 LB 한천 [참고: Lennox, 1955, Virology, 1: 190] 상에 도말하였다. 재조합 클론의 플라스미드 제조는 바이오로봇 (Biorobot) 9600 (제품 번호 900200; 공급처: Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 수행하였다. 문헌 [참고: Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067)]에 따라서 변형시킨 문헌 [참고: Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467)]의 디데옥시 쇄-중지 방법에 의해 서열 분석을 수행하였다. 다음 키트 ("RRdRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit") [공급처: PE Applied Biosystems (제품 번호 403044, Weiterstadt, Germany)]를 사용하였다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열 분석 반응에 관한 분석은 "ABI 프리즘 377" 서열 분석기 [공급처: PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Germany)]를 이용하여 "로티포레시스 (Rotiphoresis) NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드" 겔 (29:1) (제품 번호 A124.1; 공급처: Roth, Karlsruhe, Germany)에서 수행하였다.

그 다음, 이로써 수득된 미가공 서열 데이터를, 스타덴 (Staden) 프로그램 패키지 [참고: 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231] 버젼 97-0를 이용하여 처리하였다. pZerol 유도체의 개개 서열을 어셈블리하여 연속적인 콘티그 (contig)로 만들었다. XNIP 프로그램 [참고: Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231]을 이용하여 컴퓨터-이용 암호화 영역 분석을 수행하였다. 추가의 분석은 "국립 생물공학 정보 센터" ["National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 비-중복 데이터뱅크에 대항하여, "BLAST 조사 프로그램" [참고: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402]를 이용하여 수행하였다.

이로써 생성된 뉴클레오티드 서열이 서열 4에 나타나 있다. 뉴클레오티드 서열을 분석한 결과, 1737개 염기 쌍의 개방 판독 프레임이 밝혀졌는데, 이를 poxB 유전자로 지칭하였다. 이러한 poxB 유전자는 579개 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다 (서열 5).

실시예 10

poxB 유전자를 통합 돌연변이 유발시키기 위한 통합 벡터의 제조

균주 ATCC 13032로부터, 문헌 [참고: Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법에 의해 염색체성 DNA를 분리하였다. 실시예 8로부터의 씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 poxB 유전자의 서열을 기초로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 위해 다음 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:

poxBint1 (서열 19):

5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'

poxBint2 (서열 20):

5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍 (Biotech) (Ebersberg, Germany)에 의해 합성하고, PCR 반응은 Pwo-폴리머라제 (공급처: Boehringer)를 이용하여 문헌 [참고: Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 폴리머라제 연쇄 반응의 보조 하에, 크기가 대략 0.9 kb인 DNA 단편을 분리하였는데, 이는 poxB 유전자의 내부 단편을 수반하고 있고 서열 6에 나타나 있다.

이와 같이 증폭시킨 DNA 단편을 벡터 pCR2.1-TOPO [참고: Mead at al. (1991) Bio/Technology 9: 657-663]에서 TOPO TA 클로닝 키트 [공급처: Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; 카탈로그 번호 K4500-01)]를 이용하여 연결시켰다. 그 다음, 이. 콜라이 균주 DH5α를, 연결 배치 [참고: Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]를 이용하여 전기천공시켰다. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 25 mg/l 카나마이신을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (공급처: Qiagen)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 EcoRI로 제한하고 후속 아가로스 겔 전기영동 (0.8%)함으로써 검사하였다. 이 플라스미드는 pCR2.1poxBint로 칭해졌다 (도 5).

플라스미드 pCR2.1poxBint는 균주 에스케리챠 콜라이 DH5α/pCR2.1poxBint의 형태로 부다페스트 조약에 따라서 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)]에 DSM 13114로서 기탁되었다.

실시예 11

리신 생산자 DSM 5715에서 poxB 유전자의 통합 돌연변이 유발

실시예 10에 언급된 벡터 pCR2.1poxBint를 코리네박테륨 글루타미쿰 DSM 5715에서 문헌 [참고: Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347 (1994)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시켰다. 균주 DSM 5715는 AEC-내성 리신 생산자이다. 벡터 pCR2.1poxBint은 DSM 5715에서 독립적으로 복제할 수 없고, 이것이 DSM 5715의 염색체 내로 통합된 경우에만 세포 내에 유지된다. 염색체 내로 통합된 pCR2.1poxBint을 수반한 클론의 선별은 전기천공 배치를, 15 mg/l 카나마이신으로 보충시킨 바 있는 LB 한천 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 상에 도말함으로써 수행하였다. 통합을 탐지하기 위해, poxBint 단편을 문헌 [참고: "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" of Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993)]의 방법에 의해 Dig 혼성화 키트 [공급처: Boehringer를 이용하여 표지시켰다.

잠재적 형질전환체의 염색체성 DNA를 문헌 [참고: Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]의 방법에 의해 분리하고, 각 경우에 있어 제한 효소 SalI, SacI 및 HindIII로 절단하였다. 이로써 형성된 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리시키고, Dig 혼성화 키트 (공급처: Boehringer)를 이용하여 68℃에서 혼성화하였다. 실시예 9에서 언급된 플라스미드 pCR2.1poxBint가 염색체성 poxB 유전자 내의 DSM5715의 염색체 내로 삽입되었다. 이 균주는 DSM5715::pCR2.1poxBint로 칭해졌다.

실시예 12

리신 제조에 대한, poxB 유전자를 동시 제거하면서 zwf 유전자를 과발현시킨 효과

12.1 균주 DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf의 제조

균주 DSM5715::pCR2.1poxBint를, 문헌 [참고: Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]에 기재된 전기천공 방법을 이용하여 플라스미드 pEC-T18mob2zwf로 형질전환시켰다. 형질전환체의 선별은 5 mg/l 테트라사이클린 및 25 mg/l 카나마이신을 보충시킨 바 있는, 18.5 g/1 뇌-심장 침출 배지, 0.5 M 솔비톨, 5 g/1 박토-트립톤, 2.5 g/1 박토-효모 추출물, 5 g/1 NaCl 및 18 g/1 박토-한천을 포함하는 LBHIS 한천 상에서 수행하였다. 33℃에서 2일 동안 항온 배양을 수행하였다.

각 경우에 있어 통상적인 방법 [참고: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]에 의해 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 이를 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 KpnI로 절단한 다음, 후속 아가로스 겔 전기영동함으로써 플라스미드를 검사하였다. 이러한 방식으로 수득된 균주는 DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf로 칭해졌다.

12.2 L-리신의 제조

실시예 12.1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf를 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상등액 중의 리신 함량을 결정하였다.

이를 위해, 상기 균주를 먼저, 상응하는 항생제를 수반한 한천 판 [테트라사이클린 (5 mg/1) 및 카나마이신 (25 mg/l)을 수반한 뇌-심장 한천] 상에서 33℃ 하에 24시간 동안 항온 배양하였다. 비교용 균주는 항생제에 대한 그들의 내성에 따라서 보충시켰다. 이러한 한천 판 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩하였다 (100 ml 원뿔형 플라스크 중의 10 ml 배지). 완전 배지 Cg III을 예비배양을 위한 배지로서 사용하였다.

배지 Cg III

NaCl 2.5 g/1

박토-펩톤 10 g/l

박토-효모 추출물 10 g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 2% (w/v)

pH는 7.4가 되도록 하였다.

테트라사이클린 (5 mg/1) 및 카나마이신 (25 mg/l)을 이에 가하였다. 예비배양물을 진탕기 상에서 240 rpm으로 33℃ 하에 16시간 동안 항온 배양하였다. 주 배양물을 이러한 예비배양물로부터 시딩하여 주 배양물의 초기 OD (660 nm)이 0.1이 되도록 하였다. 배지 MM을 주 배양에 사용하였다.

배지 MM

CSL (옥수수 담금액) 5 g/1

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 58 g/1

(NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂P0₄ 0.1 g/1

MgS0₄ * 7H₂O 1.0 g/1

CaCl₂ * 2H₂O 10 mg/1

FeS0₄ * 7H₂O 10 mg/l

MnS0₄ * H₂0 5.0 mg/1

바이오틴 (멸균-여과시킴) 0.3 mg/1

티아민 * HC1 (멸균-여과시킴) 0.2 mg/l

L-류신 (멸균-여과시킴) 0.1 g/1

CaC0₃ 25 g/l

조절판이 있는 100 ml 원뿔형 플라스크에서 10 ml 용적으로 배양을 수행하였다. 테트라사이클린 (5 mg/1) 및 카나마이신 (25 mg/l)을 가하였다. 배양을 33℃ 및 80% 대기 습도 하에 수행하였다.

실험 결과가 표 4에 나타나 있다:

균주	OD (660 nm)	L-리신 HCl (g/l)
DSM5715	10.8	16.0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	8.3	17.1
DSM5715::pCR2.1poxBint	7.1	16.7
DSM5715::pCR2.1poxBint/ pEC-Tmob2zwf	7.8	17.7

실시예 13

zwf 대립 유전자 zwf (A243T)

분리 및 서열 분석

다중의 비-지시된 돌연변이 유발, 돌연변이체 선별 및 씨. 글루타미쿰 ATCC13032으로부터의 스크리닝에 의해, 코리네박테륨 글루타미쿰 균주 DM658을 제조하였다. 이 균주는 L-리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 (AEC)에 대항하여 내성이 있고, L-리신, L-리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 (AEC) 및 L-트레오닌의 혼합물에 무감작한 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 갖는다. 균주 DM658은 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell)]에 DSM7431로서 기탁되었다.

이러한 균주 DM658로부터, 통상적인 방법 [참고: Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 의해 염색체성 DNA를 분리하였다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)의 보조 하에, zwf 유전자 또는 대립 유전자를 수반하는 DNA 박편을 증폭시켰다. 씨. 글루타미쿰의 zwf 유전자의 서열을 기초로 하여, PCR을 위해 실시예 1.2로부터의 다음 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:

zwf-정배향 (서열 11):

5' - TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG - 3'

zwf-역배향 (서열 12):

5' - CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG - 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍 (Ebersberg, Germany)에 의해 합성하였고, PCR 반응은 문헌 [참고: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 이들 프라이머는 zwf 대립 유전자를 수반하는, 길이가 대략 1.85 kb인 DNA 박편의 증폭을 허용해주었다.

이와 같이 증폭된, 균주 DM658의 zwf 대립 유전자를 수반하고 길이가 대략 1.85 kb인 DNA 단편은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동함으로써 확인하고, 겔로부터 분리시킨 다음, 통상적인 방법에 의해 정제하였다 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden, Germany).

증폭된 DNA 단편 또는 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열은 MWG 바이오텍 (Ebersberg, Germany)에 의해 서열 분석함으로써 결정하였다. 이러한 PCR 생성물의 서열이 서열 21에 나타나 있다. 페이턴트인 (Patentin) 프로그램의 보조 하에 생성된 쯔비쉔페르멘트 단백질 (Zwf 단백질)의 아미노산 서열이 서열 22에 나타나 있다.

균주 DM658의 zwf 대립 유전자의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열은 위치 727에 염기 아데닌을 함유한다. zwf 대립 유전자의 암호화 영역 내의 뉴클레오티드 서열의 위치 727은 서열 21에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 위치 1034에 상응한다.

야생형 유전자의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열의 위치 727에서는, 뉴클레오티드가 염기 구아닌이다. 야생형 유전자의 암호화 영역 내의 뉴클레오티드 서열의 위치 727은 서열 9 중의 위치 1264에 상응한다. 균주 DM658의 쯔비쉔페르멘트 단백질 (Zwf (A243T))의 아미노산 서열은 위치 243에 아미노산 트레오닌을 함유하고 있다 (서열 22). 야생형 단백질의 상응하는 위치에는 아미노산 알라닌이 존재한다 (서열 10). 따라서, 이러한 대립 유전자는 zwf (A243T)으로서 지칭된다.

서열 23은 구아닌 아데닌 전이를 포함하는 zwf (A243T) 대립 유전자의 암호화 서열의 내부 절편을 나타낸다 (서열 23의 위치 137 참고).

