JP2001169788A - 分枝アミノ酸の排出をコードするヌクレオチド配列、その単離法および使用 - Google Patents
分枝アミノ酸の排出をコードするヌクレオチド配列、その単離法および使用Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 分枝アミノ酸の新規に改良された発酵的製造
方法の提供。 【解決手段】 ａ）コリネバクテリウムグルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）由来の２種類の特定のアミノ酸配列のいずれかを
少なくとも１つ含有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドと少なくとも７０％の一致を示すポリヌク
レオチドｂ）特定のアミノ酸配列と少なくとも７０％の
一致を示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドｃ）ポリヌクレオチドａ）又は
ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、及びｄ）ａ）、ｂ）
又はｃ）のポリヌクレオチド配列の、少なくとも１５個
の連続した塩基を含有するポリヌクレオチドから成る群
より選択されるポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有
する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
方法の提供。 【解決手段】 ａ）コリネバクテリウムグルタミカム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ）由来の２種類の特定のアミノ酸配列のいずれかを
少なくとも１つ含有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドと少なくとも７０％の一致を示すポリヌク
レオチドｂ）特定のアミノ酸配列と少なくとも７０％の
一致を示すアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチドｃ）ポリヌクレオチドａ）又は
ｂ）に相補的なポリヌクレオチド、及びｄ）ａ）、ｂ）
又はｃ）のポリヌクレオチド配列の、少なくとも１５個
の連続した塩基を含有するポリヌクレオチドから成る群
より選択されるポリヌクレオチドを少なくとも１つ含有
する、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分枝アミノ酸の排
出をコードするヌクレオチド配列、その同定および単離
方法ならびに分枝アミノ酸の排出をコードする遺伝子が
増幅されているコリネフォルムバクテリアを使用した、
分枝アミノ酸の発酵的製法に関する。
出をコードするヌクレオチド配列、その同定および単離
方法ならびに分枝アミノ酸の排出をコードする遺伝子が
増幅されているコリネフォルムバクテリアを使用した、
分枝アミノ酸の発酵的製法に関する。
【０００２】分枝アミノ酸である、Ｌ−イソロイシン、
Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンは、医薬品工業におい
て、またヒト用薬剤および動物用栄養剤に使用されてい
る。
Ｌ−バリンおよびＬ−ロイシンは、医薬品工業におい
て、またヒト用薬剤および動物用栄養剤に使用されてい
る。
【０００３】分枝アミノ酸が、コリネフォルムバクテリ
ア株、特にコリネバクテリウムグルタミカム（Coryneba
cterium glutamicum）の発酵によって製造され得ること
は公知である。分枝アミノ酸は非常に重要であるため、
製造方法を改良する努力が続けられている。方法の改良
は、発酵技術に関する手法、例えば攪拌および酸素供
給、あるいは栄養培地の組成、例えば発酵時の糖濃度、
または製造物の後処理、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、または微生物自体固有の性能特性に及ぶ。
ア株、特にコリネバクテリウムグルタミカム（Coryneba
cterium glutamicum）の発酵によって製造され得ること
は公知である。分枝アミノ酸は非常に重要であるため、
製造方法を改良する努力が続けられている。方法の改良
は、発酵技術に関する手法、例えば攪拌および酸素供
給、あるいは栄養培地の組成、例えば発酵時の糖濃度、
または製造物の後処理、例えばイオン交換クロマトグラ
フィー、または微生物自体固有の性能特性に及ぶ。
【０００４】微生物の性能特性は、突然変異誘発、選択
および突然変異体の選択という一連の方法により向上す
る。この方法では、イソロイシンの類似体であるイソロ
イシンヒドロキシアメート（isoleucine hydroxyamate,
Kisumi M, Komatsubara S,Sugiura, M, Chibata I (19
72) Journal of Bacteriology 110: 761〜763）、バリ
ンの類似体である２−チアゾールアラニン（Tsuchida
T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H(1975) Agricult
ural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319〜132
2）またはロイシンの類似体であるα−アミノブチレー
ト（AmbeOno Y, Sato K, Totsuka K, Yoshihara Y, Nak
amori S(1996) Bioscience BiotechnologyBiochemistry
60:1368〜1387）のような抗生物質に耐性の株、または
重要な代謝を制御するための、および分枝アミノ酸を製
造するための栄養要求性株（Tsuchida T, Yoshinaga F,
Kubota K, Momose H, Okumura S (1975) Agricultural
and Biological chemistry; Nakayama K, Kitada S, K
inoshita S(1961) Journalof General and Applied Mic
robiology, Japan 7: 52〜69；Nakayama K, Kitada S,
Sato Z, Kinoshita (191) Journal of General and App
lied Microbiology, Japan 7: 41〜51）を獲得できる。
および突然変異体の選択という一連の方法により向上す
る。この方法では、イソロイシンの類似体であるイソロ
イシンヒドロキシアメート（isoleucine hydroxyamate,
Kisumi M, Komatsubara S,Sugiura, M, Chibata I (19
72) Journal of Bacteriology 110: 761〜763）、バリ
ンの類似体である２−チアゾールアラニン（Tsuchida
T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H(1975) Agricult
ural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319〜132
2）またはロイシンの類似体であるα−アミノブチレー
ト（AmbeOno Y, Sato K, Totsuka K, Yoshihara Y, Nak
amori S(1996) Bioscience BiotechnologyBiochemistry
60:1368〜1387）のような抗生物質に耐性の株、または
重要な代謝を制御するための、および分枝アミノ酸を製
造するための栄養要求性株（Tsuchida T, Yoshinaga F,
Kubota K, Momose H, Okumura S (1975) Agricultural
and Biological chemistry; Nakayama K, Kitada S, K
inoshita S(1961) Journalof General and Applied Mic
robiology, Japan 7: 52〜69；Nakayama K, Kitada S,
Sato Z, Kinoshita (191) Journal of General and App
lied Microbiology, Japan 7: 41〜51）を獲得できる。
【０００５】近年では、分枝アミノ酸産生コリネバクテ
リウム株の株改良のために、個々の分枝アミノ酸生合成
遺伝子を増幅してアミノ酸産生への効果を研究するとい
う、組み合えＤＮＡ技術を利用した方法が用いられる。
このことを確認する文献として、特に、Kinoshita（“G
lutamic Acid Bacteria”, Biology of Industrial Mic
roorganisms, Demain and Solomon（編集）, Benjamin
Cummings, London, UK, 1985, 115〜142）、Hilliger
（BioTec 2, 40〜44（1991））、Eggeling（Amino Acid
s 6: 261〜272（1994））、JettenおよびSinskey（Crit
ical Reviews inBiotechnology 15, 73〜103（199
5））、Sahm等（Annuals of the New York Academy of
Science 782, 25〜39（1996））、およびEggeling等（J
ournal of Biotechnology 56: 168〜180（1997））が挙
げられる。
リウム株の株改良のために、個々の分枝アミノ酸生合成
遺伝子を増幅してアミノ酸産生への効果を研究するとい
う、組み合えＤＮＡ技術を利用した方法が用いられる。
このことを確認する文献として、特に、Kinoshita（“G
lutamic Acid Bacteria”, Biology of Industrial Mic
roorganisms, Demain and Solomon（編集）, Benjamin
Cummings, London, UK, 1985, 115〜142）、Hilliger
（BioTec 2, 40〜44（1991））、Eggeling（Amino Acid
s 6: 261〜272（1994））、JettenおよびSinskey（Crit
ical Reviews inBiotechnology 15, 73〜103（199
5））、Sahm等（Annuals of the New York Academy of
Science 782, 25〜39（1996））、およびEggeling等（J
ournal of Biotechnology 56: 168〜180（1997））が挙
げられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、分枝
アミノ酸の発酵的製造に改良を加えた新規方法を提供す
ることである。
アミノ酸の発酵的製造に改良を加えた新規方法を提供す
ることである。
【０００７】分枝アミノ酸は、医薬品工業において、ま
たヒト用医薬品および動物用栄養剤に使用される。分枝
アミノ酸を製造するための新規に改良された方法を提供
することに、多大な関心が集まっている。
たヒト用医薬品および動物用栄養剤に使用される。分枝
アミノ酸を製造するための新規に改良された方法を提供
することに、多大な関心が集まっている。
【０００８】以後、分枝アミノ酸と言えば、特にＬ−イ
ソロイシン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンを意味する
ものとする。
ソロイシン、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンを意味する
ものとする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、 ａ）配列番号３または５のアミノ酸配列を少なくとも１
つ含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
と少なくとも７０％の一致を示すポリヌクレオチド ｂ）配列番号３または５のアミノ酸配列と少なくとも７
０％の一致を示すアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に相補的なポリヌ
クレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の、
少なくとも１５個の連続した塩基を含有するポリヌクレ
オチドから成る群より選択されるポリヌクレオチドを少
なくとも１つ含有する、単離されたポリヌクレオチドを
提供する。
つ含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
と少なくとも７０％の一致を示すポリヌクレオチド ｂ）配列番号３または５のアミノ酸配列と少なくとも７
０％の一致を示すアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に相補的なポリヌ
クレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の、
少なくとも１５個の連続した塩基を含有するポリヌクレ
オチドから成る群より選択されるポリヌクレオチドを少
なくとも１つ含有する、単離されたポリヌクレオチドを
提供する。
【００１０】本発明はまた、コリネフォルムバクテリア
中で複製可能であり、かつ有利に、少なくとも配列番号
１および配列番号６に示される遺伝子ｂｒｎＦおよび／
またはｂｒｎＥをコードするヌクレオチド配列を含有す
るコリネバクテリアに由来した、組み換えＤＮＡを提供
する。
中で複製可能であり、かつ有利に、少なくとも配列番号
１および配列番号６に示される遺伝子ｂｒｎＦおよび／
またはｂｒｎＥをコードするヌクレオチド配列を含有す
るコリネバクテリアに由来した、組み換えＤＮＡを提供
する。
【００１１】本発明は、さらに、（ｉ）ｂｒｎＥおよび
／またはｂｒｎＦ遺伝子をコードする、配列番号１また
は配列番号６のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）遺伝
暗号の縮重の範囲内で配列（ｉ）に相当する少なくとも
１つの配列、または（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉ
ｉ）と相補的な配列にハイブリダイズする少なくとも１
つの配列、場合により、（ｉｖ）（ｉ）の機能中立セン
ス突然変異を有する、請求項１記載の組み換えＤＮＡを
提供する。
／またはｂｒｎＦ遺伝子をコードする、配列番号１また
は配列番号６のヌクレオチド配列、または（ｉｉ）遺伝
暗号の縮重の範囲内で配列（ｉ）に相当する少なくとも
１つの配列、または（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉ
ｉ）と相補的な配列にハイブリダイズする少なくとも１
つの配列、場合により、（ｉｖ）（ｉ）の機能中立セン
ス突然変異を有する、請求項１記載の組み換えＤＮＡを
提供する。
【００１２】本発明は、配列番号１、２、４または６か
ら選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つを含有
