JP2001190296A - コリネ細菌を使用するｌ−アミノ酸の発酵生産法 - Google Patents
コリネ細菌を使用するｌ−アミノ酸の発酵生産法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 glyA遺伝子が減衰されたコリネ型細菌の使用
下に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−トレオニンを発酵生産す
る方法 【解決手段】 次の： ａ）少なくともglyA遺伝子が減衰している所望のＬ−ア
ミノ酸を生産するコリネ型細菌を培養し、 ｂ）所望の生成物を培地中または細菌の細胞中で増加さ
せ、かつ ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離する工程を実施する、Ｌ−アミ
ノ酸の製法。
下に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−トレオニンを発酵生産す
る方法 【解決手段】 次の： ａ）少なくともglyA遺伝子が減衰している所望のＬ−ア
ミノ酸を生産するコリネ型細菌を培養し、 ｂ）所望の生成物を培地中または細菌の細胞中で増加さ
せ、かつ ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離する工程を実施する、Ｌ−アミ
ノ酸の製法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の対象は、glyA遺伝子
が減衰されたコリネ型細菌の使用下に、Ｌ−アミノ酸、
特にＬ−トレオニンを発酵生産する方法である。
が減衰されたコリネ型細菌の使用下に、Ｌ−アミノ酸、
特にＬ−トレオニンを発酵生産する方法である。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸は、動物飼料、医薬および
製薬工業において使用される。
製薬工業において使用される。
【０００３】コリネ型細菌、特にコリネバクテリウム
グルタミカムからの菌株の発酵によりアミノ酸を製造す
ることは公知である。その優れた重要性により、製法を
改善するための研究が恒常的に行われている。方法の改
善は、例えば攪拌および酸素の供給のような発酵技術の
手段、または例えば発酵の間の糖濃度のような栄養培地
の組成、またはイオン交換クロマトグラフィーによる生
成物の形状の後処理または微生物自体の内在的な機能特
性に関する。
グルタミカムからの菌株の発酵によりアミノ酸を製造す
ることは公知である。その優れた重要性により、製法を
改善するための研究が恒常的に行われている。方法の改
善は、例えば攪拌および酸素の供給のような発酵技術の
手段、または例えば発酵の間の糖濃度のような栄養培地
の組成、またはイオン交換クロマトグラフィーによる生
成物の形状の後処理または微生物自体の内在的な機能特
性に関する。
【０００４】これらの微生物の機能特性を改善するため
に、突然変異誘発法、選択および突然変異体選択を使用
する。この方法において、抗代謝拮抗剤、例えばトレオ
ニン類縁体のα−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸
（AHV）に対して耐性の菌株、またはレギュレータ的に
重要な代謝物にとって栄養要求体であり、かつＬ−アミ
ノ酸、例えばトレオニンを生産する菌株が得られる。
に、突然変異誘発法、選択および突然変異体選択を使用
する。この方法において、抗代謝拮抗剤、例えばトレオ
ニン類縁体のα−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸
（AHV）に対して耐性の菌株、またはレギュレータ的に
重要な代謝物にとって栄養要求体であり、かつＬ−アミ
ノ酸、例えばトレオニンを生産する菌株が得られる。
【０００５】数年来、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバ
クテリウム グクタミカムの菌株の菌株改善のために、
個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅し、かつアミノ酸生
産に影響を及ぼすことを試みることにより、同様に組換
えDNA技術法が使用されてきた。これに関する概要文献
は、Kinoshita による("Glutamic Acid Bacteria", in
: Biology of Industrial Microorganisms, Demain an
d Solomon (Eds.)、Benjamin Cummings, London, UK, 1
985, 115-142)、Hilliger（BioTec 2, 40-44 (199
1)）、Eggeling（Amino Acid 6, 261-272 (1994)）、Je
tten und Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology
15, 73-103 (1995))およびSahm et al. (Annuals of t
he New York Academy of Science 782, 25-39 (1996))
に記載されている。
クテリウム グクタミカムの菌株の菌株改善のために、
個々のアミノ酸生合成遺伝子を増幅し、かつアミノ酸生
産に影響を及ぼすことを試みることにより、同様に組換
えDNA技術法が使用されてきた。これに関する概要文献
は、Kinoshita による("Glutamic Acid Bacteria", in
: Biology of Industrial Microorganisms, Demain an
d Solomon (Eds.)、Benjamin Cummings, London, UK, 1
985, 115-142)、Hilliger（BioTec 2, 40-44 (199
1)）、Eggeling（Amino Acid 6, 261-272 (1994)）、Je
tten und Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology
15, 73-103 (1995))およびSahm et al. (Annuals of t
he New York Academy of Science 782, 25-39 (1996))
に記載されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、コリ
ネ型バクテリウムを用いた新規の改善されたＬ−アミノ
酸の新規の発酵生産の方法を提供することであった。
ネ型バクテリウムを用いた新規の改善されたＬ−アミノ
酸の新規の発酵生産の方法を提供することであった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】Ｌ−アミノ酸は、医薬に
おいて、および製薬工業において、食品工業、特に動物
飼料において使用される。従って、アミノ酸の新規の改
善された製法を提供することについて一般的な関心があ
る。
おいて、および製薬工業において、食品工業、特に動物
飼料において使用される。従って、アミノ酸の新規の改
善された製法を提供することについて一般的な関心があ
る。
【０００８】以下に、Ｌ−アミノ酸が言及される場合に
は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−イソロイシンのことを意
味する。
は、Ｌ−トレオニンまたはＬ−イソロイシンのことを意
味する。
【０００９】本発明の対象は、glyA遺伝子産物をコード
するヌクレオチド配列（glyA遺伝子）が少なくとも減衰
され、特に低いレベルで発現されるコリネ型細菌を用
い、所望の生成物を培地または細胞中で富化し、かつＬ
−アミノ酸を単離するＬ−アミノ酸の発酵生産方法を提
供することである。
するヌクレオチド配列（glyA遺伝子）が少なくとも減衰
され、特に低いレベルで発現されるコリネ型細菌を用
い、所望の生成物を培地または細胞中で富化し、かつＬ
−アミノ酸を単離するＬ−アミノ酸の発酵生産方法を提
供することである。
【００１０】使用される菌株は、有利にはglyA遺伝子の
減衰の前に既にＬ−アミノ酸を産生する。
減衰の前に既にＬ−アミノ酸を産生する。
【００１１】有利な実施態様は、請求項１に記載されて
いる。
いる。
【００１２】これに関連して、“減衰”という用語は、
相応するDNA（この場合はglyA遺伝子）によりコードさ
れる微生物中の１種以上の酵素の細胞内活性を、例えば
弱いプロモーターを使用するか、または低い活性を有す
る相応する酵素をコードするかもしくは相応する遺伝子
または酵素（タンパク質）を不活性化する遺伝子もしく
は対立遺伝子を使用し、かつ場合によりこれらの措置を
組み合わせることによって低下または抑制させることを
意味する。
相応するDNA（この場合はglyA遺伝子）によりコードさ
れる微生物中の１種以上の酵素の細胞内活性を、例えば
弱いプロモーターを使用するか、または低い活性を有す
る相応する酵素をコードするかもしくは相応する遺伝子
または酵素（タンパク質）を不活性化する遺伝子もしく
は対立遺伝子を使用し、かつ場合によりこれらの措置を
組み合わせることによって低下または抑制させることを
意味する。
【００１３】本発明の対象である微生物は、グルコー
ス、ショ糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、デンプン、セ
ルロースまたはグリセロールおよびエタノールからアミ
ノ酸を製造することができる。代表的なコリネ型細菌
は、特にコリネバクテリウム属であってよい。コリネバ
クテリウム属のうち、Ｌ−アミノ酸を製造する能力で当
業者に公知である特にコリネバクテリウム グルタミカ
ム種を挙げることができる。
ス、ショ糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、デンプン、セ
ルロースまたはグリセロールおよびエタノールからアミ
ノ酸を製造することができる。代表的なコリネ型細菌
は、特にコリネバクテリウム属であってよい。コリネバ
クテリウム属のうち、Ｌ−アミノ酸を製造する能力で当
業者に公知である特にコリネバクテリウム グルタミカ
ム種を挙げることができる。
【００１４】適当なコリネバクテリウム属の菌株、特に
コリネバクテリウム クルタミカム種は、特に公知の野
生型菌株 コリネバクテリウム グルタミカム（glutamicum） AT
CC 13032 コリネバクテリウム アセトグルタミカム(acetoglutam
icum) ATCC 15806 コリネバクテリウム アセトアシッドフィラム(acetoac
idophilum) ATCC 13870 コリネバクテリウム メラッセコラ(melassecola) ATCC
17965 コリネバクテリウム サーモアミノゲネス(thermoamino
genes) FERM BP-1539 ブレビバクテリウム フラブム(flavum) ATCC 14067 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム(lactoferm
entum) ATCC 13869および ブレビバクテリウム ジバリカタム(divaricatum) ATC
C 14020 およびそれから生産されたＬ−アミノ酸産生突然変異体
もしくは菌株、例えばＬ−トレオニン産生菌株 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 21649 ブレビバクテリウム フラブム BB69 ブレビバクテリウム フラブム DSM5399 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム FERM-BP
269 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム TBB-10お
よび 例えばＬ−イソロイシン産生菌株 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 14309 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 14310 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 14311 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 15168 コリネバクテリウム アンモニアゲネス（ammoniagene
