MXPA01011495A - Proceso para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con la amplificacion del gen de transcetolasa. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con un proceso para la preparacion de L-aminoacidos por fermentacion de bacterias corineformes, el cual comprende llevar a cabo las siguientes etapas: a) fermentacion de la bacteria productora de L-aminoacido deseada en la cual por lo menos se amplifica el gen para tkt, b) concentracion del L-aminoacido en el medio o en las celulas de la bacteria, y c) aislamiento del L-aminoacido producido, y vectores que transportan el gen para tkt.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN FERMENTATIVA DE L-AMINOÁCIDOS CON LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN DE TRANSCETOLASA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina, L-treonina y L-isoleucina utilizando las bacterias corineformes en las cuales se amplifica por lo menos el gen para tkt.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La L-lisina, L-treonina y L-isoleucina se utilizan en nutrición animal, en medicina humana y en la industria farmacéutica. Se sabe que estos aminoácidos se preparan por fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium g-lutamicum . Debido a la gran importancia, constantemente se está llevando a cabo trabajo para mejorar el proceso de preparación. Las mejoras al proceso se pueden relacionar con medidas de fermentación tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el REF: 134005 tratamiento de la forma de producto mediante, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades de rendimiento intrínsecas del microorganismo mismo. Se utilizan métodos de mutagénesis, selección y selección mutante para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas las cuales son resistentes a antimetabolitos, tales como, por ejemplo, el análogo de treonina ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV) , o son auxotróficas para metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácidos, tales como, por ejemplo, treonina, se obtienen de esta manera. También se han utilizado durante algunos años métodos de la técnica de ADN recombinante para mejorar la cepas de Csrr.ejbacte iu-7. glutamicum las cuales producen L-aminoácido .

OBJETIVO DE LA INVENCIÓN Los inventores tienen el objetivo de proporcionar nuevos fundamentos para un proceso mejorado para la preparación fermentativa de L-lisina, L-treonina y L-isoleucina con bacterias corineformes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La L-lisina, L-treonina y L-isoleucina se utilizan en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimenticia y especialmente en nutrición animal . Por lo tanto, existe un interés general en proporcionar un proceso mejorado nuevo para la preparación de estos aminoácidos . Cuando se mencionan a continuación L-aminoácidos, estos significan L-lisina, L-treonina y L-isoleucina. La invención proporciona un proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando bacterias corineformes en las cuales la secuencia nucleotídica la cual codifica para la enzima transcetolasa (EC número 2.2.1.1) (gen para tkt) se amplifica, y en particular se sobre expresa. Las cepas utilizadas preferiblemente producen de antemano L-aminoácidos antes de la amplificación del gen para tkt. Las modalidades preferidas se encuentran en las reivindicaciones . El término "amplificación" a este respecto describe el incremento en la actividad intracelular de una o más enzimas de un microorganismo las cuales son codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo, al incrementar el número de copias del gen o genes, utilizando un promotor potente o utilizando un gen el cual codifica para una enzima correspondiente que tiene alta actividad, y opcionalmente combinar estas medidas . Los microorganismos los cuales la presente invención proporciona pueden preparar L-aminoácidos de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o de glicerol y etanol. Son representativos de las bacterias corineformes, en particular del género Coryne acterimn. Del género Corynebacterium, se puede mencionar en particular la especie Corynebacterium glutamicum, la cual se conoce entre los especialistas por su capacidad para producir L-aminoácidos. Las cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de las especies Corynebacterium glutamicum son, por ejemplo, las cepas conocidas de tipo silvestre Corynebacterium glutamicum ATCC13032 CoryneJacte ium acetoglutamicum ATCC15806 CoryOejbacteriu?7 acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevabacterium lactofermentum ATCC13869 Brevabacterium divaricatum ATCC14020 y mutantes productores dé L-aminoácidos preparados a partir de las mismas, tales como, por ejemplo, las cepas productoras de L-treonina Corynebacterium glutamicum TCC21649 Brevibacterium flavum BB69 Brevibacterium flavum DSM5399 Brevibacterium lactof rmentum FERM-BP 269 Brevibacterium lactofermentum TBB-10 y como tales, por ejemplo, las cepas productoras de L-isoleucina CoryOejbacte iizm glutamicum ATCC 14309 Corynebacterium glutamicum ATCC 14310 Corynebacterium glutamicum ATCC 14311 Corynebacterium glutamicum ATCC 15168 Co-ryOejbacteriuií7 ammoniagenes ATCC 6871 tales como, por ejemplo, las cepas productoras de L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevijbacteriuip flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 C?-ryOe¿>acte.rium glutamicum FERM-P 6463 CoryneJ acte ímp glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Cor ne acterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DSM12866 Se ha encontrado que las bacterias corineformes producen L-aminoácidos de una manera mejorada después de la sobreexpresión del gen para tkt, el cual codifica para la transcetolasa (EC número 2.2.1.1). La secuencia nucleotldica del gen tkt se describe bajo el número de acceso AB023377 en el databank de la European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania), Ikeda et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 51, 201-206 (1999) describen además el efecto de la amplificación del gen tkt en la formación de L-triptofano, L-tirosino y L-fenilalanina. El gen tkt descrito en las referencias del texto mencionado se pueden utilizar de acuerdo con la invención. Los alelos del gen tkt los cuales resultan de la degeneración del código genético o debido a mutaciones directas de la función neutra por lo tanto se pueden utilizar. Para obtener una amplificación (por ejemplo una sobreexpresión) , por ejemplo, se incrementa el número de copias de los genes correspondientes, o se muta la región promotora y deregulación del sitio de unión de ribosoma hacia el extremo 5 ' del gen estructural . Los casetes de expresión los cuales se incorporan hacia al extremo 5' del gen estructural actúan de la misma manera. Mediante promotores - inducibles, es posible adicionalmente incrementar la expresión en el curso de la formación fermentativa de L-aminoácido. De igual manera, la expresión se mejora por medidas para prolongar la vida del ARN-m. Además, la actividad enzimática también aumenta al evitar la degradación de la proteína enzimática. Los genes o las construcciones de genes están presentes aquí en plásmidos con un número variable de copias, o se integran y amplifican en los cromosomas. De manera alternativa, una sobreexpresión de los genes en cuestión puede además obtenerse al cambiar la composición del medio y el procedimiento de cultivo. En este contexto, se pueden encontrar instrucciones por los expertos, por ejemplo, en Martin et al.

