KR20010112494A - ｔｋｔ 유전자를 증폭시켜 Ｌ-아미노산을 발효적으로제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은

a) 적어도 tkt 유전자가 증폭된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 코리네형 세균을 발효시키는 단계,

b) L-아미노산을 배지 또는 상기 세균의 세포내에 축적시키는 단계 및

c) 생산된 L-아미노산을 분리하는 단계를 수행함을 포함하여, 코리네형 세균을 발효시켜 L-아미노산을 제조하는 방법 및 tkt 유전자를 함유하는 벡터에 관한 것이다.

Description

ｔｋｔ 유전자를 증폭시켜 Ｌ-아미노산을 발효적으로 제조하는 방법{Process for the fermentative preparation of Ｌ-amino acids with amplification of the tkt gene}

L-라이신, L-트레오닌 및 L-이소루신은 동물 사료, 사람 의학 및 제약 산업에서 사용된다.

이들 아미노산은 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주의 발효에 의해 생산되는 것으로 공지되어 있다. 이의 큰 중요성으로 인하여, 제조방법을 개선시키기 위한 노력이 지속적으로 이루어져 왔다. 이러한 방법의 개선은 발효 수단, 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 예를 들어, 발효 동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성, 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산 특성에 관련될 수 있다.

돌연변이 유발, 선별법 및 돌연변이 선별법을 사용하여 이들 미생물의 생산 특성을 개선시킨다. 상기 방식으로, 항대사물질, 예를 들어, 트레오닌 유사체 α-아미노-β-하이드록시발레르산(AVH)에 대해 내성이거나, 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며 L-아미노산, 예를 들어, 트레오닌을 생산하는 균주를 수득한다.

수년 동안, 재조합 DNA 기술이 또한 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 개선시키는데 사용되어 왔다.

본 발명은 적어도 tkt 유전자가 증폭된 코리네형 세균을 사용하는, L-라이신, L-트레오틴 및 L-이소루신의 발효적 제조방법에 관한 것이다.

다음 도면을 첨부한다:

·도 1: 플라스미드 pEC-T18mob2의 지도

·도 2: 플라스미드 pMS82의 지도

·도 3: 플라스미드 pMS82B의 지도

·도 4: 플라스미드 pCR2.1poxBint의 지도.

기재된 염기쌍 수는 재현성의 범주에서 수득된 근사값이다.

사용된 약어는 다음의 의미를 갖는다:

도 1의 경우:

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

oriV: 이.콜라이의 플라스미드-암호화 복제 오리진

RPmob: 플라스미드 유동을 위한 mob 영역

rep: 씨. 글루타미쿰 플라스미드 pGA1으로부터의 플라스미드-암호화 복제 오리진

per: pGA1으로부터의 복제수를 조절하기 위한 유전자

lacZ-알파: β-갈락토시다제 유전자의 lacZα 유전자 단편(N-말단)

도 2 및 도 3의 경우:

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

rep: 씨. 글루타미쿰 플라스미드 pGA1로부터의 플라스미드-암호화 복제 오리진

per: PGA1으로부터의 복제수를 조절하기 위한 유전자

lacZ: pEC-T18mob2로부터의 lacZα 유전자 단편의 클로닝 잔존부분

tkt: 트랜스케톨라제 유전자

도 4의 경우:

ColE1 ori: 플라스미드 ColE1의 복제 오리진

lacZ: lacZα 유전자 단편의 클로닝 잔존부분

fl ori: 파지 fl의 복제 오리진

KmR: 가나마이신 내성

ApR: 암피실린 내성

poxBint: poxB 유전자의 내부 단편

또한, 다음 약어를 사용하였다:

AccⅠ: 제한 효소 AccI의 절단 부위

BamHⅠ: 제한 효소 BamHI의 절단 부위

EcoRⅠ: 제한 효소 EcoRⅠ의 절단 부위

HindⅢ: 제한 효소 HindⅢ의 절단 부위

KpnⅠ: 제한 효소 KpnⅠ의 절단 부위

PstⅠ: 제한 효소 PstⅠ의 절단 부위

PvuⅠ: 제한 효소 PvuⅠ의 절단 부위

SalⅠ: 제한 효소 SalⅠ의 절단 부위

SacⅠ: 제한 효소 SacⅠ의 절단 부위

SamⅠ:제한 효소 SmaⅠ의 절단 부위

SphⅠ: 제한 효소 SphⅠ의 절단 부위

XbaⅠ: 제한 효소 XbaⅠ의 절단 부위

XhoⅠ: 제한 효소 XhoⅠ의 절단 부위.

본 발명자들은 코리네형 세균을 사용하여 L-라이신, L-트레오닌 및 L-이소루신을 발효적으로 제조하기 위한 개선된 방법에 대한 새로운 원리를 제공하는 것을 목적으로 한다.

L-라이신, L-트레오닌 및 L-이소루신은 사람 의학 및 제약 산업, 식료품 산업 및 특히 동물 사료에서 사용된다. 따라서, 이들 아미노산을 제조하기 위한 신규한 개선된 방법을 제공하는하는데 일반적인 관심이 있다.

하기에서 L-아미노산이 언급될 경우, 이는 L-라이신, L-트레오닌 및 L-이소루신을 의미한다.

