DE60036615T2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren durch verstärkung des tkt-gens - Google Patents

Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren durch verstärkung des tkt-gens Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die fermentative Herstellung von L-Lysin unter Verwendung coryneformer Bakterien, in welchem zumindest das tkt-Gen verstärkt wird.
  • Stand der Technik
  • L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin werden in Tiernahrung, in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie eingesetzt.
  • Es ist bekannt, dass diese Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen von coryneformen Bakterien, insbesondere von Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellungsverfahren gearbeitet. Verbesserungen der Verfahren können sich auf Fermentationsmaßnahmen beziehen, wie zum Beispiel das Rühren und die Bereistellung von Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie z. B. die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zu der Produktform z. B. durch Ionenaustauschchromatographie, oder die intrinsischen Output-Eigenschaften des Mikroorganismus selbst.
  • Verfahren der Mutagenese, Selektion und Mutanten-Selektion werden zur Verbesserung der Output-Eigenschaften dieser Mikroorganismen angewandt. Stämme, die gegenüber Antimetaboliten, wie z. B. dem Threonin-Analogon α-Amino-β-hydroxyvalerinsäure (AHV), resistent sind oder die für Metabolite von regulatorischer Bedeutung auxotrop sind und L-Aminosäuren, wie z. B. Threonin, produzieren, werden auf diese Weise erhalten.
  • Verfahren der rekombinanten DNA-Technik sind ebenfalls seit einigen Jahren für die Verbesserung des Stamms von Corynebacterium glutamicum-Stämmen angewandt worden, welche L-Aminosäure produzieren.
  • Gegenstand der Erfindung
  • Die Erfinder hatten das Ziel der Bereitstellung neuer Grundlagen für verbesserte Verfahren für die fermentative Herstellung von L-Lysin mit coryneformen Bakterien.
  • Beschreibung der Erfindung
  • L-Lysin kommt in der Humanmedizin und der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und besonders in der Tierernährung zum Einsatz. Aus diesem Grund besteht ein allgemeines Interesse an der Bereitstellung neuer verbesserter Verfahren für die Herstellung von L-Lysin.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren für die fermentative Herstellung von L-Lysin unter Verwendung von coryneformen Bakterien bereit, in welchem die Nukleotidsequenz, die für das Enzym Transketolase codiert (EC-Nummer 2.2.1.1) (tkt-Gen), verstärkt, insbesondere überexprimiert wird bzw. werden.
  • Die verwendeten Stämme produzieren vorzugsweise bereits L-Lysin vor der Verstärkung des tkt-Gens.
  • Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen zu finden.
  • Der Begriff "Verstärkung" in diesem Zusammenhang beschreibt die Zunahme der intrazellulären Aktivität von einem oder mehreren Enzymen in einem Mikroorganismus, welche durch die entsprechende DNA codiert werden, zum Beispiel durch Erhöhung der Kopienzahl des Gens bzw. der Gene, unter Verwendung eines wirksamen Promotors oder unter Verwendung eines Gens, welches für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls unter Kombinierung dieser Maßnahmen.
  • Die Mikroorganismen, welche die vorliegende Erfindung bereitstellt, können L-Lysin aus Glucose, Sucrose, Lactose, Fructose, Maltose, Molassen, Stärke, Cellulose oder aus Glycerol und Ethanol herstellen. Sie sind stellvertretend für coryneforme Bakterien, insbesondere der Gattung Corynebacterium. Von der Gattung Corynebacterium kann insbesondere die Spezies Corynebacterium glutamicum genannt werden, die unter Spezialisten für ihre Fähigkeit zur Produzierung von L-Aminosäuren bekannt ist.
  • Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, inbesondere der Spezies Corynebacterium glutamicum, sind zum Beispiel die bekannten Wildtypen-Stämme:
    Corynebacterium glutamicum ATCC13032
    Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
    Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
    Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
    Brevibacterium flavum ATCC14067
    Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
    Brevibacterium divaricatum ATCC14020
    und daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten, wie zum Beispiel die L-Lysin produzierenden Stämme:
    Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
    Brevibacterium flavum FERM-P 1708
    Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
    Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
    Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464
    Corynebacterium glutamicum ATCC13032
    Corynebacterium glutamicum DM58-1
    Corynebacterium glutamicum DSM12866
  • Es wurde herausgefunden, dass coryneforme Bakterien L-Lysin in einer verbesserten Weise nach der Überexpression des tkt-Gens produzieren, welches für Transketolase codiert (EC-Nummer 2.2.1.1).
  • Die Nukleotidsequenz des tkt-Gens wird unter der Zugangssnummer AB023377 in der Datenbank der European Molecular Biology Laboratories (Europäische Molekularbiologie-Labore) (EMBL, Heidelberg, Deutschland) offenbart. Ikeda et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 51, 201–206 (1999)) beschreiben darüber hinaus die Wirkung der Verstärkung des tkt-Gens auf die Bildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Phenylalanin. Als ein Ergebnis der Verstärkung des tkt-Gens in einem Tryptophan- und Lysin-Coproduzenten wird die Tryptophan-Produktion erhöht und die Lysin-Produktion wird verringert. Das in den genannten Textreferenzen beschriebene tkt-Gen kann gemäß der Erfindung verwendet werden. Allelen des tkt-Gens, die aus der Degeneration des genetischen Codes resultieren oder auf Sense-Mutationen einer neutralen Funktion zurückzuführen sind, können darüber hinaus verwendet werden.