(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la especificación de patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente de E.U.A. 4,601,893, en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), en la especificación abierta al público Japonesa JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer - (Biotechnology and Bioengineeríng 58, 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular. A modo de ejemplo, la transcetolasa se sobre expresa con la ayuda de un plásmido. El vector lanzadera de E.coli - C. glutámico pEC-T18mob2 que se muestra en la Figura 1 se utiliza para esto. Después de incorporación del gen tkt en pEC-T18mob2 y la corrección de orientación subsecuente del fragmento de ADN que transporta el gen tkt, se forma el plásmido pMS82B que se muestra en la Figura 3. Se pueden utilizar de la misma manera otros vectores plasmídicos los cuales son capaces de replicación en C. glutamicum, tal como, por ejemplo pE Exl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) ó pZ8-l (EP-B- 0 375 889). Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos amplificar una o más enzimas de la vía de biosíntesis particular, de glicolisis, de anaplerosis o de la exportación de aminoácidos, además de la amplificación del gen tkt, el cual codifica para transcetolasa. Así, por ejemplo, en particular para la preparación de L-treonina, se pueden amplificar, en particular sobreexpresar, uno o más genes elegidos del grupo que consisten de • el gen hom el cual codifica para la homoserina deshidrogenasa (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) del alelo hom el cual codifica para la homoserina deshidrogenasa "resistente a retroalimentación" (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991), • el gen gap el cual codifica para la gliceraldehido 3 -fosfato deshidrogenasa (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)), • el gen pyc, el cual codifica para la piruvato carboxilasa (Peters-Wendish et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)), • el gen mqo, el cual codifica para la malato: quinona oxidorreductasa (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)) , • el gen zwf, el cual codifica para glucosa 6- fosfato deshidrogenasa (JP-A-09224661) , • el gen gnd, el cual codifica para 6- fosfogluconato deshidrogenasa (JP-A-9 -224662) , • el gen thrE, el cual codifica para exportación de treonina (DE 199 41 478.5; DSM 12840), • el gen zwal (DE 199 59 328.0 DSM 13115), • el gen eno, el cual codifica para enolasa (DE: 19947791.4) iempo.

Así, por ejemplo, en particular para la preparación de L-lisina, se pueden amplificar, y preferiblemente sobreexpresar uno o más genes que se eligen del grupo que consiste de: • el gen dapA el cual codifica para dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335) , • un gen lysC que codifica para una aspartato cinasa resistente a retroalimentación (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • el gen gap el cual codifica para gliceraldehido 3 -fosfato deshidrogenasa (Eikmanns (1992) , Journal of Bacteriology 174:6076-6086), • el gen pyc, el cual codifica para piruvato carboxilasa (Eikmanns (1992) , Journal of Bacteriology 174:6076-6086) , • el gen mqo el cual codifica para malato-quinona oxidorreductasa (Molenaar et al . , European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)), • el gen zwf el cual codifica para glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (JP-A-09224661) , • al mismo tiempo el gen gnd el cual codifica para 6-fosfogluconato deshidrogenasa (JP-A-9-224662) , • al mismo tiempo, el gen lysE el cual codifica para la exportación de lisina (DE-A-195 48 222) - • al mismo tiempo el gen zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115) , • el gen eno, el cual codifica para enolasa (DE: 19947791.4) al mismo tiempo. Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos al mismo tiempo atenuar uno o más de los genes que se eligen del grupo que consiste de: • el gen pck el cual codifica para fosfoenol piruvato carboxicinasa (DE 199 50 409.1; DSM 13047) , • el gen pgi, el cual codifica para glucosa 6-fosfatoisomerasa (US 09/396,478, DSM 12969), • el gen poxB el cual codifica para piruvato oxidasa (DE 199 51 975.7; DSM 13114), • el gen zwa2 (DE: 199 59 327.2; DSM 13113) además de la amplificación del gen tkt. Además de la sobreexpresión de transcetolasa, puede ser ventajoso además para la producción de L-aminoácidos para eliminar reacciones colaterales indeseables Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in:Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, RU, 1982). Los microorganismos preparados de acuerdo con la invención se pueden cultivar continua o discontinuamente en el proceso por lote (cultivo por lotes) o en un lote de alimentación (proceso de alimentación) o un proceso de lotes de alimentación repetida (proceso de alimentación repetitiva) con el propósito de producción de L-aminoácidos. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo para ser utilizado debe satisfacer los requerimientos de los microorganismo particulares de una manera adecuada. Las descripciones de medio de cultivo para diversos microorganismos están contenidos en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D.C., E.U.A., 1981). Los azúcares y carbohidratos tales como, por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como, por ejemplo, aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y grasa de coco, ácidos grasos tales como, por ejemplo, ácido palmitico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como, por ejemplo, glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, se pueden utilizar como la fuente de carbono. Esta sustancia se puede utilizar individualmente o como una mezcla. Como la fuente de nitrógeno se pueden utilizar compuestos orgánicos que contienen nitrógeno tal como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de macerado de maíz, harina de frijol de soya y urea, o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio . Las fuentes de nitrógeno se pueden utilizar individualmente o como una mezcla. Como la fuente de fósforo se pueden utilizar fosfato diácido de potasio o fosfato ácido de dipotasio o las sales correspondientes que contengan sodio. El medio de cultivo por lo tanto debe comprender además sales de metales, tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, las cuales son necesarias para crecimiento. Finalmente, se pueden usar sustancias de crecimiento esencial tales como aminoácidos y vitaminas, además de las sustancias mencionadas en lo anterior. Los precursores adecuados además se pueden agregar al medio de cultivo. Las sustancias iniciales mencionadas se pueden agregar al cultivo en forma de un lote único, o se pueden alimentar durante el cultivo de una manera adecuada. Los compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico se pueden utilizar de una manera adecuada para controlar el pH. Se pueden utilizar antiespumantes tales como esteres de poliglicol de ácido graso para controlar el desarrollo de espuma. Se pueden agregar substancias adecuadas que tengan una acción selectiva, por ejemplo antibióticos al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener condiciones aeróbicas, se introducen en el cultivo oxígeno o mezclas de gases que contengan oxígeno tales como, por ejemplo, aire. La temperatura del cultivo habitualmente es de 20°C a 45°C, y preferiblemente de 25°C a 40°C. El cultivo se continua hasta que ha formado el máximo de L-aminoácido. Este objetivo habitualmente se obtiene en las siguientes 10 horas a 160 horas. El análisis de los L-aminoácidos se puede llevar a cabo por cromatografía de intercambio aniónico con derivatización (formación de derivados) de ninhidrina subsecuente, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), o se puede llevar a cabo por CLAR en fase inversa como se describe por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174) . Los siguientes microorganismos se han depositado ante la Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células, Braunschweig, Alemania) , de acuerdo con el tratado de Budapest : Escherichia coli K-12 DH5a/pEC-T18mob2 as DSM 13244. Se anexan las siguientes Figuras. • Figura 1: Mapa del plásmido pEC-T18mob2 • Figura 2: Mapa del plásmido pMS82 • Figura 3 : Mapa del plásmido pMS82B • Figura 4 : Mapa del plásmido pCR2. IpoxBint Los números de pares de bases establecidos son valores aproximados que se obtienen en contexto de la capacidad de reproducción. Las' abreviaturas utilizadas tienen el siguiente significado: Con referencia a la Figura 1 : Tet: Gen de resistencia para tetraciclina oriV: Origen de replicación codificado por plásmido RP4mob : de la región mob de E. coli para movilización del plásmido rep : Origen de replicación codificada por plásmido del plásmido pGAl de C. glutamicum per: Gen para control del número de copias de pGAl lacZ-alfa: Fragmento del gen lacZa (N-terminal) del gen para ß-galactosidasa - Con referencia a la Figura 2 y 3 : Tet: Gen de resistencia para tetraciclina rep: Origen de replicación codificado por plásmido de el plásmido pGAl de C. glutamicum per.- Gen para controlar el número de copias de PGAl laZ Residuo de clonación del fragmento del gen lacZa de pEC-T18mob2 tkt: Gen transcetolasa Con referencia a la Figura 4 : ColEl ori: Origen de replicación del plásmido ColEl lacZ : Residuo de clonación del fragmento del gen lacZa fl ori: Origen de replicación del fago fl KmR: Resistencia a canomicina ApR: Resistencia a ampicilina poxBint : Fragmento interno del gen poxB. Además, se han utilizado las siguientes abreviaturas : Accl: Sitio se separación de la enzima de restricción Accl BamHl: Sitio se separación de la enzima de restricción BamHl ECORI : Sitio se separación de la enzima de restricción EcoRI HindIII Sitio se separación de la enzima de restricción HindIII Kpnl Sitio se separación de la enzima de restricción Kpnl PStI: Sitio se separación de la enzima de restricción Psti Pvul: Sitio se separación de la enzima de restricción Pvul Salí: Sitio se separación de la enzima de restricción Salí Sacl Sitio se separación de la enzima de restricción Sacl Smal Sitio se separación de la enzima de restricción Smal Sphl: Sitio se separación de la enzima de restricción Sphl. Xbal: Sitio se separación de la enzima de restricción Xbal Xhol Sitio se separación de la enzima de restricción Xhol - EJEMPLOS Los ejemplos siguientes ilustrarán adicionalmente esta invención. Dos de las técnicas de biología molecular utilizadas son, por ejemplo, aislamiento de ADN plasmídico, tratamiento de enzima de restricción, ligaciones, transformaciones estándar de Escherichia coli , etc. (a menos que se indique de otra manera) , como se describe por Sambrook et al, . (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, E.U.A.).