s） ATCC 6871である。
コリネバクテリウム クルタミカム種は、特に公知の野
生型菌株 コリネバクテリウム グルタミカム（glutamicum） AT
CC 13032 コリネバクテリウム アセトグルタミカム(acetoglutam
icum) ATCC 15806 コリネバクテリウム アセトアシッドフィラム(acetoac
idophilum) ATCC 13870 コリネバクテリウム メラッセコラ(melassecola) ATCC
17965 コリネバクテリウム サーモアミノゲネス(thermoamino
genes) FERM BP-1539 ブレビバクテリウム フラブム(flavum) ATCC 14067 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム(lactoferm
entum) ATCC 13869および ブレビバクテリウム ジバリカタム(divaricatum) ATC
C 14020 およびそれから生産されたＬ−アミノ酸産生突然変異体
もしくは菌株、例えばＬ−トレオニン産生菌株 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 21649 ブレビバクテリウム フラブム BB69 ブレビバクテリウム フラブム DSM5399 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム FERM-BP
269 ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム TBB-10お
よび 例えばＬ−イソロイシン産生菌株 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 14309 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 14310 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 14311 コリネバクテリウム グルタミカム ATCC 15168 コリネバクテリウム アンモニアゲネス（ammoniagene
s） ATCC 6871である。
【００１５】コリネ型細菌は、glyA遺伝子の減衰後に改
善された方法でＬ−アミノ酸を産生することが見出され
た。
善された方法でＬ−アミノ酸を産生することが見出され
た。
【００１６】glyA遺伝子は、酵素セリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ（EC 2.1.2.1）をコードする。gl
yA遺伝子のヌクレオチド配列は、日本公開公報 JP-A-08
107788に記載されている。参考テキストに記載されてい
る glyA遺伝子は、本発明により使用することができ
る。遺伝コードの縮重からまたは機能的に中立なセンス
突然変異により生じるglyA遺伝子の対立遺伝子をさらに
使用することができる。
ルトランスフェラーゼ（EC 2.1.2.1）をコードする。gl
yA遺伝子のヌクレオチド配列は、日本公開公報 JP-A-08
107788に記載されている。参考テキストに記載されてい
る glyA遺伝子は、本発明により使用することができ
る。遺伝コードの縮重からまたは機能的に中立なセンス
突然変異により生じるglyA遺伝子の対立遺伝子をさらに
使用することができる。
【００１７】減衰を達成するために、glyA遺伝子の発現
または遺伝子産物の触媒特性を減少または除去させるこ
とができる。場合により、両方の方法が組み合わされ
る。
または遺伝子産物の触媒特性を減少または除去させるこ
とができる。場合により、両方の方法が組み合わされ
る。
【００１８】遺伝子発現は、適当な培養によるか、また
は遺伝子発現のシグナル構造の遺伝子修飾（突然変異）
により減少させることができる。遺伝子発現のシグナル
構造は、例えばリプレッサー遺伝子、アクチベーター遺
伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエータ
ー、リボゾーム結合部位、開始コドンおよびターミネー
ターである。当業者は、これに関しての情報を、例えば
特許出願 WO 96/15246、Boyd および Murphyによる (Jo
urnal of Bacteriology 170: 5949、(1988))、Voskuil
および Chambliss による(Nucleic Acids Research 26:
3548(1988))、Jensen および Hammerによる(Biotechno
logy and Bioengineering 58: 191 (1998))、Patek 等
による(Microbiology 142: 1297 (1996))および公知の
遺伝子および分子生物学のテキスト、例えば Knippers
によるテキスト（“Molekulare Genetik”、第６版、Ge
org Thieme 出版、シュツットガルト、ドイツ、1995）
またはWinnackerによるテキスト（“Gene und Klon
e”、VCH出版会社、ヴァインハイム、ドイツ、1990）に
見出すことができる。
は遺伝子発現のシグナル構造の遺伝子修飾（突然変異）
により減少させることができる。遺伝子発現のシグナル
構造は、例えばリプレッサー遺伝子、アクチベーター遺
伝子、オペレーター、プロモーター、アテニュエータ
ー、リボゾーム結合部位、開始コドンおよびターミネー
ターである。当業者は、これに関しての情報を、例えば
特許出願 WO 96/15246、Boyd および Murphyによる (Jo
urnal of Bacteriology 170: 5949、(1988))、Voskuil
および Chambliss による(Nucleic Acids Research 26:
3548(1988))、Jensen および Hammerによる(Biotechno
logy and Bioengineering 58: 191 (1998))、Patek 等
による(Microbiology 142: 1297 (1996))および公知の
遺伝子および分子生物学のテキスト、例えば Knippers
によるテキスト（“Molekulare Genetik”、第６版、Ge
org Thieme 出版、シュツットガルト、ドイツ、1995）
またはWinnackerによるテキスト（“Gene und Klon
e”、VCH出版会社、ヴァインハイム、ドイツ、1990）に
見出すことができる。
【００１９】酵素タンパク質の触媒特性において変化も
しくは減少を生じさせる突然変異は、先行技術から公知
である；例としては、Qui and Goodmanによる学術論文
（Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617(1
997)）、Sugimoto 等（Bioscience Biotechnology and
Biochemistry 61: 1760-1762(1997)）および Moeckel
（“Die Threonindehydratase aus Corynebacterium gl
utamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms”, Berichte des Forschungs
zentrums Juelichs, Juel-2906, ISSN09442952, Juelic
h, Germany, 1994）が挙げられる。要約は、公知の遺伝
子および分子生物学のテキスト、例えばHagemannによる
テキスト（“Allgemeine Genetik”, Gustav Fischer V
erlag, Stuttgart, 1986）に記載されている。
しくは減少を生じさせる突然変異は、先行技術から公知
である；例としては、Qui and Goodmanによる学術論文
（Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617(1
997)）、Sugimoto 等（Bioscience Biotechnology and
Biochemistry 61: 1760-1762(1997)）および Moeckel
（“Die Threonindehydratase aus Corynebacterium gl
utamicum: Aufhebung der allosterischen Regulation
und Struktur des Enzyms”, Berichte des Forschungs
zentrums Juelichs, Juel-2906, ISSN09442952, Juelic
h, Germany, 1994）が挙げられる。要約は、公知の遺伝
子および分子生物学のテキスト、例えばHagemannによる
テキスト（“Allgemeine Genetik”, Gustav Fischer V
erlag, Stuttgart, 1986）に記載されている。
【００２０】突然変異として、転位、転換、挿入および
欠失が該当する。酵素活性におけるアミノ酸交換の作用
に依存して、突然変異とは、ミスセンス突然変異または
ナンセンス突然変異のことをいう。遺伝子中の少なくと
も１つの塩基対の挿入または欠失は、フレームシフト突
然変異を生じ、その結果、間違ったアミノ酸が挿入され
るか、または翻訳を予定より早く中断させてしまう。幾
つかのコドンの欠失は、一般的に酵素活性の完全な欠損
を生じる。このような突然変異を製造する手引きは、先
行技術に属し、公知の遺伝子および分子生物学のテキス
ト、例えばKnippersによるテキスト（“Molekulare Gen
etik”、第６版、Georg Thieme 出版、シュツットガル
ト、ドイツ、1995）、Winnackerによる（“Gene und Kl
one”、VCH出版会社、ヴァインハイム、ドイツ、1990）
または Hagmannによる（“Allgemeine Genetik”, Gust
av Fischer 出版、シュツットガルト、1986）に記載さ
れている。
欠失が該当する。酵素活性におけるアミノ酸交換の作用
に依存して、突然変異とは、ミスセンス突然変異または
ナンセンス突然変異のことをいう。遺伝子中の少なくと
も１つの塩基対の挿入または欠失は、フレームシフト突
然変異を生じ、その結果、間違ったアミノ酸が挿入され
るか、または翻訳を予定より早く中断させてしまう。幾
つかのコドンの欠失は、一般的に酵素活性の完全な欠損
を生じる。このような突然変異を製造する手引きは、先
行技術に属し、公知の遺伝子および分子生物学のテキス
ト、例えばKnippersによるテキスト（“Molekulare Gen
etik”、第６版、Georg Thieme 出版、シュツットガル
ト、ドイツ、1995）、Winnackerによる（“Gene und Kl
one”、VCH出版会社、ヴァインハイム、ドイツ、1990）
または Hagmannによる（“Allgemeine Genetik”, Gust
av Fischer 出版、シュツットガルト、1986）に記載さ
れている。
【００２１】例として、天然のプロモーターの除去およ
び上流に存在する調節可能なコントロール因子の挿入に
より、glyA遺伝子は減衰される。コントロール因子とし
てlacI-tac系が使用される。染色体のglyA遺伝子の上流
にlacI-tac系を挿入することを可能にするために、挿入
プラスミドpK18mobglyA'（図１）を製造した。プラスミ
ドpK18mobglyA'は、tacプロモーター (Amann et al., G
ene 25: 167-178 (1983); De Boer et al., Proceeding
s of the National Academy of Science of the United
States of America USA 80: 21-25 (1983)）およびプ
ロモーターのすぐ下流に、配列番号１に示されるglyA遺
伝子の５’−末端配列を有する。
び上流に存在する調節可能なコントロール因子の挿入に
より、glyA遺伝子は減衰される。コントロール因子とし
てlacI-tac系が使用される。染色体のglyA遺伝子の上流
にlacI-tac系を挿入することを可能にするために、挿入
