CN1350589A

CN1350589A - 经扩增tkt基因发酵制备L－氨基酸的方法

Info

Publication number: CN1350589A
Application number: CN00807474A
Authority: CN
Inventors: L·K·杜尼肯(死亡); 阿什令·麦科麦克; 克里奥娜·斯特普尔顿; 凯文·伯克; 贝蒂娜·默克尔; 格奥尔格·蒂尔巴赫
Original assignee: Degussa GmbH; National University of Ireland
Current assignee: Evonik Operations GmbH; National University of Ireland
Priority date: 2000-03-17
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2002-05-22
Also published as: MXPA01011495A; BR0010713A; EP1179084A1; PL358913A1; ATE374831T1; EP1179084B1; DE60036615D1; CA2374012A1; WO2001068894A1; SK16192001A3; AU5982200A; KR20010112494A; DE60036615T2

Abstract

本发明涉及一种通过发酵棒状细菌制备L－氨基酸的方法,其包括进行以下步骤:a)发酵产生所需L－氨基酸的细菌,该细菌中至少tkt基因是扩增的,b)浓缩培养基或细菌细胞中的L－氨基酸,及c)分离产生的L－氨基酸。本发明还涉及携带tkt基因的载体。

Description

经扩增tkt基因发酵制备L-氨基酸的方法

本发明涉及用棒状细菌经发酵制备L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸的方法，在所述棒状细菌中至少tkt基因是扩增的。

现有技术

L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸用于动物营养，人用药及制药工业。

已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。

为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸的菌株。

一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良生产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株。

发明目的

本发明目的是提供新的用棒状细菌经发酵制备L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸的改良方法。

发明描述

L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸用于人用药物及制药工业，食品工业，特别是动物营养。因此提供生产这些氨基酸的新改良方法总是令人感兴趣的。

当下文提及L-氨基酸时，指L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸。

本发明提供了用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸的方法，在该棒状细菌中编码转酮酶(EC2.2.1.1)的核苷酸序列(tkt基因)是扩增的，尤其是过表达的。

使用的菌株优选在tkt基因扩增之前已产生L-氨基酸。

优选的实施方案见于权利要求。

文中术语“扩增”是指微生物中由相应的DNA编码的一或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶的基因，及任选地组合使用这些方法。

本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属，在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。

以下已知的野生型菌株：

谷氨酸棒杆菌ATCC13032

醋谷棒杆菌ATCC15806

嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870

嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539

黄色短杆菌ATCC14067

乳发酵短杆菌ATCC13869和

扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变株，如：生产L-苏氨酸的菌株

谷氨酸棒杆菌ATCC21649

黄色短杆菌BB69

黄色短杆菌DSM5399

乳发酵短杆菌FERM-BP269

乳发酵短杆菌TBB-10以及如生产L-异亮氨酸的菌株

谷氨酸棒杆菌ATCC14309

谷氨酸棒杆菌ATCC14310

谷氨酸棒杆菌ATCC14311

谷氨酸棒杆菌ATCC15168

产氨棒杆菌ATCC6871以及如生产L-赖氨酸的菌株

谷氨酸棒杆菌FERM-P1709

黄色短杆菌FERM-P1708

乳发酵短杆菌FERM-P1712

谷氨酸棒杆菌FERM-P6463

谷氨酸棒杆菌FERM-P6464

谷氨酸棒杆菌ATCC13032

谷氨酸棒杆菌DSM58-1

谷氨酸棒杆菌DSM12866是棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌合适菌株的实例。

已发现在编码转酮酶(EC2.2.1.1)的tkt基因过表达之后，棒状细菌以改进方式生产L-氨基酸。

tkt基因的核苷酸序列见于欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377。Ikeda等(应用分子生物学和生物技术51，201-206(1999))进一步阐述了tkt基因的扩增对L-色氨酸，L-酪氨酸和L-苯丙氨酸形成的作用。在提及的参考文献中阐述的tkt基因根据本发明可以使用。遗传密码简并或由于中性功能的有义突变导致的tkt基因的等位基因也可使用。