する請求項２記載のポリヌクレオチド、配列番号３また
は５記載のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有するポリ
ペプチドをコードする、請求項２記載のポリヌクレオチ
ド、請求項１記載のポリヌクレオチドを１つまたは複数
を有するか、あるいは配列番号１または６のＤＮＡ配列
を有するベクター、およびベクターを有しかつ宿主細胞
として機能するコリネフォルムバクテリアをも提供す
る。
ら選択されたヌクレオチド配列の少なくとも１つを含有
する請求項２記載のポリヌクレオチド、配列番号３また
は５記載のアミノ酸配列を少なくとも１つ含有するポリ
ペプチドをコードする、請求項２記載のポリヌクレオチ
ド、請求項１記載のポリヌクレオチドを１つまたは複数
を有するか、あるいは配列番号１または６のＤＮＡ配列
を有するベクター、およびベクターを有しかつ宿主細胞
として機能するコリネフォルムバクテリアをも提供す
る。
【００１３】本発明はさらに、配列番号１、２、４また
は６のポリヌクレオチドを有する完全な遺伝子を含有す
る好適な遺伝子ライブラリーと配列番号１、２、４また
は６の前記ポリヌクレオチドあるいはその断片を有する
プローブとをハイブリダイゼーションし、該ＤＮＡ配列
を単離してスクリーニングすることによって獲得できる
ポリヌクレオチド配列を実質的に１つ含有するポリヌク
レオチドを提供する。
は６のポリヌクレオチドを有する完全な遺伝子を含有す
る好適な遺伝子ライブラリーと配列番号１、２、４また
は６の前記ポリヌクレオチドあるいはその断片を有する
プローブとをハイブリダイゼーションし、該ＤＮＡ配列
を単離してスクリーニングすることによって獲得できる
ポリヌクレオチド配列を実質的に１つ含有するポリヌク
レオチドを提供する。
【００１４】本発明のポリヌクレオチド配列は、イソロ
イシン、ロイシンまたはバリンの排出に携わるタンパク
質をコードするｃＤＮＡの全長を単離する際に、および
ｂｒｎＦおよび／またはｂｒｎＥ遺伝子と高い類似性を
示す配列を有するこのようなｃＤＮＡまたは遺伝子を単
離する際に必要なＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡ用のハ
イブリダイゼーションプローブとして好適である。
イシン、ロイシンまたはバリンの排出に携わるタンパク
質をコードするｃＤＮＡの全長を単離する際に、および
ｂｒｎＦおよび／またはｂｒｎＥ遺伝子と高い類似性を
示す配列を有するこのようなｃＤＮＡまたは遺伝子を単
離する際に必要なＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡ用のハ
イブリダイゼーションプローブとして好適である。
【００１５】本発明のポリヌクレオチド配列はまた、プ
ライマーとして好適であり、これを用いてポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、イソロイシン、ロイシンま
たはバリン排出タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを
製造することができる。
ライマーとして好適であり、これを用いてポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、イソロイシン、ロイシンま
たはバリン排出タンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡを
製造することができる。
【００１６】プローブまたはプライマーとして機能する
このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０、有
利に少なくとも２０，特に有利に少なくとも１５の連続
したヌクレオチドを有する。少なくとも４０または５０
の塩基対長さを有するオリゴヌクレオチドもまた好適で
ある。
このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも３０、有
利に少なくとも２０，特に有利に少なくとも１５の連続
したヌクレオチドを有する。少なくとも４０または５０
の塩基対長さを有するオリゴヌクレオチドもまた好適で
ある。
【００１７】“単離”とは、本来の環境から分離すると
いう意味である。
いう意味である。
【００１８】“ポリヌクレオチド”とは、一般的にポリ
リボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド
であり、この際、ＲＮＡまたはＤＮＡは修飾されていな
くても修飾されていてもよい。
リボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチド
であり、この際、ＲＮＡまたはＤＮＡは修飾されていな
くても修飾されていてもよい。
【００１９】“ポリペプチド”とは、ペプチド結合によ
って連結された２つ以上のアミノ酸から成るペプチドま
たはタンパク質を意味する。
って連結された２つ以上のアミノ酸から成るペプチドま
たはタンパク質を意味する。
【００２０】本発明のポリペプチドには、配列番号３お
よび／または５のポリペプチド、特に分枝アミノ酸輸送
の生物活性を有するポリペプチドおよび配列番号３およ
び／または５のポリペプチドと少なくとも７０％の同一
性を示し、配列番号３および／または５のポリペプチド
と有利に８０％の同一性を示し、特に有利に９０〜９５
％の同一性を示し、かつ該活性を有するポリペプチドが
含まれる。
よび／または５のポリペプチド、特に分枝アミノ酸輸送
の生物活性を有するポリペプチドおよび配列番号３およ
び／または５のポリペプチドと少なくとも７０％の同一
性を示し、配列番号３および／または５のポリペプチド
と有利に８０％の同一性を示し、特に有利に９０〜９５
％の同一性を示し、かつ該活性を有するポリペプチドが
含まれる。
【００２１】本発明は、また、前記の複製可能なＤＮＡ
の導入により形質転換したコリネフォルム微生物、特に
コリネバクテリウムを提供する。
の導入により形質転換したコリネフォルム微生物、特に
コリネバクテリウムを提供する。
【００２２】さらに本発明は、特に、もともと分枝アミ
ノ酸を製造しており、かつその中で分枝アミノ酸の排出
をコードするｂｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子の
ヌクレオチド配列を増幅、有利に過剰発現しているコリ
ネフォルムバクテリアを使用した、分枝アミノ酸の発酵
的製法に関する。
ノ酸を製造しており、かつその中で分枝アミノ酸の排出
をコードするｂｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子の
ヌクレオチド配列を増幅、有利に過剰発現しているコリ
ネフォルムバクテリアを使用した、分枝アミノ酸の発酵
的製法に関する。
【００２３】これに関連して“増幅”という用語は、例
えば遺伝子のコピー数を増加させたり、強力なプロモー
ターや高い活性を有する相当の酵素（タンパク質）をコ
ードする遺伝子を使用したり、場合によりこれらの方法
を組み合わせたりして、微生物における相当のＤＮＡで
コードされた酵素（タンパク質）の１つ以上の細胞内活
性を上昇させることを意味する。
えば遺伝子のコピー数を増加させたり、強力なプロモー
ターや高い活性を有する相当の酵素（タンパク質）をコ
ードする遺伝子を使用したり、場合によりこれらの方法
を組み合わせたりして、微生物における相当のＤＮＡで
コードされた酵素（タンパク質）の１つ以上の細胞内活
性を上昇させることを意味する。
【００２４】本発明で提供される微生物は、グルコー
ス、スクロース、ラクトース、マンノース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから、あ
るいはグリセロールとエタノールとから、分枝アミノ酸
を製造できる。微生物にはコリネフォルムバクテリアの
典型例、特にコリネバクテリウム属が含まれる。コリネ
バクテリウム属の中でもコリネバクテリウム グルタミ
カムは特に有利であり、そのＬ−アミノ酸産生能により
専門家に公知である。
ス、スクロース、ラクトース、マンノース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、デンプン、セルロースから、あ
るいはグリセロールとエタノールとから、分枝アミノ酸
を製造できる。微生物にはコリネフォルムバクテリアの
典型例、特にコリネバクテリウム属が含まれる。コリネ
バクテリウム属の中でもコリネバクテリウム グルタミ
カムは特に有利であり、そのＬ−アミノ酸産生能により
専門家に公知である。
【００２５】コリネバクテリウム属の好適な株は、特に
コリネバクテリウム属グルタミカム種であり、特に公知
の野生株は： コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ （Brevibacterium flavum） ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９および （Brevibacterium lactofermentum） ブレビバクテリウム ジバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０ （Brevibacterium divaricatum） であり、これらから製造される分枝アミノ酸産生突然変異体または株、例えば、 イソロイシン産生株の コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４３０９ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４３１０ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４３１１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１５１６８ コリネバクテリウム アンモニアジーン ＡＴＣＣ６８７１ （Corynebacterium ammoniagenes） であり、ロイシン産生株の コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ２１８８５ ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ２１８８９ であり、またはバリン産生株の コリネバクテリウム グルタミカム ＤＳＭ１２４５５ コリネバクテリウム グルタミカム ＦＥＲＭ−Ｐ９３２５ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−Ｐ９３２４ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−ＢＰ１７６３ である。
コリネバクテリウム属グルタミカム種であり、特に公知
の野生株は： コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２ ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７ （Brevibacterium flavum） ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＡＴＣＣ１３８６９および （Brevibacterium lactofermentum） ブレビバクテリウム ジバリカタム ＡＴＣＣ１４０２０ （Brevibacterium divaricatum） であり、これらから製造される分枝アミノ酸産生突然変異体または株、例えば、 イソロイシン産生株の コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４３０９ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４３１０ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４３１１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１５１６８ コリネバクテリウム アンモニアジーン ＡＴＣＣ６８７１ （Corynebacterium ammoniagenes） であり、ロイシン産生株の コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ２１８８５ ブレビバクテリウム フラバム ＡＴＣＣ２１８８９ であり、またはバリン産生株の コリネバクテリウム グルタミカム ＤＳＭ１２４５５ コリネバクテリウム グルタミカム ＦＥＲＭ−Ｐ９３２５ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−Ｐ９３２４ ブレビバクテリウム ラクトフェルメンタム ＦＥＲＭ−ＢＰ１７６３ である。
【００２６】コリネバクテリウム グルタミカムから新
規ｂｒｎＥおよびｂｒｎＦ遺伝子を単離することに成功
した。最初に、ｂｒｎＦまたはｂｒｎＥの欠損したコリ
ネバクテリウム グルタミカム突然変異体を製造するこ
とにより、遺伝子を単離する。このために、好適な出発
株、例えばＡＴＣＣ１４７５２またはＡＴＣＣ１３０３
２に対して突然変異誘発法を実行する。
規ｂｒｎＥおよびｂｒｎＦ遺伝子を単離することに成功
した。最初に、ｂｒｎＦまたはｂｒｎＥの欠損したコリ
ネバクテリウム グルタミカム突然変異体を製造するこ
とにより、遺伝子を単離する。このために、好適な出発
株、例えばＡＴＣＣ１４７５２またはＡＴＣＣ１３０３
２に対して突然変異誘発法を実行する。
【００２７】古典的な突然変異誘発法は、Ｎ−メチル−
Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような化学薬品
の処理またはＵＶ照射である。突然変異を誘発するこの
種の方法は一般公知であり、特にMillerの文献（A Shor
t Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manua
l and Handbook for Escherichia coli and RelatedBac
teria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 199
2)）またはアメリカ細菌学会のマニュアル“Manual of
Methods for General Bacteriology”（Washington D.
C., USA, 1981）に記載されている。
Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのような化学薬品
の処理またはＵＶ照射である。突然変異を誘発するこの
種の方法は一般公知であり、特にMillerの文献（A Shor
t Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manua
l and Handbook for Escherichia coli and RelatedBac
teria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 199
2)）またはアメリカ細菌学会のマニュアル“Manual of
Methods for General Bacteriology”（Washington D.