E emplo 1 Construcción de una Biblioteca de gen de Corynebacterium glutamicum cepa AS019 Se construye la biblioteca de ADN de Corynebacterium glutamicum cepa AS019 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)) utilizando el sistema ? Zap ExpressMR (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), como se describe por O'Donohue (O'Donohue, M. (1997) . The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway.). EÍ equipo ? Zap Express"" requiere de Stratagene (Stragagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037.) y se utiliza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se digiere AS019-DNA con la enzima de restricción Sau3A y se liga a los brazos ? Zap ExpressMR tratados con BamHl y desforforilados .

Eiemplo 2 Clonación y Secuenciado del Gen tkt 1. Clonación Una cepa de Escherichia coli , AI1118, que presenta mutaciones en los genes tktA y tktB como se describe por Iida et al., 1993 (Identification and characterization of the tktB gene encoding a second transketolasa in Escherichia coli K- 12. Journal of Bacteriology 175: 5375-83), se transforma con aproximadamente 500 ng de la biblioteca del plásmido ? Zap ExpressMR AS019 descrita antes. La selección de los transformante se realiza en medio mínimo M9 (Sambrook et al (1989) . Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratories, E.U.A.), que contiene kanamicina a una concentración de 50 mg/l e incubación a 37 °C durante 48 horas. El ADN plasmídico se aisla de un transformante de acuerdo con Birnboim y Doly, 1979 (A rapid alkaline extraction procedure for screéning recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Research, 7: 1513-1523.), y se denomina pTSM2. 3. Secuenciado La clona pTSM2 se secuencia comercialmente por MWG-Biotech Ltd., Waterside House, Peartree Bridge, Milton Keynes MK6 3BY, R.U. se prepara ADN plasmídico de alta pureza a partir de MWG-Biotech, utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN GmbH, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Alemania) , y posteriormente se leofiliza utilizando un leofilizador Lyovac GT 2 (Leybold Heraeus) . El análisis de secuencia inicial se lleva a cabo utilizando los cebadores directo universal e inverso M13.

M13/pUC cebador directo: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3' M13/pUC cebador inverso: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3' Un cebador interno se designa subsecuentemente a partir de la secuencia que se obtiene la cual permite que se deduzca la totalidad del gen tkt. La secuencia del cebador interno es como sigue: Cebador interno 1 : 5' TGCAGCAACCAAGACTG 3' La secuencia que se obtiene después se analiza utilizando el programa DNA Strider (Mack (1988) , Nucleic Acids Research 16: 1829-1836), versión 1.0 en una computadora Apple Macintosh. Este programa permite el análisis tal como el uso del sitio de restricción, análisis del marco de lectura abierta y determinación de uso de codon. Las investigaciones entre la secuencia de ADN obtenidas y las de las bases de datos EMBL y Genbank se obtienen utilizando el programa BLAST (Altschul et al., (1997). Nucleic Acida Research, 25: 3389-3402). Las secuencias de ADN y proteína se alinean utilizando los programas Clustal V y Clustal W. (Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244). La secuencia que se obtiene de esta manera se muestra en la SEC. DE ID. No. 1. El análisis de la secuencia de nucleótidos que se obtiene muestra un marco de lectura abierta de 2094 pares de bases el cual se denomina como el gen tkt. Codifica para proteína de 697 aminoácidos que se muestra en la SEC. DE ID. No. 2.

Eiemplo 3 Expresión del Gen tkt 3.1 Preparación del vector lanzadera pEC-T18mob2 - Se construye de acuerdo con la técnica anterior el vector pEC-T18mov2 lanzadera de E. coli - C. glutamicum . El vector contiene la región de replicación rep del plásmido pGAl que incluye efecto de replicación por (US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525- 1532 (1997)), el gen tetA(Z) que imparte resistencia a tetraciclina del plásmido pAGl (UA-A- 5,158,891; entrada de biblioteca de genes en la National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, E.U.A.) con número de acceso AF121000) , la región de replicación oriv del plásmido pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), el fragmento del gen lacZa incluye el promotor lac y un sitio de coloración múltiple (mes) (Norrander et al. Gene 26, 101-106 (2983)) y la región mob del plásmido RP4 (Simón et al., (1983) bio/Technology 1:784- 791) . El vector construido se transforma E. coli cepa DH5a (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I.