プラスミドpK18mobglyA'（図１）を製造した。プラスミ
ドpK18mobglyA'は、tacプロモーター (Amann et al., G
ene 25: 167-178 (1983); De Boer et al., Proceeding
s of the National Academy of Science of the United
States of America USA 80: 21-25 (1983)）およびプ
ロモーターのすぐ下流に、配列番号１に示されるglyA遺
伝子の５’−末端配列を有する。
【００２２】プラスミドは、さらにLacインヒビターを
コードするlacI遺伝子を有する[Farabaugh, Nature 27
4: 765-769(1978); Stark et al., Gene 51: 255-267
(1987)]。lacI-tac-5’glyA単位の配列は、配列番号２
に示されている。プラスミドpK18mobglyA'は、大腸菌中
で複製させることができるが、コリネバクテリウム グ
ルタミカム中では複製させることができない。組込みに
影響する“交差”現象による相同的組換え後に、glyA遺
伝子の完全なコピー（その発現は、上流に存在するlacI
-tac コントロール因子により制御または調節すること
ができる）および本来のプロモーターを含む３’−末端
上で切断されたglyA遺伝子の不活性なコピーが得られ
る。lacI-tac glyA 単位の配列は、配列番号３に示され
ている。配列番号４は、glyA遺伝子産物の公知のアミノ
酸配列を示す。適当な濃度のラクトース類縁体イソプロ
ピルチオガラクトシド（Fuerste et al., Gene 48: 119
-131 (1986) ）を添加することにより、glyA遺伝子の発
現を制御するかもしくはセリンヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼの細胞含量を減衰または調整することがで
きる。
コードするlacI遺伝子を有する[Farabaugh, Nature 27
4: 765-769(1978); Stark et al., Gene 51: 255-267
(1987)]。lacI-tac-5’glyA単位の配列は、配列番号２
に示されている。プラスミドpK18mobglyA'は、大腸菌中
で複製させることができるが、コリネバクテリウム グ
ルタミカム中では複製させることができない。組込みに
影響する“交差”現象による相同的組換え後に、glyA遺
伝子の完全なコピー（その発現は、上流に存在するlacI
-tac コントロール因子により制御または調節すること
ができる）および本来のプロモーターを含む３’−末端
上で切断されたglyA遺伝子の不活性なコピーが得られ
る。lacI-tac glyA 単位の配列は、配列番号３に示され
ている。配列番号４は、glyA遺伝子産物の公知のアミノ
酸配列を示す。適当な濃度のラクトース類縁体イソプロ
ピルチオガラクトシド（Fuerste et al., Gene 48: 119
-131 (1986) ）を添加することにより、glyA遺伝子の発
現を制御するかもしくはセリンヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼの細胞含量を減衰または調整することがで
きる。
【００２３】組込み突然変異に関する手引きおよび説明
は、例えばSchwarzer および Puehler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) 、Peters-Wendisch 等（Microbiolo
gy 144, 915-927 (1998)）またはFitzpatrick 等（Appl
ied Microbiology Biotechnology 42, 575-580 (199
4)）に記載されている。
は、例えばSchwarzer および Puehler (Bio/Technology
9, 84-87 (1991)) 、Peters-Wendisch 等（Microbiolo
gy 144, 915-927 (1998)）またはFitzpatrick 等（Appl
ied Microbiology Biotechnology 42, 575-580 (199
4)）に記載されている。
【００２４】減衰したglyA遺伝子を有するコリネ型細菌
のアミノ酸産生菌株の例は、トレオニン産生コリネバク
テリウム グルタミカム DM368-2: :pk18mobglyA'であ
る。
のアミノ酸産生菌株の例は、トレオニン産生コリネバク
テリウム グルタミカム DM368-2: :pk18mobglyA'であ
る。
【００２５】さらにアミノ酸を生産するために、付加的
にglyA遺伝子を減衰する他に、それぞれの生合成経路、
解糖、アナプレロティック経路、クエン酸回路またはア
ミノ酸エクスポートの１種以上の酵素を強化させるのが
有利である。
にglyA遺伝子を減衰する他に、それぞれの生合成経路、
解糖、アナプレロティック経路、クエン酸回路またはア
ミノ酸エクスポートの１種以上の酵素を強化させるのが
有利である。
【００２６】従って、例えばＬ−トレオニンを製造する
ために、 ・同時に、ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする
hom遺伝子（Peoples etal., Molecular Microbiology
2, 63-72 (1988)）または“フィーバック耐性”ホモセ
リン−デヒドロゲナーゼをコードするhomｄｒ-Allel (A
rcher et al., Gene 107, 53-59 (1991))を過剰発現さ
せる、および／または ・同時に、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするgap遺伝子（Eikmanns et al., Journa
l of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992))を過剰発現
させる、または ・同時に、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpy
c遺伝子（Peters-Wendisch et al., Microbiology 144:
915-927 (1998))を過剰発現させる、または ・同時に、マレート：キノンオキシドレダクターゼをコ
ードするmqo遺伝子（Molenaaret al.,、European Journ
al of Biochemistry 254, 395-403 (1998)を過剰発現さ
せる、または ・同時に、トレオニン−エクスポートをコードするthrE
遺伝子（DE 19941478.5;DSM 12840)を過剰発現させるこ
とができる。
ために、 ・同時に、ホモセリン−デヒドロゲナーゼをコードする
hom遺伝子（Peoples etal., Molecular Microbiology
2, 63-72 (1988)）または“フィーバック耐性”ホモセ
リン−デヒドロゲナーゼをコードするhomｄｒ-Allel (A
rcher et al., Gene 107, 53-59 (1991))を過剰発現さ
せる、および／または ・同時に、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナ
ーゼをコードするgap遺伝子（Eikmanns et al., Journa
l of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992))を過剰発現
させる、または ・同時に、ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpy
c遺伝子（Peters-Wendisch et al., Microbiology 144:
915-927 (1998))を過剰発現させる、または ・同時に、マレート：キノンオキシドレダクターゼをコ
ードするmqo遺伝子（Molenaaret al.,、European Journ
al of Biochemistry 254, 395-403 (1998)を過剰発現さ
せる、または ・同時に、トレオニン−エクスポートをコードするthrE
遺伝子（DE 19941478.5;DSM 12840)を過剰発現させるこ
とができる。
【００２７】さらに、glyA遺伝子以外に、アミノ酸を製
造するために、同時に ・ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコー
ドするpck遺伝子（DE 19950409.1, DSM 13047）を減衰
させる、および／または ・ピルビン酸オキシダーゼをコードするpoxB遺伝子（US
09/396, 478, DSM 12969）を減衰させることができ
る。
造するために、同時に ・ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコー
ドするpck遺伝子（DE 19950409.1, DSM 13047）を減衰
させる、および／または ・ピルビン酸オキシダーゼをコードするpoxB遺伝子（US
09/396, 478, DSM 12969）を減衰させることができ
る。
【００２８】最後に、アミノ酸を製造するために、glyA
遺伝子を減衰する以外に、不所望の副反応を除外するの
が有利である（Nakayama: “Breeding of Amino Acid P
roducing Micro-organisms”、in: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (ed
s.), Academic Press, London, UK, 1982）。
遺伝子を減衰する以外に、不所望の副反応を除外するの
が有利である（Nakayama: “Breeding of Amino Acid P
roducing Micro-organisms”、in: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (ed
s.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【００２９】使用されるべき培地は、適当な方法でそれ
ぞれの菌株の要求を満足させなくてはならない。種々の
微生物の培地の説明は、米国微生物学協会（the Americ
an Society for Bacteriology）のハンドブック“Manua
l of Methods for GeneraＬＢacteriology”(ワシント
ン D.C., USA, 1981)に含まれる。炭素源として、糖お
よび炭水化物、例えばグルコース、ショ糖、乳糖、果
糖、麦芽糖、糖蜜、スターチおよびセルロース、油およ
び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびヤ
シ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およ
びリノール酸、アルコール、例えばグリセロールおよび
エタノールおよび有機酸、例えば酢酸を使用することが
できる。これらの物質は、個別にまたは混合物として使
用することができる。窒素源として、窒素含有の有機化
合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、トウモロコシエキス、大豆粉および尿素、または
無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸ア
ンモニウムを使用することができる。窒素源は、個別に
または混合物として使用することができる。燐源とし
て、燐酸、燐酸二水素カリウムまたは燐酸水素二カリウ
ムまたはナトリウム含有の相応する塩を使用することが
できる。この培地は、さらに成長に必要な金属塩、例え
ば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければなら
ない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビ
タミンを前記の物質に付加的に使用することができる。
この培地に更に有利な前駆体を添加することもできる。
前記の使用物質は培養へ１回のバッチの形で添加する
か、または適当な方法で培養の間に供給することができ