  • Um eine Verstärkung (z. B. Überexpression) zu erreichen, wird die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht, oder es wird die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomen-Bindungsstelle stromaufwärts des Strukturgens mutiert. Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden, fungieren in derselben Weise. Durch induzierbare Promotoren ist es weiterhin möglich, die Exprimierung im Verlauf der fermentativen L-Lysin-Bildung zu erhöhen. Die Exprimierung wird ebenso durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA verbessert. Darüber hinaus wird die Enzymaktivität auch durch Verhindern des Abbaus des Enzymproteins erhöht. Die Gene oder Genkonstrukte sind hier entweder in Plasmiden mit einer variierenden Kopienzahl vorhanden oder sind in dem Chromosom integriert und verstärkt. Alternativ kann eine Überexpression der fraglichen Gene außerdem durch Verändern der Zusammensetzung der Medien und der Kulturprozedur erreicht werden.
  • Instruktionen in diesem Zusammenhang sind für den Fachmann u. a. bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der europäischen Patentschrift EPS 0 472 869 , im US-Patent 4 601 893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60 (Angewandte und Umweltmikrobiologie 60), 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der offengelegten japanischen Patentschrift JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie zu finden.
  • Als ein Beispiel wurde Transketolase mit Hilfe eines Plasmids überexprimiert. Der in 1 gezeigte E. coli – C. glutamin-Shuttle-Vektor pEC-T18mob2 wurde hierfür verwendet. Nach dem Einbau des tkt-Gens in pEC-T18mob2 und der nachfolgenden Orientierungskorrektur des das tkt-Gen tragenden DNA-Fragments wurde das in 3 gezeigte Plasmid pMS82B gebildet.
  • Andere Plasmidvektoren, die zur Replikation in C. glutamicum in der Lage sind, wie z. B. pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pZ8-1 ( EP-B-0 375 889 ) können auf die gleiche Weise verwendet werden.
  • Ferner kann es für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, ein oder mehrere Enzyme des speziellen Biosynthesewegs, der Glykolyse, der Anaplerose oder des L-Lysin-Exports zu verstärken, zusätzlich zu der Verstärkung des tkt-Gens, welches für Transketolase codiert.
  • Damit können für die Herstellung von L-Lysin ein oder mehrere Gene, die gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • • dem dapA-Gen, welches für Dihydrodipicolinat-Synthase codiert ( EP-B 0 197 335 ),
    • • dem zwf-Gen, welches für Glucose-6-phosphatdehydrogenase codiert ( JP-A-09224661 ),
    • • gleichzeitig dem gnd-Gen, welches für 6-Phosphogluconatdehydrogenase codiert ( JP-A-9-224662 ),
    • • dem eno-Gen, welches für Enolase codiert ( DE-A-199 47 791 )
    gleichzeitig verstärkt werden, vorzugsweise überexprimiert werden.
  • Es kann darüber hinaus für die Produktion von L-Lysin gleichzeitig von Vorteil sein, ein oder mehrere Gene abzuschwächen, die gewählt sind aus der Gruppe bestehend aus:
    • • dem pck-Gen, welches für Phosphoenolpyruvat-carboxykinase codiert ( DE-A-199 50 409 ; DSM 13047),
    • • dem pgi-Gen, welches für Glucose-6-phosphat-Isomerase codiert ( EP-A-1 087 015 , DSM 12969),
    • • dem poxB-Gen, welches für Pyruvatoxidase codiert ( DE-A-199 51 975 ; DSM 13114),
    zusätzlich zu der Verstärkung des tkt-Gens.
  • Zusätzlich zu der Überexpression von Transketolase kann es darüber hinaus für die Produktion von L-Lysin vorteilhaft sein, unerwünschte Nebenreaktionen zu eliminieren (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" (Züchten von Aminosäure produzierenden Mikroorganismen), in: Overproduction of Microbial Products (Überproduktion von mikrobiellen Produkten), Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
  • Die gemäß der Erfindung hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich in dem Batch-Verfahren (Batch-Kultur) oder in dem Batch-Zuführungs-(Beschickungsverfahren) oder Batch-Zuführungs-Wiederholungsverfahren (repetitive Beschickungsverfahren) für den Zweck der L-Lysin-Produktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung bekannter Kulturverfahren ist in dem Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder in dem Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben. Das verwendete Kulturmedium muß die Anforderungen der speziellen Mikroorganismen in einer geeigneten Weise erfüllen. Beschreibungen von Nährmedien für verschiedene Mikroorganismen sind in dem Handbuch "Manual Methods for General Bacteriology" (Manuelle Verfahren für allgemeine Bakteriologie) der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Zucker und Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Sucrose, Lactose, Fructose, Maltose, Molassen, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojabohnenöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosnussfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerol und Ethanol, und organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, können als Quelle von Kohlenstoff verwendet werden. Diese Substanzen können einzeln oder als eine Mischung verwendet werden. Organische stickstoffhaltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Mais-Einweichungs-Flüssigkeit, Sojabohnenmehl und Harnstoff, oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat, können als die Quelle von Stickstoff verwendet werden. Die Quellen von Stickstoff können einzeln oder als eine Mischung verwendet werden. Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium enthaltenden Salze können als Quelle von Phosphor verwendet werden. Das Kulturmedium muß außerdem Salze von Metallen umfassen, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, welche für das Wachstum erforderlich sind. Schließlich können essentielle Wachstumssubstanzen, wie Aminosäuren und Vitamine, zusätzlich zu den oben genannten Substanzen verwendet werden. Geeignete Vorläufer können darüber hinaus dem Kulturmedium zugegeben werden. Die genannten Ausgangssubstanzen können der Kultur in der Form einer einzelnen Charge zugegeben werden, oder sie können während der Kultivierung in einer geeigneten Weise zugeführt werden.
  • Basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, oder Säureverbindungen, wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure, können in einer geeigneten Weise zur Regulierung des pH-Wertes zum Einsatz kommen. Antischaummittel, wie z. B. Fettsäurepolyglycolester, können zur Regulierung bzw. Eindämmung der Entwicklung von Schaum zum Einsatz kommen. Geeignete Substanzen mit einer selektiven Wirkung, z. B. Antibiotika, können dem Medium zugesetzt werden, um die Stabilität von Plasmiden zu erhalten. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasgemische, wie z. B. Luft, in die Kultur eingeführt. Die Temperatur der Kultur beträgt in der Regel 20°C bis 45°C, und vorzugsweise 25°C bis 40°C. Das Kultivieren wird fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-Lysin gebildet hat. Dieses Ziel wird in der Regel innerhalb 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
  • Die Analyse von L-Lysin kann durch Anionenaustauschchromatographie mit nachfolgender Ninhydrin-Derivatisierung durchgeführt werden, wie von Spackman et al. beschrieben wird. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190), oder kann durch Umkehrphasen-HPLC erfolgen, wie von Lindroth et al. beschrieben wird (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167–1174).
  • Der folgende Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt:
    Escherichia coli K-12 (DH5α/pEC-T18mob2 als DSM 13244
  • Die folgenden Figuren sind beigefügt:
  • 1 Karte des Plasmids pEC-T18mob2
  • 2 Karte des Plasmids pMS82
  • 3 Karte des Plasmids pMS82B
  • 4 Karte des Plasmids pCR2.1poxBint
  • Die angegebenen Basenpaarzahlen sind angenäherte Werte, die im Kontext der Reproduzierbarkeit erhalten werden.
  • Die verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:
  • Re 1:
    • Tet:
    Resistenzgen für Tetracyclin
    oriV:
    Plasmid-codierter Replikationsursprung von E. coli
    RP4mob:
    mob-Region für die Mobilisierung des Plasmids
    rep:
    Plasmid-codierter Replikationsursprung von C. glutamicum-Plasmid pGA1
    per:
    Gen für die Regulierung der Kopienzahl von pGA1
    lacZ-alpha:
    lacZα-Genfragment (N-Terminus) des β-Galactosidasegens
  • Re 2 und 3:
    • Tet:
    Resistenzgen für Tetracyclin
    rep:
    Plasmid-codierter Replikationsursprung von C. glutamicum-Plasmid pGA1
    per:
    Gen für die Regulierung der Kopienzahl von pGA1
    lacZ:
    Klonierungsrelikt des lacZα-Genfragments von pEC-T18mob2
    tkt:
    Transketolasegen
  • Re 4:
    • ColE1 ori:
    Replikationsursprung des Plasmids ColE1
    lacZ:
    Klonierungsrelikt des lacZα-Genfragments
    fl ori:
    Replikationsursprung von Phage f1
    KmR:
    Kanamycin-Resistenz
    ApR:
    Ampicillin-Resistenz
    poxBint:
    Internes Fragment des poxB-Gens
  • Darüber hinaus wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
    • AccI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms AccI
    BamHI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms BamHI
    EcoRI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
    HindIII:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms HindIII
    KpnI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms KpnI
    PstI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms PstI
    PvuI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms PvuI
    SalI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms SalI
    SacI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms SacI
    SmaI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms SmaI
    SphI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms SphI
    XbaI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms XbaI
    XhoI:
    Spaltungsstelle des Restriktionsenzyms XhoI
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen diese Erfindung noch weiter. Die angewandten Techniken der Molekularbiologie, z. B. Plasmid-DNA-Isolierung, Restriktionsenzym-Behandlung, Ligasierungen, Standard-Transformationen von Escherichia coli etc., werden (wenn nicht anders angegeben) von Sambrook et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Aufbau einer Gen-Bibliothek des Corynebacterium glutamicum-Stamms AS019
  • Eine DNA-Bibliothek des Corynebacterium glutamicum-Stamms AS019 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591–597 (1985)) wurde unter Verwendung des λ Zap ExpressTM-Systems, (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583–7600), wie von O'Donohue, M. (1997) beschrieben, aufgebaut; The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. (Das Klonieren und die Molekularanalyse von vier gängigen aromatischen Aminosäure-Biosynthese-Genen) Doktorarbeit, National University of Ireland, Galway.). Das λ Zap ExpressTM-Kit wurde von Stratagene (Stratagene, 11011 North Torreg Pines Rd., La Jolla, Kalifornien 92037) erworben und entsprechend den Vorschriften des Herstellers verwendet. AS019-DNA wurde mit Restriktionsenzym Sau3A verdaut und zu mit BamHI behandelten und dephosphorylierten λ Zap ExpressTM-Armen ligiert.
