KR20010051233A - 측쇄 아미노산의 배출을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열,이의 분리 방법 및 이의 용도 - Google Patents

측쇄 아미노산의 배출을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열,이의 분리 방법 및 이의 용도 Download PDF

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KR20010051233A
KR20010051233A KR1020000062857A KR20000062857A KR20010051233A KR 20010051233 A KR20010051233 A KR 20010051233A KR 1020000062857 A KR1020000062857 A KR 1020000062857A KR 20000062857 A KR20000062857 A KR 20000062857A KR 20010051233 A KR20010051233 A KR 20010051233A
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KR
South Korea
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seq
polynucleotide
gene
amino acid
leu
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KR1020000062857A
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켄네르크네히트니콜레
잠헤르만
엑겔링로타르
펩페를레발터
Original Assignee
데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
아달베르트 베. 플라텐타이히, 하
포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

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Abstract

본 발명은
a) 하나 이상의 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,
b) 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
c) 상기 a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및
d) 상기 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드(여기서, 당당해 폴리펩타이드는 brnE 또는 brnF 유전자가 암호화하는 효소의 생물학적 활성을 나타낸다), 및 brnE 또는 brnF 유전자의 증폭에 의한 측쇄 L-아미노산의 발효적 생산 방법에 관한 것이다.

Description

측쇄 아미노산의 배출을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 이의 분리 방법 및 이의 용도{Nucleotide sequences coding for the export of branched-chain amino acids, process for the isolation thereof and use thereof}
〈110〉 Degussa-Huls AG
Forschungszentrum Julich GmbH
〈120〉 Nucleotide sequences coding for the export of branched-chain
amino acid, process for the isolation thereof and use thereof
〈130〉 5-1999-024333-4, 5-1998-082611-0
〈150〉 DE 199 51 708.8
〈151〉 1999-10-27
〈160〉 6
〈170〉 KOPATIN 1.5
〈210〉 1
〈211〉 1271
〈212〉 DNA
〈213〉 Corynebacterium glutamicum ATCC14752
〈220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (101)..(853)
〈223〉 brnF
〈220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (853)..(1176)
〈223〉 brnE
〈400〉 1
gcgcgatcaa tggaatctag cttcatatat tgcacaatag cctagttgag gtgcgcaaac 60
tggcaacaaa actacccggc aattgtgtga tgattgtagt gtgcaaaaaa cgcaagagat 120
tcattcaagc ctggaggtgt cgccatccaa ggcagccctg gaaccagatg ataaaggtta 180
tcggcgctac gaaatcgcgc aaggtctaaa aacctccctt gctgcaggtt tgggcatgta 240
cccgattggt attgcgtttg gtctcttggt tattcaatac ggctacgaat ggtgggcagc 300
cccactgttt tccggcctga ttttcgcggg ctccaccgaa atgctggtca tcgccctcgt 360
tgtgggcgca gcgcccctgg gcgccatcgc gctcaccaca ttgctggtga acttccgcca 420
cgtattctat gcgttttcat tcccgctgca tgtggtcaaa aaccccattg cccgtttcta 480
ttcggttttc gcgcttatcg acgaagccta cgcagtcact gcggccaggc ccgcaggctg 540
gtcggcgtgg cgacttatct caatgcaaat agcgtttcac tcctactggg tattcggcgg 600
tctcaccgga gtggcgatcg cagagttgat tccttttgaa attaagggcc tcgagttcgc 660
cctttgctct ctctttgtca cgctgacttt ggattcctgc cgaacgaaaa agcagatccc 720
ttctctgctg ctcgcaggtt tgagcttcac cattgctctt gtggtaattc caggtcaggc 780
cctatttgcg gcgctgctga tcttcttggg tctgttgacc atccggtact tcttcttggg 840
aaaggctgct aaatgacaac tgatttctcc tgtattctcc ttgttgtcgc agtatgtgca 900
gtcattactt ttgcgctccg ggcggttccg ttcttaatcc ttaagcccct acgtgaatca 960
caatttgtgg gcaaaatggc gatgtggatg ccagcaggaa tccttgccat tttgaccgca 1020
tcaacgtttc gcagcaatgc gatagatctg aagactctaa cctttggtct cattgccgtt 1080
gcgattacag tggtggcgca tcttcttggc ggtcgacgca ccttgttgag cgttggcgct 1140
ggcaccatcg tttttgttgg actggtgaat cttttctaaa actgcataaa taacaaaaat 1200
ccgcatgccc tcaatttgaa ggggatgcgg attttttaag gaacctagaa aaggcttaag 1260
cagacagcgc t 1271
〈210〉 2
〈211〉 753
〈212〉 DNA
〈213〉 Corynebacterium glutamicum ATCC14752
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (1)..(753)
〈223〉 brnF
〈400〉 2
gtg caa aaa acg caa gag att cat tca agc ctg gag gtg tcg cca tcc 48
Val Gln Lys Thr Gln Glu Ile His Ser Ser Leu Glu Val Ser Pro Ser
1 5 10 15
aag gca gcc ctg gaa cca gat gat aaa ggt tat cgg cgc tac gaa atc 96
Lys Ala Ala Leu Glu Pro Asp Asp Lys Gly Tyr Arg Arg Tyr Glu Ile
20 25 30
gcg caa ggt cta aaa acc tcc ctt gct gca ggt ttg ggc atg tac ccg 144
Ala Gln Gly Leu Lys Thr Ser Leu Ala Ala Gly Leu Gly Met Tyr Pro
35 40 45
att ggt att gcg ttt ggt ctc ttg gtt att caa tac ggc tac gaa tgg 192
Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Ile Gln Tyr Gly Tyr Glu Trp
50 55 60
tgg gca gcc cca ctg ttt tcc ggc ctg att ttc gcg ggc tcc acc gaa 240
Trp Ala Ala Pro Leu Phe Ser Gly Leu Ile Phe Ala Gly Ser Thr Glu
65 70 75 80
atg ctg gtc atc gcc ctc gtt gtg ggc gca gcg ccc ctg ggc gcc atc 288
Met Leu Val Ile Ala Leu Val Val Gly Ala Ala Pro Leu Gly Ala Ile
85 90 95
gcg ctc acc aca ttg ctg gtg aac ttc cgc cac gta ttc tat gcg ttt 336
Ala Leu Thr Thr Leu Leu Val Asn Phe Arg His Val Phe Tyr Ala Phe
100 105 110
tca ttc ccg ctg cat gtg gtc aaa aac ccc att gcc cgt ttc tat tcg 384