C., USA, 1981）に記載されている。
【００２８】その他の突然変異誘発法は、トランスポゾ
ンのＤＮＡ配列への“可動”性を利用した、トランスポ
ゾンによる突然変異誘発法であり、これにより関連遺伝
子の機能が破壊または抑制される。コリネフォルムバク
テリアのトランスポゾンは専門家に公知である。エリス
ロマイシン耐性トランスポゾンＴｎ５４３２（Tauch
等、Plasmid(1995)33：168〜179）およびクロラムフェ
ニコール耐性トランスポゾンＴｎ５５４６はコリネバク
テリウム キセローシス（Corynebacterium xerosis）
Ｍ８２Ｂ株から、相応に単離されている。Tauch等は（P
lasmid（1995）34：119〜131およびPlasmid（1998）4
0：126〜139）これらのトランスポゾンによる突然変異
誘発が可能なことを実証した。
ンのＤＮＡ配列への“可動”性を利用した、トランスポ
ゾンによる突然変異誘発法であり、これにより関連遺伝
子の機能が破壊または抑制される。コリネフォルムバク
テリアのトランスポゾンは専門家に公知である。エリス
ロマイシン耐性トランスポゾンＴｎ５４３２（Tauch
等、Plasmid(1995)33：168〜179）およびクロラムフェ
ニコール耐性トランスポゾンＴｎ５５４６はコリネバク
テリウム キセローシス（Corynebacterium xerosis）
Ｍ８２Ｂ株から、相応に単離されている。Tauch等は（P
lasmid（1995）34：119〜131およびPlasmid（1998）4
0：126〜139）これらのトランスポゾンによる突然変異
誘発が可能なことを実証した。
【００２９】その他のトランスポゾンには、Ankri等の
記載するトランスポゾンＴｎ５５３１があり（Journal
of Bacteriology（1996）178：4412〜4419）、これを本
発明の実施例において使用している。トランスポゾンＴ
ｎ５５３１は、ａｐｈ３カナマイシン耐性遺伝子を含有
しており、図１に示したプラスミドベクターｐＣＧＬ０
０４０の形で使用される。トランスポゾンＴｎ５５３１
のヌクレオチド配列は、登録番号Ｕ５３５８７としてＮ
ＣＢＩ（National Center for BiotechnologyInformati
on, Bethesda, MD, USA）からいつでも入手できる。
記載するトランスポゾンＴｎ５５３１があり（Journal
of Bacteriology（1996）178：4412〜4419）、これを本
発明の実施例において使用している。トランスポゾンＴ
ｎ５５３１は、ａｐｈ３カナマイシン耐性遺伝子を含有
しており、図１に示したプラスミドベクターｐＣＧＬ０
０４０の形で使用される。トランスポゾンＴｎ５５３１
のヌクレオチド配列は、登録番号Ｕ５３５８７としてＮ
ＣＢＩ（National Center for BiotechnologyInformati
on, Bethesda, MD, USA）からいつでも入手できる。
【００３０】突然変異誘発、有利にトランスポゾンによ
り突然変異誘発を実行し、ｂｒｎＦまたはｂｒｎＥを欠
損した突然変異体を探す。ｂｒｎＦまたはｂｒｎＥを欠
損した突然変異体は、最小アガー培地上では良好に増殖
するのに対して、ジペプチドであるイソロイシル−イソ
ロイシンのような分枝アミノ酸を含むオリゴペプチドを
補足した最小アガー培地上では殆ど増殖しないという事
実から識別される。
り突然変異誘発を実行し、ｂｒｎＦまたはｂｒｎＥを欠
損した突然変異体を探す。ｂｒｎＦまたはｂｒｎＥを欠
損した突然変異体は、最小アガー培地上では良好に増殖
するのに対して、ジペプチドであるイソロイシル−イソ
ロイシンのような分枝アミノ酸を含むオリゴペプチドを
補足した最小アガー培地上では殆ど増殖しないという事
実から識別される。
【００３１】このような突然変異株の１つの例はＡＴＣ
Ｃ１４７５２ｂｒｎＥ：：Ｔｎ５５３１である。
Ｃ１４７５２ｂｒｎＥ：：Ｔｎ５５３１である。
【００３２】このような方法で製造される株を、ｂｒｎ
Ｆおよび／またはｂｒｎＥのクローニングおよび塩基配
列決定に使用する。
Ｆおよび／またはｂｒｎＥのクローニングおよび塩基配
列決定に使用する。
【００３３】このために、バクテリアの遺伝子ライブラ
リーを注意深く作製する。遺伝子ライブラリーの作製
は、一般的な文献およびマニュアルに記載されている。
その例は、Winnacker等のテキスト、Gene und Klone, E
ine Einfuehrung in die Gentechnologie（Verlag Chem
ie, Weinheim, Germany, 1990）またはSambrook等のマ
ニュアル、Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）であ
る。非常によく知られた遺伝子ライブラリーは、エシェ
リキア コリ Ｋ−１２株Ｗ３１１０であり、これはKo
hara等によってλ−ベクター中に作製されたものである
（Cell 50, 495〜508（1987））。Bathe等（Molecular
and General Genetics, 252：255〜265, 1996）はコリ
ネバクテリウムグルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２の遺
伝子ライブラリーを記載しており、これはエシェリキア
コリ Ｋ−１２株ＮＭ５５４（Raleigh等, 1988, Nuc
leic Acids Research 16：1563〜1575）のコスミドベク
ターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl等, 1987, Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 84：2160
〜2164）を使用して作製されたものである。本発明に好
適なベクターは、コリネフォルムバクテリア、有利にコ
リネバクテリウム グルタミカム中で複製可能なベクタ
ーである。このようなベクターは当業者に公知であり；
その１つの例はプラスミドベクターｐＺ１であり、Menk
el等によって記載されている（Applied and Environmen
tal Microbiology（1989）64：549〜554）。次に、前記
方法で獲得された遺伝子ライブラリーを、ｂｒｎＦまた
はｂｒｎＥを欠損させた指示株中に形質転換またはエレ
クトロポレーションにより移入し、分枝アミノ酸を含む
オリゴペプチドの存在する最小アガー培地上で増殖可能
な形質転換体を探す。次いでクローン化したＤＮＡ断片
の配列分析を実施する。
リーを注意深く作製する。遺伝子ライブラリーの作製
は、一般的な文献およびマニュアルに記載されている。
その例は、Winnacker等のテキスト、Gene und Klone, E
ine Einfuehrung in die Gentechnologie（Verlag Chem
ie, Weinheim, Germany, 1990）またはSambrook等のマ
ニュアル、Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）であ
る。非常によく知られた遺伝子ライブラリーは、エシェ
リキア コリ Ｋ−１２株Ｗ３１１０であり、これはKo
hara等によってλ−ベクター中に作製されたものである
（Cell 50, 495〜508（1987））。Bathe等（Molecular
and General Genetics, 252：255〜265, 1996）はコリ
ネバクテリウムグルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２の遺
伝子ライブラリーを記載しており、これはエシェリキア
コリ Ｋ−１２株ＮＭ５５４（Raleigh等, 1988, Nuc
leic Acids Research 16：1563〜1575）のコスミドベク
ターＳｕｐｅｒＣｏｓＩ（Wahl等, 1987, Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 84：2160
〜2164）を使用して作製されたものである。本発明に好
適なベクターは、コリネフォルムバクテリア、有利にコ
リネバクテリウム グルタミカム中で複製可能なベクタ
ーである。このようなベクターは当業者に公知であり；
その１つの例はプラスミドベクターｐＺ１であり、Menk
el等によって記載されている（Applied and Environmen
tal Microbiology（1989）64：549〜554）。次に、前記
方法で獲得された遺伝子ライブラリーを、ｂｒｎＦまた
はｂｒｎＥを欠損させた指示株中に形質転換またはエレ
クトロポレーションにより移入し、分枝アミノ酸を含む
オリゴペプチドの存在する最小アガー培地上で増殖可能
な形質転換体を探す。次いでクローン化したＤＮＡ断片
の配列分析を実施する。
【００３４】コリネバクテリウムのＴｎ５５３１突然変
異誘発、例えばＡＴＣＣ１４７５２ｂｒｎＥ：：Ｔｎ５
５３１によって製造された突然変異体を使用する場合、
ｂｒｎＥ：：Ｔｎ５５３１の対立遺伝子を直接クローン
化し、含有するカナマイシン耐性遺伝子ａｐｈ３を利用
して単離してもよい。公知のクローニングベクター、例
えばｐＵＣ１８（Norrander等、Gene（1983）26：101〜
106およびYanisch-Perron等、Gene（1985）33：103〜11
9）をこの目的のために使用する。好適なクローニング
宿主は、特にエシェリキア コリの制限および組み換え
による欠損株である。このような株の１つの例は、ＤＨ
５αｍｃｒであり、Grant等によって記載されている（P
roceedings of the National Academy of Sciences US
A, 87（1990）4645〜4649）。形質転換体の選択をカナ
マイシンの存在下に実行する。次に、得られた形質転換
体のプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定する。Sanger等
のジデオキシチェーンターミネーション法（Proceeding
s of the National Academy of Sciences of the Unite
d States of America USA（1977）74：5463〜5467）を
この目的のために利用する。この方法を利用することに
より、Ｔｎ５５３１の挿入部位の上流および下流に位置
する遺伝子を獲得できる。次いで、得られたヌクレオチ
ド配列を分析し、市販の配列分析ソフトウェア、例えば
レーザージーンパッケージ（Lasergene package, Bioco
mputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, US
A）またはＨＵＳＡＲパッケージ（リリース４.０, EMB
L, Heidelberg, Germany）を用いて組み立てる。
異誘発、例えばＡＴＣＣ１４７５２ｂｒｎＥ：：Ｔｎ５
５３１によって製造された突然変異体を使用する場合、
ｂｒｎＥ：：Ｔｎ５５３１の対立遺伝子を直接クローン
化し、含有するカナマイシン耐性遺伝子ａｐｈ３を利用
して単離してもよい。公知のクローニングベクター、例
えばｐＵＣ１８（Norrander等、Gene（1983）26：101〜
106およびYanisch-Perron等、Gene（1985）33：103〜11
9）をこの目的のために使用する。好適なクローニング
宿主は、特にエシェリキア コリの制限および組み換え
による欠損株である。このような株の１つの例は、ＤＨ
５αｍｃｒであり、Grant等によって記載されている（P
roceedings of the National Academy of Sciences US
A, 87（1990）4645〜4649）。形質転換体の選択をカナ
マイシンの存在下に実行する。次に、得られた形質転換
体のプラスミドＤＮＡの塩基配列を決定する。Sanger等
のジデオキシチェーンターミネーション法（Proceeding
s of the National Academy of Sciences of the Unite
d States of America USA（1977）74：5463〜5467）を
この目的のために利用する。この方法を利用することに
より、Ｔｎ５５３１の挿入部位の上流および下流に位置
する遺伝子を獲得できる。次いで、得られたヌクレオチ
ド配列を分析し、市販の配列分析ソフトウェア、例えば
レーザージーンパッケージ（Lasergene package, Bioco
mputing Software for Windows, DNASTAR, Madison, US
A）またはＨＵＳＡＲパッケージ（リリース４.０, EMB
L, Heidelberg, Germany）を用いて組み立てる。
【００３５】分枝アミノ酸排出をコードし、かつｂｒｎ
ＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のコード領域を示す配列番号
１、配列番号２および配列番号４として本発明により提
供される、コリネバクテリウム グルタミカムの新規Ｄ
ＮＡ配列を獲得するために、この方法を利用する。配列
番号３および配列番号５は、それぞれ配列番号１または
配列番号２および配列番号４から得られる遺伝子産物の
アミノ酸配列を示している。
ＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のコード領域を示す配列番号
１、配列番号２および配列番号４として本発明により提
供される、コリネバクテリウム グルタミカムの新規Ｄ
ＮＡ配列を獲得するために、この方法を利用する。配列
番号３および配列番号５は、それぞれ配列番号１または
配列番号２および配列番号４から得られる遺伝子産物の
アミノ酸配列を示している。
【００３６】遺伝暗号の縮重を起こしたコーディングＤ
ＮＡもまた、本発明により提供される。配列番号１また
は配列番号１の一部とハイブリダイズするＤＮＡ配列も
同様に本発明により提供される。タンパク質中でのアミ
ノ酸の保存的な置換、例えばグリシンからアラニンへの
置換またはアスパラギン酸からグルタミン酸への置換は
“センス突然変異”として専門家に公知であり、これに
よるタンパク質の活性に関する機能的変化は生じない、
すなわちこれらの置換は機能的に中立である。タンパク
質のＮおよび／またはＣ末端の変化は、実質的に機能障
害を起こさず、機能を安定化することさえあることも公
知である。当業者は、これに関する情報を特に、Ben-Ba
ssat等の文献（Journal of Bacteriology 169：751〜75
7（1987））、O'Regan等の文献（Gene77：237〜251（19
89））、Sahin-Toth等の文献（Protein Sciences3：240
〜247（1994））、Hochuli等（Bio/Technology6：1321
〜1325（1988））、遺伝子および分子生物学に関する公
知のテキストから見出すことができる。相当の方法で配
列番号２または配列番号４から生じるアミノ酸配列も本
発明により提供される。
ＮＡもまた、本発明により提供される。配列番号１また
は配列番号１の一部とハイブリダイズするＤＮＡ配列も
同様に本発明により提供される。タンパク質中でのアミ