  • Beispiel 2
  • Klonierung und Sequenzierung des tkt-Gens
  • 1. Klonierung
  • Ein Escherichia coli-Stamm, AI1118, der Mutationen in den tkt-A- und tktB-Genen trägt, wie von Iida et al., 1993 (Identification and characterization of the tktB gene encoding a second transketolase in Escherichia coli K-12 (Identifizierung und Charakterisierung des eine zweite Transketolase in Escherichia coli K-12 codierenden tktB-Gens), Journal of Bacteriology 175: 5375–83), beschrieben, wurde mit etwa 500 ng der oben beschriebenen AS019 λ Zap ExpressTM-Plasmid-Bibliothek transformiert. Die Selektion für Transformanten erfolgte auf M9-Minimalmedien (Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, USA), enthaltend Kanamycin in einer Konzentration von 50 mg/l, und die Inkubation erfolgte bei 37°C während 48 Stunden. Plasmid-DNA wurde von einem Transformanten wie bei Birnboim und Doly, 1979, isoliert (Eine schnelle alkalische Extraktionsprozedur zum Screenen rekombinanter Plasmid-DNA. Nucleic Acids Research, 7: 1513–1523.) und als pTSM2 bezeichnet.
  • 3. Sequenzierung
  • Der Klon pTSM2 wurde kommerziell durch MWG-Biotech Ltd., Waterside House, Peartree Bridge, Milton Keynes MK6 3BY, U. K., sequenziert. Hochreine Plasmid-DNA wurde für MWG-Biotech unter Verwendung des QIAprep-Spin-Miniprep-Kits (QIAGEN GmbH, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Deutschland) hergestellt und anschließend unter Verwendung eines Lyovac GT 2-Gefriertrockners (Leybold Heraeus) gefriergetrocknet. Die anfängliche Sequenzanalyse wurde unter Verwendung von universalen vorwärts- und rückwärtsgerichteten M13-Primer durchgeführt.
  • M13/pUC vorwärtsgerichteter Primer:
    Figure 00120001
  • M13/pUC rückwärtsgerichteter Primer:
    Figure 00120002
  • Ein interner Primer wurde anschließend aus der erhaltenen Sequenz entworfen, die eine Ableitung des gesamten tkt-Gens zuließ. Die Sequenz des internen Primers war wie folgt:
  • Interner Primer 1:
    Figure 00130001
  • Die erhaltene Sequenz wurde danach mit Hilfe des DNA Strider-Programms, (Marck (1988), Nucleic Acids Research 16: 1829–1836), Version 1.0, auf einem Apple Macintosh-Computer analysiert. Dieses Programm ermöglichte Analysen, wie die Restriktionsstellennutzung, die Offene-Leserahmen-Analyse und die Codon-Nutzungs-Bestimmung. Abfragen zwischen der erhaltenen DNA-Sequenz und jenen in EMBL- und Genbank-Datenbanken wurden mit Hilfe des BLAST-Programms erreicht (Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402). DNA- und Proteinsequenzen wurden mit Hilfe der Clustal V- und Clustal W-Programme ausgerichtet (Higgins und Sharp, 1988 Gene 73: 237–244).
  • Die so erhaltene Sequenz ist in SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Analyse der erhaltenen Nukleotidsequenz offenbarte einen offenen Leserahmen von 2094 Basenpaaren, der als tkt-Gen bezeichnet wurde. Dieses codiert für ein Protein von 697 Aminosäuren, die in der SEQ ID Nr. 2 gezeigt sind.
  • Beispiel 3
  • Expression des tkt-Gens
  • 3.1 Herstellung des Shuttle-Vektors pEC-T18mob2
  • Der E. coli-C. -glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-T18mob2 wurde gemäß dem Stand der Technik konstruiert.
  • Der Vektor enthält die Replikationsregion rep des Plasmids pGA1 einschließlich des Replikations-Effektors per ( US-A-5 175 108 ; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525–1532 (1997)), das Tetracyclin-Resistenz verleihende tetA(Z)-Gen des Plasmids pAG1 ( US-A-5 158 891 ; Genbibliothek-Eintrag am National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) mit der Zugangssnummer AF121000), die Replikationsregion oriV des Plasmids pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium an Quantitative Biology 43, 77–90 (1979)), das lacZα-Genfragment einschließlich des lac-Promotors und einer Mehrfachklonierungsstelle (mcs) (Norrander et al. Gene 26, 101–106 (1983)) und die mob-Region des Plasmids RP4 (Simon et al., (1983) Bio/Technology 1: 784–791).
  • Der konstruierte Vektor wurde in dem E. coli-Stamm DH5α transformiert (Hanahan, In: DNA Cloning. A practical approach (DNA-Klonierung. Eine praktische Herangehensweise. Bd. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Die Selektion für Plasmid tragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformations-Ansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. (Molekulares Klonen: ein Laborhandbuch) 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), welche durch 5 mg/l Tetracyclin ergänzt wurde. Plasmid-DNA wurde von einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep-Kits von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII im Anschluss an die Agarosegel-Elektrophorese untersucht (0,8 %).
  • Das Plasmid wurde pEC-T18mob2 genannt und ist in 1 gezeigt. Es ist in der Form des Escherichia-coli-K-12-Stamms DH5α/pEC-T18mob2 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Deutschland) als DSM 13244 hinterlegt.