Ser Phe Pro Leu His Val Val Lys Asn Pro Ile Ala Arg Phe Tyr Ser
115 120 125
gtt ttc gcg ctt atc gac gaa gcc tac gca gtc act gcg gcc agg ccc 432
Val Phe Ala Leu Ile Asp Glu Ala Tyr Ala Val Thr Ala Ala Arg Pro
130 135 140
gca ggc tgg tcg gcg tgg cga ctt atc tca atg caa ata gcg ttt cac 480
Ala Gly Trp Ser Ala Trp Arg Leu Ile Ser Met Gln Ile Ala Phe His
145 150 155 160
tcc tac tgg gta ttc ggc ggt ctc acc gga gtg gcg atc gca gag ttg 528
Ser Tyr Trp Val Phe Gly Gly Leu Thr Gly Val Ala Ile Ala Glu Leu
165 170 175
att cct ttt gaa att aag ggc ctc gag ttc gcc ctt tgc tct ctc ttt 576
Ile Pro Phe Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Cys Ser Leu Phe
180 185 190
gtc acg ctg act ttg gat tcc tgc cga acg aaa aag cag atc cct tct 624
Val Thr Leu Thr Leu Asp Ser Cys Arg Thr Lys Lys Gln Ile Pro Ser
195 200 205
ctg ctg ctc gca ggt ttg agc ttc acc att gct ctt gtg gta att cca 672
Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ser Phe Thr Ile Ala Leu Val Val Ile Pro
210 215 220
ggt cag gcc cta ttt gcg gcg ctg ctg atc ttc ttg ggt ctg ttg acc 720
Gly Gln Ala Leu Phe Ala Ala Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Thr
225 230 235 240
atc cgg tac ttc ttc ttg gga aag gct gct aaa 753
Ile Arg Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Ala Ala Lys
245 250
〈210〉 3
〈211〉 251
〈212〉 PRT
〈213〉 Corynebacterium glutamicum ATCC14752
〈400〉 3
Val Gln Lys Thr Gln Glu Ile His Ser Ser Leu Glu Val Ser Pro Ser
1 5 10 15
Lys Ala Ala Leu Glu Pro Asp Asp Lys Gly Tyr Arg Arg Tyr Glu Ile
20 25 30
Ala Gln Gly Leu Lys Thr Ser Leu Ala Ala Gly Leu Gly Met Tyr Pro
35 40 45
Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Ile Gln Tyr Gly Tyr Glu Trp
50 55 60
Trp Ala Ala Pro Leu Phe Ser Gly Leu Ile Phe Ala Gly Ser Thr Glu
65 70 75 80
Met Leu Val Ile Ala Leu Val Val Gly Ala Ala Pro Leu Gly Ala Ile
85 90 95
Ala Leu Thr Thr Leu Leu Val Asn Phe Arg His Val Phe Tyr Ala Phe
100 105 110
Ser Phe Pro Leu His Val Val Lys Asn Pro Ile Ala Arg Phe Tyr Ser
115 120 125
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130 135 140
Ala Gly Trp Ser Ala Trp Arg Leu Ile Ser Met Gln Ile Ala Phe His
145 150 155 160
Ser Tyr Trp Val Phe Gly Gly Leu Thr Gly Val Ala Ile Ala Glu Leu
165 170 175
Ile Pro Phe Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Cys Ser Leu Phe
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Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ser Phe Thr Ile Ala Leu Val Val Ile Pro
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Gly Gln Ala Leu Phe Ala Ala Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Thr
225 230 235 240
Ile Arg Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Ala Ala Lys
245 250
〈210〉 4
〈211〉 324
〈212〉 DNA
〈213〉 Corynebacterium glutamicum ATCC14752
〈220〉
〈221〉 CDS
〈222〉 (1)..(324)
〈223〉 brnE
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Gly Thr Ile Val Phe Val Gly Leu Val Asn Leu Phe
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〈210〉 5
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〈213〉 Corynebacterium glutamicum ATCC14752
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〈211〉 1271
〈212〉 DNA
〈213〉 Corynebacterum glutamicum ATCC13032
〈220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (101)..(853)
〈223〉 brnF
〈220〉
〈221〉 gene
〈222〉 (853)..(1176)
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〈400〉 6
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cagacagcgc t 1271
본 발명은 측쇄 아미노산의 배출(export)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 이의 동정 및 분리 방법, 및 측쇄 아미노산의 배출을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 코리네형 세균을 사용하는 측쇄 아미노산의 발효적 제조 방법을 제공한다.
측쇄 아미노산, 특히 L-이소라이신, L-발린 및 L-로이신은 제약 산업, 사람 의학 및 동물 영양학에서 사용된다.
측쇄 아미노산은 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 발효시킴으로써 생산되는 것으로 공지되어 있다. 이들의 큰 중요성으로 인하여, 생산 방법을 개선시키기 위한 노력이 지속적으로 이루어져 왔다. 이러한 방법의 개선은 발효 기술에 대한 수단, 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 영양 배지의 조성, 예를 들어, 발효 동안의 당 농도, 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 성능 특성에 관한 것일 수 있다.
이들 미생물의 성능 특성은 돌연변이 유발, 선택 및 돌연변이체 선택 방법을 사용하여 개선시킨다. 이러한 방식으로, 항대사물질, 예를 들어, 이소로이신 유사체인 이소로이신 하이드록시아메이트[참고문헌: Kisumi M, Komatsubara S, Sugiura, M, Chibata I (1972) Journal of Bacteriology 110: 761-763), 발린 유사체인 2-티아졸알라닌[참고문헌: Tsuchida T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H (1975) Agricultural and Biological Chemistry, Japan 39: 1319-1322) 또는 로이신 유사체인 α-아미노부티레이트[참고문헌: Ambe-Ono Y, Sato K, Totsuka K, Yoshihara Y, Nakamori S (1996) Bioscience Biotechnology Biochemistry 60: 1386-1387]에 대해 내성이거나 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며 측쇄 아미노산[참고문헌: Tsuchida T, Yoshinanga F, Kubota K, Momose H, Okumura S (1975) Agricultural and Biological Chemistry; Nakayama K, Kitada S, Kinoshita S (1961) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7: 52-69; Nakayama K, Kitada S, Sato Z, Kinoshita (191) Journal of General and Applied Microbiology, Japan 7: 41-51]을 생산하는 균주를 수득한다.