실시예 14

zwf 대립 유전자 zwf (A243T)의 전이

14.1 zwf (A243T) 대립 유전자를 수반하는 DNA 단편의 분리

균주 DM658로부터, 통상적인 방법 [참고: Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 의해 염색체성 DNA를 분리하였다. 야생형 균주 내의 위치 727에 함유된 염기 구아닌 대신 암호화 영역 (CDS)의 위치 727에 염기 아데닌을 함유하고 있는 zwf (A243T) 대립 유전자를 수반하는 DNA 박편을, 폴리머자레 연쇄 반응의 보조 하에 증폭시켰다. 씨. 글루타미쿰의 zwf 유전자의 서열을 기초로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 위해 다음 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:

zwf_XL-Al (서열 24):

5' ga tct aga-agc tcg cct gaa gta gaa tc 3'

zwf_XL-El (서열 25):

5' ga tct aga-gat tca cgc agt cga gtt ag 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍 (Ebersberg, Germany)에 의해 합성하였고, PCR 반응은 문헌 [참고: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 이들 프라이머는 zwf (A243T) 대립 유전자를 수반하는 (서열 26), 길이가 대략 1.75 kb인 DNA 박편의 증폭을 허용해주었다. 이들 프라이머는 더욱이, 제한 엔도뉴클레아제 XbaI의 절단 부위에 대한 서열을 함유하고 있는데, 이는 상기 나타낸 뉴클레오티드 서열에서 밑줄쳐져 있다.

zwf (A243T) 대립 유전자를 수반하는, 길이가 대략 1.75 kb인 상기 증폭된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동함으로써 확인한 다음, 이러한 겔로부터 분리하고, 통상적인 방법으로 정제하였다 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

14.2 교환 벡터의 구축

zwf (A243T) 대립 유전자를 함유하는 대략 1.75 kb 길이의 XbaI DNA 단편을, 문헌 [참고: Schaefer et al. (Gene, 14, 69-73 (1994)]에 기재된 바와 같은 sacB 시스템을 사용하여 대체 돌연변이 유발을 통하여 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715의 염색체 내로 혼입하였다. 이러한 시스템은 상동 재조합에 의해 발생하는 대립 유전자 교환물의 제조 및 선별을 허용해 주었다.

가동 가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB를 제한 효소 XbaI로 분해시키고, 알칼리성 포스파타제 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 말단부를 탈인산화시켰다. 이러한 방식으로 제조된 벡터를, 크기가 대략 1.75 kb인 zwf (A243T) 단편과 혼합하고, 혼합물을 T4 DNA 리가제 (공급처: Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리하였다.

이어서, 이. 콜라이 균주 S17-1 [참고: Simon et al., Bio/Technologie 1: 784-791, 1993]을 연결 배치로 형질전환시켰다 [참고: Hanahan, In. DNA cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 25 mg/l 카나마이신을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989].

퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (공급처: Qiagen)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 효소 PstI로 제한 절단하고 후속 아가로스 겔 전기영동함으로써 검사하였다. 이 플라스미드는 pK18mobsacBzwf (A243T)로 칭해지고, 도 6에 도시되었다.

14.3 대립 유전자의 전이

실시예 14.2에 언급된 벡터 pK18mobsacB_zwf (A243T)를 문헌 [참고: Schaefer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)]의 프로토콜에 의해 접합시킴으로써 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715 내로 전이시켰다. 이 벡터는 DSM 5715에서 독립적으로 복제할 수 없고, 이것이 재조합 사건의 결과로서 DSM 5715의 염색체 내로 통합된 경우에만 세포 내에 유지된다. 피전달접합 균주 (transconjugant), 즉 통합된 pK18mobsacB_zwf (A243T)를 수반하는 클론에 대한 선별은 접합 배치를, 15 mg/l 카나마이신 및 50 mg/l 날리딕스산으로 보충시킨 바 있는 LB 한천 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989] 상에 도말함으로써 수행하였다. 카나마이신-내성 피전달접합 균주를, 25 mg/l 카나마이신을 함유하는 LB 한천 판 상에 도말하고, 33℃에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 카나마이신-내성 피전달접합 균주는 DSM5715::pK18mobsacB_zwf (A243T)로 칭해졌다. 플라스미드 벡터 pK18mobsacB_zwf (A243T)를 균주 DSM5715 내에 통합한 결과로서 수득한 균주, 즉 DSM5715::pK18mobsacB_zwf (A243T)는 zwf 야생형 유전자와 zwf (A243T) 대립 유전자를 함유하고 있다.

제2 재조합 사건의 결과로서 플라스미드의 절제가 수행된 돌연변이체를 선별하기 위해, 균주 DSM5715::pK18mobsacB_zwf (A243T)의 세포를 비선택적으로 LB 액체 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 10% 슈크로스를 수반한 LB 한천 상에 도말하고 30시간 동안 항온 배양하였다.

플라스미드 pK18mobsacB_zwf (A243T)는 출발 플라스미드 pK18mobsacB 처럼, 카나마이신 내성 유전자 이외에도 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)로부터의 레반 슈크라제 (levan sucrase)를 암호화하는 sacB 유전자의 카피를 함유하였다. 슈크라제에 의해 유도될 수 있는 발현으로 인해, 씨. 글루타미쿰에 대해 독성인 생성물 레반 합성을 촉매하는 레반 슈크라제가 형성된다. 따라서, 제2 재조합 사건의 결과로서 통합 플라스미드 pK18mobsacB_zwf (A243T)를 절제시킨 클론 만이 슈크로스 함유 LB 한천 상에서 성장한다. 돌연변이 부위와 관련한 제2 재조합 사건 위치에 따라서, 대립 유전자 교환 (즉, 돌연변이물의 혼입)이 일어나거나 또는 본래 카피 (즉, 야생형 유전자)가 숙주 염색체 내에 여전히 남아 있다.

표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 알아보기 위해 대략 40 내지 50개 클론을 시험하였다. 표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 나타내는 4개 집락에서, zwf (A243T) 돌연변이물을 관통하는 zwf 유전자의 일정 영역을, 서열 분석용 프라이머 zf_l (서열 27) (제조사: GATC Biotech AG, Konstanz, Germany)로부터 출발하여 서열 분석하여, zwf (A243T) 대립 유전자의 돌연변이가 염색체에 존재한다는 것을 입증하였다. 프라이머 zf_l의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

zf_l (서열 27):

5' ggc tta cta cct gtc cat tc 3'

zwf 유전자의 암호화 영역 (CDS)의 위치 727에 염기 아데닌을 함유하므로 그의 염색체에 zwf (A243T) 대립 유전자를 갖는 클론을 이러한 방식으로 확인하였다. 이 클론은 균주 DSM5715zwf2_A243T로 칭해졌다.

균주 DSM5715zwf2_A243T는 부다페스트 조약 하에 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)]에 DSM15237으로 기탁되었다.

실시예 15

글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 성상 확인 및 결정

15.1 균주 DM658의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 결정

zwf 대립 유전자에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 효소 활성을 성상 확인하기 위해, zwf (A243T) 균주 DM658을 LB 배지 (공급처: Merck KG, Darmstadt, Germany)에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 조절판이 있는 250 ml 원뿔형 플라스크에서 25 ml 용적으로, 진탕기 상에서 200 rmp 하에 33℃에서 예비배양을 수행하였다. 비교를 위해 야생형 균주 ATCC13032를 나란히 항온 배양하였다. 원심분리시켜 바이오매스를 수집하고, pH 7.8의 트리스-HC1 (100 mM) 완충액에서 후속 세척하였다. 이 세포를 리보라이저 (Ribolyser) 시스템 (공급처: Hybaid AG, Heidelberg, Germany)을 사용함으로써 가용화시켰다. 이러한 방법에 의해, 상기 언급된 세포를 함유하는 0.6 g의 트리스-HC1 (100 mM) /NaCl 완충액 (520 mM) (pH 7.8) 용액과 1.6 g 유리 비드 (직경 0.2 ㎛)를 사용함으로써 상기 세포를 기계적으로 가용화시켰다. 원심분리시킨 후, 상등액을 분리하고 조 추출물로서 사용하였다. 비색 BCA 방법 (공급처: Pierce, Rockford, IL, USA, 주문 번호 23235ZZ)을 사용하여 총 단백질 농도를 결정하기 위해 분취량의 상등액을 사용하였다. 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 결정하기 위해 또 다른 분취량을 사용하였다.

글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (EC 1.1.1.49)는 다음 반응을 촉매한다:

글루코스-6-포스페이트 + NADP⁺ ⇒

6-포스포글루코노-δ-락톤 + NADPH

글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 결정하기 위한 검정 시스템은 100 mM 트리스-HCl (pH 7.8), 10 mM MgCl₂ 및 260 μM NADP⁺를 함유하고 있다. 글루코스-6-포스페이트를 부가함으로써 반응을 개시하여 최종 농도 7 mM의 글루코스-6-포스페이트를 수득하였다. 250℃ 하에 히타치 (Hitachi) U3200 분광광도계 (공급처: Nissei Sangyo, Duesseldorf, Germany)를 이용하여 340 nm에서 NADPH의 흡광도를 모니터링하였다.

용적(측정) 효소 활성 (단위/ml)을 계산하기 위해, 다음 식을 사용하였다:

분당 340 nm에서 NADPH의 흡광도 변화

____________________________________________

6.22* 검정을 위해 사용된 조 추출물의 용적

특이 효소 활성 (단위/mg; mU = 밀리단위/mg)을 계산하기 위해, 총 단백질 효소 활성을 조 추출물의 단백질 농도로 나누었다.

NADPH의 존재 하에서의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 측정은 100 mM 트리스-HC1 (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 260 μM NADP⁺ 및 260 μM NADPH를 함유하는 검정 시스템에서 수행하였다. 글루코스-6-포스페이트를 부가함으로써 반응을 개시하여 최종 농도 7 mM을 수득하였다. NADPH의 존재 하에서의 효소 활성 계산은 앞서 기재된 바와 동일한 방식으로 수행하였다.

이러한 실험 결과가 표 5에 나타나 있다:

균주	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제
균주	NADPH의 부재 하에서의 활성 (mU/mg 단백질)	NADPH의 존재 하에서의 활성 (mU/mg 단백질)	잔류 활성 (%)
ATCC13032	80	14	17.5
DM658	130	84	64.6

15.2 균주 DSM5715zwf2_A243T의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 결정

균주 DSM5715zwf2_A243T 내에 함유된 zwf 대립 유전자 zwf (A243T)에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 효소 활성을 결정하기 위해, 상기 균주를 LB 배지 (공급처: Merck KG, Darmstadt, Germany)에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 조절판이 있는 250 ml 원뿔형 플라스크에서 25 ml 용적으로, 진탕기 상에서 200 rmp 하에 33℃에서 예비배양을 수행하였다. 비교를 위해 야생형 zwf 유전자를 갖는 모 균주 DSM5715를 나란히 항온 배양하였다. 실시예 15.1에 기재된 바와 같이, 바이오매스의 제조를 수행하였다.

그의 반응 최종 생성물인 NADPH의 존재 하에서의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 측정은 100 mM 트리스-HC1 (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 260 μM NADP⁺, 7 mM 글루코스-6-포스페이트 및 260 μM NADPH를 함유하는 검정 시스템에서 수행하였다. NADPH의 존재 하에서의 효소 활성 계산은 앞서 기재된 바와 동일한 방식으로 수행하였다.

이러한 실험 결과가 표 6에 나타나 있다:

균주	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제
균주	NADPH의 부재 하에서의 활성 (mU/mg 단백질)	NADPH의 존재 하에서의 활성 (mU/mg 단백질)	잔류 활성 (%)
DSM5715	86	13	15
DSM5715zwf2_A243T	64	18	28

실시예 16

L-리신의 제조

실시예 14에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715 및 DSM5715zwf2_A243T를 리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상등액 중의 리신 함량을 결정하였다.

이를 위해, 상기 균주를 먼저, 한천 판 상에서 33℃ 하에 24시간 동안 항온 배양하였다. 이러한 한천 판 배양물로부터 출발하여, 각 경우에 있어 예비배양물을 시딩하였다 (100 ml 원뿔형 플라스크 중의 10 ml 배지). 배지 MM을 예비배양물에 대한 배지로서 사용하였다. 예비배양물을 진탕기 상에서 240 rpm으로 33℃ 하에 16시간 동안 항온 배양하였다. 각 경우에 있어, 주 배양물을 이러한 예비배양물로부터 시딩하여 주 배양물의 초기 OD (660 nm)이 0.1이 되도록 하였다. 배지 MM을 또한, 주 배양에 사용하였다.

배지 MM

CSL 5 g/1

MOPS 20g/1

글루코스 (개별적으로 오토클레이빙됨) 50 g/1

염:

(NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂P0₄ 0.1 g/1

MgS0₄ * 7H₂O 1.0 g/1

CaCl₂ * 2H₂O 10 mg/1

FeS0₄ * 7H₂O 10 mg/l

MnS0₄ * H₂0 5.0 mg/1

바이오틴 (멸균-여과시킴) 0.3 mg/1

티아민 * HC1 (멸균-여과시킴) 0.2 mg/l

L-류신 (멸균-여과시킴) 0.1 g/1

CaC0₃ 25 g/l

수성 암모니아를 이용하여 CSL (옥수수 담금액), MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 및 염 용액을 pH 7이 되도록 하고, 오토클레이빙하였다. 그 다음, 멸균성 기질 및 비타민 용액 뿐만 아니라 무수 상태로 오토클레이브된 CaCO₃을 가하였다.

조절판이 있는 100 ml 원뿔형 플라스크에서 10 ml 용적으로, 33℃ 및 80% 대기 습도 하에 배양을 수행하였다.