ノ酸の保存的な置換、例えばグリシンからアラニンへの
置換またはアスパラギン酸からグルタミン酸への置換は
“センス突然変異”として専門家に公知であり、これに
よるタンパク質の活性に関する機能的変化は生じない、
すなわちこれらの置換は機能的に中立である。タンパク
質のＮおよび／またはＣ末端の変化は、実質的に機能障
害を起こさず、機能を安定化することさえあることも公
知である。当業者は、これに関する情報を特に、Ben-Ba
ssat等の文献（Journal of Bacteriology 169：751〜75
7（1987））、O'Regan等の文献（Gene77：237〜251（19
89））、Sahin-Toth等の文献（Protein Sciences3：240
〜247（1994））、Hochuli等（Bio/Technology6：1321
〜1325（1988））、遺伝子および分子生物学に関する公
知のテキストから見出すことができる。相当の方法で配
列番号２または配列番号４から生じるアミノ酸配列も本
発明により提供される。
【００３７】配列番号１のヌクレオチド配列を使用し
て、好適なプライマーを合成することができ、それらを
ポリメラーゼ連結反応（ＰＣＲ）に使用することによ
り、様々なコリネフォルムバクテリアおよび株のｂｒｎ
ＦおよびｂｒｎＥ遺伝子を増幅することができる。当業
者はこのことを、特にGait等のテキストであるOligonuc
leotide synthesis: a practical approach（IRL Press
,Oxford, UK, 1984）とNewtonおよびGrahamのテキスト
であるＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Heidel
berg, Germany, 1994）に見出すことができる。さら
に、特にコリネフォルムバクテリアの遺伝子ライブラリ
ーから、ｂｒｎＦおよび／またはｂｒｎＥ遺伝子を見出
すためのプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配
列またはその一部分を使用することもできる。これに関
する教示を、当業者は特にBoehringer Mannheim GmbH
（Mannheim, Germany, 1991）によるマニュアル“The D
IG SystemUsers Guide for filter Hybridization”お
よびLiebl等の文献（InternationalJournal of Systema
tic Bacteriology（1991）41：255〜260）に見出すこと
ができる。この方法で増幅されたｂｒｎＥおよびｂｒｎ
Ｆ遺伝子を有するＤＮＡ断片を、次いで、クローン化し
て塩基配列を決定する。
て、好適なプライマーを合成することができ、それらを
ポリメラーゼ連結反応（ＰＣＲ）に使用することによ
り、様々なコリネフォルムバクテリアおよび株のｂｒｎ
ＦおよびｂｒｎＥ遺伝子を増幅することができる。当業
者はこのことを、特にGait等のテキストであるOligonuc
leotide synthesis: a practical approach（IRL Press
,Oxford, UK, 1984）とNewtonおよびGrahamのテキスト
であるＰＣＲ（Spektrum Akademischer Verlag, Heidel
berg, Germany, 1994）に見出すことができる。さら
に、特にコリネフォルムバクテリアの遺伝子ライブラリ
ーから、ｂｒｎＦおよび／またはｂｒｎＥ遺伝子を見出
すためのプローブとして、配列番号１のヌクレオチド配
列またはその一部分を使用することもできる。これに関
する教示を、当業者は特にBoehringer Mannheim GmbH
（Mannheim, Germany, 1991）によるマニュアル“The D
IG SystemUsers Guide for filter Hybridization”お
よびLiebl等の文献（InternationalJournal of Systema
tic Bacteriology（1991）41：255〜260）に見出すこと
ができる。この方法で増幅されたｂｒｎＥおよびｂｒｎ
Ｆ遺伝子を有するＤＮＡ断片を、次いで、クローン化し
て塩基配列を決定する。
【００３８】配列番号６に示されるＡＴＣＣ１３０３２
株のｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のＤＮＡ配列をこの
方法により獲得し、これも本発明により提供される。
株のｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のＤＮＡ配列をこの
方法により獲得し、これも本発明により提供される。
【００３９】改良した方法において、いったんｂｒｎＦ
および／またはｂｒｎＥ排出遺伝子が過剰発現すると、
コリネフォルムバクテリアが分枝アミノ酸を産生するこ
とが明かとなった。
および／またはｂｒｎＥ排出遺伝子が過剰発現すると、
コリネフォルムバクテリアが分枝アミノ酸を産生するこ
とが明かとなった。
【００４０】過剰発現は、相応する遺伝子のコピー数の
増加またはプロモーターおよび制御領域または構造遺伝
子の上流に位置するリボゾーム−結合部位の突然変異に
よって達成される。構造遺伝子の上流に組み込まれる発
現カセットも同様に機能する。さらに、誘導プロモータ
ーを用いて、分枝アミノ酸を発酵的に製造する間の発現
を増加させることができる。発現は、ｍＲＮＡの寿命を
延長させる方法によっても改良できる。酵素活性は、酵
素タンパク質の分解を抑制することにより、さらに上昇
する。遺伝子または遺伝子構造体は、変化したコピー数
でプラスミド中に存在するか染色体中に統合され、増幅
される。また、関連遺伝子の過剰発現は、栄養培地の組
成および培養条件を変化させることにより達成できる。
増加またはプロモーターおよび制御領域または構造遺伝
子の上流に位置するリボゾーム−結合部位の突然変異に
よって達成される。構造遺伝子の上流に組み込まれる発
現カセットも同様に機能する。さらに、誘導プロモータ
ーを用いて、分枝アミノ酸を発酵的に製造する間の発現
を増加させることができる。発現は、ｍＲＮＡの寿命を
延長させる方法によっても改良できる。酵素活性は、酵
素タンパク質の分解を抑制することにより、さらに上昇
する。遺伝子または遺伝子構造体は、変化したコピー数
でプラスミド中に存在するか染色体中に統合され、増幅
される。また、関連遺伝子の過剰発現は、栄養培地の組
成および培養条件を変化させることにより達成できる。
【００４１】当業者は、この点に関して、特にMartin等
（Bio/Technology 5, 137〜146（1987））、Guerrero等
（Gene 138, 35〜41（1994））、TsuchiyaおよびMorina
ga（Bio/Technology 6, 428〜430）、Eikmanns等（Gene
102, 93〜98（1991））、ＥＰ−Ｂ０４７２８６９、米
国特許第４６０１８９３、SchwarzerおよびPuehler（Bi
o/Technology 9, 84〜87（1991））、Reinscheid等（Ap
plied and Environmental Microbiology 60, 126〜132
（1994））、LaBarre等（Journal of Bacteriology 17
5, 1001〜1007（1993））、ＷＯ９６１５２４６、Malum
bres等（Gene 134, 15〜24（1993））、ＪＰ−Ａ−１０
２２９８９１、JensenおよびHammer（Biotechnology an
d Bioengineering 58, 191〜195（1998））、Makrides
（Microbiological Reviews 60：512〜538（1996））お
よび公知の遺伝子および分子生物学関連のテキストから
手本を見出すことができる。
（Bio/Technology 5, 137〜146（1987））、Guerrero等
（Gene 138, 35〜41（1994））、TsuchiyaおよびMorina
ga（Bio/Technology 6, 428〜430）、Eikmanns等（Gene
102, 93〜98（1991））、ＥＰ−Ｂ０４７２８６９、米
国特許第４６０１８９３、SchwarzerおよびPuehler（Bi
o/Technology 9, 84〜87（1991））、Reinscheid等（Ap
plied and Environmental Microbiology 60, 126〜132
（1994））、LaBarre等（Journal of Bacteriology 17
5, 1001〜1007（1993））、ＷＯ９６１５２４６、Malum
bres等（Gene 134, 15〜24（1993））、ＪＰ−Ａ−１０
２２９８９１、JensenおよびHammer（Biotechnology an
d Bioengineering 58, 191〜195（1998））、Makrides
（Microbiological Reviews 60：512〜538（1996））お
よび公知の遺伝子および分子生物学関連のテキストから
手本を見出すことができる。
【００４２】実施例において、本発明の遺伝子であるｂ
ｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子は、プラスミドを用いて過
剰発現されている。好適なプラスミドはコリネフォルム
バクテリア中で複製可能なプラスミドである。多くの公
知のプラスミドベクターは、例えばｐＺ１（Menkel等,
Applied and Environmental Microbiology（1989）64：
549〜554）、ｐＥＫＥｘ１（Eikamms等、Gene 102：93
〜98（1991））またはｐＨＳ２−１（Sonnen等、Gene 1
07：69〜74（1991））であり、潜在プラスミドｐＨＭ１
５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１を基礎とする。その他
のプラスミドベクターは、例えばｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４
４８９１６０）またはｐＮＧ２（Serwold-Davis等、FEM
S Microbiology Letters 66, 119〜124（1990））を基
礎とするプラスミドであり、またはｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ
５１５８８９１）を同様に使用してもよい。
ｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子は、プラスミドを用いて過
剰発現されている。好適なプラスミドはコリネフォルム
バクテリア中で複製可能なプラスミドである。多くの公
知のプラスミドベクターは、例えばｐＺ１（Menkel等,
Applied and Environmental Microbiology（1989）64：
549〜554）、ｐＥＫＥｘ１（Eikamms等、Gene 102：93
〜98（1991））またはｐＨＳ２−１（Sonnen等、Gene 1
07：69〜74（1991））であり、潜在プラスミドｐＨＭ１
５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１を基礎とする。その他
のプラスミドベクターは、例えばｐＣＧ４（ＵＳ−Ａ４
４８９１６０）またはｐＮＧ２（Serwold-Davis等、FEM
S Microbiology Letters 66, 119〜124（1990））を基
礎とするプラスミドであり、またはｐＡＧ１（ＵＳ−Ａ
５１５８８９１）を同様に使用してもよい。
【００４３】分枝アミノ酸の製造にさらに有利なのは、
新規ｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子に加え、分枝アミノ
酸の公知の生合成経路に関する別の酵素または補充代謝
に関する酵素、またはクエン酸回路に関する酵素をコー
ドする、１つ以上の遺伝子を過剰発現させることであ
る。
新規ｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子に加え、分枝アミノ
酸の公知の生合成経路に関する別の酵素または補充代謝
に関する酵素、またはクエン酸回路に関する酵素をコー
ドする、１つ以上の遺伝子を過剰発現させることであ
る。
【００４４】従って、例えばＬ−イソロイシンの製造の
ために、 ・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｈｏｍ遺伝
子（Peoples等、Molecular Microbiology 2, 63〜72（1
988））または“フィードバック耐性”ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼをコードするｈｏｍdr対立遺伝子（Archer
等、Gene 107, 53〜59（1991））を同時に過剰発現させ
てよく、または ・スレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ遺伝
子（Moeckel等、Journalof Bacteriology（1992）8065
〜8072）または“フィードバック耐性”スレオニンデヒ
ドラターゼをコードするｉｌｖＡ（Ｆｂｒ）対立遺伝子
（Meckel等、(1994) Molecular Microbiology 13：833
〜842）を同時に過剰発現させてよく、または ・アセトヒドロキシ酸の合成をコードするｉｌｖＢＮ遺
伝子（Keilhauer等、（1993）Journal of Bacteriology
175：5595〜5603）を同時に過剰発現させてよく、また
は ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
遺伝子（Sahm und Eggeling（1999）Applied and Envir
onmental Microbiology 65：1973〜1979）を同時に過剰
発現させてよく、または ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）を同時に過剰発現さ
せてよく、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等、European Journal of Biochemistry
254, 395〜403（1998））を同時に過剰発現させてよ
い。
ために、 ・ホモセリンデヒドロゲナーゼをコードするｈｏｍ遺伝
子（Peoples等、Molecular Microbiology 2, 63〜72（1
988））または“フィードバック耐性”ホモセリンデヒ
ドロゲナーゼをコードするｈｏｍdr対立遺伝子（Archer
等、Gene 107, 53〜59（1991））を同時に過剰発現させ
てよく、または ・スレオニンデヒドラターゼをコードするｉｌｖＡ遺伝
子（Moeckel等、Journalof Bacteriology（1992）8065
〜8072）または“フィードバック耐性”スレオニンデヒ
ドラターゼをコードするｉｌｖＡ（Ｆｂｒ）対立遺伝子