몇년 동안, 재조합 DNA 기술 방식이 또한 측쇄 아미노산에 대한 개별적 생합성 유전자를 증폭시키고 측쇄 아미노산 생산에 미치는 효과를 조사함으로써 측쇄 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개선하는데 사용되어 왔다. 이러한 주제에 대한 개관 논문은 특히 문헌[참조: Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, Demain 및 Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142, Hilliger, BioTec 2, 40-44 (1991); Eggeling, Amino Acids 6: 261-272 (1994); Jetten 및 Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); Sahm et al., Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996); 및 Eggeling et al., Journal of Biotechnology 56: 168-180 (1997)]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명자들은 측쇄 아미노산의 개선된 발효적 생산을 위한 신규한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 트랜스포손 Tn5531을 함유하는 플라스미드 pCGL0040의 지도이다. 트랜스포손은 무음영 화살표로서 나타낸다.
기재된 길이는 대략적인 것으로 간주되어야 한다. 사용된 약어 및 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다:
· EcoRI: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 제한 엔도뉴클레아제
· XbaI: 크산토모나스 바드리(Xanthomonas badrii)로부터의 제한 엔도뉴클레아제
· ClaI: 카리오파눔 라툼(Caryophanum latum)으로부터의 제한 엔도뉴클레아제
· SalI: 스트렙토마이세스 알부스(Streptomyces albus)로부터의 제한 엔도뉴클레아제
· ScaI: 스트렙토마이세스 캐스피토수스(Streptomyces caespitosus)로부터의 제한 엔도뉴클레아제
· SmaI: 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens)로부터의 제한 엔도뉴클레아제
· Amp: 암피실린 내성 유전자
· Kan: 카나마이신 내성 유전자
· oriBR322: 플라스미드 pBR322의 복제 영역
측쇄 아미노산은 제약 산업, 사람 의학 및 동물 영양학에서 사용된다. 따라서, 측쇄 아미노산의 생산을 위한 신규한 개선된 방법을 제공하는데 전반적인 관심이 있다.
이후에 언급하는 측쇄 아미노산은 특히 L-이소로이신, L-발린 또는 L-로이신을 의미하는 것으로 이해해야 한다.
본 발명은
a) 하나 이상의 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,
b) 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
c) 상기 a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및
d) 상기 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 코리네형 세균내에서 복제가능하고 서열 1 및 서열 6으로 제시된 바와 같은 유전자 brnF 및/또는 brnE를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 코리네박테리움으로부터 유래하는 재조합 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한
(i) 유전자 brnF 및/또는 brnE를 암호화하는 서열 1 또는 서열 6으로 제시된 뉴클레오타이드 서열,
(ii) 유전자 암호의 축퇴 범위내에서 (i)의 서열에 정합되는 하나 이상의 서열, 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 서열에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로
(iv) (i)에서 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 함유하는, 특허청구범위 제1항에 청구된 바와 같은 복제가능한 DNA를 제공한다.
본 발명은 또한
서열 1, 서열 2, 서열 4 또는 서열 6으로 제시된 뉴클레오타이드 서열로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 특허청구범위 제2항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드,
서열 3 또는 서열 5로 제시된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 특허청구범위 제2항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드,
특허청구범위 제1항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드(들) 또는 서열 1 또는 서열 6으로 제시된 DNA 서열을 함유하는 벡터, 및
상기 벡터를 함유하는 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 세균을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열 1, 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 유전자를 함유하는 적합한 유전자 라이브러리와 서열 1, 서열 2, 서열 4 또는 서열 6에 따르는 상기한 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 프로브 또는 이의 단편과의 하이브리드화 및 상기 언급된 DNA 서열의 분리에 의한 스크리닝에 의해 수득가능한 특정 폴리뉴클레오타이드 서열로 실질적으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 이소로이신, 로이신 또는 발린 배출 단백질을 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하고, 이러한 cDNA 또는 유전자(여기서, 이들의 서열은 brnF 및/또는 brnE 유전자의 서열과 고도의 유사성을 나타낸다)를 분리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA에 대한 하이브리드화 프로브로서 적합하다.
추가로, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase chain reaction: PCR)을 사용하여 이의 도움으로 이소로이신, 로이신 또는 발린 배출 단백질을 암호화하는 유전자의 DNA를 생산할 수 있는 프라이머로서 적합하다.
프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유한다. 또한, 40개 내지 50개 이상의 염기쌍 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 적합하다.
"분리된"은 이의 자연 환경으로부터 분리됨을 의미한다.
일반적으로, "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA가 변형되지 않거나 변형될 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다.
"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드 또는 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따르는 폴리펩타이드는 서열 3 및/또는 서열 5에 따르는 폴리펩타이드, 특히 측쇄 아미노산을 수송하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드, 및 또한 서열 3 및/또는 서열 5에 따르는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 90 내지 95% 동일하면서 상기 언급된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한, 본 발명은 특히 상기한 복제가능한 DNA의 삽입에 의해 형질전환된 코리네박테리움 속의 코리네형 미생물을 제공한다.
또한, 본 발명은 특히 측쇄 아미노산을 미리 생산하는 코리네형 세균을 사용하는 측쇄 아미노산의 발효적 생산 방법을 제공하며, 여기서 측쇄 아미노산의 배출을 암호화하는 유전자 brnE 및/또는 brnF의 뉴클레오타이드 서열은 증폭, 특히 과발현된다.
이와 관련하여, 용어 "증폭"은, 예를 들어, 유전자(들)의 복제수를 증가시키고, 강한 프로모터 또는 증강된 활성을 갖는 상응하는 효소(단백질)를 암호화하는 유전자를 사용하고, 임의로 이들 수단을 병용함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시킴을 의미한다.
본 발명에 의해 제공되는 미생물은 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분, 셀룰로즈, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 측쇄 아미노산을 생산할 수 있다. 이러한 미생물은 특히 코리네박테리움 속의 대표적인 코리네형 세균을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서도, L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력에 대해 당업자에게 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰이 특별히 언급될 수 있다.
코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주는, 예를 들어, 다음과 같은 공지된 야생형 균주이다:
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032,
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ACTT14067,
브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ACTT13869 및
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ACTT14020, 및 이로부터 제조된 측쇄 아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주,
예를 들어, 이소로이신 생산 균주:
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14309,
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14310,
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14311,
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC15168 및
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC6871,
예를 들어, 로이신 생산 균주:
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21885 및
브레비박테리움 플라붐 ACTT21889, 또는
예를 들어, 발린 생산 균주:
코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 12455,
코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 9325,
브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 9324 및
브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-BP 1763.