본 발명은 효소 트랜스케톨라제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(EC 번호 2.2.1.1)(tkt 유전자)이 증폭되고 특히 과발현된 코리네형 세균을 사용하는, L-아미노산의 발효적 제조방법을 제공한다.

사용되는 균주는 바람직하게는 tkt 유전자의 증폭 전에 L-아미노산을 미리 생산한다.

바람직한 양태는 특허청구의 범위에서 찾아볼 수 있다.

이와 관련하여, 용어 "증폭"은, 예를 들어, 잠재적 프로모터 또는 활성이 높은 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 병용함으로써, 유전자 또는 유전자들의 복제수를 증가시켜 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 기술한다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분, 셀룰로즈, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산을 생산할 수 있다. 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속중에서 이들 미생물이 대표적이다. 코리네박테리움 속 중에서도, 특히 이의 L-아미노산 생산능력에 대하여 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰을 언급할 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주는, 예를 들어 다음의 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032;

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806;

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870;

코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERMBP-1539;

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067;

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및

L-아미노산을 생산하는, 이로부터 제조된 돌연변이체, 예를 들어 L-트레오닌 생산 균주로서:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21649;

브레비박테리움 플라붐 BB69;

브레비박테리움 플라붐 DSM5399;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-BP 269 및

브레비박테리움 락토퍼멘툼 TBB-10, 및

예를 들어 L-이소루신 생산 균주로서:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14309;

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14310;

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14311;

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 15168 및

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 6871, 및

예를 들어 L-라이신 생산 균주로서:

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709;

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708;

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712;

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463;

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464;

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032;

코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12866이다.

본 발명에 이르러, 코리네형 세균이 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자(EC 번호 2.2.1.1)의 과발현 후에 개선된 방식으로 코리네형 세균을 생산한다는 것이 밝혀졌다.

tkt 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 수탁번호 AB023377로서 기관[European Molecular Biology Laboratories; EMBL, Heidelberg, Germany]에 공개되어 있다. 이케다 등[참조 문헌: Ikeda et al., Applied Microbiology and Biotechnology 51, 201-206 (1999)]은 L-트립토판, L-티로신 및 L-페닐알라닌의 형성에 대한 tkt 유전자 증폭의 효과를 추가로 기술하였다. 상기 언급된 참조 문헌에서 기술되어 있는 tkt 유전자는 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 유전자 코드의 축퇴 또는 중립 기능의 센스 돌연변이로 인해 야기되는 tkt 유전자의 대립형질 유전자를 또한 사용할 수 있다.

증폭(예: 과발현)을 달성하기 위해, 예를 들어 상응하는 유전자의 복제수를 증가시키거나, 구조적 유전자의 상부스트림에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 자리를 돌연변이시킨다. 구조적 유전자의 상부스트림에 혼입되어있는 발현 카세트가 동일한 방식으로 작용한다. 발효적 L-아미노산 형성 과정중에유도성 프로보터에 의해 추가로 발현을 증가시킬 수 있다. 이와 마찬가지로, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키는 방법에 의해 개선시킨다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성을 증가시킨다. 유전자 또는 유전자 작제물은 가변적인 복제수로 플라스미드내에 존재하거나, 염색체에 삽입되어 증폭된다. 대안으로서, 배지 조성 및 배양 방법을 변화시킴으로써 당해 유전자의 과발현을 또한 달성할 수 있다.

당해 숙련가는 이와 관련된 지침사항을, 예를 들어, 문헌[참조 문헌: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchita and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1998); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 제0 472 869호; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 제WO 96/15246호; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993), 일본 공개 특허공보 제10-229891호; Jensen and Hammmer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)] 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.

예로써, 트랜스케톨라제는 플라스미드를 보조로하여 과발현시킨다. 도 1에 나타낸 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰(E. coli-C. Glutamicum) 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 이를 위해 사용한다. tkt 유전자를 pEC-T18mob2내로 혼입시킨 다음, tkt 유전자를 함유하는 DNA 단편을 배향 교정시킨 후, 도 3에 나타낸 플라스미드 pMS82B를 형성시킨다.

씨. 글루타미쿰에서 복제할 수 있는 기타 플라스미드 벡터, 예를 들어, pEKEx1[참조 문헌: Eikamanns et al., Gene 102:93-98 (1991)] 또는 pZ8-1[참조 문헌: EP-B-0 375 889]를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.

또한, L-아미노산의 생산을 위해, 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자의 증폭 이외에, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충과정 또는 아미노산 배출 중의 하나 이상의 효소를 증폭시키는 것이 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들어, 특히 L-트레오닌의 제조를 위해, 다음 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭시키고 특히 과발현시킬 수 있다.