（Meckel等、(1994) Molecular Microbiology 13：833
〜842）を同時に過剰発現させてよく、または ・アセトヒドロキシ酸の合成をコードするｉｌｖＢＮ遺
伝子（Keilhauer等、（1993）Journal of Bacteriology
175：5595〜5603）を同時に過剰発現させてよく、また
は ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
遺伝子（Sahm und Eggeling（1999）Applied and Envir
onmental Microbiology 65：1973〜1979）を同時に過剰
発現させてよく、または ・ピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝
子（ＤＥ−Ａ−１９８３１６０９）を同時に過剰発現さ
せてよく、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等、European Journal of Biochemistry
254, 395〜403（1998））を同時に過剰発現させてよ
い。
【００４５】従って、例えばＬ−ロイシンの製造のため
に、 ・リンゴ酸イソプロピル合成をコードするｌｅｕＡ遺伝
子（Patek等、Applied Environmental Microbiology 60
（1994）133〜140）または“フィードバック耐性”リン
ゴ酸イソプロピル合成をコードする対立遺伝子を同時に
過剰発現させてよく、または ・リンゴ酸イソプロピルデヒドラターゼをコードするｌ
ｅｕＣおよびｌｅｕＤ遺伝子（Patek等、Applied Envir
onmental Microbiology 60（1994）133〜140）を同時に
過剰発現させてよく、 ・リンゴ酸イソプロピルデヒドロゲナーゼをコードする
ｌｅｕＢ遺伝子（Patek等、Applied Environmental Mic
robiology 60（1994）133〜140）を同時に過剰発現させ
てよく、または ・アセトヒドロキシ酸の合成をコードするｉｌｖＢＮ遺
伝子（Keilhauer等、（1993）Journal of Bacteriology
175：5595〜5603）を同時に過剰発現させてよく、また
は ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
遺伝子（SahmおよびEggeling（1999）Applied and Envi
ronmental Microbiology 65：1973〜1979）を同時に過
剰発現させてよく、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等, European Journal of Bichemistry
254, 395〜403（1998））を同時に過剰発現させてよ
い。
に、 ・リンゴ酸イソプロピル合成をコードするｌｅｕＡ遺伝
子（Patek等、Applied Environmental Microbiology 60
（1994）133〜140）または“フィードバック耐性”リン
ゴ酸イソプロピル合成をコードする対立遺伝子を同時に
過剰発現させてよく、または ・リンゴ酸イソプロピルデヒドラターゼをコードするｌ
ｅｕＣおよびｌｅｕＤ遺伝子（Patek等、Applied Envir
onmental Microbiology 60（1994）133〜140）を同時に
過剰発現させてよく、 ・リンゴ酸イソプロピルデヒドロゲナーゼをコードする
ｌｅｕＢ遺伝子（Patek等、Applied Environmental Mic
robiology 60（1994）133〜140）を同時に過剰発現させ
てよく、または ・アセトヒドロキシ酸の合成をコードするｉｌｖＢＮ遺
伝子（Keilhauer等、（1993）Journal of Bacteriology
175：5595〜5603）を同時に過剰発現させてよく、また
は ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
遺伝子（SahmおよびEggeling（1999）Applied and Envi
ronmental Microbiology 65：1973〜1979）を同時に過
剰発現させてよく、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等, European Journal of Bichemistry
254, 395〜403（1998））を同時に過剰発現させてよ
い。
【００４６】従って、Ｌ−バリンを製造するために、例
えば ・アセトヒドロキシ酸の合成をコードするｉｌｖＢＮ遺
伝子（Keilhauer等、（1993）Journal of Bacteriology
175：5595〜5603）を同時に過剰発現させてよく、また
は ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
遺伝子（SahmおよびEggeling（1999）Applied and Envi
ronmental Microbiology 65：1973〜1979）を同時に過
剰発現させてよく、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等, European Journal of Bichemistry
254, 395〜403（1998））を同時に過剰発現させてよ
い。
えば ・アセトヒドロキシ酸の合成をコードするｉｌｖＢＮ遺
伝子（Keilhauer等、（1993）Journal of Bacteriology
175：5595〜5603）を同時に過剰発現させてよく、また
は ・ジヒドロキシ酸デヒドラターゼをコードするｉｌｖＤ
遺伝子（SahmおよびEggeling（1999）Applied and Envi
ronmental Microbiology 65：1973〜1979）を同時に過
剰発現させてよく、または ・リンゴ酸：キノン酸化還元酵素をコードするｍｑｏ遺
伝子（Molenaar等, European Journal of Bichemistry
254, 395〜403（1998））を同時に過剰発現させてよ
い。
【００４７】分枝アミノ酸を製造するのにさらに有利で
あるのは、ｂｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子の過
剰発現に加えて、不所望な二次反応を抑制することであ
る（Nakayama: " Breeding of Amino Acid Producing M
icroorganisms": Overproduction of Microbial Produc
ts, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (編集）、AcademicPre
ss, London, UK, 1982）。
あるのは、ｂｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子の過
剰発現に加えて、不所望な二次反応を抑制することであ
る（Nakayama: " Breeding of Amino Acid Producing M
icroorganisms": Overproduction of Microbial Produc
ts, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (編集）、AcademicPre
ss, London, UK, 1982）。
【００４８】分枝アミノ酸を製造するために、本発明の
微生物をバッチ法または供給バッチ法または反復供給バ
ッチ法を利用して、連続的にあるいは断続的に培養して
よい。公知の培養方法の概要は、Chmielのテキスト（Bi
oprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahren
stechnik（Gustav Fischer Verlag, Stuttgart（199
1））またはStorhasのテキスト（Bioreaktoren und per
iphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/
Wiesbaden, 1994））に記載されている。
微生物をバッチ法または供給バッチ法または反復供給バ
ッチ法を利用して、連続的にあるいは断続的に培養して
よい。公知の培養方法の概要は、Chmielのテキスト（Bi
oprozesstechnik 1. Einfuehrung in die Bioverfahren
stechnik（Gustav Fischer Verlag, Stuttgart（199
1））またはStorhasのテキスト（Bioreaktoren und per
iphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/
Wiesbaden, 1994））に記載されている。
【００４９】使用する培地は、特殊な株の要求にも十分
対応すべきである。様々な微生物のための培地は、アメ
リカ細菌学会の“Manual of Methods for General Bact
eriology”（Washington D.C., USA, 1981）に記載され
ている。使用する炭素源には、糖および炭化水素、例え
ばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、スターチおよびセルロース、油
脂および脂肪、例えば大豆油、ひまわり油、ピーナッツ
オイルおよびココナツオイル、脂肪酸、例えばパルミチ
ン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例
えばグリセロールおよびエタノール、および有機酸、例
えば酢酸がある。これらの物質を、単独であるいは混合
して使用してよい。使用する窒素源には、窒素含有化合
物、例えばペプトン、イーストエキストラクト、肉抽出
物、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆ミールお
よび尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウムおよび硝酸アンモニウムがある。窒素源を、単独で
あるいは混合して使用してよい。使用するリン源には、
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリ
ウムあるいは相当のナトリウム塩がある。培地は、増殖
に必須な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩
をさらに含有しなければならない。最後に、不可欠な増
殖−促進物質であるアミノ酸およびビタミンも、前記物
質に加えて添加してよい。好適な前駆物質をさらに培地
に添加してもよい。前記の供給物質を単バッチでまたは
培養中に適当に培地に添加してよい。
対応すべきである。様々な微生物のための培地は、アメ
リカ細菌学会の“Manual of Methods for General Bact
eriology”（Washington D.C., USA, 1981）に記載され
ている。使用する炭素源には、糖および炭化水素、例え
ばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトー
ス、マルトース、糖蜜、スターチおよびセルロース、油
脂および脂肪、例えば大豆油、ひまわり油、ピーナッツ
オイルおよびココナツオイル、脂肪酸、例えばパルミチ
ン酸、ステアリン酸およびリノール酸、アルコール、例
えばグリセロールおよびエタノール、および有機酸、例
えば酢酸がある。これらの物質を、単独であるいは混合
して使用してよい。使用する窒素源には、窒素含有化合
物、例えばペプトン、イーストエキストラクト、肉抽出
物、麦芽エキス、コーンスチープリカー、大豆ミールお
よび尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、
塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニ
ウムおよび硝酸アンモニウムがある。窒素源を、単独で
あるいは混合して使用してよい。使用するリン源には、
リン酸、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリ
ウムあるいは相当のナトリウム塩がある。培地は、増殖
に必須な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩
をさらに含有しなければならない。最後に、不可欠な増
殖−促進物質であるアミノ酸およびビタミンも、前記物
質に加えて添加してよい。好適な前駆物質をさらに培地
に添加してもよい。前記の供給物質を単バッチでまたは
培養中に適当に培地に添加してよい。
【００５０】塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水、また
は酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を、培地のｐＨ
を調整するために、適当に添加してよい。消泡剤、例え
ば脂肪酸ポリグリコールエステルを、泡形成の制御のた
めに使用してよい。選択を可能にする好適な物質、例え
ば抗生物質を、プラスミドの安定性を保持するために培
地に添加してもよい。酸素または酸素含有性の混合気
体、例えば空気を培地に導入して好気性を維持してもよ
い。培養温度は通常２０〜４５℃であり、有利に２５〜
４０℃である。分枝アミノ酸の形成が最高量に達するま
で培養を続ける。通常１０〜１６０時間以内でこの目的
は達せられる。
水酸化カリウム、アンモニアまたはアンモニア水、また
は酸性化合物、例えばリン酸または硫酸を、培地のｐＨ
を調整するために、適当に添加してよい。消泡剤、例え
ば脂肪酸ポリグリコールエステルを、泡形成の制御のた
めに使用してよい。選択を可能にする好適な物質、例え
ば抗生物質を、プラスミドの安定性を保持するために培
地に添加してもよい。酸素または酸素含有性の混合気
体、例えば空気を培地に導入して好気性を維持してもよ
い。培養温度は通常２０〜４５℃であり、有利に２５〜
４０℃である。分枝アミノ酸の形成が最高量に達するま
で培養を続ける。通常１０〜１６０時間以内でこの目的
は達せられる。
【００５１】Spackman等の文献（Analytical Chemistry
30,（1958）,1190）に記載される陰イオン交換カラム
クロマトグラフィーと続くニンヒドリン誘導体化によ
り、またはLindroty等の文献（Analytical Chemistry
（1979）51：1167〜1174）に記載される逆相ＨＰＬＣに
より、分枝アミノ酸を分析できる。
30,（1958）,1190）に記載される陰イオン交換カラム
クロマトグラフィーと続くニンヒドリン誘導体化によ
り、またはLindroty等の文献（Analytical Chemistry
（1979）51：1167〜1174）に記載される逆相ＨＰＬＣに
より、分枝アミノ酸を分析できる。
【００５２】以下の微生物は、ブタベスト条約に基づ