본 발명에 이르러, 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유전자 brnE 및 brnF를 성공적으로 분리해 내었다. 상기 유전자들을 분리하기 위해서는, 먼저 brnF 또는 brnE 유전자에 결함이 있는 씨. 글루타미쿰의 돌연변이체를 생산한다. 이를 위하여, 예를 들어, ATCC14752 또는 ATCC13032와 같은 적당한 출발 균주를 돌연변이 유발법으로 처리한다.
통상의 돌연변이 유발법에는 화합물, 예를 들어, N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘에 의한 처리, 또는 UV 조사가 포함된다. 돌연변이를 일으키는 이러한 방법은 일반적으로 공지되어 있으며, 특히 문헌[참조: Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)] 또는 편람[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology", The American Society for Bacteriology (Washing D.C., USA, 1981)]을 참조한다.
또 다른 돌연변이 유발법으로는, DNA 서열내에서 "점프"하는 트랜스포손의 특성을 이용하여 관련 유전자의 기능을 방해하거나 차단하는 트랜스포손 돌연변이 유발법이 있다. 코리네형 세균의 트랜스포손은 당업자에게 공지되어 있다. 에리트로마이신 내성 트랜스포손 Tn5432[참고문헌: Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179] 및 클로로암페니콜 내성 트랜스포손 Tn5546이 따라서 코리네박테리움 크세로시스(Corynebacterium xerosis) 균주 M82B로부터 분리되어 있다. 문헌[참조: Tauch et al., Plasmid (1995) 34: 119-131 및 Plasmid (1998) 40: 126-139]에는 이들 트랜스포손을 사용할 경우에 돌연변이 유발이 가능한 것으로 입증되어 있다.
또 다른 트랜스포손으로는, 문헌[참조: Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419]에 기술되어 있으며, 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 트랜스포손 Tn5531이 있다. 트랜스포손 Tn5531은 aph3 카나마이신 내성 유전자를 함유하며, 도 1에 도시된 플라스미드 벡터 pCGL0040의 형태로 제공될 수 있다. 트랜스포손 Tn5531의 뉴클레오타이드 서열은 미국 미들랜드주 베데스다에 소재하는 기탁기관[National Center for Biotechnology Information(NCBI)]으로부터 수탁번호 제U53587호로 자유롭게 구입가능하다.
돌연변이 유발, 바람직하게는 트랜스포손 돌연변이 유발을 수행하면, brnF 또는 brnE 유전자에 결함이 있는 돌연변이체가 발견된다. brnF 또는 brnE 유전자에 결함이 있는 돌연변이체가 최소 아가상에서는 양호한 성장을 보이지만, 측쇄 아미노산 함유 올리고펩타이드, 예를 들어, 디펩타이드인 이소로이실-이소로이신이 보충된 최소 아가상에서는 불량한 성장을 나타낸다는 사실을 토대로 이 돌연변이체를 식별할 수 있다.
이러한 돌연변이체의 예로는 균주 ATCC14752brnE::Tn5531이 있다.
상기한 방법으로 생산된 균주는 brnF 및/또는 brnE 유전자를 클로닝시키고 서열분석하는데 사용할 수 있다.
이를 위하여, 목적하는 세균의 유전자 라이브러리를 작제할 수 있다. 유전자 라이브러리의 작제는 일반적으로 공지된 교과서 및 편람에 기재되어 있다. 예로서, 교과서[참조: Winnacker, Gene und Klone, eine Einfuhrung in die Gentechnology(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 편람[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]를 언급할 수 있다. 매우 익히 공지된 유전자 라이브러리는 문헌[참조: Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 기술된 바와 같이 λ-벡터내에 작제된 이. 콜라이(E. coli) K-12 균주 W3110의 유전자 라이브러리이다. 문헌[참조: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996]에는, 코스미드 벡터 SuperCos I[참고문헌: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164]을 사용하여 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참고문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]내에 작제된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 본 발명에 적합한 벡터는 코리네형 세균, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰내에서 복제하는 벡터이다. 이러한 벡터는 선행 기술로부터 공지되어 있으며, 이의 예로서는 문헌[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554]에 기술되어 있는 플라스미드 벡터 pZ1를 언급할 수 있다. 이어서, 상기한 방법으로 수득된 유전자 라이브러리를 형질전환 또는 전기천공으로 brnF 또는 brnE에 결함이 있는 지시 균주내로 전이하여, 측쇄 아미노산 함유 올리고펩타이드의 존재하의 최소 아가상에서 성장할 수 있는 형질전환체를 발견한다. 이어서, 클로닝된 DNA 단편을 서열 분석한다.
Tn5531 돌연변이 유발에 의해 생성된 코리네형 세균의 돌연변이체, 예를 들어, 균주 ATCC14752brnE::Tn5531을 사용할 경우, 여기에 함유된 카나마이신 내성 유전자 aph3을 사용하여 brnE::Tn5531 대립형질유전자를 직접 클로닝시켜 분리할 수 있다. 공지된 클로닝 벡터, 예를 들어, pUC18[참고문헌: Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 및 Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119]을 상기 목적에 사용한다. 제한 결함 및 재조합 결함을 갖는 이. 콜라이 균주가 클로닝 숙주로서 특히 적합하다. 예로는 문헌[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 기술된 균주 DH5αmcr이 있다. 형질전환체 선택은 카나마이신의 존재하에서 수행한다. 다음, 수득된 형질전환체의 플라스미드 DNA를 서열분석한다. 문헌[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1997) 74: 5463-5467]에 기술된 디데옥시 쇄 종결법을 상기 목적에 사용할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, Tn5531 삽입 부위로부터의 상류 및 하류에 위치한 유전자를 수득한다. 다음, 시판용 서열 분석 소프트웨어, 예를 들어, Lasergene package[공급원: Biocomputing Software for Windows, DNASTAR; 미국 매디슨 소재] 또는 HUSAR package[release 4.0, 공급원: EMBL; 독일 하이델베르크 소재]를 사용하여, 수득된 상기 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 조합한다.
이러한 방법을 사용하여, 측쇄 아미노산의 배출을 암호화하고 서열 1로서 본 발명에 의해 제공되는, 씨. 글루타미쿰의 신규 DNA 서열을 수득한다. 서열 2 및 서열 4는 유전자 brnF 및 brnE의 암호화 영역을 나타낸다. 서열 3 및 서열 5는 서열 1, 또는 서열 2와 서열 4로부터 각각 수득된 유전자 생성물의 아미노산 서열을 나타낸다.