·호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자[참조 문헌: Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)] 또는 "피드 백(feed back) 내성 " 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립형질 유전자[참조 문헌: Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)],

·글리세르알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조 문헌: Eikmanns et al., Journal of Bacterology 174: 6076-6086 (1992)],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: Peters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)],

·말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조 문헌: Molenarr et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

·글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자[참조 문헌: JP-A-09224661]

·6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자[참조 문헌: JP-A-9-224662]

·트레오닌 배출을 암호화하는 thrE 유전자[참조 문헌: DE 199 41 478.5; DSM 12840]

·zwal 유전자[참조 문헌: DE 199 59 328.0; DSM 13115]

·엔올라제를 암호화하는 eno 유전자[참조 문헌: DE 19947791.4]

따라서, 예를 들어, L-라이신의 제조를 위해, 다음 유전자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 바람직하게는 과발현시킬 수 있다:

·디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[참조 문헌: EP-B 197 335],

·피드 백 내성 아스파레이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조 문헌: Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324],

·글리세롤알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteroiology 174:6076-6086],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조 문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteroiology 174:6076-6086],

·말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조 문헌: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

·글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자[참조 문헌: JP-A-09224661],

·동시에, 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호하하는 gnd 유전자[참조 문헌: JP-A-9-224662],

·동시에, 라이신 배출을 암호화는 lysE 유전자[참조 문헌: DE-A-195 48 222]

·동시에, zwal 유전자[참조 문헌: DE 199 59 328.0; DSM 13115] 또는

·엔올라제를 암호화하는 eno 유전자[참조 문헌: DE 19947791.4].

또한, L-아미노산 생산을 위해, tkt 유전자의 증폭 이외에, 다음 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 약화시키는 것이 유리할 수 있다.

·포스포엔올 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참조 문헌: DE 199 59 409.1; DSM 13047],

·글루코즈 6-포스페이트 이소머라아제를 암호화하는 pgi 유전자[참조 문헌: US 09/396,478, DSM 12969],

·피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[참조 문헌: DE 199 51975.7; DSM 13114] 또는

·zwa2 유전자[참조 문헌: DE: 199 59 327.2; DSM 13113]

트랜스케톨라제의 과발현 이외에, L-아미노산의 생산을 위해, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 또한 유리할 수 있다[참조 문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms"; Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

L-아미노산을 제조하기 위해, 본 발명에 따라서 제조되는 미생물은 배치 방법(배치 배양) 또는 유가식(feed process) 또는 반복 유가식 방법(repetitive feed process)으로 연속적 또는 비연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 교과서[참조 문헌: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); Storhas, Bioreakoren und periphere Einrichtungen, Bioreactors and Peripheral Euipment(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 미생물의 요구 조건을 적합한 방식으로 충족시켜야한다. 다양한 미생물용 배양 배지는 편람[참조 문헌: "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다. 탄소원으로서 당 및 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀루로즈), 오일 및 지방(예:대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테이르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산)을 사용할 수 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 질소원으로서 유기 질소-함유 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아) 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 사용할 수 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 증식에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황화철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 상기 언급된 물질 이외에도 필수 성장 물질, 예를 들어, 아미노산 및 비타민을 사용할 수 있다. 추가로, 적합한 전구체를 배양 배지에 첨가할 수 있다. 언급된 출발 물질은 단일 배치 형태로 배양물에 첨가할 수 있거나, 배양 동안 적합한 방식으로 공급할 수 있다.

염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적합한 방식으로 pH를 조절할 수 있다. 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 거품 발생을 조절할 수 있다. 선택적 작용을 갖는 적합한 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가하여 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다. 호기성 조건을 유지시키기 위해는, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어, 공기를 배양물에 유입한다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 최대량의L-아미노산이 생성될때까지 지속한다. 이러한 목적은 통상적으로 10시간 내지 160시간내에 달성된다.

L-아미노산 분석은 문헌[참조 문헌: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화에 의해 수행하거나, 문헌[참조 문헌: Lindroth et al., Analytical Chemistry (1979) 51:. 1167-1174]에 기술된 바와 같이 역상 HPLC에 의해 수행할 수 있다.

다음 미생물은 부다페스트 조약에 따라서 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cuturew, Braunschweig, Germany)]에 기탁하였다:

DSM 13244로서 에스케리키아 콜라이 K-12 DH5α/pEC-T18mob2.

하기 실시예는 본 발명을 설명할 것이다. 사용된 분자생물학 기술, 예를 들어, 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 처리, 연결 및 이. 콜라이의 표준 형질전환 등은 (달리 언급하지 않는 한) 문헌[참조 문헌: Sambrook et al., MolecularCloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA]에 기술되어있는 것이다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 AS019의 유전자 라이브러리 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 AS019의 DNA 라이브러리[참조 문헌: Yoshihamma et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)]는 오도휴[참조 문헌: O'Donohue, M. (1997), Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutammicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway]에 의해 기술된 바와 같이 λZap Express^TM시스템[참조 문헌: Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600]을 사용하여 작제한다. λZap Express^TM키트를 스트라타진(Stratgene, 11011 North Torry Pines RD., La Jolla, California 92037)로부터 구입하여 제조업자의 지침에 따라서 사용한다. ASO19-DNA를 제한 효소 Sau3A로 분해시키고 BamHⅠ처리되고 탈인산화된 λZap Express^TM팔(arm)에 연결시킨다.

실시예 2

tkt 유전자의 클로닝 및 서열화

1. 클로닝

이다 등[참조 문헌: Iida et al., 1993, Identification andcharacterization of the tktB gene encoding a second transketolase in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology 175: 5375-83]에 의해 기술된 바와 같이, tkt 유전자 및 tktB 유전자에 돌연변이를 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주인 AI1118를 상기 기술된 AS019 λZap Express^TM플라스미드 라이브러리 500ng로 형질전화시킨다. 형질전화체의 선별은 50mg/ℓ 농도의 가나마이신을 함유하며 37℃에서 48시간 동안 항온처리한 M9 최소 배지에서 수행한다. 플라스미드 DNA를 문헌[참조 문헌: Birnboim and Doly, 1979, A rapid alkaline extractin procedure for screening recombinant plasmid DNA]에 따라서 하나의 형질전화체로부터 분리하고 pTSM2로 명명한다.