る。
ぞれの菌株の要求を満足させなくてはならない。種々の
微生物の培地の説明は、米国微生物学協会（the Americ
an Society for Bacteriology）のハンドブック“Manua
l of Methods for GeneraＬＢacteriology”(ワシント
ン D.C., USA, 1981)に含まれる。炭素源として、糖お
よび炭水化物、例えばグルコース、ショ糖、乳糖、果
糖、麦芽糖、糖蜜、スターチおよびセルロース、油およ
び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびヤ
シ油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およ
びリノール酸、アルコール、例えばグリセロールおよび
エタノールおよび有機酸、例えば酢酸を使用することが
できる。これらの物質は、個別にまたは混合物として使
用することができる。窒素源として、窒素含有の有機化
合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、トウモロコシエキス、大豆粉および尿素、または
無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、燐酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸ア
ンモニウムを使用することができる。窒素源は、個別に
または混合物として使用することができる。燐源とし
て、燐酸、燐酸二水素カリウムまたは燐酸水素二カリウ
ムまたはナトリウム含有の相応する塩を使用することが
できる。この培地は、さらに成長に必要な金属塩、例え
ば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含有しなければなら
ない。最後に、必須の成長物質、例えばアミノ酸及びビ
タミンを前記の物質に付加的に使用することができる。
この培地に更に有利な前駆体を添加することもできる。
前記の使用物質は培養へ１回のバッチの形で添加する
か、または適当な方法で培養の間に供給することができ
る。
【００３０】培地のｐＨ−調節のために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えば
リン酸または硫酸が適当な手法で使用される。泡形成を
制御するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコール
エステルを使用することができる。プラスミドの安定を
維持するために、適当な選択作用をする物質、例えば抗
生物質を培地に添加することができる。好気性条件を維
持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば
空気を培地中へ導入する。培養温度は通常２０℃〜４５
℃、有利に２５℃〜４０℃である。所望の産物の最大量
が生成されるまで培養は継続される。この目的は通常１
０時間〜１６０時間の間に達成される。
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水、または酸性化合物、例えば
リン酸または硫酸が適当な手法で使用される。泡形成を
制御するために、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコール
エステルを使用することができる。プラスミドの安定を
維持するために、適当な選択作用をする物質、例えば抗
生物質を培地に添加することができる。好気性条件を維
持するために、酸素または酸素含有ガス混合物、例えば
空気を培地中へ導入する。培養温度は通常２０℃〜４５
℃、有利に２５℃〜４０℃である。所望の産物の最大量
が生成されるまで培養は継続される。この目的は通常１
０時間〜１６０時間の間に達成される。
【００３１】Ｌ−アミノ酸の測定法は、先行技術から公
知である。分析は、Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)に記載さ
れたと同様にアミノ酸交換クロマトグラフィー、引き続
きニンヒドリン誘導化によって行うことができ、または
Lindroth et al.（Analytical Chemistry(1979) 51: 1
167-1174）に記載されたと同様に逆相ＨＰＬＣにより行
うことができる。
知である。分析は、Spackman et al . (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)に記載さ
れたと同様にアミノ酸交換クロマトグラフィー、引き続
きニンヒドリン誘導化によって行うことができ、または
Lindroth et al.（Analytical Chemistry(1979) 51: 1
167-1174）に記載されたと同様に逆相ＨＰＬＣにより行
うことができる。
【００３２】次の微生物はブタペスト条約に従ってDeut
schen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkultur
en (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託されてい
る： ・DSM 13170としてEscherichia coli菌株 DH5αmcr/pK1
8mobglyA'。
schen Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkultur
en (DSMZ, Braunschweig, Deutschland)に寄託されてい
る： ・DSM 13170としてEscherichia coli菌株 DH5αmcr/pK1
8mobglyA'。
【００３３】実施例 本発明を以下の実施例により詳説する。
【００３４】Escherichia coliからのプラスミドDNAの
単離および制限の全ての技術、クレノウおよびアルカリ
ホスファターゼ処理は、Sambrook et al.(Molecular cl
oning. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbo
ur Laboratory Press)に記載の方法により実施した。Es
cherichia coliの形質転換は、特記されない限り、Chun
g et al. (Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America USA (1989)
86: 2172-2175)に記載の方法により実施した。
単離および制限の全ての技術、クレノウおよびアルカリ
ホスファターゼ処理は、Sambrook et al.(Molecular cl
oning. A laboratory manual(1989) Cold Spring Harbo
ur Laboratory Press)に記載の方法により実施した。Es
cherichia coliの形質転換は、特記されない限り、Chun
g et al. (Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America USA (1989)
86: 2172-2175)に記載の方法により実施した。
【００３５】例１ コリネバクテリウム−グルタミカムATCC 13032からのgl
yA遺伝子のクローニングおよび配列決定 glyA遺伝子をE.Coli クローニングベクターpUC18（Nor
rander et al., Gene(1983) 26: 101-106, Roche Diagn
ostics, Mannheim, Germany）中でクローニングした。
クローニングは、２工程で実施した。はじめにコリネバ
クテリウム−グルタミカムATCC 13032からの遺伝子を、
日本公開公報 JP-A-08107788から由来される以下のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）により増幅した。
yA遺伝子のクローニングおよび配列決定 glyA遺伝子をE.Coli クローニングベクターpUC18（Nor
rander et al., Gene(1983) 26: 101-106, Roche Diagn
ostics, Mannheim, Germany）中でクローニングした。
クローニングは、２工程で実施した。はじめにコリネバ
クテリウム−グルタミカムATCC 13032からの遺伝子を、
日本公開公報 JP-A-08107788から由来される以下のオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）により増幅した。
【００３６】
【化１】
【００３７】PCR-反応は、３０サイクルで、２００μM
デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, dT
TP）、それぞれ相応するオリゴヌクレオチド１μＭ、コ
リネバクテリウム−グルタミカムATCC 13032からの染色
体DNA１００ng、１０倍反応緩衝液 1/10体積および熱
安定性 Tag-/Pwo-DNA ポリメラーゼ混合物２．６単位
（Expand High Fidelity PCR System from Roche Diagn
ostics, Mannheim, Germany）の存在で、サーモサイク
ラー（Thermocycler）（PCT-100, MJ Research,Inc., W
atertown, USA）中で、次の条件下：９４℃で３０秒
間、６４℃で１分間および６８℃で３分間で実施した。
デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, dT
TP）、それぞれ相応するオリゴヌクレオチド１μＭ、コ
リネバクテリウム−グルタミカムATCC 13032からの染色
体DNA１００ng、１０倍反応緩衝液 1/10体積および熱
安定性 Tag-/Pwo-DNA ポリメラーゼ混合物２．６単位
（Expand High Fidelity PCR System from Roche Diagn
ostics, Mannheim, Germany）の存在で、サーモサイク
ラー（Thermocycler）（PCT-100, MJ Research,Inc., W
atertown, USA）中で、次の条件下：９４℃で３０秒
間、６４℃で１分間および６８℃で３分間で実施した。
【００３８】増幅させた約１．７kbサイズの断片を引き
続きSureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Bio
tech, Uppsala, Sweden)を用いて、製造者の指示により
ベクターpUC18の SmaI切断部位にライゲーションした。
全てのライゲーションバッチを用いて、E.Coli 菌株DH5
αmcr（Grant et al., Proceedings of the NationalAc
ademy of Sciences of the United States of America
USA (1990) 87: 4645-4649）を形質転換させた。形質転
換体を、そのカルベニシリン耐性を用いて、５０μｇ／
ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ-アガールプレート上で同
定した。形質転換体７からプラスミドを作成し、かつ制
限分析により、インサートとしての１．７kb PCR-断片
の存在に関して検査した。このように得られた組換えプ
ラスミドは、以下にpUC18glyAとして示される。
続きSureClone Ligation Kit (Amersham Pharmacia Bio
tech, Uppsala, Sweden)を用いて、製造者の指示により
ベクターpUC18の SmaI切断部位にライゲーションした。
全てのライゲーションバッチを用いて、E.Coli 菌株DH5
αmcr（Grant et al., Proceedings of the NationalAc
ademy of Sciences of the United States of America
USA (1990) 87: 4645-4649）を形質転換させた。形質転
換体を、そのカルベニシリン耐性を用いて、５０μｇ／
ｍＬカルベニシリン含有ＬＢ-アガールプレート上で同