또한, 유전자 암호의 축퇴로부터 발생하는 암호화 DNA 서열도 본 발명에 의해 제공된다. 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열은 유사하게 본 발명에 의해 제공된다. 단백질내에서의 아미노산의 보존적 치환, 예를 들어, 알라닌의 글라이신으로의 치환 또는 글루타민산의 아스파르트산으로의 치환은 단백질의 활성을 근본적으로 변화시키지 않는, 즉 기능적으로 중립인 센스 돌연변이로서 당업자에게 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에서의 변화가 실질적으로 이의 기능에 영향을 주지 않으며, 심지어 이를 안정화시킬 수 도 있다는 사실도 공지되어 있다. 당업자는 이와 관련한 정보를 특히 문헌[참조: Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77: 237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3: 240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다. 또한, 서열 2 또는 서열 4로부터 상응하는 방식으로 발생하는 아미노산 서열도 본 발명에 의해 제공된다.
서열 1로 제시된 뉴클레오타이드 서열을 사용하여, 적합한 프라이머를 합성할 수 있고, 이어서 이들을 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 각종 코리네형 세균 및 균주의 brnF 및 brnE 유전자를 증폭시킬 수 있다. 당업자는 이와 관련된 지식을 특히 교과서[참조: Gait, Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)] 및 문헌[참조: Newton 및 Graham, PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)]에서 찾아볼 수 있다. 또는, 서열 1로 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 일부를 프로브로서 사용하여, 특히 코리네형 세균의 유전자 라이브러리에서 brnF 및/또는 brnE 유전자를 탐색할 수 있다. 당업자는 이와 관련된 지식을 특히 편람[참조: "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization", Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1991)] 및 문헌[참조: Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 찾아볼 수 있다. 이어서, 상기 방법으로 증폭된 brnE 및 brnF 유전자를 함유하는 DNA 단편을 클로닝시켜 서열분석한다.
서열 6으로 제시된 균주 ATCC13032의 유전자 brnF 및 brnE의 DNA 서열은 상기와 같은 방법으로 수득하며, 이 서열 또한 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명자들은 brnF 및/또는 brnE 배출 유전자를 과발현시키면, 코리네형 세균이 측쇄 아미노산을 개선된 방식으로 생산한다는 것을 발견하였다.
과발현은 상응하는 유전자의 복제수를 증가시키거나 구조 유전자로부터의 상류에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있다. 구조 유전자로부터의 상류에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 추가로, 유도성 프로모터에 의해 측쇄 아미노산의 발효적 생산 동안 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 향상된다. 또한, 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증폭시킨다. 유전자 또는 유전자 작제물은 가변의 복제수의 플라스미드내에 존재하거나 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 또는, 목적하는 유전자의 과발현은 영양 배지의 조성 및 배양 조건을 변화시킴으로써 성취할 수도 있다.
당업자는 이와 관련된 지침을 특히 문헌[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya 및 Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 제EP-B 0 472 869호; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer 및 Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 특허원 제WO 96/15246호; Malumbers et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 공개특허 공보 제JP-A-10-229891호; Jensen 및 Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)], 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.
예로써, 본 발명에 따르는 유전자 brnF 및 brnE를 플라스미드의 도움으로 과발현시킨다. 적합한 플라스미드는 코리네형 세균내에서 복제하는 플라스미이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들어, pZ1[참고문헌: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554], pEKEx1[참고문헌: Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참고문헌: Sonnen et al., Gene 107:69-74, 1991]이 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기본으로 한다. 기타 플라스미드 벡터, 예를 들어, pCG4[참고문헌: US-A 제4,489,160호], pNG2[참고문헌: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124, 1990] 또는 pAG1[참고문헌: US-A 제5,158,891호]을 기본으로 하는 플라스미드를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.
또한, 측쇄 아미노산의 생산에 있어서, 신규 brnF 및 brnE 유전자 이외에, 공지된 측쇄 아미노산의 생합성 경로의 추가 효소, 보충 대사의 효소 또는 시트르산 사이클의 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 과발현시키는 것이 유리할 수 있다.
이와 같이, 예를 들어, L-이소루이신을 생산하기 위해서는, 다음 유전자를 동시에 과발현시킬 수 있다:
· 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자[참고문헌: Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1998)] 또는 "피이드 백 내성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 homdr대립형질 유전자[참고문헌: Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)],
· 트레오닌 데하이드라타제를 암호화하는 ilvA 유전자[참고문헌: Mockel et al., Journal of Bacteriology (1992) 8065-8072] 또는 "피이드 백 내성" 트레오닌 데하이드라타제를 암호화하는 ilvA(Fbr) 대립형질 유전자[참조: Mockel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842],
· 아세토하이드록시산 신타제를 암호화하는 유전자 ilvBN[참고문헌: Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595-5603],
· 디하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는 ilvD 유전자[참고문헌: Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979],
· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참고문헌: 제DE-A-19 831 609호], 또는
· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참고문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)].
이와 같이, 예를 들어, L-로이신을 생산하기 위해서는, 다음 유전자를 동시에 과발현시킬 수 있다:
· 이소프로필 말레이트 신타제를 암호화하는 leuA 유전자[참고문헌: Patek et al., Applied and Environmental Microbiology 60 (1994) 133-140] 또는 "피이드 백 내성" 이소프로필 말레이트 신타제를 암호화하는 대립형질 유전자,
· 이소프로필 말레이트 데하이드라타제를 암호화하는 leuC 및 leuD 유전자[참고문헌: Patek et al., Applied and Environmental Microbiology 60 (1994) 133-140],
· 이소프로필 말레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 leuB 유전자[참고문헌: Patek et al., Applied and Environmental Microbiology 60 (1994) 133-140],
· 아세토하이드록시산 신타제를 암호화하는 유전자 ilvBN[참고문헌: Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595-5603],
· 디하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는 ilvD 유전자[참고문헌: Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979] 또는
· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참고문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)].
이와 같이, 예를 들어, L-발린을 생산하기 위해서는, 다음 유전자를 동시에 과발현시킬 수 있다:
· 아세토하이드록시산 신타제를 암호화하는 유전자 ilvBN[참고문헌: Keilhauer et al., (1993) Journal of Bacteriology 175: 5595-5603],
· 디하이드록시산 데하이드라타제를 암호화하는 ilvD 유전자[참고문헌: Sahm und Eggeling (1999) Applied and Environmental Microbiology 65: 1973-1979] 또는
· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참고문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)].
추가로, 측쇄 아미노산의 생산의 경우에 brnE 및/또는 brnF 유전자를 과발현시키는 것 이외에, 목적하지 않는 2차 반응을 억제하는 것이 유리할 수 있다[참고문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].