  • 3.2 Klonierung des tkt-Gens zu dem E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Vektor pEC-T18mob2
  • PCR wurde zur Verstärkung von DNA-Fragmenten, die das gesamte tkt-Gen von C. glutamicum enthielten und die stromaufwärts- und stromabwärts gelegenen Regionen flankieren, angewandt. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die aus SEQ ID Nr. 1 entworfen wurden, durchgeführt. Genomische DNA wurde von Corynebacterium glutamicum ATCC13032 gemäß Heery und Dunican, (Applied and Environmental Microbiology 59: 791–799 (1993)), isoliert und es wurden etwa 150–200 ng als Matrize verwendet. Die verwendeten Primer waren:
  • tkt vorwärtsger. Primer:
    Figure 00150001
  • tkt rückwärtsger. Primer:
    Figure 00150002
  • Die PCR-Parameter waren wie folgt:
    35 Zyklen
    95°C während 6 Minuten
    94°C während 1 Minute
    55°C während 1 Minute
    72°C während 45 Sekunden
    1 mM MgCl2.
  • Das erhaltene PCR-Produkt wurde zu dem kommerziell verfügbaren pGEM-T-Vektor kloniert, der von Promega Corp. erworben wurde (pGEM-T Easy Vector System 1, Kat. Nr. A1360, Promega UK, Southampton) unter Verwendung des E. coli-Stamms JM109 (Panisch-Perron et al., Gene 33: 103–119 (1985) als Wirt. Das gesamte tkt-Gen wurde anschließend von dem pGEM T-Vektor auf einem SphI/SalI-Fragment isoliert und in die lacZ SphI/SalI-Region des E. coli-C. glutamicum-Shuttle-Vektors pEC-T18mob2 (1) kloniert und mit pMS82 bezeichnet (2). Die Restriktionsenzymanalyse mit AccI (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) ergab die unkorrekte Orientierung des tkt-Gens in dem lacZα-Gen von pEC-T18mob2. Die Orientierung wurde durch Restriktion mit EcoRI-Enzym (Boehringer Mannheim, GmbH, Deutschland) und erneutes Ligieren bzw. Religieren korrigiert. Die Restriktionsenzym-Analyse mit AccI (Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland) ergab die korrekte Orientierung des tkt-Gens in dem lacZα-Gen (d. h. stromabwärts des lac-Promotors) von pEC-T18mob2, und dieses Plasmid wurde mit dem Namen pMS82B bezeichnet (3).
  • Beispiel 4
  • Wirkung der Überexpression des tkt-Gens in verschiedenen Lysin-Produzenten
  • Der L-Lysin produzierende Stamm Corynebacterium glutamicum DSM5715 ist in der EP-B-0435132 beschrieben, und der Stamm DSM12866 ist in der DE-A-19931314.8 beschrieben. Beide Stämme sind bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [German Collection of Microorganisms and Cell Cultures] Braunschweig, Deutschland gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
  • 4.1 Herstellung der Stämme DSM5715/pMS82B und DSM12866/pMS82B
  • Die Stämme DSM5715 und DSM12866 wurden mit dem Plasmid pMS82B unter Anwendung des von Liebl et al. beschriebenen Elektroporationsverfahrens transformiert (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)). Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionskulturbrühe, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar umfasste, der durch 5 mg/l Tetracyclin ergänzt wurde. Die Inkubation wurde 2 Tage lang bei 33°C durchgeführt.
  • Plasmid-DNA wurde in jedem Fall von einem Transformanten durch herkömmliche Verfahren isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915–927), mit der Restriktions-Endonuklease AccI gespalten, und das Plasmid wurde durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese untersucht. Die auf diesem Weg erhaltenen Stämme wurden DSM5715/pMS82B und DSM12866/pMS82B genannt.
  • 4.2 Herstellung von L-Lysin
  • Die in Beispiel 4.1 erhaltenen Corynebacterium glutamicum-Stämme DSM5715/pMS82B und DSM12866/pMS82B wurden in einem Kulturmedium kultiviert, das für die Produktion von Lysin geeignet ist, und es wurde der Lysingehalt in dem Kulturüberstand ermittelt.
  • Hierfür wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetracyclin (5 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur geimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). Die komplette Medium CgIII wurde als Medium für die Vorkultur verwendet.
    Medium Cg III
    NaCl 2,5 g/l
    Bacto-Pepton 10 g/l
    Bacto-Hefeextrakt 10 g/l
    Glucose (separat autoklaviert) 2 % (w/v)
  • Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 gebracht.
  • Tetracyclin (5 mg/l) wurde zugegeben. Die Vorkultur wurde 16 Stunden lang bei 33°C mit 240 U/min auf einer Schüttelmaschine inkubiert. Eine Hauptkultur wurde von dieser Vorkultur geimpft, sodass die anfängliche OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Das Medium MM wurde für die Hauptkultur verwendet.
    Medium MM
    CSL (Mais-Einweichungs-Flüssigkeit) 5 g/l
    MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/l
    Glucose (separat autoklaviert) 50 g/l
    (NH4)2SO4 25 g/l
    KH2PO4 0,1 g/l
    MgSO4·7H2O 1,0 g/l
    CaCl2·2H2O 10 mg/l
    FeSO4·7H2O 10 mg/l
    MnSO4·H2O 5,0 mg/l
    Biotin (sterilgefiltert) 0,3 mg/l
    Thiamin·HCl (sterilgefiltert) 0,2 mg/l
    L-Leucin (sterilgefiltert) 0,1 g/l
    CaCO3 25 g/l
  • Das CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert 7 gebracht und autoklaviert.