3. 서열화

클론 pTSM2은 MWG-바이오테크(MWG-Biotech Ltd., Waterside House, Peartree Bridge, Milton Keynes MK63BY, U.K)에 의해 서열 분석되어 있다. 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit, 제조원: QIAGEN Gmbh, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Germany)를 사용하여, 고순도의 플라스미드 DNA를 MWG-바이오테크를 위해 제조하고, 이어서 Lyovac GT 2 동결건조기(제조원: Leybold Heraeu)를 사용하여 동결건조시킨다. 초기 서열 분석은 일반적인 전방향 프라이머 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 수행한다.

M13/pUC 전방향 프라이머: 5' GTAAAACGACGGCCAGT 3'

M13/pUC 역방향 프라이머: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3'

이어서, 내부 프라이머를 전체 tkt 유전자를 추론할 수 있도록 하는 수득된 서열로부터 디자인한다. 내부 프라이머의 서열은 다음과 같다:

내부 프라이머 1:

5' TGCAGCAACCAAGACTG 3'

이어서, 수득된 서열을 애플 매킨토시 컴퓨터에서 DNA 스트라이더(Strider) 프로그램[참조 문헌: Marck (1988), Nucleic Acids Research 16: 1829-1836] 버전 1.0을 사용하여 분석한다. 상기 프로그램은 분석, 예를 들어, 제한 부위 용도, 개방 판독 프레임 분석 및 코돈 용도 측정을 가능하게 한다. 수득된 DNA 서열과 EMBL 및 진뱅크(Genbank) 데이터베이스의 서열 사이의 조사는 BLAST 프로그램을 사용하여 달성한다[참조 문헌: Altschul et al., (1997), Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402]. DNA 및 단백질 서열은 클러스탈 V(Clustal V) 및 클러스탈 W(Clustal W) 프로그램을 사용하여 정렬시킨다[참조 문헌: Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244].

따라서, 수득된 서열을 서열 1에 나타낸다. 수득된 뉴클레오타이드 서열의 분석은 tkt 유전자로서 명명된 2094 염기쌍의 개방 판독 프레임을 나타낸다. 상기 유전자는 서열 2에 나타낸 697개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

실시예 3

tkt 유전자의 발현

3.1 셔틀 벡터 pEC-t18mob2의 작제

이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 선행 분야에 따라서 작제한다.

벡터는, 복제 이펙터(effector) per을 포함하는 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep[참조 문헌: US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)], 플라스미드 pGA1의 테트라사이클린 내성-부여 tetA(Z) 유전자[참조 문헌: US-A-5,158,891; 승인번호 AF121000의 유전자 라이브러리 명(National Center for Biotechnology, NCBI, Bethesda, MD, USA), 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV[참조 문헌: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitave Biology 43, 77-90 (1979)], lac 프로모터 및 다중 클로닝 부위(mcs)를 포함하는 lacZα[참조 문헌: Norrander et al. Gene 26, 101-106 (1983)] 유전자 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참조 문헌: Simon et al., (1983) Bio/Technology 1:784-791]을 함유한다

작제된 벡터를 이. 콜라이 균주 DH5α내에서 형질전환시킨다[참조 문헌: Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach. Vol. Ⅰ. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드-함유 세포는 5mg/ℓ의 테트라사이클린 보충된 LB 한천상에 형질전환 배치를 도말함으로써 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 플라스미드 DNA는 퀴아프렘 스핀 미니프렘 키트(제조원: Qiagen)를 보조로 하여 형질전환체로부터 분리하여 제한 효소 EcoRⅠ및 HindⅢ로 절단한 다음, 아가로스 겔(0.8%) 전기영동시켜 확인한다.

플라스미드를 pEC-T18mob2로 명명하고 도 1에 나타낸다. 상기 플라스미드는 균주 에스케리키아 콜라이 K-12 균주 DH5α/pEC-T18mob2의 형태로 DSM 13244로서 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cuturew, Braunschweig, Germany)에 기탁되어 있다.

3.2 tkt 유전자의 이. 콜라이-씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2로의 클로닝

PCR을 사용하여 씨. 글루타미쿰의 전체 tkt 유전자를 함유하며 상부스트림 및 하부스트림 영역에 인접하는 DNA 단편을 증폭시킨다. PCR 반응은 서열 1로부터 디자인된 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 수행한다. 게놈 DNA를 문헌[참조 문헌: Heery and Dunican, Applied and Environmental Microbilogy 59: 791-199 91993)]에 따라서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 분리하고 약 150 내지 200ng를 주형으로서 사용한다. 사용되는 프라이머는 다음과 같다:

tkt 전방향 프라이머: 5' CTG ATC ATC GGA TCT AAC GAA 3'

tkt 역방향 프라이머: 5' ATT GCC CCG GGT TGA AGC TAA3 3'

PCR 매개변수는 다음과 같다:

35 사이클

95℃에서 6분 동안

94℃에서 1분 동안

55℃에서 1분 동안

72℃에서 45초 동안

MgCl₂1mM.