IRL-Press, Oxford, Washington DC. E.U.A.). La selección para células que presentan plásmidos se realiza al sembrar en placa el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), el cual se ha suplementado con 5 mg/l de tetraciclina. El ADN - plasmídico se aisla de un- transformante con la ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de Quiagen y se verifica por restricción con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII subsecuente a electroforesis en gel de agarosa (0.8%) . El plásmido se denomina pEC-T18mob2 y se muestra en la Figura 1. Se deposita en forma de la cepa Escherichia coli K-12 cepa DH5a/pEC-T18mob2 en la Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) como DSM 13244. 3.2 Clonación del Gen tkt en el Vector Lanzadera de E. coli -C. glutamicum pEC-T18mob2 Se utiliza PCR para amplificar fragmentos de ADN que contienen la totalidad del gen tkt de C. glutamicum y que flanquean las regiones hacia el estremo 5 ' y hacia el extremo 3 ' . Las reacciones PCR se llevan a cabo utilizando cebadores oligonucleotídicos diseñados de la SEC. DE ID. NO.: 1. El ADN genómico se aisla de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de acuerdo con Heery y Dunican, (Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799 (1993)) y se utilizan aproximadamente 150-200 ng como plantilla. Los cebadores utilizados fueron: cebador directo de tkt: 5' CTG ATC ATC GGA TCT AAC GAA 3' - cebador inverso de tkt : 5 ' ATT GCC CCG GGT TGA AGC TAA3 3 Los parámetros de PCR fueron los siguientes: 35 ciclos 95 °C durante 6 minutos 94 °C durante 1 minuto 55 °C durante 1 minuto 72 °C durante 45 segundos MgCl2 1 mM El producto de PCR obtenido se clona en el vector pGEM-T disponible comercialmente que se adquiere de Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector System 1, cat. no. A1360, Promega RU, Southampton) utilizando E. coli cepa JM109 (Yanish-Perron et al., Gene 33: 103-119 (1985)) como un huésped. La totalidad del gen tkt se aisla subsecuentemente del vector T de pGEM en un fragmento Sphl/SalI y se clona en la región Sphl/Sall de lacZ del vector lanzadera de E. coli - C. glutamicum pEC-T18mob2 (Figura 1) , y se designa pMS82 (Figura 2) . El análisis por enzima de restricción con Accl (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) muestra la orientación incorrecta del gen tkt en el gen lacZa de pEC-T18mob2. Se corrige la orientación al restringir con enzima EcoRI (Boehringher Mannheim GmbH, Alemania) y religando. El análisis por encima de restricción con Accl (Boehringer Mannheim GmbH, Alemania) muestra la orientación correcta del gen tkt en el gen lacZa (es decir, hacia el extremo 3 ' del promotor lac) de pEC-T18mob2 y este plásmido se denomina con el nombre pMS82B (Figura 3) .

Eiemplo 4 Efecto de la Sobreexpresión del Gen tkt en Varios Productores de Lisina La cepa productora de L-lisina Corynebacterium glutamicum DSM5715 se describe en EP-B-0435132 y la cepa DSM12866 se describe en DE-A-19931314. Ambas cepas se depositan en el Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares] en Braunschweig (Alemania) de acuerdo con el tratado de Budapest . 4.1 Preparación de las cepas DSM5715/pMS82B y DSM12866/pMS82B Se transforman las cepas DSM5715 y DSM12866 con el plásmido pMS82B utilizando el método de electroporación descrito por Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989) ) . La selección de los transformantes se llevó a cabo en agar LBHIS que comprende 18.5 g/1 de caldo de infusión cerebro-corazón, sorbitol 0.5 M, Bacto-triptona 5 - gl/1, Bacto-extracto de levadura 2.5 g/1, NaCl 5 g/1 y Bacto-agar 18 g/1, el cual se ha suplementado con tetraciclina 5 mg/l. La incubación se lleva a cabo durante 2 días a 33°C. El ADN plasmídico se aisla en cada caso de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wendish et al., 1998, Microbiology, 144, 915 - 927), se separa con la endonucleasa de restricción Accl, y el plásmido se verifica por electroforesis subsecuente en gel de agarosa. Las cepas que se obtienen de esta manera se denominan DSM5715/pMS82B y DSM12866/pMS82B. 4.2 Preparación de L-lisina Las Corvnebacterium glutamicum cepas DMS5715/pMS82B y DSM12866/pMS82B obtenidas en el Ejemplo 4.1 se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determina el contenido de lisina en el sobrenadante de cultivo. Para esto, la cepa se incuba primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l)) durante 24 horas a 33°C. A partir de este cultivo en placa de agar, se siembra un precultivo (10 ml de medio en un matraz cónico de 100 ml) . Se utiliza el medio completo CglII como el medio para el precul ivo .

Medio Cg III NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a 2% (p/v) autoclave por separado) El pH se lleva a aproximadamente pH 7.4 A esto se agrega tetraciclina (5 mg/l) . El precultivo se incuba durante 16 horas a 33 °C a 240 rpm en una máquina de agitación. Se siembra un cultivo principal de este precultivo de manera que la DO inicial (660 nm) del cultivo principal es de 0.1. Se utiliza medio MM para el cultivo principal .

Medio MM CSL (licor de macerado de maíz) 5 g/l MOPS (ácido morfolino propanosulfónico) 20 g/1 Glucosa (sometida a autoclave por separado) 50 g/1 (NH 2S04 25 g/1 KH2P04 0.1 g/l MgS04 * 7H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 IL.0 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5.0 mg/l Biotina (esterilizada por filtración) 0.3 mg/l Clorhidrato de tiamina (esterilizada por 0.2 mg/l filtración) L-Leucina (esterilizada por filtración) 0.1 g/1 CaCO, 25 g/1 El CSL, MOPS y la solución de sal se llevan a pH 7 con amoníaco acuoso y se someten a autoclave . Después se agregan el sustrato estéril y las soluciones de vitamina así como el CaC03 sometido a autoclave en estado seco. El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflectores. Se agrega tetraciclina (5 mg/l) . El cultivo se lleva a cabo a 33 °C y 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, la DO se determina a una medición de longitud de onda de 660 nm con un equipo Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de lisina que se forma se determina con un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y derivatización posterior a columna con detección por ninhidrina. En la Tabla 1 se muestra el resultado del experimento .

Tabla 1 Eiemplo 5 Preparación de la Biblioteca del Gen Cósmido Genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 El ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 se aisla como se describe por Tauch et al., (1995, Plasmid 33:168-179), y se separa parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, Código No. 27-0913- 02) . Los fragmentos de ADN se desfosforilan con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Bischemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Código No. 1758250) . El ADN del vector cósmido SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla, E.U.A., Descripción de Producto SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Código No. 251301) se separa con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Feiburg, Alemania, Descripción de Producto Xbal, Código No. 27-0948-02) y se desfosforila por igual con fosfatasa alcalina de camarón. El ADN cósmido después se separa con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto BamHl, Código No. 27-0868-04) . El ADN cósmido tratado de esta manera se mezcla con el ADN ATCC13032 tratado y el lote se trata con ADN ligasa T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto T4-DNA-Ligase, Código No. 27-0870-04) . La mezcla de ligación después se empaca en fagos con la ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, E.U.A., Descripción de Producto Gigapack II XL Packing Extract, Código No. 200217) . Para la infección de ?. coli cepa NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) , las células se captan en MgS04 10 mM y se mezclan con una alícuota de la suspensión de fago. La infección y titulación de la biblioteca del cósmido se lleva a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , las células se siembran en placa en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + 100 µg/ml de ampicilina. Después de incubación durante la noche a 37 °C, se seleccionan clonas individuales recombinantes .

- Ejemplo 6 Aislamiento y Secuenciado del Gen poxB El ADN cósmido de una colonia individual (Ejemplo 5) se aisla con Qiaprep Spin Miniprep Kit (Producto No. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se separa parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Sau3AI, Producto No. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desforforilan con fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción de Producto SAP, Producto No. 1758250) . Después de separación por electroforesis en gel, los fragmentos de cósmido en el tamaño de 1,500 a 2,000 pb se aislan con QiaExII Gel Extraction Kit (Producto No. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciado pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción de Producto Zero Background Cloning Kit, Producto No. K2500-01) se separa con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción de Producto Ba Hl, Producto No. 27-0868-04) . La ligación de los fragmentos de cósmido en el vector de secuenciado pZero-1 se lleva a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , la mezcla de ADN se incuba durante la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) . Esta mezcla de ligación después se somete a electroporación (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en E. coli cepa DH5ocMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences E.U.A. 87:4645-4649), y se siembra en placas en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) con 50 µg/ml de zeocina.