측쇄 아미노산을 생산할 목적으로, 본 발명에 따르는 미생물을 배취식 또는 유가식 또는 반복 유가식으로 연속 배양하거나 불연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법에 대한 요약은 교과서[참조: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 및 Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 제공되어 있다.
사용되는 배양 배지는 특정 균주의 요구 조건을 적합하게 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물용 배양 배지는 문헌[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology", American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 탄소원으로서는 당 및 탄수화물, 예를 들어, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈, 오일 및 지방, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유, 지방산, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예를 들어, 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어, 아세트산을 사용할 수 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 질소원으로서는 질소-함유 유기 화합물, 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아 또는 무기 화합물, 예를 들어, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 사용할 수 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인 공급원으로서는 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 증식에 필수적인 황산마그네슘 또는 황화철과 같은 금속 염을 함유하여야만 한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질 이외에도 필수 성장-촉진 물질, 예를 들어, 아미노산 및 비타민을 사용할 수 있다. 추가로, 적합한 전구체를 또한 배양 배지에 첨가할 수 있다. 언급된 공급 물질은 단일 배취로서 배양물에 첨가할 수 있거나 배양 동안 적절하게 공급할 수 있다.
수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물, 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물을 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 거품 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해서는, 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물, 예를 들어, 공기를 배양물에 유입할 수 있다. 배양 온도는 일반적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 측쇄 아미노산의 최대량이 생산될 때까지 배양을 계속한다. 상기 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 성취된다.
측쇄 아미노산은 문헌[참조: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1990]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서, 닌하이드린 유도체화에 의해 분석하거나, 문헌[참조: Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 기술된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 분석할 수 있다.
하기 미생물은 부다페스트 조약하에 독일 브라운슈바익에 소재하는 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)]에 수탁되었다:
·DSM 12839로서 에스케리키아 콜라이 균주 GM2929pCGL0040.
실시예
본 발명은 이후 실시예의 내용을 통해 더욱 상세히 기술될 것이다.
에스케리키아 콜라이로부터 플라스미드 DNA의 분리 및 모든 제한, 클레노우(Klenow), 및 알카리성 포스파타제 처리 기술은 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular cloning, A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 따라 수행한다. 달리 특별한 언급이 없는 한, 에스케리키아 콜라이의 형질전환은 문헌[참고: Chung et al., Proceedings the National Academy of Sciences of the United States of America (1989) 86: 2172-2175]에 따라 수행한다.
실시예 1
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752의 brnF 및 brnE 유전자의 클로닝 및 서열분석
1. 트랜스포손 돌연변이 유발
균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752를 트랜스포손 Tn5531[이의 서열은 미국 베데스다에 소재하는 기탁기관(National Center for Biotechnology Information)의 뉴클레오타이드 데이터베이스에 수탁번호 제U53587호로 기탁되었다]을 이용하여 돌연변이를 유발시킨다. 조립된 트랜스포손 Tn5531[참고문헌: Ankri et al., Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419]을 함유하는 플라스미드 pCGL0040을 메틸라제-결함 이. 콜라이 균주 GM2929pCGL0040[E. coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12]으로부터 분리한다. 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752를 전기천공[참고문헌: Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]에 의해 플라스미드 pCGL0040로 형질전환시킨다. 트랜스포손 Tn5531이 게놈내에 통합된 클론을 카나마이신 15㎍/mL을 함유하는 LBHIS 아가 플레이트[참고문헌: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304] 상에서의 이들의 카나마이신 내성에 의해 동정한다. 이러한 방식으로, 2000개 클론을 수득하여, 이소로이실-이소로이신의 존재하에 지연된 성장에 대해 시험한다. 이를 위하여, 모든 클론을 3mM 이소로이실-이소로이신을 함유하거나 함유하지 않는 CGXII 최소 배지 아가 플레이트에 각각 옮긴다. 배지는 문헌[참조: Keihauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기술된 배지 CGXII와 동일하나, 추가로 카나마이신 25㎍/mL 및 아가 15g/L를 함유한다. 카이하우어(Keihauer) 등에 의해 기술된 배지의 조성을 표 1에 제시한다.
배지 CGXII의 조성
성분 농도
(NH4)2SO4 20g/L
우레아 5g/L
KH2PO4 1g/L
K2HPO4 1g/L
MgSO4x 7H2O 0.25g/L
3-모르폴리노프로판설폰산 42g/L
CaCl2 10mg/L
FeSO4x 7H2O 10mg/L
MnSO4x H2O 10mg/L
ZnSO4x 7H2O 1mg/L
CuSO4 0.2mg/L
NiCl2x 6 H2O 0.02mg/L
비오틴 0.2mg/L
글루코즈 40g/L
프로토카테큐산 30mg/L
아가 플레이트를 30℃에서 항온처리하고, 12, 18 및 24시간 후에 성장을 조사한다. 이소로이실-이소로이신의 부재하에서는 초기 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14752에 필적할 만큼 성장하지만, 3mM 이소로이실-이소로이신의 존재하에서는 지연된 성장을 나타내는 트랜스포손 돌연변이체를 수득한다. 이를 ATCC14752brnF::Tn5531로 지칭한다.
2. ATCC14752brnF::Tn5531내에서의 Tn5531의 삽입 부위의 클로닝 및 서열분석
실시예 1.1에 기술된 돌연변이체 중 트랜스포손 Tn5531로부터의 상류에 위치한 삽입 부위를 클로닝시키기 위하여, 이 돌연변이체 균주의 염색체 DNA를 우선적으로 문헌[참조: Schwarzer et al., Bio/Technology (1990) 9: 84-87]에 기술된 바와 같이 분리하고, 당해 염색체 DNA 400ng을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI로 절단한다. 완전한 제한 배취를, EcoRI(제조원: Roche Diagnostics; 독일 만하임 소재)로 또한 선형화된 벡터 pUC18[참고문헌: Norander et al., Gene (1983) 26: 101-106]에 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[참고문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America (1990) 87: 4645-4649]을 전기천공에 의해 완전 결합 삽입체로 형질전환시킨다[참고문헌: Dower et al., Nucleic Acid Research (1988) 16: 6127-6145]. 트랜스포손 Tn5531의 삽입 부위가 벡터 pUC18상에 클로닝된 형태로 존재하는 형질전환체를 카베니실린 50㎍/mL 및 카나마이신 25㎍/mL를 함유하는 LB-아가 플레이트 상에서의 이들의 카베니실린 내성 및 카나마이신 내성에 의해 동정한다. 플라스미드를 3개의 형질전환체로부터 제조하고, 클로닝된 삽입체의 크기를 제한 분석에 의해 측정한다. 삽입체의 크기가 약 7.2kb인 상기 플라스미드 중 하나에 존재하는 삽입 부위의 뉴클레오타이드 서열을 문헌[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467]에 기술된 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 결정한다. 이를 위하여, 1.3kb의 삽입체를 올리고뉴클레오타이드 프라이머: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3'로부터 출발하여 서열분석한다.