수득되는 PCR 생성물은, 이. 콜라이 균주 JM109[참조 문헌: Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119 (1985)]을 숙주로서 사용하여 프로메가(Promega Corp.)로부터 구입한 시판중인 pGEM-T 벡터(pGEM-T Easy Vector System 1, cat. no. A1360, Promega UK, Southampton)내로 클로닝시킨다. 이어서, 전체 tkt 유전자를 SphⅠ/SalⅠ 단편에 대하여 pGEM T-벡터로부터 분리하고, 이. 콜라이-씨, 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2의 lacZ SphⅠ/SalⅠ 영역(도 1)내로 클로닝시키고 pMS82(도 2)로 명명한다. AccⅠ(제조원: Boehringer Mannheim GmbH, Germany)를 사용하는 제한 효소 분석은 pEC-T18mob2의 lacZα유전자내의 tkt 유전자의 부정확한 배향을 나타낸다. 배향은 EcoRⅠ 효소(제조원: Boehringer Mannheim GmbH, Germany)로 절단하고 재연결시켜 교정한다. AccⅠ(제조원: Boehringer Mannheim GmbH, Germany)를 사용하는 제한 효소 분석은 pEC-T18mob2의 lacZα 유전자(즉, lac-프로모터의 다운스트림에 위치)내의 tkt 유전자의 정확한 배향을 나타내며, 상기 플라스미드를 pMS82B(도 3)로 명명한다.

실시예 4

다양한 라이신 생산자에서 tkt 유전자 과발현의 효과

L-라이신-생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715는 EP-B-0435132에 기술되어 있으며, 균주 DSM12866은 DE-A-19931314.8에 기술되어 있다. 이들 균주 둘다는 부다페스트 조약에 따라서 브로인슈바익(독일)에 소재하는 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁되어 있다.

4.1 균주 DSM5715/pMS82B 및 DSM12866/pMS82B의 제조

균주 DSM5715 및 DSM12866을 리벨 등에 의해 기술된 전기천공법[참조 문헌: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)]을 사용하여 플라스미드 pMS82B로 형질전환시킨다. 형질전환체는 5mg/ℓ의 테트라사이클린으로 보충된, 18.5g/ℓ의 뇌-심장 융합 브로쓰, 0.5M의 소르비톨, 5g/ℓ의 박토-트립톤, 2.5g/ℓ의 박토-효모 추출물, 5g/ℓ의 NaCl 및 18g/ℓ의 박토-한천을 함유하는 LBHITS 한천상에서 선별한다. 33℃에서 2일 동안 배양한다.

각각의 경우에 플라스미드 DNA를 통상의 방법(참조: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927) 사용하여 형질전환체로부터 분리하고, 제한 엔도뉴클레아제 AccⅠ로 절단한 다음, 이를 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인한다. 상기 방식으로 수득한 균주를 DSM5715/pMS82B 및 DSM12866/pMS82B로 명명한다.

4.2 L-라이신의 제조

실시예 4.1에서 수득한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pMS82B 및 DSM12866/pMS82B를 라이신 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고, 배양 상청액중의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 첫째로, 균주를 상응하는 항생제를 함유하는 한천 평판[테트라사이클린(5mg/ℓ)을 함유하는 뇌-심장 한천]상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 한천 평판 배양으로부터 시작하여, 예비배양물을 (100㎖들이 원뿔형 플라스크내의 배지 10㎖에) 접종시킨다. 완전 배지 CgⅢ를 예비배양용 배지로서 사용한다.

배지 CgⅢ

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(개별적으로 오토클레이브시킴) 2%(w/v)

pH는 pH 7.4로 조정한다.

테트라사이클린(5mg/ℓ)을 상기 배지에 첨가한다. 예비배양물을 33℃에서 16시간 동안 240rpm의 진탕기에서 배양한다. 주 배양물은 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 상기 예비배양물로부터 접종시킨다. 배지 MM을 주 배양물용으로 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코즈(개별적으로 오토클레이브시킴) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄*2H₂O 0.1g/ℓ

CaCl₂*7H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄*H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(멸균-여과시킴) 0.3mg/ℓ

티아민*HCl(멸균-여과시킴) 0.2mg/ℓ

L-루신(멸균-여과시킴) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염 용액을 수성 암모니아를 사용하여 pH7로 조정하고 오토클레이브시킨다. 이어서, 멸균 기질 및 비타민 용액과 함께 무수-오토클레이브시킨 CaCO₃를 첨가한다. 배양은 배플이 장착된 100㎖들이 원뿔형 플라스크에서 10㎖ 용적으로 수행한다. 33℃ 및 80%의 대기 습도에서 배양한다.

72시간 후, 660nm의 측정 파장에서 바이오멕 1000(Biomek 1000, 제조원: Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 OD를 측정한다. 형성된 라이신의 양은 이온 교환 크로마토그래피 및 닌히드린 검출법을 사용하는 컬럼후 유도체에 의해, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여 측정한다.

시험 결과를 표 1에 나타낸다.