실험 결과가 표 7에 나타나 있다:

균주	OD (660 nm)	리신 HCl (g/l)
DSM5715	8.6	15.3
DSM5715zwf2_A243T	9.0	16.2

실시예 17

균주 DM1697의 zwf 야생형 유전자를 zwf (D245S) 대립 유전자로 대체시킴

17.1 zwf 유전자를 수반하는 DNA 단편의 분리

코리네박테륨 글루타미쿰 균주 DM1697는 씨. 글루타미쿰 ATCC21527로부터 방향이 없는 (non-directed) 돌연변이 유발, 선별 및 돌연변이체 용출을 여러 번 수행함으로써 생성시켰다. ATCC21527은 L-류신 및 L-호모세린에 대한 영양요구 균주이다. 이와는 달리 균주 DM1697은 L-류신 및 L-호모세린에 대한 원영양체이고, 리신 유사체 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대한 내성이 있으며, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인과 트레오닌의 혼합물 (각 경우에 있어 25 mM)에 의해 억제에 대해 무감작한 피드백-내성 아스파르테이트 키나제를 갖는다.

균주 DM1697로 부터, 통상적인 방법 [참고: Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 의해 염색체성 DNA를 분리하였다. zwf 유전자를 수반하는 DNA 박편을 폴리머라제 연쇄 반응의 보조 하에 증폭시켰다. 실시예 1로부터의 씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 zwf 유전자의 서열을 기초로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응을 위해 다음 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:

zwf_XL-Al (서열 24):

5' ga tctaga agc tcg cct gaa gta gaa tc 3'

zwf_XL-El (서열 25):

5' ga tctaga gat tca cgc agt cga gtt ag 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍 (Ebersberg, Germany)에 의해 합성하였고, PCR 반응은 문헌 [참고: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다. 이들 프라이머는 zwf 유전자를 수반하는 (서열 38), 길이가 대략 1.75 kb인 DNA 박편의 증폭을 허용해주었다. 이들 프라이머는 더욱이, 제한 엔도뉴클레아제 XbaI의 절단 부위에 대한 서열을 함유하고 있는데, 이는 상기 나타낸 뉴클레오티드 서열에서 밑줄쳐져 있다.

zwf 유전자를 수반하는, 길이가 대략 1.75 kb인 상기 증폭된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 XbaI로 절단하고, 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동함으로써 확인한 다음, 이러한 겔로부터 분리하고, 통상적인 방법으로 정제하였다 (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

17.2 교환 벡터 pK18mobsacB_zwf의 구축

가동 가능한 클로닝 벡터 pK18mobsacB를 제한 효소 XbaI로 분해시키고, 알칼리성 포스파타제 (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 말단부를 탈인산화시켰다. 이러한 방식으로 제조된 벡터를, 크기가 대략 1.75 kb인 zwf 단편과 혼합하고, 혼합물을 T4 DNA 리가제 (공급처: Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리하였다.

이어서, 이. 콜라이 균주 DH5α [참고: Brown (ed.) Molecular Biology Labfax, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK, 1991]을 연결용 배치로 형질전환시켰다 [참고: Hanahan, In. DNA cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 50 mg/l 카나마이신을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989].

퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트 (공급처: Qiagen)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 효소 XbaI로 제한 절단하고 후속 아가로스 겔 전기영동함으로써 검사하였다. 이 플라스미드는 pK18mobsacB_zwf로 칭해지고, 도 7에 도시되었다.

17.3 야생형 zwf 유전자의 부위-특이적 돌연변이를 통한 zwf (D245S) 대립 유전자의 구축

퀵체인지 (QuikChange) 부위-지시된 돌연변이 유발용 키트 (공급처: Stratagene, La Jolla, USA)를 이용하여 부위-지시된 돌연변이 유발을 수행하였다. 3개의 점 돌연변이 (치환)를 서열 38에 나타낸 zwf 야생형 유전자의 뉴클레오티드 서열 내에 도입하였다. 뉴클레오티드 서열의 위치 861에서 구아닌이 티민으로 치환되었고, 위치 862에서 아데닌이 시토신으로 치환되었으며, 위치 863에서 티민이 아데닌으로 치환되었다. 이러한 방식으로 창출된 뉴클레오티드 서열이 서열 39에 나타나 있고, 이는 그의 아미노산 서열의 위치 245에서 아스파르테이트 대신 세린을 갖는 변이체 Zwf 단백질을 암호화한다.

대립 유전자는 zwf (D245S)로 불리운다. 기재된 돌연변이물을 생성시키기 위해, 선형 증폭을 위한 다음 프라이머 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:

DM_D245Sa (서열 40):

5' AGATCACCATGGCTGAA (TCA) ATTGGCTTGGGTGGAC 3'

DM_D245Sb (서열 41):

5' GCACGTCCACCCAAGCCAAT (TGA) TTCAGCCATGGTG 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍에 의해 합성하였다. zwf 유전자로부터 유래된 아미노산 서열의 위치 245에서 아스파르테이트를 대체시켜야 하는 세린에 대한 코돈은 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 괄호로 표시하였다. Pfu 터보 (Turbo) DNA 폴리머라제를 통한 선형 증폭을 위해, 이러한 플라스미드 가닥에 대해 각각 상보적인 2개의 프라이머를 수반한, 실시예 17.2에 기재된 플라스미드 pK18mobsacB_zwf를 이용하였다. 이와 같이 프리이머를 신장시킴으로써, 깨진 환상 가닥을 갖는 돌연변이된 플라스미드가 형성되었다. 선형 증폭 생성물을 DpnI (이러한 엔도뉴클레아제는 메틸화 및 반-메틸화 주형 DNA를 특이적으로 절단시킨다)로 처리하였다. 새로이 합성된, 깨지고 돌연변이된 벡터 DNA를 이. 콜라이 균주 XL1 Blue로 형질전환시켰다 [참고: Bullock, Fernandez and Short, BioTechniques (5) 376-379 (1987)]. 형질전환시킨 후, XL1 Blue 세포는 돌연변이된 플라스미드 내의 틈 (nick)을 복구해준다. 형질전환체의 선별은 카나마이신 50 mg/l을 갖는 LB 배지 상에서 수행하였다. 이로써 수득된 플라스미드는, DNA를 분리한 후 제한 절단을 통하여 검사하고, 전기영동에 의해 확인하였다. 돌연변이된 DNA 단편의 DNA 서열은 서열 분석함으로써 검사하였다. PCR 생성물의 서열은 서열 39에 나타낸 뉴클레오티드 서열에 상응하였다. 이로써 생성된 플라스미드는 pK18mobsacB_zwf (D245S)로 칭해졌다. 이 플라스미드의 지도가 도 8에 도시되어 있다.

17.4 균주 DM1697의 zwf 야생형 유전자를 zwf (D245S) 대립 유전자로 대체시킴

실시예 17.3에 기재된 플라스미드 pK18mobsacB_zwf (D245S)를, 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 접합에 의해 씨. 글루타미쿰 DM1697 내로 전이시켰다. 선별은 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 씨. 글루타미쿰 DM1697의 염색체 내에서의 표적화 재조합 사건에 대해 이루어졌다. 플라스미드의 절제 동안 제2의 재조합 사건의 위치에 따라서, 돌연변이를 함유하는 zwf 대립 유전자는 zwf 유전자 자리 (활동 위치)에서 염색체 내에 발현되거나, 또는 숙주 본래의 zwf 유전자 자리가 여전히 존재하였다.

표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 알아보기 위해, 대략 40 내지 50개 집락을 시험하였다. 표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 나타내는 6개 집락에서, zwf (D245S) 돌연변이물을 관통하는 zwf 유전자의 일정 영역을, 서열 분석용 프라이머 zf_2 (서열 42) (제조사: GATC Biotech AG, Konstanz, Germany)로부터 출발하여 서열 분석하여, zwf (D245S) 대립 유전자의 돌연변이가 염색체에 존재한다는 것을 입증하였다. 프라이머 zf_2의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:

zf_2 (서열 42):

5' TTC TGT GTT CCG CAT CGA CC 3'

zwf 유전자의 암호화 영역 (CDS)의 위치 733, 734 및 735 각각에 염기 티민, 시토신 및 아데닌을 함유하므로 그의 염색체에 zwf (D245S) 대립 유전자 (서열 36)를 갖는 클론을 이러한 방식으로 확인하였다. zwf 대립 유전자의 암호화 영역의 뉴클레오티드 서열의 위치 733, 734 및 735는 서열 39 내의 위치 861, 862 및 863에 각각 상응하였다. 이 클론은 균주 DM1697_zwf (D245S)로 칭해졌다.

균주 DM1697_zwf (D245S)는 부다페스트 조약에 따라서 다음 수탁기관 [Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)]에 DSM15632로 기탁되었다.

17.5 균주 DSM15632의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 결정

균주 DSM15632 내에 함유된 zwf (D245S)에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 효소 활성을 결정하기 위해, 상기 균주를 LB 배지 (공급처: Merck KG, Darmstadt, Germany)에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 조절판이 있는 250 ml 원뿔형 플라스크에서 25 ml 용적으로, 진탕기 상에서 200 rmp 하에 33℃에서 배양을 수행하였다. 비교를 위해 야생형 zwf 유전자를 갖는 모 균주 DSM1697을 나란히 항온 배양하였다. 실시예 15.1에 기재된 바와 같이, 바이오매스의 제조를 수행하였다.

그의 반응 최종 생성물인 NADPH의 존재 하에서의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 측정은 100 mM 트리스-HC1 (pH 7.8), 10 mM MgCl₂, 260 μM NADP⁺, 7 mM 글루코스-6-포스페이트 및 400 μM NADPH를 함유하는 검정 시스템에서 수행하였다. NADPH의 존재 하에서의 효소 활성 계산은 앞서 기재된 바와 동일한 방식으로 수행하였다.

이러한 실험 결과가 표 8에 나타나 있다:

균주	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제
균주	NADPH의 부재 하에서의 활성 (mU/mg 단백질)	NADPH의 존재 하에서의 활성 (mU/mg 단백질)	잔류 활성 (%)
DSM1697	97	14	14
DSM15632	57	16	28

17.6 L-리신의 제조

한천 판 (뇌 심장 한천) 상에서 33℃ 하에 24시간 동안 성장시킨 실시에 17.4에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM15632의 세포를, 조절판이 있는 500 ml 원뿔형 플라스크에서 5% 슈크로스 대신 5% 글루코스를 함유한 50 ml의 LSS1 배지 [참고: Ohnishi et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002)]에 접종하였다. 초기에 부가된 당이 완전히 고갈된 후 초기 정지 상에서, 회전 진탕기 상에서 33℃ 하의 배양을 중지시켰다. 4 ml의 시드 육즙을, 1000 ml의 배지 LPG1을 함유하는 2 L 발효기 (Biostat B 반응기; 공급처: B. Braun, Melsungen, Germany)에 접종하였다 [참고: Ohnishi et al., Applied Microbiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002)].

초기에 부가된 당이 소모된 후, 발효기 내의 총 배양 용적이 2000 ml에 도달할 때까지 50% (w/v) 글루코스와 3.5% (w/v) (NH₄)₂SO₄ 를 함유하는 용액을 지속적으로 공급하였다. p0₂ > 20%, > 0.5 1/min으로의 통기 및 33℃에서 배양을 수행하였다. pH를 7.0으로 유지시켰다. 형성된 리신의 양을, 닌히드린 탐지를 수반하는 포스트-칼럼 유도체화 및 이온 교환 크로마토그래피함으로써 아미노산 분석기 [공급처: Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Germany)]를 이용하여 결정하였다.

실험 결과가 표 9에 나타나 있다:

균주	OD (660 nm)	L-리신 HCl (g/l)
DSM1697	88	118.6
DSM15632	86	124.6

실시예 18

씨. 글루타미쿰 DM1698의 구축

실시예 17.1에서 언급된 씨. 글루타미쿰 DM1697을 기초로 하여, 씨. 글루타미쿰 균주 DM1698을 구축하였다. 이에는 실시예 14.2에서 구축된 교환 벡터 pK18mobsacB_zwf (A243T)를 사용하여 균주 DM1697 내로 도입시킨 zwf (A243T)-대립 유전자가 정착되어 있다. zwf (A243T)-대립 유전자는 접합에 의해 DM1697 내로 전이시키고, 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 교환 및 선별하였다. 이로써 생성된 균주가 DM1698로 칭해졌고, 이것이 본 실시예에 사용되었다.

균주 DSM5715 및 DSM5715zwf2_A243T에 대해 실시예 16에 나타낸 바와 같이, 돌연변이물 zwf (A243T)를 zwf-유전자 내로 통합시키면 L-리신의 생산이 개선되었다. 이는 또한, zwf (A243T)-대립 유전자가 정착되어 있는 균주 DM1698에도 적용되며, 그 결과 이는 모 균주 DM1697 보다 더 우수한 L-리신 생산자이다.