定した。形質転換体７からプラスミドを作成し、かつ制
限分析により、インサートとしての１．７kb PCR-断片
の存在に関して検査した。このように得られた組換えプ
ラスミドは、以下にpUC18glyAとして示される。
【００３９】プラスミドpUC18glyA中の１．７kb PCR-
断片のヌクレオチド配列は、ジデオキシチェーンターミ
ネーション法により決定された（Proceedings of the N
ational Academy of Sciences of the United States o
f America USA (1977) 74: 5463-5467）。このために、
pUC18glyAの完全なインサートは、以下のプライマーを
用いて配列決定された。
断片のヌクレオチド配列は、ジデオキシチェーンターミ
ネーション法により決定された（Proceedings of the N
ational Academy of Sciences of the United States o
f America USA (1977) 74: 5463-5467）。このために、
pUC18glyAの完全なインサートは、以下のプライマーを
用いて配列決定された。
【００４０】
【化２】
【００４１】得られたヌクレオチド配列は、レーザー遺
伝子プログラムパッケージ（Lasergene program packag
e）(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Ma
dison, USA)を用いて分析された。分析は、1302bpの長
さのオープンリーディングフレームの同定を行った。相
応する遺伝子は、glyA遺伝子として示される。これに関
連する遺伝子産物は、４３４アミノ酸を有しかつ配列番
号４に再現されている。
伝子プログラムパッケージ（Lasergene program packag
e）(Biocomputing Software for Windows, DNASTAR, Ma
dison, USA)を用いて分析された。分析は、1302bpの長
さのオープンリーディングフレームの同定を行った。相
応する遺伝子は、glyA遺伝子として示される。これに関
連する遺伝子産物は、４３４アミノ酸を有しかつ配列番
号４に再現されている。
【００４２】例２ glyA遺伝子の発現を減少させるベクターの構築 例１に記載されたプラスミドpUC18glyAから、制限酵素E
coRI およびTfiIを用いて、その独自のプロモーター領
域のないglyA遺伝子を有する１４１８bpサイズのDNA断
片を切断した。これらの断片の５’−および３’−末端
をクレノウ酵素で処理した。得られたDNA断片は、事前
にBamHIで一本鎖にし、クレノウ酵素で処理しかつ脱リ
ン酸化しておいたベクターpVWEx2中に、glyA遺伝子が、
イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を用い
て誘導することができるベクターのtacプロモーターの
直後の同じ位置に存在するようにライゲーションした
[Wendisch“コリネバクテリウム グルタミカムの野生
型菌株および組換え菌株における中心代謝経路のインビ
ボ活性の生理学的およびNMR-分光分析 (physiologicala
nd NMR-spectroscopic analyses of the in vivo activ
ity of central metabolic pathways in the wild-type
strain and in recombinant strains of Corynebacter
ium glutamicum) ”Juelich リサーチセンターの報告、
Juel-3397, ISSN09442952, Juelich, ドイツ、1997] 。
全てのライゲーションバッチを用いて、E. Coli菌株DH5
αmcr（Grant et al., proceedings of America USA (1
990) 87:4645-4649）を形質転換した。形質転換体を、
そのテトラサイクリン抵抗を用いて、１５μｇ／ｍＬ
テトラサイクリン含有のＬＢ-アガールプレート上で同
定した。tacプロモーターに関する形質転換体１２から
プラスミドを作成し、かつ制限分析により正しい位置の
インサートとしての１４１８bpの断片の存在に関して検
査した。このように得られた組換プラスミドは、以下に
pVWEx2glyAとして示される。
coRI およびTfiIを用いて、その独自のプロモーター領
域のないglyA遺伝子を有する１４１８bpサイズのDNA断
片を切断した。これらの断片の５’−および３’−末端
をクレノウ酵素で処理した。得られたDNA断片は、事前
にBamHIで一本鎖にし、クレノウ酵素で処理しかつ脱リ
ン酸化しておいたベクターpVWEx2中に、glyA遺伝子が、
イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を用い
て誘導することができるベクターのtacプロモーターの
直後の同じ位置に存在するようにライゲーションした
[Wendisch“コリネバクテリウム グルタミカムの野生
型菌株および組換え菌株における中心代謝経路のインビ
ボ活性の生理学的およびNMR-分光分析 (physiologicala
nd NMR-spectroscopic analyses of the in vivo activ
ity of central metabolic pathways in the wild-type
strain and in recombinant strains of Corynebacter
ium glutamicum) ”Juelich リサーチセンターの報告、
Juel-3397, ISSN09442952, Juelich, ドイツ、1997] 。
全てのライゲーションバッチを用いて、E. Coli菌株DH5
αmcr（Grant et al., proceedings of America USA (1
990) 87:4645-4649）を形質転換した。形質転換体を、
そのテトラサイクリン抵抗を用いて、１５μｇ／ｍＬ
テトラサイクリン含有のＬＢ-アガールプレート上で同
定した。tacプロモーターに関する形質転換体１２から
プラスミドを作成し、かつ制限分析により正しい位置の
インサートとしての１４１８bpの断片の存在に関して検
査した。このように得られた組換プラスミドは、以下に
pVWEx2glyAとして示される。
【００４３】次に、lacI、tacプロモーターのリプレッ
サー遺伝子、tacプロモーターおよびコリネバクテリウ
ム グルタミカムのクローンglyA遺伝子の最初の438bp
を有するDNA断片を、以下のオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりプ
ラスミドpVWEx2glyAから増幅した。
サー遺伝子、tacプロモーターおよびコリネバクテリウ
ム グルタミカムのクローンglyA遺伝子の最初の438bp
を有するDNA断片を、以下のオリゴヌクレオチドプライ
マーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりプ
ラスミドpVWEx2glyAから増幅した。
【００４４】
【化３】
【００４５】PCR反応は、３０サイクルで、２００μMデ
オキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTT
P）、それぞれ相応するオリゴヌクレオチド１μM、pVWE
x2glyA プラスミドDNA 100ng、１０倍反応緩衝液 1/10
体積、熱安定性Taq-/Pwo-DNAポリメラーゼ混合物２．６
単位（Roche Diagostics社、マンハイム、ドイツのExpa
nd High Fidelity）の存在で、サーモサイクラー（Ther
mocycler）（PCT-100,MJ Research, Inc., Watertown,
USA）中で、次の条件下：９４℃で３０秒間、５８℃で
３０秒間および７２℃で２分間で実施した。
オキシヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTT
P）、それぞれ相応するオリゴヌクレオチド１μM、pVWE
x2glyA プラスミドDNA 100ng、１０倍反応緩衝液 1/10
体積、熱安定性Taq-/Pwo-DNAポリメラーゼ混合物２．６
単位（Roche Diagostics社、マンハイム、ドイツのExpa
nd High Fidelity）の存在で、サーモサイクラー（Ther
mocycler）（PCT-100,MJ Research, Inc., Watertown,
USA）中で、次の条件下：９４℃で３０秒間、５８℃で
３０秒間および７２℃で２分間で実施した。
【００４６】増幅させた約２．０kbサイズの断片を引き
続きEcoRIおよびBamHIを用いて消化させ、Macherey-Nag
el 社(デューレン、ドイツ)のNucleoSpin Extract 2in
1Kitを用いて、製造者の指示により単離し、次に同様に
EcoRIおよびBamHIを用いて切断し、かつ脱リン酸化して
おいたベクターpk18mob中でライゲーションした（Schae
fer et al., Gene (1994) 145: 69-73）。全てのライゲ
ーションバッチを用いて、E.Coli 菌株DH5αmcr（Grant
et al., Proceedings of the National Academy of Sc
iences of the United States of America USA (1990)
87: 4645-4649）を形質転換させた。形質転換体を、そ
れらのカナマイシン耐性を用いて、５０μｇ／ｍＬカナ
マイシン含有のＬＢ-アガールプレート上で同定した。
形質転換体１２からプラスミドを作成し、かつ制限分析
により、インサートとしての２．０kb PCR-断片の存在
に関して検査した。このように得られた組換プラスミド
は、以下にpK18mobglyA'として示される（図１参照）。
続きEcoRIおよびBamHIを用いて消化させ、Macherey-Nag
el 社(デューレン、ドイツ)のNucleoSpin Extract 2in
1Kitを用いて、製造者の指示により単離し、次に同様に
EcoRIおよびBamHIを用いて切断し、かつ脱リン酸化して
おいたベクターpk18mob中でライゲーションした（Schae
fer et al., Gene (1994) 145: 69-73）。全てのライゲ
ーションバッチを用いて、E.Coli 菌株DH5αmcr（Grant
et al., Proceedings of the National Academy of Sc
iences of the United States of America USA (1990)
87: 4645-4649）を形質転換させた。形質転換体を、そ
れらのカナマイシン耐性を用いて、５０μｇ／ｍＬカナ
マイシン含有のＬＢ-アガールプレート上で同定した。
形質転換体１２からプラスミドを作成し、かつ制限分析
により、インサートとしての２．０kb PCR-断片の存在
に関して検査した。このように得られた組換プラスミド
は、以下にpK18mobglyA'として示される（図１参照）。
【００４７】例３ 減少された調節可能なglyA発現をする菌株コリネバクテ
リウム グルタミカムATCC13032：：pK18mobglyA'の構
築 エレクトロポレーション（Haynes et al., FEMS Microb
iology Letters (1989) 61: 329-334）により、からの
ベクターpZ1（Menkel et al., Applied and Environmen
tal Microbiology (1989) 64: 549-554）および例２に
記載されたプラスミドpK18mobglyA'を野生型菌株 コリ
ネバクテリウム グルタミカム ATCC13032（Abe et a
l., Journal of General and Applied Microbiology (1
967) 13: 279-301）中に導入した。
リウム グルタミカムATCC13032：：pK18mobglyA'の構
築 エレクトロポレーション（Haynes et al., FEMS Microb
iology Letters (1989) 61: 329-334）により、からの