균주	OD	L-라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715	7.2	14.1
DSM5715/pMS82B	7.2	14.8
DSM12866	10.9	15.3
DSM12866/pMS82B	11.2	16.8

실시예 5

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 게놈 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체 DNA를 문헌[참조 문헌: Tauch et al., 1995, Plasmid 33:168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고 제한 효소 Sau3AⅠ(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명: Sau3AⅠ, 코드 번호 27-0913-02)로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 새우 알칼리 포스파타제(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, 제품명: SAP, 코드 번호 1758250)로 탈인산화시킨다. 코스미드 벡터 슈퍼코스1(SuperCos1, 공급원: 스트라타젠, La Jolla, USA, 제품명: SuperCos1 Cosmid Vektor kit, 코드 번호 251301)[참조 문헌: Wahl et al. (1997) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164]를 제한 효소 XbaⅠ(제조원: Amersham Pharmcia, Freiburg, Germany, 제품명: XbaⅠ, 코드 번호 27-0948-02)로 절단하고, 마찬가지로 새우 알칼리 포스파타제로 탈인산화시킨다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소BamHⅠ(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명: BamHⅠ, 코드 번호 27-0868-04)로 절단한다. 상기 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC13032 DNA와 함께 혼합하고, 배치를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, 제품명: T4-DNA-Ligase, 코드 번호 27-0870-04)로 처리한다. 이어서, 연결 혼합물을 기가팩 Ⅱ XL 팩킹 추출물(제조원: Stratagene, La Jolla, USA, 제품명: Gigapack Ⅱ XL Packing Extract, 코드 번호 200217)을 보조로 하여 파지내에서 팩킹시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554를 감염[참조 문헌: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575]시키기 위해, 세포를 MgSO₄속에 넣고 파지 상청액의 분취액과 혼합한다. 코스미드 라이브러리의 감염 및 역가측정은 문헌[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하고, 세포를 100㎍/㎖의 암피실린이 보충된 LB 한천[참조 문헌: Lennox, 1955, Viology, 1:190]상에 도말한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 각각의 재조합 클론을 선별한다.

실시예 6

poxB 유전자의 분리 및 서열화

각각의 콜로니의 코스미드 DNA(실시예 5)를 제조업자의 지침에 따라서 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(제품 번호:27106, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고, 제한 효소 Sau3AⅠ(제조원: Amersham Pharmacia, Freiburg,Germany, 제품명: Sau3AⅠ, 코드 번호 27-0913-02)로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 새우 알칼리 포스파타제(제조원: Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, 제품명: SAP, 코드 번호 1758250)로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 1500 내지 2000bp 크기 범위의 코스미드 단편을 퀴아엑스Ⅱ 겔 추출 키트(QiaExⅡ Gel Extraction kit, 제품 번호: 20021, 제조원: Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리한다. 서열화 벡터 pZero-1(제조원: Invitrogen, 네덜란드 그로닝겐 소재, 제품명: Zero Background Cloning Kit, 제품 번호: K2500-01)를 제한 효소 BamHⅠ(제조원: Amersham Pharmcia, 독일 프라이부르크 소재, 제품명: BamHⅠ, 제품 번호: 27-0868-04)로 절단한다. 서열화 벡터 pZero-1내에서의 코스미드 단편은 문헌[참조 문헌: Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 DNA 혼합물을 T4 리가제(제조원: Pharmacia Biotech, 독일 프라이부르크 소재)와 함께 밤새 배양하여 연결시킨다. 이어서, 상기 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조: Grant, 1990, Proceeding of the National Academy of Sciences U.S.A. 87:4645-4649]내로 전기천공시키고[참조: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7] 50㎍/㎖의 제오신을 함유한 LB 한천상에 도말한다[참조: Lennox, 1955, Virology, 1:190]. 바이오로봇 9600(제품 번호: 900200, 제조원: Qigen, Hilden, Germany)을 사용하여 재조합 클론의 플라스미드 제조를 수행한다. 서열화는, 문헌[참조 문헌: Zimmermann et al. 1990, Nucleic Acids Research 18:1067])에 따라서 변형시킨, 생거 등(Sanger et al)의 디데옥시 쇄-종결법을 사용하여 수행한다[참조 문헌:1997, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467]. "RR d로다민 터미네이터 사이클 서열화 키트(RR dRodamin Terminator Cycle Sequencing Kit, 제조원: PE Applied Biosystems, 독일 바이테르슈타트 소재)"를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열화 반응의 분석은 "ABI 프리즘 377" 서열기(제조원: PE Applied Biosystems, 독일 바이테르슈타트 소재)를 사용하여 "로티포레시스 NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드" 겔(29:1)(제품번호: A124.1, 제조원: Roth, 독일 카를스루헤 소재)에서 수행한다.

이어서, 미처리된 수득한 서열 데이터를 스타덴 프로그램 패키지(Staden program package, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) 버전 97-0을 사용하여 처리한다. pZero1 유도체의 각각의 서열을 연속된 배열로 통합시킨다. 컴퓨터 보조된 암호화 영역 분석은 XNIP 프로그램(Staden, 1986, Nucleic acids Rearch, 14:217-231]으로 수행한다. 기관[National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 풍부하지 못한 데이터베이스에 대해, "블래스트 서치 프로그램"(BLAST search program)[참조 문헌: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402]을 사용하여 추가로 분석한다.

수득한 뉴클레오타이드 서열은 서열 3에 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열의 분석은 poxB 유전자로서 지정된 1737개 염기쌍의 개방 판독 프레임을 보여준다. poxB 유전자는 579개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드(서열 4)를 암호화한다.