실시예 19

균주 DM1697의 zwf 야생형 유전자 내로의 90개 염기쌍 결실 도입, 및 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 활성 결정

실시예 19 및 실시예 20의 실험은, JP-A-092244661에 기재된 zwf 유전자의 암호화 서열 (서열 7 참고) 내에 포함되지 않은 코리네박테륨 글루타미쿰의 zwf 유전자 [예를 들어, 서열 9 내의 zwf 야생형 유전자 또는 서열 21 내의 zwf (A243T)-대립 유전자 참고]의 암호화 서열의 5' 말단의 90개 염기쌍이 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 효소적 활성에 요구된다는 사실을 입증하기 위해 계획되었다.

실시예 19에서는, 이것이 야생형 유전자 (서열 19) 및 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (서열 10)에 대해 입증되었다. 실시예 20에서는, 실시예 13에 기재되어 있는, zwf (A243T)-대립 유전자 (서열 21) 및 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 (서열 22)에 대해 입증되었다.

본 실시예에서는, 90개 염기쌍을 결실시키기 전 및 후 야생형 대립 유전자에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 효소적 활성을 비교하기 위해, 씨 글루타미쿰 균주 DM1697의 zwf 야생형 유전자 (실시예 17.1 참고)로부터 90개 염기쌍을 결실시켰다.

19.1 zwf 결실 단편을 벡터 pCRBluntII TOPO 내로 클로닝함

염색체성 DNA를 문헌 [참고: Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)]의 방법에 의해 균주 ATCC13032로부터 분리하였다. 실시예 1로부터의 씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 zwf 유전자의 서열을 기초로 하여, 유전자 SOE화 방법 [참고: Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)]에 의해 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통하여 zwf 결실 단편을 생성하기 위해 다음에 기재된 올리고뉴클레오티드를 선택하였다:

zwfA (서열 43):

5' - AT TCTAGA CAC CTT GAT CTT CTC CGT TG - 3'

zwfB (서열 44):

5' - GAT GGT AGT GTC ACG ATC CT - 3'

zwfC (서열 45):

5' - AGG ATC GTG ACA CTA CCA TCA TGG TGA TCT TCG GTG TCA C - 3'

zwfD (서열 46):

5' - AT TCTAGA GCG GAG GTT TTA TCC AAT GG - 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍 (Ebersberg, Germany)에 의해 합성하였고, PCR 반응은 벤트 (Vent) DNA 폴리머라제 [공급처: NewEnglandBiolabs (Germany, Product Description Vent DNA Polymerase)]를 이용하여 문헌 [참고: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다.

프라이머 zwfA 및 zwfD는 각 경우에 있어, 제한 효소 XbaI에 대한 삽입된 절단 부위를 함유하였는데, 이러한 부위는 상기 제시된 뉴클레오티드 서열에서 밑줄쳐져 있다. 프라이머 zwfC의 처음 20개 염기는 프라이머 zwfB의 역 상보 서열을 함유하였다.

폴리머라제 연쇄 반응의 보조 하에, 프라이머 zwfA 및 zwfB는 710 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있었고, 프라이머 zwfC 및 zwfD는 850 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있었다. 이러한 증폭물을 대상으로 하여, 0.8% 아가로스-겔에서 후속 아가로스-겔 전기영동함으로써 검사하고, 고 순도 PCR 생성물 정제용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)를 이용하여 아가로스-겔로부터 분리한 다음, 프라이머 zwfA 및 zwfD를 이용하여 또 다른 PCR 반응에서 DNA 주형으로서 함께 사용하였다. 이로써, 크기가 1560 bp인 zwf 결실 단편이 생성되었다 (서열 47 참고).

이로써 증폭된 생성물을 0.8% 아가로스-겔에서 후속 검사하였다.

이와 같이 수득된 PCR 생성물을 벡터 pCRBluntII TOPO (Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, Invitrogen, Deutschland)에서 클로닝한 다음, 이. 콜라이 균주 TOP10 [참고: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]을 제조업자의 지시에 따라서 연결용 배치로 형질전환시켰다. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 50 mg/l 카나마이신을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989].

고 순도 플라스미드 분리용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 XbaI로 제한 절단하고 후속 아가로스 겔 전기영동함 (0.8%)으로써 검사하였다. 이 플라스미드는 pCRBluntII_ABlCDl로 칭해지고, 도 9에 도시되었다.

19.2. 대체 벡터 pK18mobsacB_zwfdelta90bp의 구축

도 9 및 10에서 "deltazwf90"로 지칭된 zwf 결실 단편은, 실시예 19.1에서 수득된 벡터 pCRBluntII_ABlCDl을 제한 효소 XbaI로 완전히 절단함으로써 분리하였다. 아가로스 겔 (0.8%)에서 격리시킨 후, 크기가 대략 1600 bp인 zwf 결실 단편을 고 순도 PCR 생성물 정제용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)의 보조 하에 아가로스 겔로부터 분리하였다.

이러한 방식으로 처리한 zwf 결실 단편은 가동화 클로닝 벡터 pK18mobsacB [참고: Schafer et al., Gene 14: 69-73 (1994)]를 이용하여 연결하는데 이용하였다. 이는 제한 효소 XbaI로 미리 개방 절단시킨 다음, 쉬림프 알칼리성 포스파타제 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 탈인산화시켰다. 벡터 DNA를 zwf 결실 단편과 혼합한 다음, 혼합물을 T4 DNA 리가제 (공급처: Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리하였다.

이어서, 이. 콜라이 균주 S17-1 [참고: Simon et al., Bio/Technologie 1: 784-791, 1993]를 연결용 배치로 형질전환시켰다. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 50 mg/l 카나마이신을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989].

고 순도 플라스미드 분리용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 XbaI로 제한 절단하고 후속 아가로스 겔 전기영동함 (0.8%)으로써 검사하였다. 부가적으로, 상기와 같이 클로닝된 zwf 결실 단편은 GATC 바이오텍 AG (Konstanz, Germany)에 의한 서열 분석을 통하여 확인하였다. 이 플라스미드는 pK18mobsacB_zwfdelta90bp로 칭해지고, 도 10에 도시되었다.

19.3 균주 DM1697의 zwf 야생형 유전자 내로의 90개 염기쌍 결실물의 도입

균주 DM1697은 실시예 17.1에 기재되었는데, 이는 zwf 야생형 유전자를 수반하였다.

실시예 19.2에 기재된 플라스미드 pK18mobsacB_zwfdelta90bp를, 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 접합에 의해 씨. 글루타미쿰 DM1697 내로 전이시켰다 [참고: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]. 선별은 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 씨. 글루타미쿰 DM1697의 염색체 내에서의 표적화 재조합 사건에 대해 이루어졌다. 플라스미드의 절제 후 제2의 재조합 사건의 위치에 따라서, 90 bp 결실물을 수반하는 zwf 대립 유전자는 zwf 유전자 자리에서 염색체 내에 발현되거나, 또는 숙주 본래의 zwf 유전자 자리가 여전히 존재하였다.

표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 알아보기 위해, 대략 40 내지 50개 집락을 시험하였다. 표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 나타내는 30개 집락에서는, 상기 zwf 결실물을 관통하는 zwf 유전자의 일정 영역을, 문헌 [참고: Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)]에 기재된 표준 PCR 방법을 사용하여 Taq DNA 폴리머라제 (공급처: Qiagen, Hilden, Germany)와 폴리머라제 연쇄 반응시킴으로써 증폭시켜, zwf 대립 유전자 내의 90 bp 결실이 염색체에 존재한다는 것을 입증하였다.

다음에 기재되는 올리고뉴클레오티드 [MWG Biotec (Ebersberg)에 의해 합성됨]를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:

zwfi1 (서열 48):

5' - GGC GTT GAC TTG GCA GAT GT - 3'

zwfi2 (서열 49):

5' - GCA GAC CGC TGT GAA GGA AT - 3'

이로써, 크기가 581 bp인 PCR 단편의 증폭이 일어났는데, 이는 90 bp 결실이 존재한다는 것을 지시하거나, 또는 크기가 671 bp인 PCR 단편의 증폭이 일어났는데, 이는 zwf 야생형 서열을 지시하였다.

이와 같이 증폭된 생성물을 0.8% 아가로스-겔에서 후속 검사하였다.

이로써, zwf 결실 대립 유전자를 함유하는 씨. 글루타미쿰 균주를 확인하고, 분리하여 이를 DM1697deltazwf90bp로 칭하였다.

19.4 균주 DM1697deltazwf90bp의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 결정

균주 DM1697deltazwf90bp 내에 함유된 zwf 결실 대립 유전자에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 효소 활성을 결정하기 위해, 상기 균주를 LB 배지 (공급처: Merck KG, Darmstadt, Germany)에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 조절판이 있는 250 ml 원뿔형 플라스크에서 25 ml 용적으로, 진탕기 상에서 200 rmp 하에 33℃에서 배양을 수행하였다. 비교를 위해 모 균주 DM1697을 나란히 항온 배양하였다. 실시예 15.1에 기재된 바와 같이, 바이오매스의 제조를 수행하였다.

글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 측정은 100 mM 트리스-HC1 (pH 7.8) + 1 mM DTT, 15 mM MgCl₂, 1.5 mM NADP⁺ 및 10 mM 글루코스-6-포스페이트를 함유하는 검정 시스템에서 수행하였다. 효소 활성 계산은 앞서 기재된 바와 동일한 방식으로 수행하였다.

이러한 실험 결과가 표 10에 나타나 있다:

균주	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 활성 (mU/mg 단백질)
DM1697	80
DM1697deltazwf90bp	0

실시예 20

균주 DM1698의 zwf (A243T)-대립 유전자 내로의 90개 염기쌍 결실 도입, 및 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 활성 결정

20.1 균주 DM1698의 zwf (A243T)-대립 유전자 내로의 90개 염기쌍 결실 도입

실시예 19.2에 기재된 플라스미드 pK18mobsacB_zwfdelta90bp를, 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 접합에 의해 씨. 글루타미쿰 DM1698 (실시예 18 참고) 내로 전이시켰다 [참고: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]. 선별은 실시예 14.3에 기재된 바와 같이 씨. 글루타미쿰 DM1698의 염색체 내에서의 표적화 재조합 사건에 대해 이루어졌다. 플라스미드의 절제 후 제2의 재조합 사건의 위치에 따라서, 90 bp 결실물을 수반하는 zwf 대립 유전자는 zwf 유전자 자리에서 염색체 내에 발현되거나, 또는 숙주 본래의 zwf 유전자 자리가 여전히 존재하였다.

표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 알아보기 위해, 대략 40 내지 50개 집락을 시험하였다. 표현형 "슈크로스의 존재 하에서의 성장" 및 "카나마이신의 존재 하에서의 비-성장"을 나타내는 30개 집락에서는, 상기 zwf 결실물을 관통하는 zwf 유전자의 일정 영역을, 문헌 [참고: Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press)]에 기재된 표준 PCR 방법을 사용하여 Taq DNA 폴리머라제 (공급처: Qiagen, Hilden, Germany)와 폴리머라제 연쇄 반응시킴으로써 증폭시켜, zwf 대립 유전자 내의 상기 결실이 염색체에 존재한다는 것을 입증하였다.

zwfi1 (서열 48):

5' - GGC GTT GAC TTG GCA GAT GT - 3'

zwfi2 (서열 49):

5' - GCA GAC CGC TGT GAA GGA AT - 3'

이로써, 크기가 581 bp인 DNA 단편이 형성되었는데, 이는 90 bp 결실을 보유하고 있거나, 또는 크기가 671 bp인 DNA 단편이 형성되었는데, 이는 상응하는 zwf 야생형 서열을 보유하였다.

zwf 결실 대립 유전자를 함유하는 씨. 글루타미쿰 균주를 분리하여 이를 DM1698deltazwf90bp로 칭하였다.

실시예 19.2로부터의 플라스미드 pK18mobsacB_zwfdelta90bp를 사용하여 90개 염기쌍 결실을 균주 DM1698의 zwf (A243T) 대립 유전자 내로 통합하였다. 이러한 플라스미드 내에 함유된 zwf 결실 단편의 뉴클레오티드 서열은 그의 뉴클레오티드 서열 (서열 47)의 위치 711에서부터 1554까지를 수반하고 야생형 유전자의 암호화 서열 (서열 9)의 뉴클레오티드 91 내지 934를 수반하였다. 이들은 zwf 야생형 단백질 (서열 10)의 아미노산 31 내지 311을 암호화하는데, 이는 아미노산 서열의 위치 243에서 야생형 서열을 포함하였다. 접합시킨 결과, 균주 DM1698의 zwf (A243T) 돌연변이물을 이러한 접합물 내에서 대체 벡터 pK18mobsacB_zwfdelta90bp의 zwf 야생형 대립 유전자로 대체시키는 것이 가능하였다.

돌연변이 zwf (A243T)가 균주 DM1698deltazwf90bp (A243T)의 염색체에 여전히 존재하는지를 확인하기 위해, 라이트사이클러 (LightCycler) (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)의 보조 하에 상기 돌연변이를 탐지하였다.