ベクターpZ1（Menkel et al., Applied and Environmen
tal Microbiology (1989) 64: 549-554）および例２に
記載されたプラスミドpK18mobglyA'を野生型菌株 コリ
ネバクテリウム グルタミカム ATCC13032（Abe et a
l., Journal of General and Applied Microbiology (1
967) 13: 279-301）中に導入した。
【００４８】pZ1で形質転換後、形質転換体を、そのカ
ナマイシン耐性を用いて、１５μｇ／ｍＬカナマイシン
含有ＬＢＨＩＳ-アガールプレート上で同定した。形質
転換体３からプラスミドを作成し、かつ制限分析によ
り、インサートとしてのからのベクターpZ1の存在に関
して検査した。このように、対照菌株コリネバクテリウ
ム グルタミカムATCC13032/PZ1が生じた。
ナマイシン耐性を用いて、１５μｇ／ｍＬカナマイシン
含有ＬＢＨＩＳ-アガールプレート上で同定した。形質
転換体３からプラスミドを作成し、かつ制限分析によ
り、インサートとしてのからのベクターpZ1の存在に関
して検査した。このように、対照菌株コリネバクテリウ
ム グルタミカムATCC13032/PZ1が生じた。
【００４９】pK18mobglyA'を用いて形質転換した後、プ
ラスミドは、クローニングされたglyAの５’−末端の相
同的組換えにより、コリネバクテリウム グルタミカム
ATCC13032の染色体中に組み込まなければならなかっ
た。得られたカナマイシン耐性クローンを、１５μg/mL
カナマイシンおよび1mM イソプロピル−β−D−チオガ
ラクトシド（IPTG）（Liebel et al., FEMS Microbiolo
gy Letters (1989) 65:299-304）含有ＬＢＨＩＳ-アガ
ールプレート上で同定した。染色体中のpK18mobglyA'の
正しい挿入は、２で得られた組込み突然変異体中で、以
下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により検査された。
ラスミドは、クローニングされたglyAの５’−末端の相
同的組換えにより、コリネバクテリウム グルタミカム
ATCC13032の染色体中に組み込まなければならなかっ
た。得られたカナマイシン耐性クローンを、１５μg/mL
カナマイシンおよび1mM イソプロピル−β−D−チオガ
ラクトシド（IPTG）（Liebel et al., FEMS Microbiolo
gy Letters (1989) 65:299-304）含有ＬＢＨＩＳ-アガ
ールプレート上で同定した。染色体中のpK18mobglyA'の
正しい挿入は、２で得られた組込み突然変異体中で、以
下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（PCR）により検査された。
【００５０】
【化４】
【００５１】PCR-反応は、３０サイクルで、２００μM
デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, dT
TP）、それぞれ相応するオリゴヌクレオチド１μＭ、コ
リネバクテリウム グルタミカムATCC 13032::pK18mobg
lyA'からの染色体DNA１００ng、１０倍反応緩衝液 1/1
0体積および熱安定性Tag-/Pwo-DNAポリメラーゼ混合物
２．６単位（Roche Diagostics社、マンハイム、ドイツ
のExpand High Fidelity）の存在で、サーモサイクラー
（Thermocycler）（PCT-100, MJ Research, Inc., Wate
rtown, USA）中で、次の条件下：９４℃で３０秒間、４
８℃で３０秒間および７２℃で２分間で実施した。この
ように、glyAがイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
（IPTG）を用いて誘導することができるtacプロモータ
ーの制御下に存在する、菌株コリネバクテリウム グル
タミカムATCC13032::pK18mobglyA'が形成された。
デオキシヌクレオチド三リン酸（dATP, dCTP, dGTP, dT
TP）、それぞれ相応するオリゴヌクレオチド１μＭ、コ
リネバクテリウム グルタミカムATCC 13032::pK18mobg
lyA'からの染色体DNA１００ng、１０倍反応緩衝液 1/1
0体積および熱安定性Tag-/Pwo-DNAポリメラーゼ混合物
２．６単位（Roche Diagostics社、マンハイム、ドイツ
のExpand High Fidelity）の存在で、サーモサイクラー
（Thermocycler）（PCT-100, MJ Research, Inc., Wate
rtown, USA）中で、次の条件下：９４℃で３０秒間、４
８℃で３０秒間および７２℃で２分間で実施した。この
ように、glyAがイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
（IPTG）を用いて誘導することができるtacプロモータ
ーの制御下に存在する、菌株コリネバクテリウム グル
タミカムATCC13032::pK18mobglyA'が形成された。
【００５２】例４ 菌株コリネバクテリウム グルタミカムATCC13032::pK1
8mobglyA'中のglyAによりコードされるセリンヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼ−活性の測定glyAによりコ
ードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
−活性を測定するための粗原料抽出物を得るために、例
３に記載された菌株Ｃ. グルタミカム ATCC13032/PZ1
および C. グルタミカムATCC13032::pK18mobglyA'を２
５μg カナマイシン/mLおよび１００μMイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）含有の１００ML 脳心
臓注入培地（Difco Laboratories, Detroit, USA）中で
３０℃で１４時間前培養した。引き続き、細胞を０．９
％（w/v）塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、GgXII−培
地１００mlずつをこの懸濁液と一緒にＯＤ６ ００（光学
密度６００nm）が０．５であるように接種した。この培
地は、カイルホイアー等（Keilhauer et al.）により記
載された培地（Journal of Bacteriology (1993) 175:
5593-5603）と同一であったが、しかし付加的に２５μg
カナマイシン／mLおよび０．１０または１００μＭイ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を含有さ
せた。カイルホイアー等により記載された培地の組成物
は、表１に示してある。
8mobglyA'中のglyAによりコードされるセリンヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼ−活性の測定glyAによりコ
ードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
−活性を測定するための粗原料抽出物を得るために、例
３に記載された菌株Ｃ. グルタミカム ATCC13032/PZ1
および C. グルタミカムATCC13032::pK18mobglyA'を２
５μg カナマイシン/mLおよび１００μMイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）含有の１００ML 脳心
臓注入培地（Difco Laboratories, Detroit, USA）中で
３０℃で１４時間前培養した。引き続き、細胞を０．９
％（w/v）塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、GgXII−培
地１００mlずつをこの懸濁液と一緒にＯＤ６ ００（光学
密度６００nm）が０．５であるように接種した。この培
地は、カイルホイアー等（Keilhauer et al.）により記
載された培地（Journal of Bacteriology (1993) 175:
5593-5603）と同一であったが、しかし付加的に２５μg
カナマイシン／mLおよび０．１０または１００μＭイ
ソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を含有さ
せた。カイルホイアー等により記載された培地の組成物
は、表１に示してある。
【００５３】
【表１】
【００５４】２つの菌株の培養を３０℃で実施した。１
０時間後、細胞を５０mM ４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸／水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH 7.0）で１回洗浄し、かつ遠心分離（He
raeus 社、Osterode, ドイツのMinifuge RFを用いて、
５０００回転／分で１０分間）し、かつ最終容積が５mL
であるように、２００mM ４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸／水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH 7.0）中で再懸濁した。この細胞懸濁液
中に、２mM ピリドキサール−５−燐酸溶液５０μLおよ
び１００mM ジチオトレイトール溶液５０μLを添加し、
細胞を分解した。細胞を超音波ディスインテグレーター
（Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co,
Danbury, USA; 超音露光時間６分、パルス長１００％、
超音波強度２．５）によって０℃で分解した。超音波処
理後、細胞砕片を遠心分離（Sigma-Aldrich社、Deisenh
ofen, ドイツの冷却可能な遠心分離器 Sigama 202 MK中
１３０００回転／分、４℃で３０分間）により分離し
た。上澄み液は、細胞不含の粗原料抽出物として直接に
酵素活性の測定に使用された。
０時間後、細胞を５０mM ４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸／水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH 7.0）で１回洗浄し、かつ遠心分離（He
raeus 社、Osterode, ドイツのMinifuge RFを用いて、
５０００回転／分で１０分間）し、かつ最終容積が５mL
であるように、２００mM ４−（２−ヒドロキシエチ
ル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸／水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH 7.0）中で再懸濁した。この細胞懸濁液
中に、２mM ピリドキサール−５−燐酸溶液５０μLおよ
び１００mM ジチオトレイトール溶液５０μLを添加し、
細胞を分解した。細胞を超音波ディスインテグレーター
（Branson Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co,
Danbury, USA; 超音露光時間６分、パルス長１００％、
超音波強度２．５）によって０℃で分解した。超音波処
理後、細胞砕片を遠心分離（Sigma-Aldrich社、Deisenh
ofen, ドイツの冷却可能な遠心分離器 Sigama 202 MK中
１３０００回転／分、４℃で３０分間）により分離し
た。上澄み液は、細胞不含の粗原料抽出物として直接に
酵素活性の測定に使用された。
【００５５】細胞不含の粗原料抽出物中のタンパク質測
定は、Bensadoun and Weinstein（AnalyticaＬＢiochem
istry (1976) 70: 241-250）により測光的に実施した。
その際に、タンパク質含量は、ウシ血清アルブミンを標
準として用いてプロットした校正曲線により測定した。