き、ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung fuer Microganisme
n und Zellkulturen, Braunschweig, Germany）に寄託
されている： ・ＤＳＭ１２８３９として寄託されたエシェリキア コ
リ ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ００４０株。
き、ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung fuer Microganisme
n und Zellkulturen, Braunschweig, Germany）に寄託
されている： ・ＤＳＭ１２８３９として寄託されたエシェリキア コ
リ ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ００４０株。
【００５３】
【実施例】本発明を以下の実施例により、詳細に説明す
る。
る。
【００５４】エシェリキア コリ（Escherichia coli）
からのプラスミドＤＮＡの単離および、制限、クレノウ
処理ならびにアルカリホスファターゼ処理技術の全て
を、Sambrook等の記載に従って実施した（Molecular cl
oning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harb
or Laboratory Press）。特に記載しないかぎり、エシ
ェリキア コリの形質転換を、Chung等の方法に従って
実施した（Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America(1989)86：2
172〜2175）。
からのプラスミドＤＮＡの単離および、制限、クレノウ
処理ならびにアルカリホスファターゼ処理技術の全て
を、Sambrook等の記載に従って実施した（Molecular cl
oning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harb
or Laboratory Press）。特に記載しないかぎり、エシ
ェリキア コリの形質転換を、Chung等の方法に従って
実施した（Proceedings of the National Academy of S
ciences of the United States of America(1989)86：2
172〜2175）。
【００５５】例１ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５
２のｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のクローニングおよ
び塩基配列決定 １. トランスポゾンによる突然変異誘発 ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Inform
ation , Bethesda, USA）のヌクレオチドデータベース
に、登録番号Ｕ５３５８７として寄託された配列を有す
るトランスポゾンＴｎ５５３１を使用して、コリネバク
テリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５２株に突然
変異を誘発した。メチラーゼ−欠損エシェリキア コリ
ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ００４０（エシェリキア コリ
ＧＭ２９２９：Palmer等、Gene (1994) 143:1〜12）
から、トランスポゾンＴｎ５５３１（Ankri等、Journal
of Bacteriology (1996)178：4412〜4419）を有するプ
ラスミドｐＣＧＬ００４０を単離した。プラスミドｐＣ
ＧＬ００４０を用いて、エレクトロポレーション（Hayn
es等, FEMS Microbiology Letters (1989）61：329〜33
4）により、コリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣ
Ｃ１４７５２株を形質転換させた。カナマイシン１５μ
ｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳアガープレート上で、ト
ランスポゾンＴｎ５５３１をゲノム中に組み込んだクロ
ーンを、そのカナマイシン耐性を利用して同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters（1989）65：299〜3
04）。この方法で、２０００個のクローンを獲得し、イ
ソロイシル−イソロイシン存在下での増殖の遅延を調べ
た。この目的のために、イソロイシル−イソロイシンを
含有しない、あるいは３ｍＭ含有するＣＧＸＩＩ最小培
地アガープレート上に、全てのクローンを１つずつ移動
した。この培地は、Keilhauer等の記載するＣＧＸＩＩ
培地と同等であるが（Journal of Bacteriology（199
3）175：5593〜5603）、付加的に、カナマイシン２５μ
ｇ／ｍｌおよび寒天１５ｇ／ｌを含有した。Keilhauer
等の記載する培地の組成を、表１に示す。
２のｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のクローニングおよ
び塩基配列決定 １. トランスポゾンによる突然変異誘発 ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Inform
ation , Bethesda, USA）のヌクレオチドデータベース
に、登録番号Ｕ５３５８７として寄託された配列を有す
るトランスポゾンＴｎ５５３１を使用して、コリネバク
テリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１４７５２株に突然
変異を誘発した。メチラーゼ−欠損エシェリキア コリ
ＧＭ２９２９ｐＣＧＬ００４０（エシェリキア コリ
ＧＭ２９２９：Palmer等、Gene (1994) 143:1〜12）
から、トランスポゾンＴｎ５５３１（Ankri等、Journal
of Bacteriology (1996)178：4412〜4419）を有するプ
ラスミドｐＣＧＬ００４０を単離した。プラスミドｐＣ
ＧＬ００４０を用いて、エレクトロポレーション（Hayn
es等, FEMS Microbiology Letters (1989）61：329〜33
4）により、コリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣ
Ｃ１４７５２株を形質転換させた。カナマイシン１５μ
ｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳアガープレート上で、ト
ランスポゾンＴｎ５５３１をゲノム中に組み込んだクロ
ーンを、そのカナマイシン耐性を利用して同定した（Li
ebl等、FEMS Microbiology Letters（1989）65：299〜3
04）。この方法で、２０００個のクローンを獲得し、イ
ソロイシル−イソロイシン存在下での増殖の遅延を調べ
た。この目的のために、イソロイシル−イソロイシンを
含有しない、あるいは３ｍＭ含有するＣＧＸＩＩ最小培
地アガープレート上に、全てのクローンを１つずつ移動
した。この培地は、Keilhauer等の記載するＣＧＸＩＩ
培地と同等であるが（Journal of Bacteriology（199
3）175：5593〜5603）、付加的に、カナマイシン２５μ
ｇ／ｍｌおよび寒天１５ｇ／ｌを含有した。Keilhauer
等の記載する培地の組成を、表１に示す。
【００５６】
【表１】
【００５７】アガープレートを３０℃でインキュベート
し、１２、１８および２４時間後の増殖を調べた。トラ
ンスポゾンによる突然変異体が得られ、これは、イソロ
イシル−イソロイシン不含の場合には、最初のコリネバ
クテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２株と同程
度の増殖を示すが、イソロイシル−イソロイシン３ｍＭ
の存在下では増殖が遅延した。このような突然変異体を
ＡＴＣＣ１４７５２ｂｒｎＦ：：Ｔｎ５５３１とした。
し、１２、１８および２４時間後の増殖を調べた。トラ
ンスポゾンによる突然変異体が得られ、これは、イソロ
イシル−イソロイシン不含の場合には、最初のコリネバ
クテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２株と同程
度の増殖を示すが、イソロイシル−イソロイシン３ｍＭ
の存在下では増殖が遅延した。このような突然変異体を
ＡＴＣＣ１４７５２ｂｒｎＦ：：Ｔｎ５５３１とした。
【００５８】２. ＡＴＣＣ１４７５２ｂｒｎＦ：：Ｔ
ｎ５５３１中のＴｎ５５３１挿入部位のクローニングお
よび塩基配列決定 例１.１で記載した突然変異体中のトランスポゾンＴｎ
５５３１よりも下流に位置する挿入部位をクローニング
するために、まず、Schwarzer等の記載（Bio/Technolog
y (1990) 9：84〜87）に従って該突然変異体株の染色体
ＤＮＡを単離し、そのうちの４００ｎｇを制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩで切断した。制限バッチ全体をベ
クターｐＵＣ１８に連結し（Norander等、Gene（1983）
26：101〜106）、同様にRoche Diagonostics社（Mannhe
im, Germany）製のＥｃｏＲＩで直鎖とした。連結した
バッチ全てを用いて、エレクトロポレーション（Dower
等、Nucleic Acid Research（1988）16：6127〜6145）
により、エシェリキア コリ ＤＨ５ａｍｃｒ株（Gran
t等、Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America（1990）87：4645
〜4649）を形質転換させた。トランスポゾンＴｎ５５３
１の挿入部位がベクターｐＵＣ上にクローニングされて
存在する形質転換体を、そのカルベニシリンおよびカナ
マイシン耐性を利用して、カルベニシリン５０μｇ／ｍ
ｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢア
ガープレート上で同定した。３個の形質転換体からプラ
スミドを製造し、クローニングされた挿入部位の大きさ
を、制限分析により測定した。約７.２ｋｂの挿入物を
有する１つのプラスミド上に存在する挿入部位のヌクレ
オチド配列を、Sanger等のジデオキシチェーンターミネ
ーション法により（Proceedings of the National Acad
emy of Sciences of the United states of America（1
977）74：5463〜5467）測定した。このために、挿入物
の１.３ｋｂを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー
を出発点として配列決定した：オリゴヌクレオチドプラ
イマー：
ｎ５５３１中のＴｎ５５３１挿入部位のクローニングお
よび塩基配列決定 例１.１で記載した突然変異体中のトランスポゾンＴｎ
５５３１よりも下流に位置する挿入部位をクローニング
するために、まず、Schwarzer等の記載（Bio/Technolog
y (1990) 9：84〜87）に従って該突然変異体株の染色体
ＤＮＡを単離し、そのうちの４００ｎｇを制限エンドヌ
クレアーゼＥｃｏＲＩで切断した。制限バッチ全体をベ
クターｐＵＣ１８に連結し（Norander等、Gene（1983）
26：101〜106）、同様にRoche Diagonostics社（Mannhe
im, Germany）製のＥｃｏＲＩで直鎖とした。連結した
バッチ全てを用いて、エレクトロポレーション（Dower
等、Nucleic Acid Research（1988）16：6127〜6145）
により、エシェリキア コリ ＤＨ５ａｍｃｒ株（Gran
t等、Proceedings of the National Academy of Scienc
es of the United States of America（1990）87：4645
〜4649）を形質転換させた。トランスポゾンＴｎ５５３
１の挿入部位がベクターｐＵＣ上にクローニングされて
存在する形質転換体を、そのカルベニシリンおよびカナ
マイシン耐性を利用して、カルベニシリン５０μｇ／ｍ
ｌおよびカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有するＬＢア
ガープレート上で同定した。３個の形質転換体からプラ
スミドを製造し、クローニングされた挿入部位の大きさ
を、制限分析により測定した。約７.２ｋｂの挿入物を
有する１つのプラスミド上に存在する挿入部位のヌクレ
オチド配列を、Sanger等のジデオキシチェーンターミネ
ーション法により（Proceedings of the National Acad
emy of Sciences of the United states of America（1
977）74：5463〜5467）測定した。このために、挿入物
の１.３ｋｂを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー
を出発点として配列決定した：オリゴヌクレオチドプラ
イマー：
【００５９】
【外１】
【００６０】トランスポゾンの上流に位置する挿入部位
を同定するために、突然変異体の染色体ＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩで切断し、ＰｓｔＩで直鎖化
したベクターｐＵＣ１８に連結させた。残りのクローニ
ング操作は、前記と同様に実施した。約４.８ｋｂの挿
入物を有する１つのプラスミドの挿入部位のヌクレオチ
ド配列を、Sanger等のジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法により測定した（Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United states of Americ
a（1977）74：5463〜5467）。このために、挿入物の１.
６ｋｂを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを出発
点として配列決定した：
を同定するために、突然変異体の染色体ＤＮＡを制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩで切断し、ＰｓｔＩで直鎖化
したベクターｐＵＣ１８に連結させた。残りのクローニ
ング操作は、前記と同様に実施した。約４.８ｋｂの挿
入物を有する１つのプラスミドの挿入部位のヌクレオチ
ド配列を、Sanger等のジデオキシチェーンターミネーシ
ョン法により測定した（Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United states of Americ
a（1977）74：5463〜5467）。このために、挿入物の１.