  • Das sterile Substrat und Vitaminlösungen wurden danach zugegeben, ebenso wie das im Trockenzustand autoklavierte CaCO3.
  • Das Kultivieren wird in einem 10-ml-Volumen in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Prallwänden durchgeführt.
  • Tetracyclin (5 mg/l) wurde zugegeben. Das Kultivieren wurde bei 33°C und 80 % atmosphärischer Feuchtigkeit durchgeführt.
  • Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Reckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge des gebildeten Lysin wurde mit einem Aminosäure-Analysiergerät von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Post-Kolonnen-Derivatisierung mit Ninhydrin-Detektion bestimmt.
  • Das Ergebnis des Experiments ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Stamm OD L-Lysin HCl g/l
    DSM5715 7,2 14,1
    DSM5715/pMS82B 7,2 14,8
    DSM12866 10,9 15,3
    DSM12866/pMS82B 11,2 16,8
  • Beispiel 5
  • Erstellung einer genomischen Cosmidgen-Bibliothek von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
  • Chromosomale DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde isoliert, wie von Tauch et al. beschrieben (1995, Plasmid 33: 168–179) und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI gespalten (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02). Die DNA-Fragmente wurde mit alkalischer Shrimp- bzw. Garnelen-Phosphatase dephosphoryliert (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code Nr. 1758250). Die DNA des Cosmidvektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), erhalten von Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1-Cosmidvektor-Kit, Code Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI gespalten (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code Nr. 27-0948-02) und ebenso mit alkalischer Garnelen-Phosphatase dephosphoryliert. Die Cosmid-DNA wurde danach mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code Nr. 27-0868-04). Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA vermischt und der Ansatz wurde mit T4 DNA-Ligase behandelt (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA- Ligase, Code Nr. 27-0870-04). Die Ligationsmischung wurde danach in Phagen gepackt mit Hilfe von Gigapack II XL Packing Extracts (Packungsextrakten) (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code Nr. 200217). Für die Infizierung des E. coli-Stamms NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO4 aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension gemischt. Die Infizierung und die Titerierung der Cosmid-Bibliothek wurden durchgeführt wie von Sambrook et al. beschrieben (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), wobei die Zellen auf LB-Agar ausplattiert wurden (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) + 100 μg/ml Ampicillin. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante einzelne Klone selektiert.
  • Beispiel 6
  • Isolierung und Sequenzierung des poxB-Gens
  • Die Cosmid-DNA einer einzelnen Kolonie (Beispiel 5) wurde mit dem Qiaprep-Spin-Miniprep-Kit (Produkt Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) entsprechend den Vorschriften des Herstellers isoliert und teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3AI gespalten (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt Nr. 27-0913-02). Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Garnelen-Phosphatase dephosphoryliert (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt Nr. 1758250). Nach der Trennung durch Gel-Elektrophorese wurden die Cosmid-Fragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII-Gel-Extraktions-Kit (Produkt Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Die DNA des Sequenzierungsvektors pZero-1, erhalten von Invitrogen (Groningen, Holland, Produktbeschreibung Null-Hintergrund-Klonierungs-Kit, Produkt Nr. K2500-01) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI gespalten (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04). Die Ligation der Cosmid-Fragmente in dem Sequenzierungsvektor pZero-1 wurde durchgeführt wie von Sambrook et al. beschrieben (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), wobei die DNA-Mischung über Nacht mit T4-Ligase inkubiert wird (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland). Diese Ligationsmischung wurde dann mittels Elektroporation (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343-7) in den E. coli-Stamm DH5αMCR eingebracht (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 87: 4645–4649) und auf LB-Agar ausplattiert (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin. Die Plasmid-Herstellung der rekombinanten Klone wurde mit Biorobot 9600 (Produkt Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die Sequenzierung wurde durch das Didesoxyketten-Stop-Verfahren von Sanger et al. durchgeführt (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifizierungen gemäß Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research 18: 1067). Das "RR dRhodamin-Terminator-Zyklus-Sequenzierungs-Kit" von PE Applied Biosystems (Produkt Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) kam zum Einsatz. Die Trennung durch Gel-Elektrophorese und Analyse der Sequenzierungsreaktion wurden in einem "Rotiphorese-NF-Acrylamid/Bisacrylamid"-Gel (29:1) (Produkt Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem "ABI Prisma 377"-Sequenzierer von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt.
  • Die erhaltenen Rohsequenz-Daten wurden danach mit Hilfe des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231), Version 97-0, verarbeitet. Die einzelnen Sequenzen der pZero1-Derivate wurden zu einem kontinuierlichen „Contig" zusammengesetzt. Die rechnergestützte Codierungsregion-Analyse wurde mit dem XNIP-Programm erstellt (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231). Weitere Analysen wurden mit den "BLAST-Abfrage- bzw. Suchprogrammen" (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389–3402) gegen die nicht-redundante Datenbank des "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) durchgeführt.