이러한 라이트사이클러는 터머사이클러가 형광성 탐지를 병용한 것이다.

문헌 [참고: Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)]의 방법에 의해 균주 DM1698deltazwf90bp (A243T)로부터 염색체성 DNA를 분리하였다. 제1 상에서는, zwf (A243T) 돌연변이를 함유하는 DM1698deltazwf90bp (A243T)의 염색체 대략 0.3 kb의 DNA 단편을 PCR 반응의 보조 하에 증폭시켰다 [참고: Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]. 다음에 기재되는 올리고뉴클레오티드 [MWG Biotec (Ebersberg)에 의해 합성됨]를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다:

LC-zwf1 (서열 50):

5' - tccgcatcgaccactatttg - 3'

LC-zwf2 (서열 51):

5' - cgctggcacgaaagaaattg - 3'

제2 상에서는, 상이한 형광성 마커 [라이트사이클러 (LC)-Red640 및 플루오레세인]로 표지시킨, 상이한 크기의 2개 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. 서열 내에서 혼성화가 일어났는데, 여기서 돌연변이 zwf (A243T)가 국재되었다. "형광 공명 에너지 전이"-방법 (FRED)의 보조 하에 돌연변이의 존재 여부를 탐지할 수 있다. 혼성화에 사용된 다음 올리고뉴클레오티드는 TIB MOLBIOL (Berlin, Germany)에 의해 합성하였다:

zwf243-C (서열 52):

5' - LC-Red640 - tatcttcagtcatggtgatc - (P) 3'

zwf243-A (서열 53):

5' - gtcgtagtaaccagcacgtccacccaagcc - 플루오레세인 3'

이러한 방식으로, 균주 DM1698deltazwf90bp (A243T)가 돌연변이 zwf (A243T)를 여전히 함유하고 있다는 것이 입증되었다. 이에는 서열 54에 나타낸 zwf-대립 유전자 zwfdelta90bp (A243T)가 정착되었고; 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 상응하는 아미노산 서열이 서열 55에 나타나 있다.

20.2 균주 DM1698deltazwf90bp (A243T)의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 결정

균주 DM1698deltazwf90bp (A243T) 내에 함유된 zwfdelta90bp (A243T) 대립 유전자에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 효소 활성을 결정하기 위해, 상기 균주를 LB 배지 (공급처: Merck KG, Darmstadt, Germany)에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 조절판이 있는 250 ml 원뿔형 플라스크에서 25 ml 용적으로, 진탕기 상에서 200 rmp 하에 33℃에서 배양을 수행하였다. 비교를 위해 zwf (A243T)-대립 유전자를 갖는 모 균주 DM1698을 나란히 항온 배양하였다. 실시예 15.1에 기재된 바와 같이, 바이오매스의 제조를 수행하였다.

글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 측정은 100 mM 트리스-HC1 (pH 7.8) + 1 mM DTT, 15 mM MgCl₂, 1.5 mM NADP⁺ 및 10 mM 글루코스-6-포스페이트를 함유하는 검정 시스템에서 수행하였다. 효소 활성은 앞서 기재된 바와 동일한 방식으로 계산하였다.

이러한 실험 결과가 표 10에 나타나 있다:

<표 10>

균주	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 활성 (mU/mg 단백질)
DM1698	127
DM1698zwfdelta90bp (A243T)	0

실시예 21

2개 플라스미드-암호화된 zwf-대립 유전자의 발현 결정

본 실시예에서는, 2개의 상이한 zwf 대립 유전자의 발현을 위한 2개 플라스미드를 구축하고, 이를 대상으로 하여 실시예 20.1에서 수득한 균주 DM1698zwfdelta90bp (A243T)의 불활성 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 효소적 활성의 복구를 알아보기 위해 시험하였다. 이와 같이 시험된 zwf 대립 유전자는 zwfL 및 zwfS인데, 여기서 "L"은 "장 (long)"의 약자이고 "S"는 "단 (short)"의 약자이다. 대립 유전자 zwfL에는 돌연변이 zwf (A243T)가 정착되어 있고, 이에는 zwf 유전자의 암호화 서열의 5'-영역의 90개 염기쌍이 포함된다 [서열 9에서 야생형 유전자에 대해 나타낸 바와 같고, 서열 21에서 zwf (A243T)-대립 유전자에 대해 나타낸 바와 같다]. 대립 유전자 zwfS에는 또한, 돌연변이 zwf (A243T)가 정착되어 있지만, zwf 유전자의 암호화 서열의 5'-영역의 90개 염기쌍이 결실되었다 (서열 7에서 야생형 유전자에 대해 나타낸 바와 같다).

21.1 대립 유전자 zwfS 및 zwfL의 증폭

zwf 대립 유전자 zwfS 및 zwfL은 다음에 기재되는 합성 올리고뉴클레오티드 및 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 증폭시켰다. 문헌 [참고: Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168-179)]의 방법에 의해, 대립 유전자 zwf (A243T)가 정착되어 있는 균주 DM658로부터 염색체성 DNA를 분리하였다. 실시예 1로부터의 씨. 글루타미쿰에 대해 공지된 zwf 유전자의 서열을 기초로 하여, 증폭된 단편이 zwf 대립 유전자의 암호화 영역과 그의 상단-영역의 25개 염기쌍은 함유하지만, 가능한 프로모터 영역은 함유하지 않도록 하는 프라이머를 선택하였다. 또한, 표적 벡터 내로의 클로닝을 허용해 주는 제한 효소에 적합한 부위를 삽입하였다. PCR 프라이머의 서열 및 제한 효소 SalI에 대한 삽입된 절단 부위 (밑줄쳐진 서열)가 다음에 기재되었다:

zwfRBS1 (서열 56 참고):

5' - AT GTCGAC AAG AAA GGA TCG TGA CAC TAC - 3'

zwfRBS2 (서열 57 참고):

5' - AT GTCGAC CCC CCG CAT CGC TGG CC - 3'

zwfRBSE (서열 58 참고):

5' - AT GTCGAC ATC GCT TTC GGA GTC AGT GA - 3'

상기 제시된 프라이머는 MWG 바이오텍 (Ebersberg, Germany)에 의해 합성하였고, PCR 반응은 벤트 DNA 폴리머라제 [공급처: NewEnglandBiolabs (Germany, Product Description Vent DNA Polymerase)]를 이용하여 문헌 [참고: Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press)]의 표준 PCR 방법에 의해 수행하였다.

폴리머라제 연쇄 반응의 보조 하에, 프라이머 zwfA 및 zwfB는 710 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있었고, 프라이머 zwfRBS1 및 zwfRBSE는 514개 아미노산으로 이루어진 Zwf 단백질 (서열 60)의 발현을 위한 암호화 서열을 포함하는 zwfL로 불리우는 1732 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있었다 (서열 59 참고). 프라이머 zwfRBS2 및 zwfRBSE는 484개 아미노산으로 이루어진 Zwf 단백질 (서열 62)의 발현을 위한 암호화 서열을 포함하는 zwfS로 불리우는 16422 bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있었다 (서열 61 참고).

이러한 증폭물을 대상으로 하여, 0.8% 아가로스-겔에서 후속 아가로스-겔 전기영동함으로써 검사하고, 고 순도 PCR 생성물 정제용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)를 이용하여 아가로스-겔로부터 분리하였다.

고 순도 플라스미드 분리용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 SalI로 제한하고 후속 아가로스 겔 (0.8%) 전기영동함으로써 검사하였다. 이로써 수득된 플라스미드는 pCRBluntII_zwfL (도 11에 도시됨) 및 pCRBluntII_zwfS (도 12에 도시됨)로 칭해졌다.

21.2 벡터 pZ8-1에서 대립 유전자 zwfS 및 zwfL의 클로닝

이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 발현 벡터 pZ8-1 (EP 0 375 889)을 씨. 글루타미쿰에서 뿐만 아니라 이. 콜라이에서 발현시키기 위한 기저 벡터로서 이용하였다. 이 플라스미드의 DNA를 제한 효소 SalI (공급처: Invitrogen, Germany)로 완전히 절단시킨 다음, 쉬림프 알칼리성 포스파타제 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)로 탈인산화시켰다.

실시예 21.1에서 수득한 벡터 pCRBluntII_zwfL를 제한 효소 SalI로 완전히 절단시킴으로써 zwfL 대립 유전자를 분리하였다. 실시예 21.2에서 수득한 벡터 pCRBluntII_zwfS를 제한 효소 SalI로 완전히 절단시킴으로써 zwfS 대립 유전자를 분리하였다. 아가로스 겔 (0.8%)에서 격리시킨 후, 크기가 대략 1.7 kb인 zwfL 단편과 크기가 대략 1.6 kb인 zwfS 단편을, 고 순도 PCR 생성물 정제용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)의 보조 하에 아가로스 겔로부터 분리하였다.

상기 언급된 바와 같이 제조된 벡터 pZ8-1을, 아가로스 겔로부터 분리한 zwfL 단편 및 zwfS 단편과 혼합하고, 배치를 T4 DNA 리가제 (공급처: Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)로 처리하였다.

연결용 배치를 이. 콜라이 균주 DH5α에서 형질전환시켰다 [참고: Hanahan, In: DNA cloning. A Practical Approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 형질전환 배치를, 50 mg/l 카나마이신을 수반하는 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Lennox, 1955, Virology, 1: 190]. 37℃에서 밤새 항온 배양한 후, 재조합 개개 클론을 선별하였다. 제조업자의 지시에 따라서 고 순도 플라스미드 분리용 키트 (공급처: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)의 보조 하에 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 SalI로 제한하고 후속 아가로스 겔 (0.8%) 전기영동함으로써 검사하였다. 부가적으로, 클로닝된 zwf 대립 유전자는, 다음 프라이머를 사용하여 GATC 바이오텍 AG (Konstanz, Germany)에 의해 서열 분석함으로써 확인하였다:

GATC-Rl_neu-29234 (서열 63)

5' - GGAACACAGAAGATTCTG - 3'

GATC-Fl_neu-29233 (서열 64)

5' - CCGTGTTACTGAGATTGC - 3'

GATC-zwf_int-27334 (서열 65)

5' - TGGCTGAATCCACCGAAGAA - 3'

이로써 생성된 플라스미드는 pZ8-1_zwfL (도 13에 도시됨) 및 pZ8-1_zwfS (도 14에 도시됨)으로 칭해졌다.

21.3 균주 DM1698/pZ8-1,

DM1698zwfdelta90bp (A243T)/pZ8-1,

DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL 및

DM1698zwfdelta90bp (A243T) /pZ8-1_zwfS의 제조

삽입된 단편을 수반하지 않는 벡터 pZ8-1을 코리네박테륨 글루타미쿰 DM1698에서 문헌 [참고: Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시켰다.

실시예 21.2에서 언급된 벡터 pZ8-1_zwfL 및 pZ8-1_zwfS, 및 삽입된 단편을 수반하지 않는 벡터 pZ8-1을, 실시예 20에 기재된 바와 같이 코리네박테륨 글루타미쿰 DM1698zwfdelta90bp (A243T)에서 문헌 [참고: Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123 (1994): 343-347)]의 전기천공 방법에 의해 전기천공시켰다.

플라스미드-수반 세포에 대한 선별은 전기천공 배치를, 15 mg/l 카나마이신을 보충시킨 LB 한천 상에 도말함으로써 이루어졌다 [참고: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989].

각 경우에 있어 통상적인 방법 [참고: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]에 의해 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고, 제한 효소 SalI로 제한하고 후속 아가로스 겔 (0.8%) 전기영동함으로써 검사하였다.

균주는 DM1698/pZ8-1,

DM1698zwfdelta90bp (A243T)/pZ8-1,

DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL 및

DM1698zwfdelta90bp (A243T) /pZ8-1_zwfS로 칭해졌다.

21.4 상기 수득된 균주의 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 활성 결정

균주 DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1_zwfL 및 DM1698zwfdelta90bp (A243T) /pZ8-1_zwfS 내에 함유된 상이한 zwf 대립 유전자에 의해 암호화된 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제 효소 활성을 결정하기 위해, 이들 균주를 25 mg/l 카나마이신을 수반한 LB 배지 (공급처: Merck KG, Darmstadt, Germany)에서 24시간 동안 항온 배양하였다. 조절판이 있는 250 ml 원뿔형 플라스크에서 25 ml 용적으로, 진탕기 상에서 200 rmp 하에 33℃에서 배양을 수행하였다.

비교를 위해, 실시예 20에 기재된 바와 같이 염색체 내에 2개의 상이한 zwf 대립 유전자를 갖는 모 균주 DM1698 및 DM1698zwfdelta9ObpA243T와, 벡터 pZ8-1을 갖는 균주 DM1698/pZ8-1 및 DM1698zwfdelta90bp(A243T)/pZ8-1을 나란히 항온 배양하였다. DM1698 및 DM1698zwfdelta9ObpA243T는 어떠한 플라스미드로 함유하지 않았기 때문에, 이들은 배양 배지에 카나마이신을 부가하지 않고 항온 배양하였다.