６ｋｂを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを出発
点として配列決定した：
【００６１】
【外２】
【００６２】得られたヌクレオチド配列を分析し、レー
ザージーンパッケージ（Biocomputing Software for Wi
ndows, DNASTAR, Madison, USA）を用いて組み立てた。
このヌクレオチド配列を配列番号１とする。分析によ
り、７５３ｂｐおよび３２４ｂｐの２個の読み取り枠が
同定され、これを配列番号２および配列番号４とする。
対応する遺伝子はｂｒｎＦおよびｂｒｎＥである。その
遺伝子産物は２５１アミノ酸および１０８アミノ酸から
成り、配列番号３および配列番号５として再度製造され
る。
ザージーンパッケージ（Biocomputing Software for Wi
ndows, DNASTAR, Madison, USA）を用いて組み立てた。
このヌクレオチド配列を配列番号１とする。分析によ
り、７５３ｂｐおよび３２４ｂｐの２個の読み取り枠が
同定され、これを配列番号２および配列番号４とする。
対応する遺伝子はｂｒｎＦおよびｂｒｎＥである。その
遺伝子産物は２５１アミノ酸および１０８アミノ酸から
成り、配列番号３および配列番号５として再度製造され
る。
【００６３】例２ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３
２のｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のクローニングおよ
び塩基配列決定 ＡＴＣＣ１３０３２株由来のｂｒｎＥおよびｂｒｎＦ遺
伝子をエシェリキアコリ クローニングベクターｐＵＣ
１８中にクローン化した（Norrander等、Gene（1983）2
6：101〜106、Roche Diagnostics, Mannheim, German
y）。クローニングでは２つの工程を実施した。最初
に、コリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１３０
３２由来の遺伝子を、配列番号１由来の以下のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連結反応
（ＰＣＲ）により増幅した。
２のｂｒｎＦおよびｂｒｎＥ遺伝子のクローニングおよ
び塩基配列決定 ＡＴＣＣ１３０３２株由来のｂｒｎＥおよびｂｒｎＦ遺
伝子をエシェリキアコリ クローニングベクターｐＵＣ
１８中にクローン化した（Norrander等、Gene（1983）2
6：101〜106、Roche Diagnostics, Mannheim, German
y）。クローニングでは２つの工程を実施した。最初
に、コリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１３０
３２由来の遺伝子を、配列番号１由来の以下のオリゴヌ
クレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連結反応
（ＰＣＲ）により増幅した。
【００６４】ｂｒｎＥ、ｂｒｎＦ−フォワード：
【００６５】
【外３】
【００６６】ｂｒｎＥ、ｂｒｎＦ−リバース：
【００６７】
【外４】
【００６８】デオキシヌクレオチドトリホスフェート
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２００μ
Ｍ、対応するオリゴヌクレオチド部分１μｍ、コリネバ
クテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２由来の
染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０×反応バッファー１／１
０容量および熱に安定なＴａｑ／ＰｗｏＤＮＡポリメラ
ーゼミクスチャー（Roche Diagnostics 社製 Expand Hi
gh Fidelity PCR System、Mannheim、Germany）の存在
下に、サーモサイクラー（thermocycler）中で、以下の
条件を適用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２００μ
Ｍ、対応するオリゴヌクレオチド部分１μｍ、コリネバ
クテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２由来の
染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、１０×反応バッファー１／１
０容量および熱に安定なＴａｑ／ＰｗｏＤＮＡポリメラ
ーゼミクスチャー（Roche Diagnostics 社製 Expand Hi
gh Fidelity PCR System、Mannheim、Germany）の存在
下に、サーモサイクラー（thermocycler）中で、以下の
条件を適用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル行った。
【００６９】９４℃で３０秒間 ５８℃で３０秒間 ７２℃で２分間。
【００７０】次に、SureClone Ligation Kit（Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用し、製
造元による取扱説明書に従って、約１.３ｋｂの増幅さ
れた断片をベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ制限部位に結
合させた。結合させたバッチの全量を用いて、エシェリ
キア コリ ＤＨ５ａｍｃｒ株（Grant等、Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United
States of America（1990）87：4645〜4649）を形質転
換させた。形質転換体を、そのカルベニシリン耐性を利
用して、カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ
アガープレート上で同定した。形質転換体８個からプラ
スミドを製造し、１.３ｋｂのＰＣＲ断片が挿入されて
いるかを、制限分析により測定した。得られた組み換え
プラスミドを、以後、ｐＵＣ１８ｂｒｎＥＦとする。
Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）を使用し、製
造元による取扱説明書に従って、約１.３ｋｂの増幅さ
れた断片をベクターｐＵＣ１８のＳｍａＩ制限部位に結
合させた。結合させたバッチの全量を用いて、エシェリ
キア コリ ＤＨ５ａｍｃｒ株（Grant等、Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United
States of America（1990）87：4645〜4649）を形質転
換させた。形質転換体を、そのカルベニシリン耐性を利
用して、カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ
アガープレート上で同定した。形質転換体８個からプラ
スミドを製造し、１.３ｋｂのＰＣＲ断片が挿入されて
いるかを、制限分析により測定した。得られた組み換え
プラスミドを、以後、ｐＵＣ１８ｂｒｎＥＦとする。
【００７１】プラスミドｐＵＣ１８ｂｒｎＥＦ中の１.
３ｋｂのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、Sanger等の
ジデオキシチェーンターミネーション法（Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United
States of America（18）1977：74〜5463）により決定
した。このために、ｐＵＣ１８ｂｒｎＥＦの完全な挿入
部を、Roche Dagnostics（Mannheim、Germany）社製の
以下のプライマーを使用して配列決定した： ユニバーサルプライマー：
３ｋｂのＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を、Sanger等の
ジデオキシチェーンターミネーション法（Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United
States of America（18）1977：74〜5463）により決定
した。このために、ｐＵＣ１８ｂｒｎＥＦの完全な挿入
部を、Roche Dagnostics（Mannheim、Germany）社製の
以下のプライマーを使用して配列決定した： ユニバーサルプライマー：
【００７２】
【外５】
【００７３】リバースプライマー：
【００７４】
【外６】
【００７５】得られたヌクレオチド配列を配列番号６と
する。得られたヌクレオチド配列をレーザージーンパッ
ケージ（Biocomputing Software for windows, DNASTA
R, Madison, USA）を用いて分析した。
する。得られたヌクレオチド配列をレーザージーンパッ
ケージ（Biocomputing Software for windows, DNASTA
R, Madison, USA）を用いて分析した。
【００７６】例３ コリネバクテリウム グルタミカム ＡＴＣＣ１３０３
２由来のｂｒｎＥＦ遺伝子の発現 ｂｒｎＥＦ遺伝子をエシェリキア コリ−コリネバクテ
リウム グルタミカムシャトルベクターｐＪＣ１中でク
ローニングした（Cremer等、1990、Molecular and Gene
ral Genetics 220:478〜480）。クローニングは２つの
工程で実施した。最初に、以下に示す配列番号６由来の
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラー
ゼ連結反応（ＰＣＲ）により、コリネバクテリウム グ
ルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２由来の遺伝子を増幅し
た。
２由来のｂｒｎＥＦ遺伝子の発現 ｂｒｎＥＦ遺伝子をエシェリキア コリ−コリネバクテ
リウム グルタミカムシャトルベクターｐＪＣ１中でク
ローニングした（Cremer等、1990、Molecular and Gene
ral Genetics 220:478〜480）。クローニングは２つの
工程で実施した。最初に、以下に示す配列番号６由来の
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラー
ゼ連結反応（ＰＣＲ）により、コリネバクテリウム グ
ルタミカム ＡＴＣＣ１３０３２由来の遺伝子を増幅し
た。
【００７７】ｂｒｎＥＦ−フォワード：
【００７８】
【外７】
【００７９】ｂｒｎＥＦ−リバース
【００８０】
【外８】
【００８１】これらのオリゴヌクレオチドプライマー
は、５’側に付加的なＸｂａＩ認識部位を有した。デオ
キシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２００μＭ、対応するオリゴ
ヌクレオチド部分１μｍ、コリネバクテリウム グルタ
ミカム ＡＴＣＣ１３０３２由来の染色体ＤＮＡ１００
ｎｇ、１０×反応バッファー１／１０容量および熱に安
定なＴａｑ／ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼミクスチャー
（Roche Diagnostics 社製 Expand High FidelityPCR S
ystem、Mannheim、Germany）の存在下に、サーモサイク
ラー（thermocycler）中で、以下の条件を適用して、Ｐ
ＣＲ反応を３０サイクル行った：９４℃で３０秒間、５
８℃で３０秒間、７２℃で２分間。次に、約１.３ｋｂ
の大きさの増幅断片を、製造元であるRoche Diagnostic
s (Mannheim, Germany）の取扱説明書に従って制限酵素
ＸｂａＩで処理し、RapidLigation Kit（Roche Diagnos
tics）を用いて、ベクターｐＪＣ１のＸｂａＩ制限部位
に結合させた。次いで、結合させたバッチ全量を用い
て、エシェリキア コリ ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant
等、Proceedings of the National academy of Science
s of the United States of America（1990）87：4645
〜4649）を形質転換させた。形質転換体を、そのカナマ
イシン耐性を利用して、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを
含有するＬＢアガープレート上で同定した。形質転換体
８個からプラスミドを製造し、１.３ｋｂのＰＣＲ断片
が挿入されているかを、制限分析により確認した。得ら
れた組み換えプラスミドを以後ｐＪＣ１ｂｒｎＥＦとす
る。プラスミドｐＪＣ１およびｐＪＣ１ｂｒｎＥＦを、
エレクトロポレーション（Haynes等、FEMS Microbiolog
y Letters（1989）61：329〜334）により、イソロイシ
ン−産生株であるコリネバクテリウム グルタミカム
ＤＭ３６８−２へ導入した。ＤＭ３６８−２株は、ＥＰ
−Ｂ−０３８５９４０中に記載されており、ブタベスト
条約に従って、ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung fuer Mi
krorganismen und Zellkulturen, Braunschweig,German
y）にＤＳＭ５３９９として寄託されている。形質転換
体を、そのカナマイシン耐性を利用して、カナマイシン
１５μｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳアガープレート上
で同定した（Liebl等、FEMS Microbiology Letters（19
89）65：299〜304）。コリネバクテリウム グルタミカ
ム ＤＭ３６８−２／ｐＪＣ１およびＤＭ３６８−２／
ｐＪＣ１ｂｒｎＥＦ株を、この方法により獲得した。
は、５’側に付加的なＸｂａＩ認識部位を有した。デオ
キシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）２００μＭ、対応するオリゴ
ヌクレオチド部分１μｍ、コリネバクテリウム グルタ
ミカム ＡＴＣＣ１３０３２由来の染色体ＤＮＡ１００
ｎｇ、１０×反応バッファー１／１０容量および熱に安
定なＴａｑ／ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼミクスチャー
（Roche Diagnostics 社製 Expand High FidelityPCR S
ystem、Mannheim、Germany）の存在下に、サーモサイク
ラー（thermocycler）中で、以下の条件を適用して、Ｐ
ＣＲ反応を３０サイクル行った：９４℃で３０秒間、５
８℃で３０秒間、７２℃で２分間。次に、約１.３ｋｂ
の大きさの増幅断片を、製造元であるRoche Diagnostic
s (Mannheim, Germany）の取扱説明書に従って制限酵素
ＸｂａＩで処理し、RapidLigation Kit（Roche Diagnos
tics）を用いて、ベクターｐＪＣ１のＸｂａＩ制限部位
に結合させた。次いで、結合させたバッチ全量を用い
て、エシェリキア コリ ＤＨ５αｍｃｒ株（Grant
等、Proceedings of the National academy of Science
s of the United States of America（1990）87：4645
〜4649）を形質転換させた。形質転換体を、そのカナマ
イシン耐性を利用して、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを
含有するＬＢアガープレート上で同定した。形質転換体
８個からプラスミドを製造し、１.３ｋｂのＰＣＲ断片
が挿入されているかを、制限分析により確認した。得ら
れた組み換えプラスミドを以後ｐＪＣ１ｂｒｎＥＦとす
る。プラスミドｐＪＣ１およびｐＪＣ１ｂｒｎＥＦを、
エレクトロポレーション（Haynes等、FEMS Microbiolog
y Letters（1989）61：329〜334）により、イソロイシ
ン−産生株であるコリネバクテリウム グルタミカム
ＤＭ３６８−２へ導入した。ＤＭ３６８−２株は、ＥＰ
−Ｂ−０３８５９４０中に記載されており、ブタベスト
条約に従って、ＤＳＭＺ（Deutschen Sammlung fuer Mi
krorganismen und Zellkulturen, Braunschweig,German
y）にＤＳＭ５３９９として寄託されている。形質転換
体を、そのカナマイシン耐性を利用して、カナマイシン
１５μｇ／ｍｌを含有するＬＢＨＩＳアガープレート上
で同定した（Liebl等、FEMS Microbiology Letters（19
89）65：299〜304）。コリネバクテリウム グルタミカ
ム ＤＭ３６８−２／ｐＪＣ１およびＤＭ３６８−２／
ｐＪＣ１ｂｒｎＥＦ株を、この方法により獲得した。
【００８２】例４ コリネバクテリウム グルタミカムによるＬ−イソロイ
シンの製造 カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有する心臓浸出物培地
（Difco Laboratories, Detroit, USA）５０ｍｌ中で、
３０℃で１４時間前培養することによって、ＤＭ３６８
−２／ｐＪＣ１およびＤＭ３６８−２／ｐＪＣｂｒｎＥ
Ｆ株のイソロイシン形成について調べた。次いで、０.