실시예 7

poxB 유전자의 삽입 돌연변이유발을 위한 삽입 벡터의 제조

균주 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 에크만 등(Eikmanns et al)의 방법[참조 문헌: Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]을 사용하여 분리한다. 실시예 8로부터 수득한 씨. 글루타미쿰에 대한 poxB 유전자의 서열을 기본으로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응용으로 하기의 올리고뉴클레오타이드를 선택한다:

poxBint1:

5' TGC GAG ATGGTG AAT GGT GG 3'

poxBint2:

5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'

상기에 나타낸 프라이머는 MMG 바이오텍(MMG Biotech, 독일 에베르스베르크 소재)에서 합성하고, 인니스 등의 표준 PCR 방법[참조 문헌: Innis et al., PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]에 따라서 Pwo 폴리머라제(제조원: Boehringer)를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응을 보조로하여, poxB 유전자의 내부 단편을 함유하며 서열 5에 나타낸, 크기가 약 0.9kb인 DNA 단편을 분리한다.

증폭된 DNA 단편을 TOPO TA 클로닝 키트(제조원:Invitrogen Corporation, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재, 카달로그 번호 K4500-01)를 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO 벡터[참조 문헌: Mead et al., (1991), Bio/Technology 9:657-663]에서 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이 균주 DH5α를 연결 배치를 사용하여 전기천공시킨다[참조 문헌: Hanahan, In: DNA Cloning. A practical approach. Vol.Ⅰ,IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]. 플라스미드 함유 세포는 형질전환 배치를 가나마이신 25㎎/ℓ가 보충된 LB 한천상에 도말하여 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.1989]. 플라스미드 DNA는 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(제조원: Qiagen)를 보조로하여 형질전환체로부터 분리시키고, 제한효소 EcoRI로 절단한 다음, 아가로스 겔(0.8%)상에서 전기영동시켜 확인한다. 상기 플라스미드는 pCR2.1poxBint로 명명한다(참조: 도 4).

플라스미드 pCR2.1poxBint는 부다페스트 조약에 따라서 균주 에스케리키아 콜라이 DH5α/pCR2.poxBint의 형태로 DSM 13114로서 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cuturew, Braunschweig, Germany)에 기탁하였다.

실시예 8

라이신 생산자 DSM 5715내에서의 poxB 유전자의 삽입 돌연변이유발

실시예 7에서 언급한 벡터 pCR2.poxBint를 타우치등의 전기천공법[참조 문헌: Tauch et al, FEMS Microbiological Letters 123:343-347 (1994)]에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715내에서 전기천공시킨다. 균주 DSM 5715는 AEC-내성 라이신 생산자이다. 벡터 pCR2.1poxBint는 DSM 5715내에서 독립적으로 복제할 수 없으며, DSM 5715의 염색체내로 삽입되는 경우에만 세포내에서 유지된다. 염색체내로 삽입된 pCR2.poxBint를 함유하는 클론은 전기천공 배치를 가나마이신 15㎎/ℓ가 보충된 LB 한천상에 도말하여 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2^ndEd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 삽입체를 검출하기 위해, poxBint 단편을 문헌("DIG System Users Guide for Filter Hybridization"; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993)의 방법에 의해 디그 하이브리드화 키트(Dig hybridization kit, 제조원: Boehringer)를 사용하여 표지한다. 잠재적 삽입체의 염색체 DNA를 에크만 등의 방법[참조 문헌: Eikmanns et al., Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]에 의해 분리하고, 각각의 경우에 제한 효소 SalI, SacI 및 HindIII로 절단한다. 형성된 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고 디그 하이브리드화 키트(제조원: Boehringer)를 사용하여 68℃에서 하이브리드화시킨다. 실시예 9에서 언급한 플라스미드 pCR.2.1poxBint를 염색체 poxB 유전자내에서 DSM 5715내로 삽입하였다. 상기 균주를 DSM5715::pCR2.1poxBint로 명명한다.

실시예 9

poxB 유전자를 동시에 제거시키는, tkt 유전자 과발현의 라이신 제조에 대한 효과

9.1 균주 DSM5715::pCR2.1poxBint/pMS82B의 제조

균주 DSM5715::pCR2.1poxBint는 문헌[참조 문헌: Liebl et al., FEMSMicrobiology Letters, 53:299-303 (1989)]에 기술된 전기천공법을 사용하여 플라스미드 pMS82B로 형질전환시킨다. 형질전환체는 뇌-심장 주입 브로쓰 18.5g/ℓ, 0.5M 소르비톨, 박토 트립톤 5g/ℓ, 박토 효모 추출물, 2.5g/ℓ, NaCl 5g/ℓ 및 박토 한천 18g/ℓ을 포함하며 테트라사이클린 5㎎/ℓ 및 가나마이신 25㎎/ℓ가 보충된 LBHIS 한천상에서 선별한다. 33℃에서 2일 동안 배양을 수행한다.

프라스미드 DNA를 통상의 방법[참조 문헌: Perters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927]을 사용하여 형질전환체로부터 분리시키고, 제한 엔도뉴클레아제 AccI로 절단한 다음, 연속해서 아가로스 겔 전기영동에 의해 플라스미드를 확인한다. 상기 방식으로 수득한 균주는 DSM5715::pCR2.1poxBint/pMS82B로 명명한다.