为获得扩增(如过表达)，例如可提高相应基因的拷贝数，或可突变位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增加表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改善表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。

本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reischeid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malurnbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学综述60：512-538(1996)及已知关于遗传及分子生物学的教材。

例如，转酮酶借助于质粒被过表达。为此使用图1所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。在将tkt基因掺入pEC-T18mob2及随后校正携带tkt基因的DNA片段的方向之后，形成图3所示的质粒pMS82B。

能在谷氨酸棒杆菌中复制的其它质粒载体如pEKExl(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同样方式使用。

另外，除编码转酮酶的tkt基因之外，特定生物合成途径，糖酵解，添补反应，或氨基酸输出的一或多种酶的过表达，对L-氨基酸的生产可以是有益的。

因此，例如选自以下一组的一或多个基因可被扩增尤其是过表达以生产L-苏氨酸：

·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2，63-72(1988))，或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的hom^dr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，

·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144：915-927(1998))，

·编码苹果酸∶醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)

·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)

·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-9-224662)

·编码苏氨酸输出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)

·zwal基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)

·编码烯醇酶的eno基因(DE：19947791.4)。

因此，例如选自以下一组的一或多个基因可被扩增优选过表达以生产L-赖氨酸：

·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，

·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遗传学224：317-324)，

·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，

·编码苹果酸-醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)，

·编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因(JP-A-09224661)，

·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-9-224662)，

·编码赖氨酸输出的lysE基因(DE-A-195 48 222)，

·zwal基因(DE 199 59 328.0，DSM13115)。

除扩增tkt基因之外，同时弱化选自以下一组的一或多个基因对L-氨基酸的生产也可以是有益的：

·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，

·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，

·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，

·zwa 2基因(DE19959327.2，DSM13113)。

除过表达转酮酶之外，消除非所需的副反应对L-氨基酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。

根据本发明产生的微生物可连续培养或非连续地通过分批法，补料分批法或重复补料分批法培养，以生产L-氨基酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。

所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿特区，USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。

可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。

L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)所述反相HPLC进行。

以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：

大肠杆菌K-12 DH5α/pEC-T18mob2，保藏号DSM13244。

本发明包括以下附图：

图1：质粒pEC-T18mob2图。

图2：质粒pMS82图。

图3：质粒pMS82B图。

图4：质粒pCR2.1poxBint图。

所述碱基对数是可重复获得的大约值。

图中所采用的缩写和符号有如下含义：图1：Tet：四环素抗性基因

oriV：大肠杆菌的质粒编码的复制源点

RP4mob：转移质粒的mob区域

rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点

per：pGA1的控制拷贝数的基因

lacZ-α：β-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)图2和3：Tet：四环素抗性基因

rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点

per：pGA1的控制拷贝数的基因

lacZ：来自pEC-T18mob2的lacZα基因片段的克隆残存片

段

tkt：转酮酶基因图4：ColE1 ori：质粒ColE1的复制源点

lacZ：lacZα基因片段的克隆残存片段

fl ori：噬菌体f1的复制源点

KmR：卡那霉素抗性

ApR：氨苄青霉素抗性

poxBint：poxB基因的内部片段另外，使用以下缩写：

AccI：限制酶AccI的酶切位点

BamHI：限制酶BamHI的酶切位点

EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点

HindIII：限制酶HindIII的酶切位点

KpnI：限制酶KpnI的酶切位点

PstI：限制酶PstI的酶切位点

PvuI：限制酶PvuI的酶切位点

SalI：限制酶SalI的酶切位点

SacI：限制酶SacI的酶切位点

SmaI：限制酶SmaI的酶切位点

SphI：限制酶SphI的酶切位点

XbaI：限制酶XabI的酶切位点

XhoI：限制酶XhoI的酶切位点

实施例

以下实施例进一步举例说明了本发明。所使用的分子生物学技术如质粒DNA分离，限制酶处理，连接，大肠杆菌的标准转化等方法，除非特别说明，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室，美国)。实施例1：谷氨酸棒杆菌菌株AS019基因文库的构建