실시예 15.1에 기재된 바와 같이, 바이오매스의 제조를 수행하였다.

이러한 실험 결과가 표 11에 나타나 있다:

균주/플라스미드	글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제의 활성 (mU/mg 단백질)
DM1698	75
DM1698zwfdelta90bp (A243T)	0
DM1698/pZ8-1	67
DM1698zwfdelta90bp(A243T) /pZ8-1	0
DM1698zwfdelta90bp(A243T) /pZ8-1_zwfL	40
DM1698zwfdelta90bp (A243T) /pZ8-1_zwfS	0

SEQUENCE LISTING <110> Degussa AG <120> Process for the Preparation of L-Amino Acids with Amplification of the zwf Gene <130> 990239BT <160> 65 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2811 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (373)..(2022) <223> pgi <400> 1 aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60 taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc 120 aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa 180 gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg 240 acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac 300 cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa 360 gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac 411 Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp 1 5 10 att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac 459 Ile Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn 15 20 25 ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc 507 Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala 30 35 40 45 gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag 555 Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys 50 55 60 aat ctg ctt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa 603 Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu 65 70 75 gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cac 651 Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His 80 85 90 ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg ctg cgc ctt 699 Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu 95 100 105 cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat 747 Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp 110 115 120 125 gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc 795 Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg 130 135 140 tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag aag atc gtc 843 Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val 145 150 155 aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg gct acg aag 891 Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys 160 165 170 gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa ttc gtc tcc 939 Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser 175 180 185 aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac ctc gat gca 987 Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala 190 195 200 205 gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag 1035 Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu 210 215 220 acg ctg tcc aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc 1083 Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu 225 230 235 ggt gaa gag gct gtc gcg aag cac ttc gtc gca gtg tcc acc aat gct 1131 Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala 240 245 250 gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg ttc ggc ttc 1179 Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe 255 260 265 tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gca gtt ggt ctt 1227 Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu 270 275 280 285 tcc ctc atg gca gtg atc ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt 1275 Ser Leu Met Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly 290 295 300 gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag 1323 Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu 305 310 315 aac gtt cca atc ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tcc gat ttc 1371 Asn Val Pro Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe 320 325 330 tat ggt gca gaa acc cac gct gtc cta cct tat tcc gag gat ctc agc 1419 Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser 335 340 345 cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag 1467 Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys 350 355 360 365 tca gtc cac cgc gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act ggc gaa att 1515 Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile 370 375 380 tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc ttc cag ctg 1563 Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu 385 390 395 atc cac cag ggc act cgc ctt gtt cca gct gat ttc att ggt ttc gct 1611 Ile His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala 400 405 410 cgt cca aag cag gat ctt cct gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt 1659 Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu 415 420 425 ttg atg agc aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag 1707 Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys 430 435 440 445 aac gct gaa gag atc gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac 1755 Asn Ala Glu Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn 450 455 460 cac aag gtc gtg cca ggt aat cgc cca acc acc acc att ttg gcg gag 1803 His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu 465 470 475 gaa ctt acc cct tct att ctc ggt gcg ttg atc gct ttg tac gaa cac 1851 Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His 480 485 490 acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac atc aac tcc ttc gac caa 1899 Thr Val Met Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln 495 500 505 tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac ctc gct ccg gct 1947 Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala 510 515 520 525 gtc tct ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tct tcc act gat tca 1995 Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser 530 535 540 ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt 2042 Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa 2102 tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg 2162 ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc 2222 tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc 2282 catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat 2342 ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc 2402 tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt 2462 ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca 2522 tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc 2582 ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc 2642 gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg 2702 gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc 2762 aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc 2811 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr 1 5 10 15 Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala 20 25 30 Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr 35 40 45 Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu 50 55 60 Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly 65 70 75 80 Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn 85 90 95 Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu 100 105 110 Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu 115 120 125 Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn 130 135 140 Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly 145 150 155 160 Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg 165 170 175 Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp 180 185 190 Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr 195 200 205 Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser 210 215 220 Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu 225 230 235 240 Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val 245 250 255 Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp 260 265 270 Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met 275 280 285 Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His 290 295 300 Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro 305 310 315 320 Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala 325 330 335 Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala 340 345 350 Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His 355 360 365 Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly 370 375 380 Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu Ile His Gln 385 390 395 400 Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys 405 410 415 Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser 420 425 430 Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu 435 440 445 Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val 450 455 460 Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr 465 470 475 480 Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met 485 490 495 Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val 500 505 510 Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly 515 520 525 Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys 530 535 540 Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 <210> 3 <211> 462 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60 gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac 120 cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt 180 cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag 240 gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg 300 gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt 360 accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc 420 gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa 462 <210> 4 <211> 2160 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (327)..(2063) <223> poxB <400> 4 ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60 cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120 ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180 gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240 aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300 aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta 353 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu 1 5 att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401 Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val 10 15 20 25 ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att 449 Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile 30 35 40 gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497 Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly 45 50 55 gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt 545 Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys 60 65 70 ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga 593 Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg 75 80 85 aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag 641 Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln 90 95 100 105 att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689 Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys 110 115 120 gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737 Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu 125 130 135 cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785 Arg Ile Leu His His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val 140 145 150 tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac 833 Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp 155 160 165 ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc 881 Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe 170 175 180 185 ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929 Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala 190 195 200 aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977 Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala 205 210 215 cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg 1025 Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala 220 225 230 ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc 1073 Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly 235 240 245 atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag 1121 Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu 250 255 260 265 gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc 1169 Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe 270 275 280 ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att 1217 Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile 285 290 295 ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca 1265 Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala 300 305 310 aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc 1313 Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser 315 320 325 ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg 1361 Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val 330 335 340 345 gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct 1409 Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro 350 355 360 gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457 Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val 365 370 375 ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc 1505 Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile 380 385 390 gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc 1553 Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly 395 400 405 acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat 1601 Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp 410 415 420 425 cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg 1649 Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met 430 435 440 ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag 1697 Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys 445 450 455 gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745 Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met 460 465 470 ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793 Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn 475 480 485 ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc 1841 Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr 490 495 500 505 gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct 1889 Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro 510 515 520 gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc 1937 Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile 525 530 535 cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc 1985 Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala 540 545 550 acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc 2033 Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala 555 560 565 cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083 Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro 570 575 gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143 gcccatgaga ttgccct 2160 <210> 5 <211> 579 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile 20 25 30 Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly 50 55 60 Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 80 Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95 Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln 100 105 110 Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125 Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile 130 135 140 Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly 145 150 155 160 Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175 Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205 Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220 Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile 225 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cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300 aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360 gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420 gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac 480 gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540 gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600 gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660 gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720 attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780 gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840 cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875 <210> 7 <211> 2260 <212> DNA <213> Brevibacterium flavum MJ-233 <220> <221> CDS <222> (629)..(2080) <223> Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase (EC 1.1.1.49); JP-A-09-22461 <400> 7 gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt 60 acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg ccgagctgcc tgtaaggcgc caacactcag 120 cgcccactgt gggcatccac cggcgtgaag aaccctgcgt acgctgcaac tctttacgtt 180 tccgagctgg ctggtccaaa caccgtcaac accatgccag aaggcaccat cgacgctgtt 240 ctggaactgg gcaacctgca cggtgacaac ctgtccaact ccgcggcaga agctgacgct 300 gtgttctccc agcttgaggc tctgggcgtt gacttggcag atgtcttcca ggtcctggag 360 accgaggccg tggacaagtt cgttgcttct tggagcgaac tgcttgagtc catggaagct 420 cgcctgaagt agaatcagca cgctgcatca gtaacggcga catgaaatcg aattagttcg 480 atcttatgtg gccgttacac atctttcatt aaagaaagga tcgtgacgct taccatcgtg 540 agcacaaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc aggataaacg 600 actcccccgc atcgctggcc cttccggc atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc 652 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly 1 5 gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc att tat gat cta gca aac 700 Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn 10 15 20 cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc 748 Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg 25 30 35 40 gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca agt 796 Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser 45 50 55 gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc 844 Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala 60 65 70 gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct ttc 892 Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe 75 80 85 gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc 940 Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr 90 95 100 gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc gca 988 Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala 105 110 115 120 gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa 1036 Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu 125 130 135 gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac ctc 1084 Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu 140 145 150 gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa 1132 Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu 155 160 165 tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa 1180 Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln 170 175 180 aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg 1228 Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp 185 190 195 200 aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg gct gaa gat att 1276 Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile 205 210 215 ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc 1324 Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg 220 225 230 gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg 1372 Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met 235 240 245 gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag atc 1420 Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile 250 255 260 aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc 1468 Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser 265 270 275 280 gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc aag 1516 Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys 285 290 295 gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag act 1564 Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr 300 305 310 ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg 1612 Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val 315 320 325 ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag 1660 Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu 330 335 340 att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac cag cct ttc gac ggc gac 1708 Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp 345 350 355 360 atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc gtg att cgc gtg cag cct 1756 Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro 365 370 375 gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc 1804 Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala 380 385 390 atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc 1852 Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe 395 400 405 act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc ctt atc ttg gat gcg ctg 1900 Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu 410 415 420 ttg gat gaa tcc agc ctt ttc cct acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc 1948 Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser 425 430 435 440 tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa 1996 Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu 445 450 455 cca gag gat tac cca gca ggt acg tgg ggt cca aag agc gct gat gaa 2044 Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu 460 465 470 atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc agg cca taatttaggg 2090 Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg Arg Pro 475 480 gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 2150 tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga gtgctcaccc tcatcgtggt 2210 cactgactcc gaaagcgatg tcgctgcagt taccgagtcc accaatgaag 2260 <210> 8 <211> 484 <212> PRT <213> Brevibacterium flavum MJ-233 <400> 8 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu 1 5 10 15 Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe 20 25 30 Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu 35 40 45 Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg 50 55 60 Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly 65 70 75 80 Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys 85 90 95 Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 100 105 110 Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg 115 120 125 Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile 130 135 140 Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln 145 150 155 160 Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His 165 170 175 Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 195 200 205 Gln Ile Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr 210 215 220 Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile 225 230 235 240 Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro 245 250 255 Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 260 265 270 Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly 275 280 285 Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe 290 295 300 Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile 305 310 315 320 Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys 325 330 335 Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala 340 345 350 Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn 355 360 365 Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe 370 375 380 Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met 385 390 395 400 Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr 405 410 415 Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro 420 425 430 Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu 435 440 445 Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr 450 455 460 Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr 465 470 475 480 Trp Arg Arg Pro <210> 9 <211> 2259 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (538)..(2079) <223> Zwf-Protein <220> <221> nucleotide guanine <222> (1264)..(1264) <223> corresponds to position 727 of the coding sequence <400> 9 gatccgatga ggctttggct ctgcgtggca aggcaggcgt tgccaacgct cagcgcgctt 60 acgctgtgta caaggagctt ttcgacgccg ccgagctgcc tgtaaggcgc caacactcag 120 cgcccactgt gggcatccac cggcgtgaag aaccctgcgt acgctgcaac tctttacgtt 180 tccgagctgg ctggtccaaa caccgtcaac accatgccag aaggcaccat cgacgctgtt 240 ctggaactgg gcaacctgca cggtgacaac ctgtccaact ccgcggcaga agctgacgct 300 gtgttctccc agcttgaggc tctgggcgtt gacttggcag atgtcttcca ggtcctggag 360 accgaggccg tggacaagtt cgttgcttct tggagcgaac tgcttgagtc catggaagct 420 cgcctgaagt agaatcagca cgctgcatca gtaacggcga catgaaatcg aattagttcg 480 atcttatgtg gccgttacac atctttcatt aaagaaagga tcgtgacgct taccatc 537 gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 585 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc atg gtg 633 Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30 atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc ccc gcc 681 Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45 att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc tcg ttg 729 Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60 gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac 777 Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80 gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat 825 Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt 873 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe 100 105 110 gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc 921 Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125 gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att 969 Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 cca cca gat tcc ttc gca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc 1017 Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160 atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag 1065 Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175 cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc 1113 Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190 aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg 1161 Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205 ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag 1209 Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220 ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc 1257 Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240 acc atg gct gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac 1305 Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255 ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc 1353 Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270 ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag 1401 Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285 ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 1449 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 1497 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 1545 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct 1593 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt 1641 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac 1689 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc 1737 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc 1785 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc 1833 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc 1881 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 ctt atc ttg gat gcg ctg ttg gat gaa tcc agc ctt ttc cct acc aac 1929 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca 1977 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gca ggt acg tgg ggt 2025 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc 2073 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 agg cca taatttaggg gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag 2129 Arg Pro caaatttcca agaccctaac tcgactgcgt gaatcgggca cccaggtcac caccggccga 2189 gtgctcaccc tcatcgtggt cactgactcc gaaagcgatg tcgctgcagt taccgagtcc 2249 accaatgaag 2259 <210> 10 <211> 514 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 10 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30 Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45 Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60 Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe 100 105 110 Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125 Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Pro Asp Ser Phe Ala Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160 Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175 Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190 Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205 Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220 Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240 Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255 Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270 Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 Arg Pro <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zwf-forward <400> 11 tcgacgcggt tctggagcag 20 <210> 12 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Primer poxBint2 <400> 20 gcatgaggca acgcattagc 20 <210> 21 <211> 1857 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (308)..