9.2 L-라이신의 제조

실시예 9.1에서 수득한 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pCR2.1poxBint/pMS82B를 라이신을 생산하기에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양 상청액의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 균주는 상응하는 항생제를 함유한 한천 플레이트[테트라사이클린(5㎎/ℓ) 및 가나마이신(25mg/ℓ)을 함유한 뇌/심장 한천]상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 상기 한천 플레이트 배양으로부터 시작하여, 예비배양물을 접종한다(100㎖들이 원뿔형 플라스크내의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII를 상기 예비배양용 배지로서 사용한다.

배지 CgIII

NaCl 2.5g/ℓ

박토 펩톤 10g/ℓ

박토 효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(개별적으로 오토클레이브 시킴) 2%(w/v)

pH는 pH 7.4로 조정한다.

테트라사이클린(5㎎/ℓ) 및 가나마이신(25㎎/ℓ)을 상기 배지에 첨가한다. 예비배양물은 240rpm의 진탕기상에서 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물은 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 상기 예비배양물로부터 접종시킨다. 배지 MM을 주 배양물용 배지로 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코즈(개별적으로 오토클레이브시킴) 58g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄*7H₂0 1.0g/ℓ

CaCl₂*2H₂O 10㎎/ℓ

FeSO₄*7H₂O 10㎎/ℓ

MnSO₄*H₂O 5.0㎎/ℓ

비오틴(멸균-여과시킴) 0.3㎎/ℓ

티아민*HCl(멸균-여과시킴) 0.2㎎/ℓ

L-루신(멸균-여과시킴) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염수는 암모니아수를 사용하여 pH를 7로 조정하고 오토클레이브시킨다. 이어서 멸균 기질 및 비타민 용액과 함께 무수-오토클레이브시킨 CaCO₃를 첨가한다.

배플이 장착된 100㎖들이 원뿔형 플라스크내에서 10㎖ 용적으로 배양을 수행한다. 테트라사이클린(5mg/ℓ) 및 카나마이신(25㎎/ℓ)을 첨가한다. 배양은 33℃ 및 80%의 대기 습도에서 수행한다.

72시간 후, 바이오멕 1000(제조원:Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여 660nm의 측정 파장에서 OD를 측정한다. 형성된 라이신의 양은 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출법을 사용하는 컬럼후 유도체화에 의해, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여 측정한다.

시험 결과는 표 2에 나타낸다.

균주	OD	L-라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715	10.8	15.9
DSM5715::pCR2.1poxBint	7.1	16.7
DSM5715::pCR2.1poxBint/pMS82B	7.7	17.3

Claims (11)

1. a) 적어도 tkt 유전자가 증폭된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 코리네형 세균을 발효시키는 단계,

   b) L-아미노산을 배지 또는 단계(a)의 세균의 세포내에 축적시키는 단계 및

   c) 생산된 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, 코리네형 세균의 발효에 의한 L-아미노산의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로중의 추가의 유전자가 추가로 증폭되고, 특히 과발현된 세균이 사용되는 방법.
3. 제1항에 있어서, L-라이신, L-트레오닌 및 L-이소루신을 생산하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
4. 제3항에 있어서, L-라이신을 생산하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
5. 제2항에 있어서, 특히 이미 L-라이신을 생산하는 코리네형 미생물에서,

   5.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

   5.2 피드 백(feed back) 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

   5.3 글리세롤알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

   5.4 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

   5.5 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

   5.6 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자,

   5.7 라이신 배출을 암호화하는 lysE 유전자,

   5.8 말레이트-퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자,

   5.8 zwa1 유전자 또는

   5.10 엔올라제를 암호화하는 eno 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증폭되거나 과발현되는, L-라이신의 발효적 제조방법.
6. 제2항에 있어서, 특히 이미 L-트레오닌을 생산하는 코리네형 미생물에서,

   6.1 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자 또는 "피드 백(feed back) 내성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립형질 유전자,

   6.2 글리세로알데히드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

   6.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

   6.4 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자,

   6.5 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

   6.6 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자,

   6.7 트레오닌 배출을 암호화하는 thrE 유전자,

   6.8 zwa1 유전자 또는

   6.9 엔올라제를 암호화하는 eno 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 유전자가 동시에 증폭되고, 특히 과발현되는, L-트레오닌의 발효적 제조방법.
7. 제2항에 있어서, L-아미노산, 특히 L-라이신 또는 L-트레오닌을 제조하기 위해,

   7.1 포스포엔올 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

   7.2 글루코즈 6-포스페이트 이소머라아제를 암호화하는 pgi 유전자,

   7.3 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자 또는

   7.4 zwa2 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 약화된 세균이 발효되는 방법.
8. 제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭을 달성하기 위해, 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열의 복제수가 이들 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 플라스미드 벡터로 미생물을 형질전환시킴에 의해 증가되는 방법.
9. 도 1에 나타내고, K-12 DH5α속의 기탁번호 DSM 13244로 기탁된 플라스미드벡터 pEC-T18mob2.
10. 제9항에 있어서, tkt 유전자를 추가로 함유하는 플라스미드 벡터 pEC-T18mob2.
11. tkt 유전자를 추가로 함유하는, 제10항에 따르는 플라스미드 벡터의 도입에 의해 형질전환된 코리네형 미생물, 특히 코리네박테리움 속의 미생물.