트랜스포손으로부터의 하류에 위치한 삽입 부위를 동정하기 위하여, 돌연변이체의 염색체 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 PstI로 절단하고, PstI로 선형화된 벡터 pUC18에 연결시킨다. 상기한 바와 같이 나머지 클로닝 작업을 수행한다. 삽입체의 크기가 약 4.8kb인 상기 플라스미드 중 하나에 존재하는 삽입 부위의 뉴클레오타이드 서열을 문헌[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1977) 74: 5463-5467]에 기술된 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 결정한다. 이를 위하여, 1.6kb의 삽입체를 올리고뉴클레오타이드 프라이머: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3'로부터 출발하여 서열분석한다.
수득된 뉴클레오타이드 서열을 Lasergene package[공급원: Biocomputing Software for Windows, DNASTAR; 미국 매디슨에 소재]를 사용하여, 분석 및 조립한다. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열 1로 제시한다. 이 분석에 의해 동정된 753bp 및 324bp 길이의 2개의 오픈 리딩 프레임을 서열 2 및 서열 4로 제시한다. 상응하는 유전자는 brnF 및 brnE로 지칭한다. 관련된 유전자 생성물은 251개 아미노산 및 108개 아미노산을 포함하며, 이를 서열 3 및 서열 5로서 복제한다.
실시예 2
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 brnF 및 brnE 유전자의 클로닝 및 서열분석
균주 ATCC13032로부터의 유전자 brnF 및 brnE를 이. 콜라이 클로닝 벡터 pUC18[참고문헌: Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany]내로 클로닝한다. 클로닝은 2단계로 수행한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 유전자를 우선적으로 서열 1로부터 유도된 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킨다:
brnE, brnF-전방향:
5'-[AGC GCT GTC TGC TTA AGC CTT TTC]-3'
brnE, brnF-역방향:
5'-[GCG CGA TCA ATG GAA TCT AGC TTC]-3'
PCR 반응을 다음 조건: 94℃에서 30초 동안, 58℃에서 30초 동안 및 72℃에서 2분 동안 열순환기(PTC-100; 제조원: MJ Research, Inc.; 미국 워터타운 소재)내에서 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200μM, 상응하는 올리고뉴클레오타이드 1μM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체 DNA 100ng, 10배 반응 완충액 1/10 용량, 및 열-안정성 Taq DNA/Pwo DNA 폴리머라제 혼합물(Expand High Fidelity PCR System; 제조원: Roche Diagnostics; 독일 만하임 소재)의 2.6단위의 존재하에서 30주기를 수행한다.
이어서, 약 1.3kb의 증폭된 단편을 제조자의 지침에 따라 SureClone Ligation Kit(제조원: Amersham Pharmacia Biotech; 스웨덴 웁프잘라 소재)를 사용하여, 벡터 pUC18의 SmaI 제한 부위로 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[참고문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1990) 87: 4645-4649]을 완전한 연결 배취로 형질전환시킨다. 형질전환체를 카베니실린 50㎍/mL를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 이들의 카베니실린 내성에 의해 동정한다. 플라스미드를 8개의 형질전환체로부터 제조하여, 삽입체로서 1.3kb PCR 단편의 존재를 제한 분석에 의해 측정한다. 생성된 플라스미드를 이후 pUC18brnEF로 지칭한다.
플라스미드 pUC18brnEF내의 1.3kb PCR 단편의 뉴클레오타이드 서열을 문헌[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (18) 1977: 74-5463]에 기술된 디데옥시 쇄 종결법을 사용하여 결정한다. 이를 위하여, pUC18brnEF의 완전한 삽입체를 하기 프라이머(제조원: Roche Diagnostics; 독일 만하임 소재)를 사용하여 서열분석한다:
만능 프라이머:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
역방향 프라이머:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'.
생성된 뉴클레오타이드 서열은 서열 6으로서 복제한다. 수득된 뉴클레오타이드 서열을 Lasergene package[공급원: Biocomputing Software for Windows, DNASTAR; 미국 매디슨에 소재]를 사용하여 분석한다.
실시예 3
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 brnEF 유전자의 발현
brnEF 유전자를 이. 콜라-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pJC1[참고문헌: Cremer et al., 1990, Molecular and General Genetics 220: 478-480]내로 클로닝시킨다. 클로닝은 2단계로 수행한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 유전자를 우선적으로 서열 6으로부터 유도된 하기 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시킨다:
brnEF-전방향:
5'5-GCT CTA GAA CCT TGT CAG CCA GTG CG-3'
brnEF-역방향:
5'-GCT CTA GAA AAA ATC CGC ATC CCC TCA-3'
상기 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 추가로 5'측에 XbaI 인식 부위를 함유한다. PCR 반응을 다음 조건: 94℃에서 30초 동안, 58℃에서 30초 동안 및 72℃에서 2분 동안 열순환기(PTC-100; 제조원: MJ Research, Inc.; 미국 워터타운 소재)내에서 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200μM, 상응하는 올리고뉴클레오타이드 1μM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체 DNA 100ng, 10배 반응 완충액 1/10 용량, 및 열-안정성 Taq DNA/Pwo DNA 폴리머라제 혼합물(Expand High Fidelity PCR System; 제조원: Roche Diagnostics; 독일 만하임 소재)의 2.6단위의 존재하에서 30주기를 수행한다. 이어서, 약 1.3kb의 증폭된 단편을 제조자의 지침에 따라 SureClone Ligation Kit(제조원: Amersham Pharmacia Biotech; 스웨덴 웁프잘라 소재)를 사용하여 제한 효소 XbaI로 처리하고, 벡터 pJC1의 XbaI 제한 부위로 연결시킨다. 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[참고문헌: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (1990) 87: 4645-4649]을 완전한 연결 배취로 형질전환시킨다. 형질전환체를 카나마이신 50㎍/mL를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 이들의 카나마이신 내성에 의해 동정한다. 플라스미드를 8개의 형질전환체로부터 제조하여, 삽입체로서 1.3kb PCR 단편의 존재를 제한 분석에 의해 동정한다. 생성된 플라스미드를 이후 pJC1brnEF로 지칭한다. 플라스미드 pJC1 및 pJC1brnEF를 이소로이신-생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DM368-2내로 전기천공[참고문헌: Haynes et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 61: 329-334]에 의해 삽입한다. 균주 DM368-2는 제EP-B-0 385 940호에 기술되어 있고, 부다페스트 조약하에 독일 브라운슈바익에 소재하는 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)]에 수탁되어 있다. 형질전환체를 카나마이신 15㎍/mL을 함유하는 LBHIS 아가 플레이트[참고문헌: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304] 상에서의 이들의 카나마이신 내성에 의해 동정한다. 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DM368-2/pJC1 및 DM368-2/pJC1brnEF를 상기 방식으로 수득한다.