定は、Bensadoun and Weinstein（AnalyticaＬＢiochem
istry (1976) 70: 241-250）により測光的に実施した。
その際に、タンパク質含量は、ウシ血清アルブミンを標
準として用いてプロットした校正曲線により測定した。
【００５６】細胞不含の粗原料抽出物中のセリンヒドロ
キシメチルトランスフェラーゼの活性を測定するため
に、基質トレオニンから形成されたグリシンを定量化す
る不連続な酵素試験を使用した。反応バッチを以下の組
成物（Scrimgeour and Huennekens、Methods in Enzymo
logy (1962) 第５巻：838-843 Academis Press により
改質された）中で、３７℃で１５分間インキュベートし
た：最終体積１mL中、２０mM トレオニン、２００μM
ピリドキサル−５−燐酸、９００μM テトラヒドロ葉酸
塩、１００mM ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピ
ペラジンエタンスルホン酸／水酸化ナトリウム−緩衝液
（pH 7.0）およびタンパク質（粗原料抽出物から）１．
０〜１．５mg。反応は、２５％（w/v）トリクロロ酢酸
溶液０．２５体積を添加することにより終了させ、バッ
チを０℃で１５分間インキュベートし、かつ変性タンパ
ク質を遠心分離（Sigma-Aldrich 社、Deisenhofen, ド
イツの冷却可能な遠心分離器 Sigama 202 MK中１３００
０回転／分、４℃で１５分間）した。酵素試験中に上澄
み液から形成されたグリシンの定量測定は、逆相HPLC
（Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174）により実施した。蛍光検出器（G1321A）に
接続されたSerie HP1100（Hewlett^Packard, Waldbron
n, ドイツ）のHPLC−装置を使用した；このデータのシ
ステム制御および測定は、HP-Chem-Station（Hewlett-P
ackard）を用いて行った。分析すべきアミノ酸溶液１μ
Lを、自動プレカラム誘導化においてオルト−フタルア
ルデヒド／２−メルカプトエタノール−既製試薬（Pier
ce Europe BV, Oud-Beijerland, Niederlande）２０μL
と混合した。この際に、形成された蛍光のチオ置換イソ
インドール（Jones et al., Journal of Chromatograph
y (1983) 266: 471-482）を組合せられたプレカラム（4
0x4 mm Hypersil ODS 5）とメインカラム（HypersilODS
5, 両方のカラムは、CS Chromatographie Service Gmb
H , Langerwehe,ドイツ社製）を介して、増加する無極
性相（メタノール）を用いるグラジエントプログラムに
より分離した。極性溶離液は、酢酸ナトリウムであり
（0.1 モール、pH 7.2）；流量は０．８mL／分であっ
た。誘導化されたアミノ酸の蛍光検出は、励起波長２３
０nmおよび発光波長４５０nmで行った。グリシン濃度
は、外部標準と比較することにより、かつアスパラギン
を付加的に内部標準として算出した。
キシメチルトランスフェラーゼの活性を測定するため
に、基質トレオニンから形成されたグリシンを定量化す
る不連続な酵素試験を使用した。反応バッチを以下の組
成物（Scrimgeour and Huennekens、Methods in Enzymo
logy (1962) 第５巻：838-843 Academis Press により
改質された）中で、３７℃で１５分間インキュベートし
た：最終体積１mL中、２０mM トレオニン、２００μM
ピリドキサル−５−燐酸、９００μM テトラヒドロ葉酸
塩、１００mM ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピ
ペラジンエタンスルホン酸／水酸化ナトリウム−緩衝液
（pH 7.0）およびタンパク質（粗原料抽出物から）１．
０〜１．５mg。反応は、２５％（w/v）トリクロロ酢酸
溶液０．２５体積を添加することにより終了させ、バッ
チを０℃で１５分間インキュベートし、かつ変性タンパ
ク質を遠心分離（Sigma-Aldrich 社、Deisenhofen, ド
イツの冷却可能な遠心分離器 Sigama 202 MK中１３００
０回転／分、４℃で１５分間）した。酵素試験中に上澄
み液から形成されたグリシンの定量測定は、逆相HPLC
（Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51:
1167-1174）により実施した。蛍光検出器（G1321A）に
接続されたSerie HP1100（Hewlett^Packard, Waldbron
n, ドイツ）のHPLC−装置を使用した；このデータのシ
ステム制御および測定は、HP-Chem-Station（Hewlett-P
ackard）を用いて行った。分析すべきアミノ酸溶液１μ
Lを、自動プレカラム誘導化においてオルト−フタルア
ルデヒド／２−メルカプトエタノール−既製試薬（Pier
ce Europe BV, Oud-Beijerland, Niederlande）２０μL
と混合した。この際に、形成された蛍光のチオ置換イソ
インドール（Jones et al., Journal of Chromatograph
y (1983) 266: 471-482）を組合せられたプレカラム（4
0x4 mm Hypersil ODS 5）とメインカラム（HypersilODS
5, 両方のカラムは、CS Chromatographie Service Gmb
H , Langerwehe,ドイツ社製）を介して、増加する無極
性相（メタノール）を用いるグラジエントプログラムに
より分離した。極性溶離液は、酢酸ナトリウムであり
（0.1 モール、pH 7.2）；流量は０．８mL／分であっ
た。誘導化されたアミノ酸の蛍光検出は、励起波長２３
０nmおよび発光波長４５０nmで行った。グリシン濃度
は、外部標準と比較することにより、かつアスパラギン
を付加的に内部標準として算出した。
【００５７】トレオニンを基質として用いた酵素試験の
結果は、表２に挙げてある。
結果は、表２に挙げてある。
【００５８】
【表２】
【００５９】例５ 減少した制御可能なglyA発現を有する菌株ブレビバクテ
リウム フラブムDM368-2::pk18mobglyA'の構築 エレクトロポレーション（Haynes et al., FEMS Microb
iology Letters (1989) 61: 329-334）により、からの
ベクターpZ1（Menkel et al., Applied and Environmen
tal Microbiology (1989) 64: 549-554）および例２に
記載されたプラスミドpK18mobglyA'をトレオニン−形成
菌株ブレビバクテリウム フラブムDM368-2 中に導入し
た。菌株DM368-2 は、欧州特許出願0385940第号明細書
に記載され、かつDSM5399として寄託されている。
リウム フラブムDM368-2::pk18mobglyA'の構築 エレクトロポレーション（Haynes et al., FEMS Microb
iology Letters (1989) 61: 329-334）により、からの
ベクターpZ1（Menkel et al., Applied and Environmen
tal Microbiology (1989) 64: 549-554）および例２に
記載されたプラスミドpK18mobglyA'をトレオニン−形成
菌株ブレビバクテリウム フラブムDM368-2 中に導入し
た。菌株DM368-2 は、欧州特許出願0385940第号明細書
に記載され、かつDSM5399として寄託されている。
【００６０】pZ1を用いて形質転換した後、形質転換体
を、そのカナマイシン耐性を用いて、１５μｇ／ｍＬカ
ナマイシン（Liebel et al., FEMS Microbiology Lette
rs (1989)65: 299-304）含有ＬＢHIS-アガールプレート
上で同定した。形質転換体３からプラスミドを作成し、
かつ制限分析により、からのベクターpZ1の存在に関し
て検査した。このように、対照菌株ブレビバクテリウム
フラブムDM368-2/pZ1が生じた。
を、そのカナマイシン耐性を用いて、１５μｇ／ｍＬカ
ナマイシン（Liebel et al., FEMS Microbiology Lette
rs (1989)65: 299-304）含有ＬＢHIS-アガールプレート
上で同定した。形質転換体３からプラスミドを作成し、
かつ制限分析により、からのベクターpZ1の存在に関し
て検査した。このように、対照菌株ブレビバクテリウム
フラブムDM368-2/pZ1が生じた。
【００６１】pK18mobglyA'を用いて形質転換した後、プ
ラスミドは、クローニングされたglyAの５’−末端の相
同的組換えにより、ブレビバクテリウム フラブムDM36
8-2の染色体中に組込まなければならなかった。得られ
たカナマイシン耐性クローンを、１５μg/mLカナマイシ
ンおよび1mM イソプロピル−β−D−チオガラクトシド
（IPTG）（Liebel et al., FEMS Microbiology Letters
(1989) 65: 299-304）含有ＬＢHIS-アガールプレート
上で同定した。染色体中のpK18mobglyA'の正しい組込み
は、４で得られた組込み突然変異体中で、ブレビバクテ
リウム フラブムDM368-2::pK18mobglyA'の染色体DNA
１００ngを鋳型として、例３で既に記載されたようにポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）により検査された。このよ
うに、glyAがイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
（IPTG）を用いて誘導することができるtacプロモータ
ーの制御下に存在する、菌株ブレビバクテリウム フラ
ブムDM368-2::pK18mobglyA'が形成された。
ラスミドは、クローニングされたglyAの５’−末端の相
同的組換えにより、ブレビバクテリウム フラブムDM36
8-2の染色体中に組込まなければならなかった。得られ
たカナマイシン耐性クローンを、１５μg/mLカナマイシ
ンおよび1mM イソプロピル−β−D−チオガラクトシド
（IPTG）（Liebel et al., FEMS Microbiology Letters
(1989) 65: 299-304）含有ＬＢHIS-アガールプレート
上で同定した。染色体中のpK18mobglyA'の正しい組込み
は、４で得られた組込み突然変異体中で、ブレビバクテ
リウム フラブムDM368-2::pK18mobglyA'の染色体DNA
１００ngを鋳型として、例３で既に記載されたようにポ
リメラーゼ連鎖反応（PCR）により検査された。このよ
うに、glyAがイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
（IPTG）を用いて誘導することができるtacプロモータ
ーの制御下に存在する、菌株ブレビバクテリウム フラ
ブムDM368-2::pK18mobglyA'が形成された。
【００６２】例６ 菌株ブレビバクテリウム フラブムDM368-2::pK18mobgl
yA'中のglyAによりコードされるセリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ活性の測定 例５に記載された菌株B. flavum DM368-2/pZ1およびB.
flavum DM368-2::pK18mobglyA'中における、glyAにより
コードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼ−活性の測定用の粗原料抽出物の生産は、既に例４で
記載されたように実施された。得られた細胞不含の原料
抽出物中のタンパク質測定および基質トレオニンから形
成されたグリシンを定量化する不連続な酵素試験は、例
４に記載したと同様に実施された。
yA'中のglyAによりコードされるセリンヒドロキシメチ
ルトランスフェラーゼ活性の測定 例５に記載された菌株B. flavum DM368-2/pZ1およびB.