  • Die resultierende Nukleotidsequenz ist in der SEQ ID Nr. 3 gezeigt. Die Analyse der Nukleotidsequenz zeigte einen offenen Leserahmen von 1737 Basenpaaren, der als das poxB-Gen bezeichnet wurde. Das poxB-Gen codiert für ein Polypeptid von 579 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 4).
  • Beispiel 7
  • Herstellung eines Integrationsvektors zur Integrationsmutagenese des poxB-Gens
  • Von dem Stamm ATCC 13032 wurde chromosomale DNA durch das Verfahren von Eikmanns et al. isoliert (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)). Auf Basis der Sequenz des poxB-Gens, das für C. glutamicum von Beispiel 8 bekannt ist, wurden die folgenden Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion gewählt:
  • poxBint1:
    Figure 00220001
  • poxBint2:
    Figure 00220002
  • Die gezeigten Primer wurden durch MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert, und die PCR-Reaktion wurde durch das Standard-PCR-Verfahren von Innis et al. (PCR Protocols. A guide to methods and applications = PCR-Protokolle. Ein Leitfaden für Verfahren und Anwendungen), 1990, Academic Press) mit Pwo-Polymerase von Boehringer durchgeführt. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion wurde ein DNA-Fragment von ungefähr 0,9 kb Größe isoliert, wobei dies ein internes Fragment des poxB-Gens trug und es in SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist.
  • Das verstärkte DNA-Fragment wurde mit dem TOPO TA-Klonierungs-Kit von der Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; Katalognummer K4500-01) in dem Vektor pCR2.1-TOPO ligiert (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9: 657–663). Der E. coli-Stamm DH5α wurde danach, mit dem Ligierungsansatz einer Elektrophorese unterzogen (Hanahan, In: DNA cloning. A practical approach (DNA-Klonierung: Eine praktische Herangehensweise). Bd. I IRL Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Die Selektion für Plasmid tragende Zellen erfolgte durch Ausplattieren des Transformationsansatzes auf LB-Agar (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. (Molekulares Klonieren: ein Laborhandbuch). 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), der durch 25 mg/l Kanamycin ergänzt wurde. Plasmid-DNA wurde von einem Transformanten mit Hilfe des QIAprep Spin-Miniprep-Kits von Qiagen isoliert und durch Restriktion mit dem Restriktionsenzym EcoRI und anschließende Agarosegel-Elektrophorese untersucht (0,8 %). Das Plasmid wurde mit pCR2.1poxBint benannt (4)
  • Plasmid-pCR2.1poxBint wurde in der Form des Stamms Escherichia coli DH5α/pCR2.1poxBint als DSM 13114 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen [DSMZ = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt.
  • Beispiel 8
  • Integrations-Mutagenese des poxB-Gens in dem Lysin-Produzenten DSM 5715
  • Der in Beispiel 7 genannte Vektor pCR2.1poxBint wurde durch das Elektroporationsverfahren von Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123: 343–347 (1994)) in Corynebacterium glutamicum DSM 5715 einer Elektrophorese unterzogen. Der Stamm DSM 5715 ist ein AEC-resistenter Lysin-Produzent. Der Vektor pCR2.1poxBint kann nicht unabhängig in DSM5715 repliziert werden und wird nur in der Zelle gehalten, wenn er in das Chromosom von DSM 5715 integriert wurde. Die Selektion von Klonen mit pCR2.poxBint, die in das Chromosom integriert sind, wurde durch Ausplattieren des Elektroporations-Ansatzes auf LB-Agar durchgeführt (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. (Molekulares Klonieren: ein Laborhandbuch). 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.), der durch 15 mg/l Kanamycin ergänzt wurde. Für den Nachweis der Integration wurde das poxBint-Fragment mit dem Dig-Hybridisierungs-Kit von Boehringer durch das Verfahren von "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" (Der DIG-System-Benutzerleitfaden für die Filterhybridisierung) der Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993), markiert. Chromosomale DNA eines potenziellen Integranten durch das Verfahren von Eikmanns et al. isoliert (Microbiology 140: 1817–1828 (1994)) und in edem Fall mit den Restriktionsenzymen SalI, SacI und HindIII gespalten. Die gebildeten Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese getrennt und bei 68°C mit dem Dig-Hybridisierungs-Kit von Boehringer hybridisiert. Das in Beispiel 9 genannte Plasmid pCR2.1poxBint war in das Chromosom von DSM5715 innerhalb des chromosomalen poxB-Gens eingeführt worden. Der Stamm wurde als DSM5715:pCR2.1poxBint bezeichnet.
  • Beispiel 9
  • Wirkung einer Überexpression des tkt-Gens mit gleichzeitiger Eliminierung des poxB-Gens bei der Herstellung von Lysin
  • 9.1 Herstellung des Stamms DSM5715: pCR2.1poxBint/pMS82B
  • Der Stamm DSM5715: pCR2.1poxBint wurde mit dem Plasmid pMS82B mit Hilfe des von Liebl et al. beschriebenen Elektroporationsverfahrens transformiert (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989). Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar, der 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionskulturbrühe, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar umfasste, der durch 5 mg/l Tetracyclin und 25 mg/l Kanamycin ergänzt worden war. Die Inkubation wurde 2 Tage lang bei 33°C durchgeführt.
  • Plasmid-DNA wurde in jedem Fall von einem Transformanten durch herkömmliche Verfahren isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), mit der Restriktions-Endonuklease AccI gespalten, und das Plasmid wurde durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese untersucht. Der auf diesem Weg erhaltene Stamm wurde DSM5715:pCR2.1poxBint/pMS82B genannt.