９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム溶液で細胞を２回洗浄
し、ＯＤ600（６００ｎｍでの光学密度）が０.１となる
ように、該懸濁液をＣｇＸＩＩ培地６０ｍｌ部に接種し
た。この培地はKeilhauer等の記載するものと同一であ
るが（Journal of Bacteriology（1993）175：5593〜56
03）、付加的に、１ｍｌあたりカナマイシン５０μｇを
含有する。両株を、１３０ｒｐｍで、３０℃で培養し
た。２４時間後と４８時間後のサンプルを回収し、細胞
を短時間で遠心分離した（Heraeus（Osterode, German
y）社製Biofuge picoを用い、毎分回転数１３０００で
５分間）。
シンの製造 カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有する心臓浸出物培地
（Difco Laboratories, Detroit, USA）５０ｍｌ中で、
３０℃で１４時間前培養することによって、ＤＭ３６８
−２／ｐＪＣ１およびＤＭ３６８−２／ｐＪＣｂｒｎＥ
Ｆ株のイソロイシン形成について調べた。次いで、０.
９％（ｗ／ｖ）の塩化ナトリウム溶液で細胞を２回洗浄
し、ＯＤ600（６００ｎｍでの光学密度）が０.１となる
ように、該懸濁液をＣｇＸＩＩ培地６０ｍｌ部に接種し
た。この培地はKeilhauer等の記載するものと同一であ
るが（Journal of Bacteriology（1993）175：5593〜56
03）、付加的に、１ｍｌあたりカナマイシン５０μｇを
含有する。両株を、１３０ｒｐｍで、３０℃で培養し
た。２４時間後と４８時間後のサンプルを回収し、細胞
を短時間で遠心分離した（Heraeus（Osterode, German
y）社製Biofuge picoを用い、毎分回転数１３０００で
５分間）。
【００８３】培養上清の細胞外アミノ酸濃度の定量的測
定を、逆相ＨＰＬＣで実施した（Lidroth等、Analytica
l Chemistry（1979）51：1167〜1174）。蛍光検出器
（Ｇ１３２１Ａ）を備えたシリーズＨＰ１１００ＨＰＬ
Ｃクロマトグラフ（Hewlett-Packard, Waldbronn, Germ
any）を使用した；システムを制御し、ＨＰ−Ｃｈｅｍ
−Ｓｔａｔｉｏｎ（Hewlett-Packard）を利用してデー
タを評価した。分析すべきアミノ酸溶液１μｌを、予め
調製しておいたオルト−フタル−アルデヒド／２−メル
カプトエタノール試薬（Pierce Europe BV, OudBeijerl
and, Netherlands）２０μｌを含んだ自動プレカラム誘
導装置中に混合した。連結させたプレカラム（４０×４
ｍｍ Hypersil ODS５）と主要カラム（Hypersil ODS
５，両カラムともCS-Chromatographie Sevice GmbH製
（Langerwehe, Germany）とを用い、非極性相（メタノ
ール）を上昇させるグラジエントプログラムにより、得
られた蛍光チオ置換イソインドール（Jones等、Journal
of Chromatography（1983）266：471〜482）を分離し
た。極性溶離液は酢酸ナトリウムである（０.１Ｍ：ｐ
Ｈ７.２）；流速は０.８ｍｌ／分である。誘導されるア
ミノ酸の蛍光検出を励起波長２３０ｎｍおよび放射波長
４５０ｎｍで実施した。外部標準と比較し、アスパラギ
ンを付加的な内部標準として、アミノ酸濃度を計算し
た。
定を、逆相ＨＰＬＣで実施した（Lidroth等、Analytica
l Chemistry（1979）51：1167〜1174）。蛍光検出器
（Ｇ１３２１Ａ）を備えたシリーズＨＰ１１００ＨＰＬ
Ｃクロマトグラフ（Hewlett-Packard, Waldbronn, Germ
any）を使用した；システムを制御し、ＨＰ−Ｃｈｅｍ
−Ｓｔａｔｉｏｎ（Hewlett-Packard）を利用してデー
タを評価した。分析すべきアミノ酸溶液１μｌを、予め
調製しておいたオルト−フタル−アルデヒド／２−メル
カプトエタノール試薬（Pierce Europe BV, OudBeijerl
and, Netherlands）２０μｌを含んだ自動プレカラム誘
導装置中に混合した。連結させたプレカラム（４０×４
ｍｍ Hypersil ODS５）と主要カラム（Hypersil ODS
５，両カラムともCS-Chromatographie Sevice GmbH製
（Langerwehe, Germany）とを用い、非極性相（メタノ
ール）を上昇させるグラジエントプログラムにより、得
られた蛍光チオ置換イソインドール（Jones等、Journal
of Chromatography（1983）266：471〜482）を分離し
た。極性溶離液は酢酸ナトリウムである（０.１Ｍ：ｐ
Ｈ７.２）；流速は０.８ｍｌ／分である。誘導されるア
ミノ酸の蛍光検出を励起波長２３０ｎｍおよび放射波長
４５０ｎｍで実施した。外部標準と比較し、アスパラギ
ンを付加的な内部標準として、アミノ酸濃度を計算し
た。
【００８４】結果を表２に示す。
【００８５】
【表２】 配列表
【００８６】
【外９】
【００８７】
【外１０】
【００８８】
【外１１】
【００８９】
【外１２】
【００９０】
【外１３】
【図１】図１は、トランスポゾンＴｎ５５３１を有する
プラスミドｐＣＧＬ００４０の地図である。トランスポ
ゾンは、白抜きの矢印で示されている。
プラスミドｐＣＧＬ００４０の地図である。トランスポ
ゾンは、白抜きの矢印で示されている。
付記される長さは近似である。使用される略号および用
語は、以下の意味である： ＥｃｏＲＩ：Esherichia coli由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＸｂａＩ：Xanthomonas badrii由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＣｌａＩ：Caryophanum latum由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＳａｌＩ：Streptomyces albus由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＳｃａＩ：Streptomyces caespitosus由来の制限エンド
ヌクレアーゼ。 ＳｍａＩ：Serratia marcescens由来の制限エンドヌク
レアーゼ。 Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子。 Ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝子。 ｏｒｉＢＲ３２２：プラスミドｐＢＲ３２２の複製領
域。
語は、以下の意味である： ＥｃｏＲＩ：Esherichia coli由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＸｂａＩ：Xanthomonas badrii由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＣｌａＩ：Caryophanum latum由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＳａｌＩ：Streptomyces albus由来の制限エンドヌクレ
アーゼ。 ＳｃａＩ：Streptomyces caespitosus由来の制限エンド
ヌクレアーゼ。 ＳｍａＩ：Serratia marcescens由来の制限エンドヌク
レアーゼ。 Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子。 Ｋａｎ：カナマイシン耐性遺伝子。 ｏｒｉＢＲ３２２：プラスミドｐＢＲ３２２の複製領
域。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:15） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (71)出願人 599000142 フォルシュングスツェントルム ユーリッ ヒ ゲゼルシャフト ミット ベシュレン クテル ハフツング ドイツ連邦共和国ユーリッヒ （番地な し) (72)発明者 ニコル ケンネルクネヒト ドイツ連邦共和国 クレーフェルト ズュ ートヴァル 68 (72)発明者 ヘルマン ザーム ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ ヴェンデ リヌスシュトラーセ 71 (72)発明者 ローター エッゲリング ドイツ連邦共和国 ユーリッヒ エルゼン カンプ ６ (72)発明者 ヴァルター プフェッフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33
Claims (14)
- 【請求項１】 ａ）配列番号３または５のアミノ酸配列
を少なくとも１つ含有するポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドと少なくとも７０％の一致を示すポリヌ
クレオチド ｂ）配列番号３または５のアミノ酸配列と少なくとも７
０％の一致を示すアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をコードするポリヌクレオチド ｃ）ポリヌクレオチドａ）またはｂ）に相補的なポリヌ
クレオチド、および ｄ）ａ）、ｂ）またはｃ）のポリヌクレオチド配列の、
少なくとも１５個の連続した塩基を含有するポリヌクレ
オチドから成る群より選択されるポリヌクレオチドを少
なくとも１つ含有する、単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、コリネフォルムバ
クテリア中で複製可能な、有利には組み換えＤＮＡであ
る、請求項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 （ｉ）配列番号１または６のヌクレオチ
ド配列の１つまたは（ｉｉ）遺伝暗号の縮重の範囲内で
配列（ｉ）に相当する少なくとも１つの配列、または
（ｉｉｉ）配列（ｉ）または（ｉｉ）と相補的な配列に
ハイブリダイズする少なくとも１つの配列、場合により
（ｉｖ）（ｉ）の機能中立センス突然変異を有する、請
求項２記載の組み換えＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号２および配列番号４に示される
請求項１または２記載のヌクレオチド配列に由来するタ
ンパク質のアミノ酸配列。 - 【請求項６】 請求項２または５のいずれか１項記載の
複製可能なＤＮＡの１つ以上を導入することにより形質
転換した、特にコリネバクテリウム属の、コリネフォル
ム微生物。 - 【請求項７】 ｂｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子
またはこれらの遺伝子をコードするヌクレオチド配列が
増幅、特に過剰発現されているバクテリアの使用を特徴
とする、コリネフォルムバクテリアの発酵による分枝Ｌ
−アミノ酸の製法。 - 【請求項８】 要求されているＬ−アミノ酸の生合成経
路に関する別の遺伝子が付加的に増幅されたバクテリア
を使用する、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 要求されているＬ−アミノ酸の形成を低
下させる代謝経路が少なくとも部分的に抑制されたバク
テリアを使用する、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 １つ以上のプラスミドベクターにより
形質転換された株を使用し、該プラスミドベクターがｂ
ｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子をコードするヌク
レオチド配列を有する、請求項８または９記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリンまたは
Ｌ−ロイシンを産生するコリネフォルムバクテリアを使
用する、請求項８から１０までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１２】 以下の工程： ａ）少なくともｂｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子
が増幅、特に過剰発現され、他の遺伝子を組み合わせて
増幅されていてもよい、請求項１から１１までのいずれ
か１項記載の微生物の発酵、 ｂ）要求されているＬ−アミノ酸の培地中または微生物
の細胞中への蓄積、および ｃ）該Ｌ−アミノ酸の単離 を実施することを特徴とする、分枝Ｌ−アミノ酸の製
法。 - 【請求項１３】 コリネバクテリウム属の微生物を使用
する、請求項７から１２までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１４】 イソロイシンおよび／またはロイシン
および／またはバリンを含むオリゴペプチドを含有する
栄養培地上で、全く増殖しないかほとんど増殖せず、ｂ
ｒｎＥおよび／またはｂｒｎＦ遺伝子において欠損し
た、突然変異体、有利にコリネフォルムバクテリアを指
示株として獲得し、 ａ）遺伝子ライブラリーを構築後、ｂｒｎＥまたはｂｒ
ｎＦ遺伝子を同定および単離するか、または ｂ）トランスポゾン突然変異誘発の場合には、有利に抗
生物質耐性のトランスポゾンを選択し、それにより所望
の遺伝子を獲得する、ｂｒｎＥまたはｂｒｎＦ遺伝子の
単離法。
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