실시예 4
코리네박테리움 글루타미쿰을 사용한 L-이소로이신의 생산
이소로이신 생산과 관련하여 균주 DM368-2/pJC1 및 DM368-2/pJC1brnEF를 카나마이신 50㎍/mL를 함유하는 브레인 하트(brain heart) 주입 배지(제조원: Difco Laboratories; 미국 디트로이트 소재) 50ml내에서 14시간 동안 30℃에서 예비배양함으로써 조사한다. 이어서, 세포를 0.9%(w/v)의 염화나트륨 용액으로 2회 세척하고, OD600(600nm에서의 광학 밀도)가 0.1로 되도록 CgXII 배지 60mL 분획을 상기 현탁액으로 접종한다. 배지는 문헌[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603]에 기술된 배지와 동일하나, 추가로 카나마이신 50㎍/mL를 함유한다. 두 균주 모두를 30℃ 및 130rpm에서 배양한다. 샘플을 24 및 48시간 후에 취하고, 세포를 단시간 원심분리한다[Biofuge pico(제조원: Heraeus; 독일 오스테로데 소재)로 13000rpm에서 5분 동안 수행].
배지 상등액으로부터의 세포외 아미노산 농도의 정량적 측정을 역상 HPLC[참고문헌: Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]에 의해 수행한다. 형광 검출기(G1321A)가 장착된 시리즈 HP1100 HPLC 크로마토그래피[제조원: Hewlett-Packard; 독일 발트브론 소재]를 사용하며; 시스템의 작동 및 데이타의 평가는 HP-Chem-Station(Hewlett-Packard)을 사용하여 수행한다. 분석할 아미노산 용액 1μL을 미리 제조된 오르토-프탈알데히드/2-머캅토에탄올 시약(제조원: Pierce Europe BV; 네덜란드 오우트-바이제르란트 소재) 20μL와 자동 예비 칼럼 유도체화로 혼합한다. 생성된 형광성 티오-치환된 이소인돌[참고문헌: Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482]을 배합 예비 칼럼(40x4mm Hypersil ODS 5) 및 주 칼럼(Hypersil ODS 5)[두 칼럼 모두의 제조원: CS-Chromatographie Service GmbH; 독일 란게르베헤 소재]에서, 증가하는 비극성 상(메탄올)을 사용한 구배 프로그램을 이용하여 분리한다. 극성 용출제는 아세트산나트륨(0.1M, pH 7.2)이고, 유속은 0.8mL/분이다. 유도화된 아미노산의 형광성 검출을 230nm의 여기 파장 및 450nm의 방출 파장에서 수행한다. 아미노산 농도를 외부 표준 및 추가 내부 표준인 아스파라긴의 비교를 통해 계산한다.
이 결과는 표 2에 제시한다.
균주 L-이소로이신(mM)
24시간 48시간
DM368-2/pJC1 0.7 1.1
DM368-2/pJC1brnEF 1.4 1.8
본 발명의 방법에 의해 brnE 또는 brnF 유전자의 증폭에 의한 개선된 발효적 방법으로 측쇄 L-아미노산을 생산할 수 있다.

Claims (14)

  1. a) 하나 이상의 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,
    b) 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
    c) 상기 a) 또는 b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및
    d) 상기 a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 15개 이상의 연속적인 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 코리네형 세균내에서 복제가능한, 바람직하게는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제2항에 있어서,
    (i) 서열 1 또는 서열 6으로 제시된 뉴클레오타이드 서열 중의 하나,
    (ii) 유전자 암호의 축퇴 범위내에서 (i)의 서열에 정합되는 하나 이상의 서열, 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 서열에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로
    (iv) (i)에서 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 함유하는 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
  5. 서열 2 및 서열 4로 제시된, 제1항 또는 제2항에 청구된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 단백질의 아미노산 서열.
  6. 제2항 또는 제4항에 청구된 바와 같은 하나 이상의 복제가능한 DNA를 삽입함으로써 형질전환된, 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 미생물.
  7. brnE 및/또는 brnF 유전자, 또는 상기 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증폭, 특히 과발현된 세균이 사용되는, 코리네형 세균의 발효에 의한 측쇄 L-아미노산의 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로 중 추가의 유전자가 추가로 증폭된 세균이 사용되는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생산을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 억제된 세균이 사용되는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주가 사용되고, 플라스미드 벡터가 brnE 및/또는 brnF 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, L-이소로이신, L-발린 또는 L-로이신을 생산하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
  12. a) 적어도 brnE 및/또는 brnF 유전자, 및 임의로 추가의 유전자가 함께 증폭, 특히 과발현시키는, 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 기술된 바와 같은 미생물을 발효시키는 단계,
    b) 목적하는 L-아미노산을 배지 또는 미생물의 세포내에 축적시키는 단계, 및
    c) L-아미노산을 분리하는 단계를 수행하는, 측쇄 L-아미노산의 생산 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물이 사용되는 방법.
  14. brnE 또는 brnF 유전자에 결함이 있는 바람직하게는 코리네형 세균의 돌연변이체를 이소로이신 및/또는 로이신 및/또는 발린을 포함하는 올리고펩타이드를 함유하는 영양 배지상에서 성장하지 못하거나 단지 약간 성장하는 지시 균주로서 수득하고, a) 유전자 라이브러리를 작제한 후, brnE 또는 brnF 유전자를 동정하고 분리하거나, b) 트랜스포손 돌연변이 유발의 경우, 바람직하게는 항생제 내성을 갖는 트랜스포손을 선택하여, 그 결과 목적하는 유전자를 수득함을 포함하는, brnE 또는 brnF 유전자의 분리 방법.
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