flavum DM368-2::pK18mobglyA'中における、glyAにより
コードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼ−活性の測定用の粗原料抽出物の生産は、既に例４で
記載されたように実施された。得られた細胞不含の原料
抽出物中のタンパク質測定および基質トレオニンから形
成されたグリシンを定量化する不連続な酵素試験は、例
４に記載したと同様に実施された。
【００６３】トレオニンを基質として用いた酵素試験の
結果は、表３に挙げてある。
結果は、表３に挙げてある。
【００６４】
【表３】
【００６５】例７ ブレビバクテリウム フラブムを用いたＬ−トレオニン
の製造 そのトレオニン形成を測定するために、例５に記載され
た菌株B. flavum DM368-2/pZ1およびDM368-2::pK18mobg
lyA'を２５μg カナマイシン/mLおよび１００μMイソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）含有の１００
ML 脳心臓注入培地（Difco Laboratories, Detroit, US
A）中で３０℃で１４時間前培養した。引き続き、細胞
を０．９％（w/v）塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、C
gXII−培地６０mlずつをこの懸濁液と一緒にＯＤ６００
（光学密度６００nm）が０．５であるように接種した。
この培地は、カイルホイアー等により記載された培地
（Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603）
と同一であったが、しかし付加的に２５μg カナマイシ
ン／mLおよび０．１０または１００μＭイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を含有させた。
の製造 そのトレオニン形成を測定するために、例５に記載され
た菌株B. flavum DM368-2/pZ1およびDM368-2::pK18mobg
lyA'を２５μg カナマイシン/mLおよび１００μMイソプ
ロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）含有の１００
ML 脳心臓注入培地（Difco Laboratories, Detroit, US
A）中で３０℃で１４時間前培養した。引き続き、細胞
を０．９％（w/v）塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、C
gXII−培地６０mlずつをこの懸濁液と一緒にＯＤ６００
（光学密度６００nm）が０．５であるように接種した。
この培地は、カイルホイアー等により記載された培地
（Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603）
と同一であったが、しかし付加的に２５μg カナマイシ
ン／mLおよび０．１０または１００μＭイソプロピルβ
−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を含有させた。
【００６６】両方の菌株の培養を３０℃で７２時間実施
した。４８時間および７２時間後に、それぞれのプロー
ブを取り出し、かつ細胞を短時間遠心分離した（Heraeu
s 社、Osterode, ドイツのBiofugr picoを用いて、１３
０００回転／分で５分間）。
した。４８時間および７２時間後に、それぞれのプロー
ブを取り出し、かつ細胞を短時間遠心分離した（Heraeu
s 社、Osterode, ドイツのBiofugr picoを用いて、１３
０００回転／分で５分間）。
【００６７】培養上澄み液からの細胞外のアミノ酸濃度
の定量的測定は、例４に既に記載されたように、逆相HP
LC（Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 5
1: 1167-174）により行った。トレオニン濃度は、外部
標準と比較することにより、かつアスパラギンを付加的
に内部標準として算出した。
の定量的測定は、例４に既に記載されたように、逆相HP
LC（Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 5
1: 1167-174）により行った。トレオニン濃度は、外部
標準と比較することにより、かつアスパラギンを付加的
に内部標準として算出した。
【００６８】結果は、表４に挙げられている。
【００６９】
【表４】
【００７０】
【配列表】
【００７１】
【外１】
【００７２】
【外２】
【００７３】
【外３】
【００７４】
【外４】
【００７５】
【外５】
【００７６】
【外６】
【００７７】
【外７】
【図１】プラスミドpK18mobglyA'のマップ（長さのデー
タは概略値）を示す図。
タは概略値）を示す図。
BamHI： Bacillus amyloliquefaciens からの制限エン
ドヌクレアーゼ BglII： Bacillus globigii からの制限エンドヌクレ
アーゼ BstEII： Bacillus stearothermophilus からの制限エ
ンドヌクレアーゼ EcoRI： 大腸菌からの制限エンドヌクレアーゼ EcoRV： 大腸菌からの制限エンドヌクレアーゼ HindIII： Haemophilus influenzae からの制限エンド
ヌクレアーゼ SacI： Streptomyces achromogenes からの制限エンド
ヌクレアーゼ kan： カナマイシン耐性遺伝子 lacIｑ： tac プロモーターPtacのリプレッサーの遺伝
子 Ptac： tac プロモーター glyA’： セリンヒドロキシルメチルトランスフェラー
ゼ遺伝子の５’部分 glyA2-リバース： 組込みを検査するプライマー RSP： 組込みを検査するリバーススタンダードプライ
マー
ドヌクレアーゼ BglII： Bacillus globigii からの制限エンドヌクレ
アーゼ BstEII： Bacillus stearothermophilus からの制限エ
ンドヌクレアーゼ EcoRI： 大腸菌からの制限エンドヌクレアーゼ EcoRV： 大腸菌からの制限エンドヌクレアーゼ HindIII： Haemophilus influenzae からの制限エンド
ヌクレアーゼ SacI： Streptomyces achromogenes からの制限エンド
ヌクレアーゼ kan： カナマイシン耐性遺伝子 lacIｑ： tac プロモーターPtacのリプレッサーの遺伝
子 Ptac： tac プロモーター glyA’： セリンヒドロキシルメチルトランスフェラー
ゼ遺伝子の５’部分 glyA2-リバース： 組込みを検査するプライマー RSP： 組込みを検査するリバーススタンダードプライ
マー
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｘ (71)出願人 599000142 フォルシュングスツェントルム ユーリッ ヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレン クテル ハフツング ドイツ連邦共和国ユーリッヒ （番地な し) (72)発明者 ペトラ ツィーグラー ドイツ連邦共和国 アーヘン アーダルベ ルトシュトラーセ 63 (72)発明者 ローター エッゲリング ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ エルゼン カンプ ６ (72)発明者 ヘルマン ザーム ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ リヌスシュトラーセ 71 (72)発明者 ゲオルク ティーアバッハ ドイツ連邦共和国 ビーレフェルト グン ストシュトラーセ 21 (72)発明者 ヴァルター プフェッフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33
Claims (13)
- 【請求項１】 次の： ａ）少なくともglyA遺伝子が減衰している所望のＬ−ア
ミノ酸を生産するコリネ型細菌を培養し、 ｂ）所望の生成物を培地中または細菌の細胞中で富化さ
せ、かつ ｃ）Ｌ−アミノ酸を単離する工程を実施することを特徴
とする、Ｌ−アミノ酸の製法。 - 【請求項２】 所望のＬ−アミノ酸の生合成経路の他の
遺伝子がさらに強化された細菌を使用する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 所望のＬ−アミノ酸の形成を低下させる
物質代謝経路が少なくとも部分的に抑制されている細菌
を使用する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 glyA遺伝子をコードするポリヌクレオチ
ドの発現を低下させる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 ポリヌクレオチドglyAがコードするポリ
ペプチド（酵素タンパク質）の触媒特性を低下させる、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 減衰の達成のために、図１に示されかつ
E.Coli中でDSM 13170として寄託されたベクターpK18mob
glyA’を用いて組込み突然変異誘発法を使用する、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項７】 Ｌ−トレオニンを製造するために、次の
グループ ７．１ ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするhom
遺伝子、 ７．２ グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナー
ゼをコードするgap遺伝子、 ７．３ ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするpyc
遺伝子、 ７．４ マレート：キノンオキシドレダクターゼをコー
ドするmqo遺伝子 ７．５ トレオニンエクスポートをコードするthrE遺伝
子、から選択される１種以上の遺伝子が同時に過剰発現
または増幅されている細菌を発酵させる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項８】 Ｌ−トレオニンを製造するために、次の
グループ ８．１ ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
をコードするpck遺伝子 ８．２ ピルビン酸オキシダーゼをコードするpoxB遺伝
子 から選択される１種以上の遺伝子が同時に減衰されてい
る細菌を発酵させる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 コリネバクテリウム属グルタミカムの微
生物を使用する、請求項１から８までのいずれか１項に
記載の方法。 - 【請求項１０】 glyA遺伝子が減衰しているコリネ型細
菌。 - 【請求項１１】 図１に示されかつE.Coli中でDSM 1317
0として寄託されたベクターpK18mobglyA'。 - 【請求項１２】 （ｉ）配列番号２に記載されているla
cI-tac-5’glyA単位のヌクレオチド配列、または（ｉ
ｉ）遺伝コードの縮重の領域内で配列（ｉ）に相応する
少なくとも１つの配列、または（ｉｉｉ）配列（ｉ）ま
たは（ｉｉ）に相補的な配列とハイブリダイズする少な
くとも１つの配列、および場合により（ｉｖ）（ｉ）中
の機能的に中立なセンス突然変異体を有する単離された
ポリヌクレオチド。 - 【請求項１３】 （ｉ）配列番号３に記載されているla
cI-tac-glyA単位のヌクレオチド配列 （ｉｉ）遺伝コードの縮重の領域内で配列（ｉ）に相応
する少なくとも１つの配列 （ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）に相補的な配列と
ハイブリダイズする少なくとも１つの配列、および場合
により （ｉｖ）（ｉ）中の機能的に中立なセンス突然変異体を
有する単離されたポリヌクレオチド。
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