(1849) <223> <220> <221> mutation <222> (1034)..(1034) <223> corresponds to position 727 of the coding sequence <220> <221> nucleotide adenine <222> (1034)..(1034) <223> corresponds to position 727 of the coding sequence <400> 21 tcgacgcggt tctggagcag ggcaacctgc acggtgacac cctgtccaac tccgcggcag 60 aagctgacgc tgtgttctcc cagcttgagg ctctgggcgt tgacttggca gatgtcttcc 120 aggtcctgga gaccgagggt gtggacaagt tcgttgcttc ttggagcgaa ctgcttgagt 180 ccatggaagc tcgcctgaag tagaatcagc acgctgcatc agtaacggcg acatgaaatc 240 gaattagttc gatcttatgt ggccgttaca catctttcat taaagaaagg atcgtgacac 300 taccatc gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg 349 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu 1 5 10 cgc gac ccg cag gat aaa cga ctc ccc cgc atc gct ggc cct tcc ggc 397 Arg Asp Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly 15 20 25 30 atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc 445 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu 35 40 45 ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc 493 Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe 50 55 60 tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa 541 Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu 65 70 75 aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt 589 Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg 80 85 90 gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc 637 Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly 95 100 105 110 aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag 685 Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys 115 120 125 cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg 733 Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 130 135 140 tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt 781 Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg 145 150 155 tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc 829 Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile 160 165 170 gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag 877 Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln 175 180 185 190 ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac 925 Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His 195 200 205 tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct 973 Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 210 215 220 aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc 1021 Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 225 230 235 cag atc acc atg act gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac 1069 Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr 240 245 250 tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc 1117 Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile 255 260 265 270 cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca 1165 Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro 275 280 285 gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg 1213 Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 290 295 300 tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt 1261 Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly 305 310 315 tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc 1309 Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe 320 325 330 aac cct gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc 1357 Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile 335 340 345 350 acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag 1405 Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys 355 360 365 cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca 1453 Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala 370 375 380 cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac 1501 Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn 385 390 395 gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc 1549 Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe 400 405 410 ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg 1597 Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met 415 420 425 430 gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac 1645 Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr 435 440 445 gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct 1693 Glu Arg Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro 450 455 460 acc aac gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt 1741 Thr Asn Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu 465 470 475 gaa gca tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg 1789 Glu Ala Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr 480 485 490 tgg ggt cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc 1837 Trp Gly Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr 495 500 505 510 tgg cgc agg cca taatttag 1857 Trp Arg Arg Pro <210> 22 <211> 514 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30 Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45 Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60 Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val 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Gly Trp Gln 305 310 315 320 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 Arg Pro <210> 23 <211> 756 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(756) <223> Internal segment of the coding sequence of the zwf(A243T) allele <220> <221> nucleotide adenine <222> (137)..(137) <223> Corresponding to position 727 of the coding sequence of the zwf(A 243T) allele <400> 23 agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct 60 ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca 120 cgtccagatc accatgactg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg 180 catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc 240 catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct 300 ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc 360 cggttggcag ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga 420 gtccaccact gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg 480 tgtgccgttc tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt 540 ggtgtttaaa gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca 600 aaacgccatc gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa 660 ggttccaggt tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc 720 cttcactgaa gaatcacctg aagcatacga gcgcct 756 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zwf_XL-A1 <400> 24 gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatc 28 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zwf_XL-E1 <400> 25 gatctagaga ttcacgcagt cgagttag 28 <210> 26 <211> 1763 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> PCR product <222> (1)..(1763) <223> <400> 26 gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60 cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca 120 ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc 180 aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg 240 gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc 300 tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg 360 aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt 420 gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt 480 tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact 540 gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc 600 gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt 660 tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag 720 aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg 780 ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg 840 tccagatcac catggctgaa gatattgact tgggtggacg tgctggttac tacgacggca 900 tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960 tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct 1020 ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg 1080 gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt 1140 ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg 1200 tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg 1260 tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa 1320 acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg 1380 ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct 1440 tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat 1500 ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc 1560 ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa 1620 agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg 1680 gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1740 tcgactgcgt gaatctctag atc 1763 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zf_1 <400> 27 ggcttactac ctgtccattc 20 <210> 28 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained by in-vitro mutagenesis <220> <221> CDS <222> (1)..(1542) <223> zwf(R370M) allele <400> 28 gtg agc aca aac acg acc ccc tcc agc tgg aca aac cca ctg cgc gac 48 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro 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gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac 912 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag 960 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct 1008 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct 1056 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag cgt ctt 1104 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca cca cac 1152 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac gcc atc 1200 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc ggt tcc 1248 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg gac ttc 1296 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac gag cgc 1344 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct acc aac 1392 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 gag gaa gtg gaa ctg agc tgg aag att ctg gat cca att ctt gaa gca 1440 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 tgg gat gcc gat gga gaa cca gag gat tac cca gcg ggt acg tgg ggt 1488 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 cca aag agc gct gat gaa atg ctt tcc cgc aac ggt cac acc tgg cgc 1536 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 agg cca taa 1545 Arg Pro <210> 37 <211> 514 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Obtained by in-vitro mutagenesis <400> 37 Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 1 5 10 15 Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30 Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45 Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60 Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe 100 105 110 Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125 Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160 Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175 Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190 Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205 Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220 Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240 Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255 Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270 Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285 Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300 Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320 Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335 Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365 Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380 Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400 Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415 Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430 Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445 Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460 Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480 Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495 Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg 500 505 510 Arg Pro <210> 38 <211> 1763 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-Product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1763) <223> PCR-product <400> 38 gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60 cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca 120 ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc 180 aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg 240 gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc 300 tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg 360 aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt 420 gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt 480 tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact 540 gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc 600 gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt 660 tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag 720 aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg 780 ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg 840 tccagatcac catggctgaa gatattggct tgggtggacg tgctggttac tacgacggca 900 tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960 tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct 1020 ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg 1080 gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt 1140 ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg 1200 tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg 1260 tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa 1320 acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg 1380 ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct 1440 tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat 1500 ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc 1560 ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa 1620 agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg 1680 gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1740 tcgactgcgt gaatctctag atc 1763 <210> 39 <211> 1763 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-Product <220> <221> mutation <222> (861)..(861) <223> nucleotide thymine, corresponding to position 733 of the coding sequence of the zwf(D245S) allele <220> <221> mutation <222> (862)..(862) <223> nucleotide cytosine, corresponding to position 734 of the coding sequence of the zwf(D245S)-Allele <220> <221> mutation <222> (863)..(863) <223> nucleotide adenine, corresponiding to position 735 of the coding sequence of the zwf(D245S)-Allele <400> 39 gatctagaag ctcgcctgaa gtagaatcag cacgctgcat cagtaacggc gacatgaaat 60 cgaattagtt cgatcttatg tggccgttac acatctttca ttaaagaaag gatcgtgaca 120 ctaccatcgt gagcacaaac acgaccccct ccagctggac aaacccactg cgcgacccgc 180 aggataaacg actcccccgc atcgctggcc cttccggcat ggtgatcttc ggtgtcactg 240 gcgacttggc tcgaaagaag ctgctccccg ccatttatga tctagcaaac cgcggattgc 300 tgcccccagg attctcgttg gtaggttacg gccgccgcga atggtccaaa gaagactttg 360 aaaaatacgt acgcgatgcc gcaagtgctg gtgctcgtac ggaattccgt gaaaatgttt 420 gggagcgcct cgccgagggt atggaatttg ttcgcggcaa ctttgatgat gatgcagctt 480 tcgacaacct cgctgcaaca ctcaagcgca tcgacaaaac ccgcggcacc gccggcaact 540 gggcttacta cctgtccatt ccaccagatt ccttcacagc ggtctgccac cagctggagc 600 gttccggcat ggctgaatcc accgaagaag catggcgccg cgtgatcatc gagaagcctt 660 tcggccacaa cctcgaatcc gcacacgagc tcaaccagct ggtcaacgca gtcttcccag 720 aatcttctgt gttccgcatc gaccactatt tgggcaagga aacagttcaa aacatcctgg 780 ctctgcgttt tgctaaccag ctgtttgagc cactgtggaa ctccaactac gttgaccacg 840 tccagatcac catggctgaa tcaattggct tgggtggacg tgctggttac tacgacggca 900 tcggcgcagc ccgcgacgtc atccagaacc acctgatcca gctcttggct ctggttgcca 960 tggaagaacc aatttctttc gtgccagcgc agctgcaggc agaaaagatc aaggtgctct 1020 ctgcgacaaa gccgtgctac ccattggata aaacctccgc tcgtggtcag tacgctgccg 1080 gttggcaggg ctctgagtta gtcaagggac ttcgcgaaga agatggcttc aaccctgagt 1140 ccaccactga gacttttgcg gcttgtacct tagagatcac gtctcgtcgc tgggctggtg 1200 tgccgttcta cctgcgcacc ggtaagcgtc ttggtcgccg tgttactgag attgccgtgg 1260 tgtttaaaga cgcaccacac cagcctttcg acggcgacat gactgtatcc cttggccaaa 1320 acgccatcgt gattcgcgtg cagcctgatg aaggtgtgct catccgcttc ggttccaagg 1380 ttccaggttc tgccatggaa gtccgtgacg tcaacatgga cttctcctac tcagaatcct 1440 tcactgaaga atcacctgaa gcatacgagc gcctcatttt ggatgcgctg ttagatgaat 1500 ccagcctctt ccctaccaac gaggaagtgg aactgagctg gaagattctg gatccaattc 1560 ttgaagcatg ggatgccgat ggagaaccag aggattaccc agcgggtacg tggggtccaa 1620 agagcgctga tgaaatgctt tcccgcaacg gtcacacctg gcgcaggcca taatttaggg 1680 gcaaaaaatg atctttgaac ttccggatac caccacccag caaatttcca agaccctaac 1740 tcgactgcgt gaatctctag atc 1763 <210> 40 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DM_zwfD245Sa <400> 40 agatcaccat ggctgaatca attggcttgg gtggac 36 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer DM_D245Sb <400> 41 gcacgtccac ccaagccaat tgattcagcc atggtg 36 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer zf_2 <400> 42 ttctgtgttc cgcatcgacc 20 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zwfA <400> 43 attctagaca ccttgatctt ctccgttg 28 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer zwfB <400> 44 gatggtagtg tcacgatcct 20 <210> 45 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zwfC <400> 45 aggatcgtga cactaccatc atggtgatct tcggtgtca 39 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer zwfD <400> 46 attctagagc ggaggtttta tccaatgg 28 <210> 47 <211> 1560 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR-Product: zwf deletion fragment <220> <221> misc_feature <222> (1)..(710) <223> upstream region of the zwf-gene <220> <221> misc_feature <222> (711)..(1560) <223> Internal segment of the coding sequence of the zwf-gene (SEQ ID N O: 9), starting from nucleotide 91 of the zwf gene. Nucleotide 71 1 is identically to nucleotide 1 of the coding sequence of the zw f-gene mentioned in JP-A-09-22461 as shown in SEQ ID NO: 7). <400> 47 attctagaca ccttgatctt ctccgttgct cgctaccgcg aggtcatcgc tgcgttcatc 60 gagggcatca agcaggctgc tgcaaacggc cacgacgtct ccaagatcca ctctgtggct 120 tccttcttcg tctcccgcgt cgacgttgag atcgacaagc gcctcgaggc aatcggatcc 180 gatgaggctt tggctctgcg cggcaaggca ggcgttgcca acgctcagcg cgcttacgct 240 gtgtacaagg agcttttcga cgccgccgag ctgcctgaag gtgccaacac tcagcgccca 300 ctgtgggcat ccaccggcgt gaagaaccct gcgtacgctg caactcttta cgtttccgag 360 ctggctggtc caaacaccgt caacaccatg ccagaaggca ccatcgacgc ggttctggag 420 cagggcaacc tgcacggtga caccctgtcc aactccgcgg cagaagctga cgctgtgttc 480 tcccagcttg aggctctggg cgttgacttg gcagatgtct tccaggtcct ggagaccgag 540 ggtgtggaca agttcgttgc ttcttggagc gaactgcttg agtccatgga agctcgcctg 600 aagtagaatc agcacgctgc atcagtaacg gcgacatgaa atcgaattag ttcgatctta 660 tgtggccgtt acacatcttt cattaaagaa aggatcgtga cactaccatc atggtgatct 720 tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa 780 accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca 840 aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc 900 gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg 960 atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca 1020 ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc 1080 accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca 1140 tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg 1200 cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc 1260 aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact 1320 acgttgacca cgtccagatc accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt 1380 actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg 1440 ctctggttgc catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga 1500 tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctctagaat 1560 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer zwfi1 <400> 48 ggcgttgact tggcagatgt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer zwfi2 <400> 49 gcagaccgct gtgaaggaat 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer LC-zwf1 <400> 50 tccgcatcga ccactatttg 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Primer LC-zwf2 <400> 51 cgctggcacg aaagaaattg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Oligonucleotide zwf243-C <400> 52 tatcttcagt catggtgatc 20 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(30) <223> Oligonucleotide zwf243-A <400> 53 gtcgtagtaa ccagcacgtc cacccaagcc 30 <210> 54 <211> 1455 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> allele <222> (1)..(1455) <223> zwfdelta90bp(A243T) allele <220> <221> CDS <222> (1)..(1452) <223> zwfdelta90bp(A243T) allele <400> 54 atg gtg atc ttc ggt gtc act ggc gac ttg gct cga aag aag ctg ctc 48 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu 1 5 10 15 ccc gcc att tat gat cta gca aac cgc gga ttg ctg ccc cca gga ttc 96 Pro Ala Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe 20 25 30 tcg ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa 144 Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu 35 40 45 aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct ggt gct cgt acg gaa ttc cgt 192 Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg 50 55 60 gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc 240 Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly 65 70 75 80 aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac aac ctc gct gca aca ctc aag 288 Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys 85 90 95 cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc ggc aac tgg gct tac tac ctg 336 Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 100 105 110 tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg gtc tgc cac cag ctg gag cgt 384 Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg 115 120 125 tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa gca tgg cgc cgc gtg atc atc 432 Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile 130 135 140 gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa tcc gca cac gag ctc aac cag 480 Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln 145 150 155 160 ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct tct gtg ttc cgc atc gac cac 528 Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His 165 170 175 tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac atc ctg gct ctg cgt ttt gct 576 Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 180 185 190 aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac tcc aac tac gtt gac cac gtc 624 Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 195 200 205 cag atc acc atg act gaa gat att ggc ttg ggt gga cgt gct ggt tac 672 Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr 210 215 220 tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc 720 Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile 225 230 235 240 cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca 768 Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro 245 250 255 gcg cag ctg cag gca gaa aag atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg 816 Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 260 265 270 tgc tac cca ttg gat aaa acc tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt 864 Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly 275 280 285 tgg cag ggc tct gag tta gtc aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc 912 Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe 290 295 300 aac cct gag tcc acc act gag act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc 960 Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile 305 310 315 320 acg tct cgt cgc tgg gct ggt gtg ccg ttc tac ctg cgc acc ggt aag 1008 Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys 325 330 335 cgt ctt ggt cgc cgt gtt act gag att gcc gtg gtg ttt aaa gac gca 1056 Arg Leu Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala 340 345 350 cca cac cag cct ttc gac ggc gac atg act gta tcc ctt ggc caa aac 1104 Pro His Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn 355 360 365 gcc atc gtg att cgc gtg cag cct gat gaa ggt gtg ctc atc cgc ttc 1152 Ala Ile Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe 370 375 380 ggt tcc aag gtt cca ggt tct gcc atg gaa gtc cgt gac gtc aac atg 1200 Gly Ser Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met 385 390 395 400 gac ttc tcc tac tca gaa tcc ttc act gaa gaa tca cct gaa gca tac 1248 Asp Phe Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr 405 410 415 gag cgc ctc att ttg gat gcg ctg tta gat gaa tcc agc ctc ttc cct 1296 Glu Arg 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ttg gta ggt tac ggc cgc cgc gaa 246 Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu 60 65 70 tgg tcc aaa gaa gac ttt gaa aaa tac gta cgc gat gcc gca agt gct 294 Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala 75 80 85 ggt gct cgt acg gaa ttc cgt gaa aat gtt tgg gag cgc ctc gcc gag 342 Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu 90 95 100 ggt atg gaa ttt gtt cgc ggc aac ttt gat gat gat gca gct ttc gac 390 Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp 105 110 115 aac ctc gct gca aca ctc aag cgc atc gac aaa acc cgc ggc acc gcc 438 Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala 120 125 130 135 ggc aac tgg gct tac tac ctg tcc att cca cca gat tcc ttc aca gcg 486 Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala 140 145 150 gtc tgc cac cag ctg gag cgt tcc ggc atg gct gaa tcc acc gaa gaa 534 Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu 155 160 165 gca tgg cgc cgc gtg atc atc gag aag cct ttc ggc cac aac ctc gaa 582 Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu 170 175 180 tcc gca cac gag ctc aac cag ctg gtc aac gca gtc ttc cca gaa tct 630 Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser 185 190 195 tct gtg ttc cgc atc gac cac tat ttg ggc aag gaa aca gtt caa aac 678 Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn 200 205 210 215 atc ctg gct ctg cgt ttt gct aac cag ctg ttt gag cca ctg tgg aac 726 Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn 220 225 230 tcc aac tac gtt gac cac gtc cag atc acc atg act gaa gat att ggc 774 Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly 235 240 245 ttg ggt gga cgt gct ggt tac tac gac ggc atc ggc gca gcc cgc gac 822 Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp 250 255 260 gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc atg gaa 870 Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu 265 270 275 gaa cca att tct 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tac tac gac ggc atc ggc gca gcc 726 Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala 220 225 230 cgc gac gtc atc cag aac cac ctg atc cag ctc ttg gct ctg gtt gcc 774 Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala 235 240 245 atg gaa gaa cca att tct ttc gtg cca gcg cag ctg cag gca gaa aag 822 Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys 250 255 260 atc aag gtg ctc tct gcg aca aag ccg tgc tac cca ttg gat aaa acc 870 Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr Pro Leu Asp Lys Thr 265 270 275 tcc gct cgt ggt cag tac gct gcc ggt tgg cag ggc tct gag tta gtc 918 Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln Gly Ser Glu Leu Val 280 285 290 295 aag gga ctt cgc gaa gaa gat ggc ttc aac cct gag tcc acc act gag 966 Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro Glu Ser Thr Thr Glu 300 305 310 act ttt gcg gct tgt acc tta gag atc acg tct cgt cgc tgg gct ggt 1014 Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser Arg Arg Trp Ala Gly 315 320 325 gtg ccg ttc tac ctg 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Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly 65 70 75 80 Asn Phe Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys 85 90 95 Arg Ile Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu 100 105 110 Ser Ile Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg 115 120 125 Ser Gly Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile 130 135 140 Glu Lys Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln 145 150 155 160 Leu Val Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His 165 170 175 Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val 195 200 205 Gln Ile Thr Met Thr Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr 210 215 220 Tyr Asp Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile 225 230 235 240 Gln Leu Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro 245 250 255 Ala Gln Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro 260 265 270 Cys Tyr Pro Leu Asp Lys 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<211> 18 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Primer GATC-R1_neu-29234 <400> 63 ggaacacaga agattctg 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Primer GATC-F1_neu-29233 <400> 64 ccgtgttact gagattgc 18 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Primer GATC-zwf_int-27334 <400> 65 tggctgaatc caccgaagaa 20