La preparación del plásmido de las clonas recombinantes se lleva a cabo con Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania) . El secuenciado se lleva a cabo por el método de detención de cadena didesoxi de Sanger et al . (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences E.U.A., 74:5463-5467) con modificaciones de acuerdo con Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research 18:1067). Se utiliza el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencig Kit" de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación por electroforesis en gel y el análisis de la reacción de secuenciado se llevan a cabo en un gel "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide" (29:1) (Producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de secuencia sin tratar obtenidos después se procesan utilizando el paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) versión 97-0.

Las secuencias individuales de los derivados de pZerol se ensamblan a una condición contigua continua. El análisis de la región codificante asistido por computadora se prepara con el programa XNIP (Staden 1986, Nucleic Acids Research 14:217- 231) . Se lleva a cabo un análisis adicional con los "BLAST search programs" (Altschul et al. 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402), contra el banco de datos no redundante "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, E.U.A.). 10 La secuencia nucleotídica resultante se muestra en la SEC. DE ID. NO.: 3. El análisis de la secuencia nucleotídica muestra un marco de lectura abierta de 1737 pares de bases, el cual se denomina el gen poxB. El gen poxB codifica para un polipéptido de 579 aminoácidos (SEC. DE ID. 15 NO . : 4) .

Ejemplo 7 á k Preparación de un Vector de Integración para Mutagénesis por 20 Integración del Gen poxB .

A partir de la cepa ATCC 13032, se aisla ADN cromosómico por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)). En base de la secuencia del gen 25 poxB conocida para C. glutamicum del Ejemplo 8, se eligen los - siguientes oligonucleótidos para la reacción en cadena de polimerasa: poxBintl : 5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3' poxBint2 : 5* GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3' Los cebadores mostrados se sintetizan por MWG Biotech (Ebersberg, Alemania) y la reacción de PCR se lleva a cabo por el método de PCR estándar de Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) con Pwo-Polymerasa de Boehringer. Con la ayuda de la reacción en cadena de polimerasa, se aisla un fragmento de ADN de aproximadamente 0.9 kb de tamaño, este presenta un fragmento interno del gen poxB y se muestra en la SEC . DE ID . NO . : 5. El fragmento de ADN amplificado se liga con el equipo de clonación TOPO TA de Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, E.U.A.; Número de Catálogo K4500-01) en el vector pCR2.l-TOPO (Mead at al. (1991) Bio/Technology 9:657- 663) . Después, se somete a electroporación E. coli cepa DH5a con el lote de ligación (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) . La selección de las células que presentan el plásmido se realiza al sembrar en placa el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), el cual se ha suplementado con 25 mg/l de kanamicina. El ADN plasmídico se aisla de un transformante con la ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de Qiagen y se verifica por restricción con la enzima de restricción EcoRI y la electroforesis en gel de agarosa subsecuente (0.8%). El plásmido se denomina pCR2. IpoxBint (Figura 4). El plásmido pCR2. IpoxBint se ha depositado en forma de la cepa Escherichia coli DH5 /pCR2. IpoxBint como DSM 13114 en Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el tratado de Budapest .

Ejemplo 8 Mutagénesis de Integración del poxB en DSM 5715 Productor de Lisina El vector pCR2. IpoxBint mencionado en el Ejemplo 7 se somete a electroporación por el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a AEC. El vector pCR2. IpoxBint no se puede replicar independientemente en DSM5715 y se retiene en la célula únicamente si ha sido integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de las clonas con pCR2. IpoxBint integradas en el cromosoma se llevan a cabo por sembrado en placa del lote de electroporación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratoy Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), el cual se ha suplementado con 15 mg/l de kanamicina. Para detección de la integración, el fragmento poxBint se etiqueta con el equipo de hibridación Dig de Boehringer por el método de "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" de Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993) . El ADN cromosómico de un integrante potencial se aisla por el método de Eikmanns et al.

(Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)), y en cada caso se separa con las enzimas de restricción Salí, Sacl y HindIII.

Los fragmentos que se forman se separan por electroforesis en gel de agarosa y se hibridizan a 68 °C con el equipo de hibridación Dig de Boehringer. El plásmido pCR2. IpoxBint mencionado en el Ejemplo 9 se ha insertado en el cromosoma de DSM5715 dentro del gen poxB cromosómico. La cepa se denomina DSM5715 : :pCR2. IpoxBint .

- - Eiemplo 9 Efecto de la Sobreexpresión del Gen tkt con la Eliminación Simultánea del Gen poxB en la Preparación de Lisina. 9.1 Preparación de la cepa DSM5715 : :pCR2. IpoxBint/pMS82B La cepa DSM5715 : :pCR2. IpoxBint se transforma con el plásmido pMS82B utilizando el método de electroporación descrito por Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989) ) . La selección de los transformantes se lleva a cabo en agar LBHIS que comprende 18.5 g/1 de caldo de infusión cerebro-corazón, sorbitol, 0.5 M, 5 g/1 de Bacto-triptona, 2.5 g/1 de Bacto-extracto de levadura 5 g/1 de NaCl y 18 g/1 de Bacto-agar, el cual se ha suplementado con 5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de kanamicina. La incubación se lleva a cabo durante 2 días a 33 °C. El ADN plasmídico se aisla en cada caso de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915 -927), se separa con la endonucleasa de restricción Accl, y el plásmido se verifica por la electroforesis en gel de agarosa subsecuente. La cepa que se obtiene de esta manera se denomina DSM5715 :pCR2. IpoxBint/pMS82B . 9.2 Preparación de L-lisina El C. glutamicum cepa DSM5715. :pCR2. IpoxBint/pMS82B obtenido en el Ejemplo 9.1 se cultiva en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determina el contenido de lisina en el sobrenadante de cultivo. Para esto, la cepa primero se incuba en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l) y kanamicina (25 mg/l) ) durante 24 horas a 33 °C. Partiendo de este cultivo en placa de agar, se siembra un precultivo (10 ml de medio en 100 ml de matraz cónico) . El medio CglII completo se utiliza como el medio para el precultivo. Medio Cg III NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a autoclave 2 % (p/v) por separado) El pH se lleva a pH 7.4 Se agregan a esto tetraciclina (5 mg/l) y kanamicina (25 mg/l) . El precultivo se incuba durante 16 horas a 33 °C a 240 rpm en una máquina de agitación. Se siembra un cultivo principal a partir de este precultivo de manera que la DO inicial (660nm) del cultivo principal es 0.1. Se utiliza el medio MM para el cultivo principal.