  • 9.2 Herstellung von L-Lysin
  • Der in Beispiel 9.1 erhaltene C. -glutamicum-Stamm DSM5715:pCR2.1poxBint/pMS82B wurde in einem Kulturmedium kultiviert, das für die Produktion von Lysin geeignet ist, und es wurde der Lysingehaltin dem Kulturüberstand ermittelt.
  • Hierfür wurde der Stamm zuerst auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Tetracyclin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l)) 24 Stunden lang bei 33°C inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur geimpft (10 ml Medium in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben). Das komplette Medium CgIII wurde als Medium für die Vorkultur verwendet.
    Medium Cg III
    NaCl 2,5 g/l
    Bacto-Pepton 10 g/l
    Bacto-Hefeextrakt 10 g/l
    Glucose (separat autoklaviert) 2 % (w/v)
  • Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 gebracht.
  • Tetracyclin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) wurden zugegeben. Die Vorkultur wurde 16 Stunden lang bei 33°C mit 240 U/min auf einer Schüttelmaschine inkubiert.
  • Eine Hauptkultur wurde von dieser Vorkultur geimpft, sodass die anfängliche OD (660 nm) der Hauptkultur 0,1 betrug. Das Medium MM wurde für die Hauptkultur verwendet.
    Medium MM
    CSL (Mais-Einweichungs-Flüssigkeit) 5 g/l
    MOPS (Morpholinopropansulfonsäure) 20 g/l
    Glucose (separat autoklaviert) 58 g/l
    (NH4)2SO4 25 g/l
    KH2PO4 0,1 g/l
    MgSO4·7H2O 1,0 g/l
    CaCl2·2H2O 10 mg/l
    FeSO4·7H2O 10 mg/l
    MnSO4·H2O 5,0 mg/l
    Biotin (sterilgefiltert) 0,3 mg/l
    Thiamin·HCl (sterilgefiltert) 0,2 mg/l
    L-Leucin (sterilgefiltert) 0,1 g/l
    CaCO3 25 g/l
  • Das CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert 7 gebracht und autoklaviert.
  • Das sterile Substrat und Vitaminlösungen wurden danach zugegeben, ebenso wie das im Trockenzustand autoklavierte CaCO3.
  • Das Kultivieren wird in einem 10-ml-Volumen in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben mit Prallwänden durchgeführt.
  • Tetracyclin (5 mg/l) und Kanamycin (25 mg/l) wurden zugegeben. Das Kultivieren wurde bei 33°C und 80 % atmosphärischer Feuchtigkeit durchgeführt.
  • Nach 72 Stunden wurde die OD bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit einem Biomek 1000 (Reckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge des gebildeten Lysins wurde mit einem Aminosäure-Analysiergerät von Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) durch Ionenaustauschchromatographie und Post-Kolonnen-Derivatisierung mit Ninhydrin-Detektion bestimmt.
  • Das Ergebnis des Experiments ist in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
    Stamm OD L-Lysin HCl g/l
    DSM5715 10,8 15,9
    DSM5715::pCR2.1poxBint 7,1 16,7
    DSM5715::pCR2.1poxBint/pMS82B 7,7 17,3
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00280001
    Figure 00290001
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    Figure 00320001
    Figure 00330001
    Figure 00340001
    Figure 00350001
    Figure 00360001
    Figure 00370001
    Figure 00380001

Claims (4)

  1. Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Verwendung eines L-Lysin produzierenden coryneformen Bakteriums, wobei man die folgenden Schritte durchführt: a) Verstärkung zumindest des für die Transketolase codierenden tkt-Gens in dem coryneformen Bakterium, b) Fermentation des Bakteriums aus a) in einem Medium, c) Aufkonzentrierung von L-Lysin im Medium oder in den Zellen des coryneformen Bakteriums und d) Isolierung des produzierten L-Lysins, wobei während der Fermentation die Konzentration des L-Lysins über das mit einem coryneformen Bakterium, in dem das tkt-Gen nicht verstärkt ist, erhaltene Niveau ansteigt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem coryneformen Bakterium ein oder mehrere Gene, gewählt aus der Gruppe 2.1 das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierende dapA-Gen, 2.2 das für die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierende zwf-Gen, 2.3 das für die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codierende gnd-Gen, 2.4 das für die Enolase codierende eno-Gen, gleichzeitig verstärkt oder überexprimiert wird bzw. werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in dem coryneformen Bakterium ein oder mehrere Gene, gewählt aus der Gruppe 3.1 das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende pck-Gen, 3.2 das für die Glucose-6-phosphat-Isomerase codierende pgi-Gen, 3.3 das für die Pyruvat-Oxidase codierende poxB-Gen, gleichzeitig abgeschwächt wird bzw. werden.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, wobei zur Erzielung der Verstärkung die Kopienzahl der Gene oder Nukleotidsequenzen durch Transformation der Mikroorganismen mit Plasmidvektoren, die diese Gene bzw. Nukleotidsequenzen tragen, erhöht wird.
DE60036615T 2000-03-17 2000-07-05 Verfahren zur fermentativen herstellung von l-aminosäuren durch verstärkung des tkt-gens Expired - Lifetime DE60036615T2 (de)

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