Claims

위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 (proteinogenic) 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 위치 370에서의 L-아르기닌, 위치 372에서의 L-발린, 위치 242에서의 L-메티오닌, 위치 243에서의 L-알라닌, 위치 244에서의 L-글루탐산, 및 위치 245에서의 L-아스파르트산으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 위치 243에서의 적어도 L-알라닌을 L-트레오닌에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 위치 242에서의 적어도 L-메티오닌을 L-류신에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 위치 242에서의 적어도 L-메티오닌을 L-세린에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 위치 245에서의 적어도 L-아스파르트산을 L-세린에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 위치 370에서의 적어도 L-아르기닌을 L-메티오닌에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 및 위치 372에서의 적어도 L-발린을 L-알라닌에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질로 이루어진 군 중에서 선택된 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 적어도 서열 22의 아미노산 서열의 아미노산 241 내지 246을 포함하고, 서열 10의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 10을 임의로 포함하는 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 서열 21의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 308 내지 1849를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 적어도 서열 33, 35 및 37의 아미노산 서열 중의 하나의 아미노산 237 내지 250을 포함하고, 서열 10의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 10을 임의로 포함하는 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제3항에 있어서, 서열 32, 34 및 36의 뉴클레오티드 서열 중의 하나의 뉴클레오티드 1 내지 1542를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 암호화된 단백질이 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 지니는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제8항에 있어서, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성이 NADPH에 의한 억제에 대한 내성인 단리된 폴리뉴클레오티드.
제5항 또는 제6항에 있어서, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 서열 21, 33, 35 및 37의 서열 중의 하나 또는 그의 단편으로 이루어진 단리된 폴리뉴클레오티드.
제10항에 있어서, 서열 10의 N 말단 서열의 적어도 아미노산 1 내지 10을 포함하고 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세균.
제12항에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드가 세균의 염색체 내에 포함되어 있는 세균.
제13항에 있어서, 코리네박테륨 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 또는 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli)인 세균.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제15항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 위치 370에서의 L-아르기닌, 위치 372에서의 L-발린, 위치 242에서의 L-메티오닌, 위치 243에서의 L-알라닌, 위치 244에서의 L-글루탐산, 및 위치 245에서의 L-아스파르트산으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 적어도 위치 243에서의 L-알라닌을 L-트레오닌에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 적어도, 서열 22의 아미노산 서열의 아미노산 241 내지 246을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 적어도, 서열 10의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 10 및 서열 22의 아미노산 서열의 아미노산 241 내지 246을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 서열 22의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 308 내지 1849를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 적어도, 위치 245에서의 L-아스파르트산을 L-세린에 대항하여 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 적어도, 서열 33, 35 및 37의 아미노산 서열 중의 하나의 아미노산 237 내지 250을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 적어도, 서열 10의 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 10 및 서열 33, 35 및 37의 아미노산 서열 중의 하나의 아미노산 237 내지 250을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항에 있어서, 서열 32, 34 및 36의 서열 중의 하나의 뉴클레오티드 1 내지 1542를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제27항에 있어서, 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성이 NADPH에 의한 억제에 대한 내성인 단리된 세균.
제17항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, N-말단 메티오닌을 세균 내에서 프로세싱하는 동안 단백질로부터 제거시킨, 이러한 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 세균.
제17항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네형 (coryneform) 세균인 단리된 세균.
DSM7431 하에 기탁된 코리네박테륨 글루타미쿰 DM658.
DSM 15237 하에 기탁된 코리네박테륨 글루타미쿰 DSM5715zwf2_A243T.
DSM 15632 하에 기탁된 코리네박테륨 글루타미쿰 DM1697_zwfD245S.
a) 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아미노산-생산 세균을 발효시키는 단계; 및

b) 이러한 아미노산을 배지 또는 세균 세포에서 농축시키는 단계

를 포함하여, 단리된 코리네형 세균을 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 방법.
제28항에 있어서, 세균이 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
제34항에 있어서, 세균이 서열 33, 35 및 37의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 방법.
a) 위치 369 내지 373에서의 하나 이상의 아미노산 및/또는 위치 241 내지 246에서의 하나 이상의 아미노산을 또 다른 단백질 생성가능한 아미노산으로 교환시킨, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아미노산-생산 세균을 발효시키는 단계; 및

b) 이러한 아미노산을 배지 또는 세균 세포에서 농축시키는 단계

를 포함하여, 코리네형 세균을 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 방법.
제32항에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드가 서열 22의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 방법.
제37항에 있어서, 단리된 폴리뉴클레오티드가 서열 33, 35 및 37의 아미노산 서열 중의 하나를 포함하는 단백질을 암호화하는 방법.
a) 적어도, 서열 22의 위치 242 내지 246의 아미노산 또는 서열 33, 35 및 37의 위치 237 내지 250의 아미노산을 포함하고 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아미노산-생산 세균을 발효시키는 단계; 및

b) 이러한 아미노산을 배지 또는 세균 세포에서 농축시키는 단계

를 포함하여, 단리된 코리네형 세균을 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 방법.
a) 적어도, 서열 22의 위치 242 내지 246의 아미노산 또는 서열 33, 35 및 37의 위치 237 내지 250의 아미노산을 포함하고 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제 활성을 지닌 단백질을 암호화하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아미노산-생산 세균을 발효시키는 단계; 및

b) 이러한 아미노산을 배지 또는 세균 세포에서 농축시키는 단계

를 포함하여, 코리네형 세균을 발효시킴으로써 아미노산을 제조하는 방법.
제34항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 L-리신, L-트레오닌, L-이소류신 및 L-트립토판으로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
제34항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 L-아미노산을 단리하는 것을 포함하는 방법.
제40항 또는 제41항에 있어서, 단백질이 서열 10의 N-말단 서열의 아미노산 위치 1 내지 10을 추가로 포함하는 방법.
제34항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 부가적으로, poxB 유전자에 의해 암호화된 피루베이트 옥시다제의 세포내 활성이 저하되거나 작동 중지되는 방법.
제34항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 부가적으로, pgi 유전자에 의해 암호화된 글루코스 6-포스페이트 이소머라제의 세포내 활성이 저하되거나 작동 중지되는 방법.