Medio MM CSL (licor de macerado de maíz) 5 g/1 MOPS (ácido 20 g/1 morfolinopropanosulfónico) Glucosa (sometida a autoclave por 58 g/1 separado) (NH4)2S04 25 g/1 KH2P04 0.1 g/1 MgS04 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * 1^0 5.0 mg/l Biotina (esterilizada por filtración) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (esterilizada por 0.2 mg/l filtración) L-leucina (esterilizada por filtración) 0.1 g/1 CaC03 25 g/1 El CSL, MOPS y la solución salina se llevan a pH 7 con amoníaco acuoso y se someten a autoclave. El sustrato estéril y las soluciones de vitamina se agregan posteriormente, así como CaC03 sometido a autoclave, en estado seco. El cultivo se lleva a cabo en un volumen de 10 ml, en un matraz cónico de 100 ml con deflectores. Se agregan tetraciclina (5 mg/l) y kanamicina (25 mg/l) . El cultivo se lleva a cabo a 33 °C y 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, se determina la DO a una longitud de onda de medición de 660 nm con un equipo Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . Se determina la cantidad de lisina formada con un analizador de aminoácidos de Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por cromatografía de intercambio iónico y derivatización posterior a la columna con detección con ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla 2. Tabla 2 - PROTOCOLO DE SECUENCIA <110> National University of Ireland, Galway Degussa-Hüls AG <120> Proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos usando la bacteria corineforme . <130> 000019 BT <140> <141> <160> 5 <170> Patentln Ver. 2.1. <210> 1 <211> 2350 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (205) .. (2295) <223> tkt <400> 1 cgggtcagat taagcaaaga ctactttcgg ggtagatcac ctttgccaaa tttgaaccaa 60 ttaacctaag tcgtagatct gatcatcgga tctaacgaaa acgaaccaaa actttggtcc 120 cggtttaacc caggaaggat tgaccaccta acgaaaacga accaaaactt tggtcccggt 180 ttaacccagg aaggattgac cace ttg acg ctg tea ect• gaa ctt cag gcg 231 Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala 1 5 etc act gta cgc aat tac ccc tet gat tgg tec gat gtg gac acc aag 279 Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys 10 15 20 25 gct gta gac act gtt cgt gtc etc gct gca gac gct gta .gaa aac tgt . 327 Ala Val Asp Thr Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys 30 35 40 ggc tec ggc cae cea ggc acc gca atg age ctg gct ccc ctt gca tac 375 Gly Ser Gly His Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr 45 50 55 acc ttg tac cag cgg gtt atg aac gta gat cea cag gac acc aac tgg 423 Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp 60 65 70 gca ggc cgt gac cgc ttc gtt ctt tet tgt ggc cae tec tet ttg acc 471 Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr 75 80 85 cag tac ate cag ctt tac ttg ggt gga ttc ggc ctt gag atg gat gac 519 Gln Tyr lie Gln Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp 90 95 100 105 ctg aag gct ctg cgc acc tgg gat tce ttg acc cea gga cae ect gag 567 Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu 4 - 110 115 120 tac cgc cae acc aag ggc gtt gag ate acc act ggc ect ctt ggc cag 615 Tyr Arg His Thr Lys Gly Val Glu lie Thr. hr Gly Pro Leu Gly Gln 125 130 135 ggt ctt gca tet gca gtt ggt atg gcc atg gct gct cgt cgt gag cgt 663 Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg 140 145 150' ggc cta ttc gac cea acó gct gct gag ggc gaa tec cea ttc gac cae 711 Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His 155 160 165 cae ate tac gtc att gct tet gat ggt gac ctg cag gaa ggt gtc acc 759 His He Tyr Val He Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr 170 175 180 185 tet gag gca tec tec ate gct ggc acc cag cag ctg ggc aac etc ate 807 Ser Glu Ala Ser Ser He Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu He 190 195 200 gtg ttc tgg gat gac aac cge ate tec ate gaa gac aac act gag ate 855 Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg He Ser He Glu Asp Asn Thr Glu He 205 210 215 get ttc aac gag gac gtt gtt gct cgt tac aag gct tac ggc tgg oag 903 Ala Phe Asn Glu Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln 220 225 230 acc att gag gtt gag gct ggc gag gac gtt gca gca ate gaa gct gca 951 Thr He Glu Val Glu Ala Gly .Glu Asp Val Ala Ala He Glu Ala Ala 235 240 245 gtg gct gag gct aag aag gac acc aag cga oct acc ttc ate cgc g-tt 999 Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phß He Arg Val 250 255 260 265 cgc acc ate ate ggc ttc- cea gct cea act atg atg aac acc ggt gct 1047 Arg Thr He He Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala 270 275 280 gtg cae ggt gct gct ctt ggc gca cgt gaa gtt gca gca acc aag act 1095 Val Hiß Gly Ala Ala Leu Gly -Ala Arg Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr 265 290 295 gag ctt gga ttc gat ect gag gct cae ttc gcg ate gac gat gag gtt 1143 Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu Ala His Phe Ala He Asp Asp Glu Val 300 305 310 ate gct cae acc cgc tce etc gca gag cgc gct gca cag aag aag gct 1191 He Ala His Thr Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lyß Ala 315 320 325 gca tgg cag gtc aag ttc gat gag tgg gca gct gcc aac ect gag aac 1239 Ala Trp Gln Val Lys Phß Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn 330 335 340 345 aag gct ctg ttc gat cgc ctg aac tec cgt gag ctt cea geg ggc tac 1287 Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr 350 355 360 gct gac gag etc cea acá tgg gat gca gat gag aag ggc gtc gca act 1335 Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr - 365 370 375 egt aag gct tec gag gct gca ctt cag gca ctg ggc aag acc ctt ect 1383 Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro 380 385 390 gag ctg tgg ggc ggt tec gct gac etc gca ggt tec aac aac acc gtg 1431 Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val 395 400 405 ate aag ggc tec ect tec ttc ggc ect gag tec ate tec acc gag acc 1479 He Lys Gly Ser Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser He Ser Thr Glu Thr 410 415 420 425 tgg tet gct gag ect tac ggc cgt aac ctg cae ttc ggt ate cgt gag 1527 Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phß Gly He Arg Glu 430 435 440 cae gct atg gga tec ate etc aac ggc att tec etc cae ggt ggc acc 1575 His Ala Met Gly Ser He Leu Asn Gly He Ser Leu His Gly Gly Thr 445 450 455 cgc cea tac ggc gga acc ttc etc ate ttc tec gac tac atg cgt ect 1623 Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu He Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro 460 465 470 gca gtt cgt ctt gca gct etc atg gag acc gac gct tac tac gte tgg 1671 Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp 475 480 485 acc cae gac tec ate ggt ctg ggc gaa gat ggc cea acc cae eag ect ' 1719 Thr His Asp Ser He Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro 490 495 500 505 gtt gaa acc ttg gct gca ctg cgc gcc ate cea ggt ctg tec gte ctg 1767 Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu Arg Ala He Pro Gly Leu Ser Val Leu 510 515 520 cgt ect gca gat gcg aae gag acc gcc cag get tgg gct gca goa ctt 1815 Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu 525 530 535 gag tac aag gaa ggc cet aag ggt ctt gca ctg acc cgc cag aac gtt 1863 Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val 540 545 550 ect gtt ctg gaa ggc acc aag gag aag gct gct gaa ggc gtt cgc cge 1911 Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg 555 560 565 ggt ggc tac gtc ctg gtt gag ggt tec aag gaa acc cea gat gtg ate 1959 Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val He 570 575 580 585 etc atg ggc tec ggc tec gag gtt cag ctt gca gtt aac gct gcg aag 2007 Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys 590 595 600 gct ctg gaa gct gag ggc gtt gca gct cgc gtt gtt tec gtt ect tgc 2055 Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys 605 610 615 atg gat tgg ttc cag gag cag gac gca gag tac ate gag tec gtt ctg 2103 Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr He Glu Ser Val Leu - . - 620 625 630 ect gca gct gtg acc gct cgt gtg tet gtt gaa gct ggc ate gca atg 2151 Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly He Ala Met 635 640 645 ect tgg tac cgc tte ttg ggc acc cag ggc cgt gct gtc tec ctt gag 2199 Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu 650 655 660 665 cae ttc ggt gct tet gcg gat tac cag acc ctg ttt gag aag ttc ggc 2247 His Phe Gly Ala Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly 670 675 680 ate acc acc gat gca gtc gtg gca gcg gcc aag gac tec att aac ggt 2295 He Thr Thr Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser He Asn Gly 685 690 695 taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat gattetcegg aattt 2350 <210> 2 <211> 697 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro 1 5 10 15 Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr Val Arg Val 20 25 30 Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His Pro Gly Thr 35 40 45 Ala Met S&r Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met 50 55 60 Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val 65 ' 70 75 80 Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr He Gln Leu Tyr Leu 85 90 95 Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp 100 105 110 Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr Lys Gly Val 115 120 125 Glu He Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly 130 135 140 Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala 145 150 155 160 Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His He Tyr Val He Ala Ser 165 170 175 Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser Ser He Ala 180 185 190 Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu He Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg - - 195 200 205 lie Ser He Glu Asp Asn Thr Glu He Ala Phe Asn Glu Asp Val Val 210 215 220 Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr He Glu Val Glu Ala Gly 225 230 235 240 Glu Asp Val Ala Ala He Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp 245 250 255 Thr Lys Arg Pro Thr Phe He Arg Val Arg Thr He He Gly Phe Pro 260 265 270 Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala Ala Leu Gly 275 280 285 Ala Arg Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu 290 295 300 Ala His Phe Ala He Asp Asp Glu Val He Ala His Thr Arg Ser Leu 305 310 315 320 Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp 325 330 335 Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu 340 345 350 Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp 355 360 365 Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala 370 375 380 Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala 385 390 395 400 Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val He Lys Gly Ser Pro Ser Phe 405 410 415 Gly Pro Glu Ser He Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly 420 425 430 Arg Asn Leu His Phe Gly He Arg Glu His Ala Met Gly Ser He Leu 435 440 445 Asn Gly He Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe 450 455 460 Leu He Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu 465 470 475 480 Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser He Gly Leu 485 490 495 Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu 500 505 510 Arg Ala He Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu 515 520 525 Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys 530 535 540 - Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys 545 550 555 560 Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu 565 570 575 Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val He Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu 580 585 590 Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val 595 600 605 Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Mßt Asp Trp Phe Gln Glu Gln 610 615 620 Asp Ala Glu Tyr He Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg 625 630 635 640 Val Ser Val Glu Ala Gly He Ala Met Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly 645 650 655 Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala Ser Ala Asp 660 665 670 Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly He Thr Thr Asp Ala Val Val 675 680 685 Ala Ala Ala Lys Asp Ser He Asn Gly 690 695 <210> 3 <211> 2160 <212> <213> Corynebacterium glutamicum <220> ADN <221> CDS <222> (327) .. (2063) <400> 3 ttagaggcga ttetgtgagg tcaetttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60 cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120 ttggtttega cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180 gggcatccet gtttggtacc gagtaeccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240 aagcgtggca acaactggaa tttaagagea caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300 aatagecata acgttgagga gttcag atg gca cae age tac gca gaa caá tta 353 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu 1 5 att gac act ttg gaa gct caá ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401 He Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg He Tyr Gly Leu Val 10 15 20 25 ggt gac age ctt aat ceg ate gtg gat gct gtc cgc caá tea gat att 449 Gly Asp Ser Leu Asn Pro He Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp He 30 35 40 gag tgg gtg cae gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497 Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly 45 50 55 gcg gaa teg ttg ate act ggg gag ctg goa gta tgt gct gct tet tgt 545 Ala Glu Ser Leu He Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys 60 65 70 ggt ect gga aac ac cae ctg att cag ggt ett tat gat teg oat cga 593 Gly Pro Gly Asn Thr His Leu He Gln Gly Leu Tyr Asp Ser HÍ3 Arg 75 80 85 aat ggt gcg aag gtg ttg gcc ate get age cat att ceg agt gec cag 641 Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala He Ala Ser His He Pro Ser Ala Gln 90 95 100 105 att ggt teg acg ttc ttc cag gaa acg cat ceg gag att ttg ttt aag 689 He Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu He Leu Phe Lys 110 115 120 gaa tge tet ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737 Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu 125 130 135 cgc att ttg cat cae gcg att cag tec acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785 Arg He Leu His His Ala He Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val 140 145' 150 teg gtg gta gtg att ect ggt gat ate gct aag gaa gac gca ggt gac 833 Ser Val Val Val He Pro Gly Asp He Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp 155 160 165 ggt aet tat tec aat tec act att tet tet ggc aet ect gtg gtg tte 881 Gly Thr. Tyr Ser Asn Ser Thr He Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe 170 175 180 185 ceg gat ect act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929 Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala He Asn Asn Ala 190 195 200 aag tet gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977 Lys Ser Val Thr Leu Phß Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala 205 210 215 cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tea ceg ate ggg cat gcg 1025 Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys He Lys Ser Pro He Gly His Ala 220 225 230 ctg ggt ggt aag cag tac ate eag cat gag aat ceg ttt gag gtc ggc 1073 Leu Gly Gly Lys Gln Tyr He Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly 235 240 245 atg tet ggc etg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tec aat gag 1121 Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu 250 255 260 265 gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc ect tat tet gat ttc 1169 Ala Asp Leu Leu He Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe 270 275 280 ctt ect aaa gac aae gtt gee eag gtg gat ate aac ggt gcg cae att 1217 Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp He Asn Gly Ala His He 285 290 295 ggt cga cgt acc ácg gtg aag tat ceg gtg acc ggt gat gtt gct gca 1265 Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala 300 305 310 acá ate gaa aat att ttg ect cat gtg aag gaa aaa acá gat cgt tec 1313 Thr He Glu Asn He Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser 315 320 325 ttc ctt gat cgg atg etc aag gca cae gag cgt aag ttg age teg gtg 1361 Fhe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val 330 335 340 345 gta gag acg tac acá cat aac gtc gag aag cat gtg ect att cae ect 1409 Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro He His Pro 350 355 360 gaa tac gtt gcc tet att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457 Glu Tyr Val Ala Ser He Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val 365 370 375 ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac ate 1505 Ene Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr He 380 385 390 gag aat ceg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tea tte cgc cae ggc 1553 Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly 395 400 405 acg atg gct aat gcg ttg ect cat .gcg att ggt gcg caá agt gtt gat 1601 Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala He Gly Ala Gln Ser Val Asp 410 415 420 425 cga aac cgc cag gfcg ate gcg atg tgt gge gat ggt ggt ttg ggc atg 1649 Arg Asn Arg Gln Val He Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met 430 435 440 ctg ctg ggt gag ctt etg acc gtt aag ctg cao caá ctt ceg ctg aag 1697 Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys 445 450 455 gct gtg gtg ttt aac aac agt tet ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745 Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met 460 465 470 etc gtg gag gga cag cea gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793 Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn 475 480 485 ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt ate aaa teg gta cgc ate acc 1841 Phe Ala Glu He Ala Ala Ala Ala Gly He Lys Ser Val Arg He Thx 490 495 500 505 gat ocg aag aaa gtt egc gag eag cta gct gag gca ttg gca tat ect 1889 Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro 510 515 520 gga ect gta ctg ate gat ate gte acg gat ect aat geg etg teg ate 1937 Gly Pro Val Leu He Asp He Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser He 525 530 535 cea cea acc ate acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc age aag gcg gcc 1985 Pro Pro Thr He Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala 540 545 550 - - acc cga acó gte ttt ggt gga gga gta gga geg atg ate gat ctg gcc 2033 Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met He Asp Leu Ala 555 560 565 cgt teg aac ata agg aat att ect act cea tgatgattga tacacctgct 2083 Arg Ser Asn He Arg Asn He Pro Thr Pro 570 575 gttcteattg accgegagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143 gcccatgaga ttgccct 2160 <210> 4 <211> 579 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamioum <400> 4 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu He Asp Thr Leu Glu Ala Gln 1 5 10 15 Gly Val Lys Arg He Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro He 20 25 30 Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp He Glu Trp Val His Val Arg Asn 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu He Thr Gly 50 55 60 Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 80 He Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95 He Ala Ser His He Pro Ser Ala Gln He Gly Ser Thr Phe Phe Gln 100 105 110 Glu Thr His Pro Glu He Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125 Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg He Leu His His Ala He 130 135..,.,„. 140 Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val He Pro Gly 145 150 155 160 Asp He Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175 He Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Leu Val Glu Ala He Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205 Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220 Lys He Lys Ser Pro He Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr He 225 230 235 240 Gln His Glu Asn Pro Phß Glu Val Gly Mßt Ser Gly Leu Leu Gly Tyr 245 250 255 Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu He Leu Leu 260 265 270 Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala 275 280 285 Gln Val Asp He Asn Gly Ala His He Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys 290 295 300 Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr He Glu Asn He Leu Pro 305 310 315 320 His Val • Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys 325 330 335 Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn 340 345 350 Val Glu Lys His Val Pro He His Pro Glu Tyr Val Ala Ser He Leu 355 360 365 Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met 370 375 380 Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr He Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg 385 390 395 400 Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro 405 410 415 His Ala He Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val He Ala 420 425 430 Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr 435 440 445 Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser 450 455 460 Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu He Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Gly He Lys Ser Val Arg He Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu 500 505 510 ' Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu He Asp He 515 520 525 Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser He Pro Pro Thr He Thr Trp Glu 530 535 540 Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly 545 550 555 560 Gly Val Gly Ala Met He Asp Leu Ala Arg Ser Asn He Arg Asn He 565 570 575 Pro Thr Pro <210> 5 <211> 875 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 5 tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgsattt tgcatcacgc gattcagtcc 60 accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120 gcaggtgacg gtaettattc caatteeact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180 gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240 ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgc cgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300 aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360 gaggtcggca tg ctggect gcttggttac ggcgcetgcg tggatgcgtc eaatgaggcg 420 gatctgetga ttctattggg tacggatttc ecttattctg atttccttcc taaagacaac 480 gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540 gtgaccggtg atgttgotgc aacaatcgaa aatattttge ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600 gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660 gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720 attttgaacg agetggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780 gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaaegc gcgactttgt gggttcattc 840 cgccacggca cgatggctaa tgcgttgect catgc 875 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso para la preparación de L-aminoácidos por fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque comprende llevar a cabo las siguientes etapas: a) fermentación de la bacteria productora de L-aminoácido que se desea, en la cual por lo menos se amplifica el gen tkt, b) concentración del L-aminoácido en el medio o en las células de la bacteria, y c) aislamiento del L-aminoácido producido