用λZap Express^TM系统(Short等，(1988)核酸研究，16：7583-7600)构建了谷氨酸棒杆菌菌株AS019(Yoshihama等，细菌生物学杂志162，591-597(1985))的DNA文库，如O′Donohue所述(O′Donohue，M.(1997)，谷氨酸棒杆菌四种常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆与分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway)。λZap Express^TM系统试剂盒购自Stratagene(Stratagene，11011 North Torrey Pines Rd.，LaJolla，California 92037)并按说明书使用。AS019-DNA用限制性内切酶Sau3A消化后连接到用BamHI消化并去磷酸化的λZap Express^TM臂上。实施例2：tkt基因的克隆和测序1.克隆

将大肠杆菌菌株AI118，其携带有突变的tktA和tktB基因，见Iida等，1993(鉴别和定性编码大肠杆菌K-12中第二个转酮酶的tktB基因，细菌学杂志175：5375-83)，用大约500ng的上述AS019λZapExpress^TM质粒文库转化。用含有50mg/ml卡那霉素的M9基本培养基(Sambrook等，(1989)分子克隆实验手册，冷泉港实验室，美国)37℃培养48小时对转化子进行筛选。根据Bimboim & Doly(筛选重组质粒DNA的快速碱性提取法，核酸研究7：1513-1523(1979))从一个转化子中提取质粒并命名为pTSM2。2.测序

通过MWG-Biotech公司，Waterside House，Peartree Bridge，MiltonKeynes MK6 3BY，UK对克隆pTSM2进行商业测序。提供给MWG-Biotech的高纯度的DNA用QIAprep Spin微量制备试剂盒(QIAGENGmbH，Max-Volmer-Strasse 4，40724 Hilden，德国)制备，随后用LyovacGT 2冻干仪(Leybold Heraeus)冻干。用通用的正向引物和M13反向引物进行初始测序分析：

M13/pUC正向引物：5’GTAAAACGACGGCCAGT3’

M13/pUC反向引物：5’CAGGAAACAGCTATGAC3’

然后根据所得序列设计内部引物进行全长tkt基因的测序。内部引物的序列如下：

内部引物1：5’TGCAGCAACCAAGACTG3’

所得的序列在苹果麦金托什计算机上用DNA Strider程序1.0版(Marck(1998)，核酸研究16：1829-1836)进行分析。这一程序可以进行限制性位点使用、开放读框分析和密码子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，25：3389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之间进行查询。DNA和蛋白质序列比较使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1998基因73：237-244)。

所得的序列如SEQ ID NO：1所示。对所得核苷酸序列进行分析揭示一2094个碱基对的开放读框，命名为tkt基因，其编码一个697个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO：2所示。实施例3：tkt基因的表达3.1穿梭载体pEC-T18mob2的制备

根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。

此载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5，175，108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，质粒pAG1的四环素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文库，登记号AF121000)，质粒pMB1(Sutcliffe，关于定量生物学的冷泉港讨论会43，77-90(1979))的复制起点oriV，包括lac启动子及多克隆位点(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和质粒RP4(Simon等，(1983)生物/技术1：784-791)的mob区域。

将此构建的载体转化入大肠杆菌菌株DH5α中(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿，美国)。通过将转化混合物铺板于补加5mg/l四环素的LB平板(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindHI限制，及随后经琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。

此质粒称为pEC-T18mob2并示于图1。其以大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德国)，保藏号DSM13244。3.2大肠杆菌/谷氨酸穿梭载体pEC-T18mob2中tkt基因的克隆