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza una bacteria en la cual los genes adicionales de la trayectoria de biosíntesis del L-aminoácido deseado se amplifican adicionalmente, en particular se sobre expresan.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se utiliza una bacteria corineforme la cual prepara L-treonina, L-lisina o L-isoleucina.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes las cuales preparan L-lisina.

5. Un proceso para la preparación fermentativa de L-lisina, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque en los microorganismos corineformes los cuales en particular ya producen L-lisina, se amplifican o sobreexpresan al mismo tiempo uno o más genes que se eligen del grupo que consiste de: 5.1 el gen dapA el cual codifica para dihidrodipicolinato sintasa, 5.2 el gen lysC el cual codifica para una aspartato cinasa resistente a retroalimentación, 5.3 el gen gap el cual codifica para glicerolaldehído 3 -fosfato deshidrogenasa, 5.4 el gen pyc, el cual codifica para piruvato carboxilasa, 5.5 el gen zwf, el cual codifica para glucosa 6- fosfato deshidrogenasa, 5.6 el gen gnd, el cual codifica para 6- fosfogluconato deshidrogenasa, 5.7 el gen lysE el cual codifica para la exportación de lisina, 5.8 el gen mqo, el cual codifica para malato- quinona oxidorreductasa, 5.9 el gen zwal 5.10 el gen eno, el cual codifica para enolasa.

6. Un proceso para la preparación fermentativa de L-treonina, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porgue en los microorganismos corineformes los cuales en particular producen de antemano L-treonina, se amplifican, en particular se sobre expresan, al mismo tiempo, uno o más genes que se eligen del grupo que consiste de 6.1 el gen hom, el cual codifica para homoserina deshidrogenasa o el alelo homdr, el cual codifica para una homoserina deshidrogenasa "resistente a la retroalimentación" 6.2 el gen gap, el cual codifica para glicerolaldehido 3-fosfato deshidrogenasa, 6.3 el gen pyc, el cual codifica para piruvato carboxilasa, 6.4 el gen mqo, el cual codifica para malato:quinona oxidorreductasa, 6.5 el gen zwf, el cual codifica para glucosa 6- fosfatodeshidrogenasa, 6. 6 , el gen gnd, el cual codifica para 6- fosfogluconato deshidrogenasa, - 6.7 el gen thrE, el cual codifica para la exportación de treonina, 6.8 el gen zwal, 6.9 el gen eno, el cual codifica para enolasa.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque, para la preparación de los L-aminoácidos, en particular L-lisina o L-treonina, se fermentan bacterias con uno o más genes que se eligen del grupo que consiste de 7.1 el gen pck, el cual codifica para fosfoenolpiruvato carboxicinasa, 7.2 el gen pgi, el cual codifica para glucosa 6 - fosfatoisomerasa, 7.3 el gen poxB, el cual codifica para piruvato oxidasa, 7.4 el gen zwa2 es o son atenuados al mismo tiempo.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 2 a 6, caracterizado porque, para obtener la amplificación, se incrementa el número de copias de los genes o secuencias nucleotidicas por transformación de los microorganismos con vectores plasmídicos los cuales transportan estos genes o secuencias de nucleótidos.

9. Un vector plasmídico pEC-T18mob2, depositado bajo la designación DSM 13244 en K-12 DH5a, que se muestra en la Figura 1.

10. El vector plasmídico pEC-T18mob2, de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque adicionalmente transporta el gen tkt .

11. Un microorganismo corineforme, en particular del género Corynebacterium, caracterizado porque está transformado por la introducción del vector plasmídico de conformidad con la reivindicación 10, el cual contiene adicionalmente el gen tkt.