使用PCR扩增含有谷氨酸棒杆菌的全长tkt基因和两侧上游和下游区域的DNA片段。用设计自SEQ ID NO：1的寡核苷酸引物进行PCR反应。根据Heery和Dunican所述(应用和环境微生物学59：791-799(1993))，从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中分离基因组DNA，并将大约150-220ng用作模板。所用引物是：

tkt正向引物：5’CTG ATC ATC GGA TCT AAC GAA3’

tkt反向引物：5’ATT GCC CCG GGT TGA AGC TAA3’PCR参数如下：

35次循环 95℃ 6分钟

94℃ 1分钟

55℃ 1分钟

72℃ 45秒

1mM MgCl₂

将所得PCR产物克隆入购自Promega公司的pGEM-T载体(pGEM-T Easy Vector System 1，目录号A1360，Promega UK，Southampton)中，用大肠杆菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，基因33：103-119(1985))作宿主。全长tkt基因随后分离自pGEM-T载体的SphI/SalI片段，并克隆入大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2的lacZ SphI/SalI区域中(图1)，并称之为pMS82(图2)。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德国)进行的限制酶分析显示pEC-T18mob2的lacZα基因中tkt基因的错误方向。通过用EcoRI酶(Boehringer Mannheim GmbH，德国)限制酶切并再连接而校正方向。用AccI(Boehringer Mannheim GmbH，德国)进行的限制酶分析显示pEC-T18mob2的lacZα基因(即lac启动子的下游)中tkt基因的正确方向，并将此质粒称为pMS82B(图3)。实施例4：tkt基因过表达在各种赖氨酸生产菌株中的作用

生产L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715见于EP-B-0435132所述，DSM12866见于DE-A-19931314.8所述。这两个菌株根据布达佩斯条约均保藏在德意志微生物保藏中心(Braunschweig，德国)。4.1制备DSM5715/pMS82B和DSM12866/pMS82B菌株

将菌株DSM5715和DSM12866用质粒pMS82B，通过Libel等所述电穿孔方法(FEMS微生物学通信，53：299-303(1989))转化。在包含18.5/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/lBacto-酵母膏，5g/l NaCl，和18g/l Bacto-琼脂，并已补加5mg/l四环素的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃温育2天。

在每种情况下，质粒DNA是通过常规方法(Peter-Wendisch等，1998，微生物学，144，915-927)分离自转化体，用限制性内切酶AccI酶切，并通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测质粒。以此方式获得的菌株称为DSM5715/pMS82B和DSM12866/pMS82B。4.2制备L-赖氨酸

将实施例4.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pMS82B和DSM12866/pMS82B，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。

首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。

培养基CgIII

NaCl 2.5g/l

Bacto-肽胨 10g/l

Bacto-酵母膏 10g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH调节为7.4。

加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。

培养基MM：

CSL(玉米浆) 5g/l

MOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 50g/l

(NH₄)₂SO₄ 25g/l

KH₂PO₄ 0.1g/l

MgSO₄·7H₂O 1.0g/l

CaCl₂·2H₂O 10mg/l

FeSO₄·7H₂O 10mg/l

MnSO₄·H₂O 5.0mg/l

生物素(过滤灭菌) 0.3mg/l

硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/l

L-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/l

CaCO₃ 25g/l

用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO₃。

以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。

72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。

实验结果示于表1。

表1

菌株	OD(660)	赖氨酸HCl(g/l)
菌株	OD(660)	赖氨酸HCl(g/l)	DSM5715	7.2	14.1
DSM5715/pMS82B	7.2	14.8	DSM5715	7.2	14.1
DSM5715/pMS82B	7.2	14.8	DSM12866	10.9	15.3
DSM12866/pMS82B	11.2	16.8	DSM12866	10.9	15.3

实施例5：制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒文库

如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报84：2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI编码27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032 DNA混合，并用T4 DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细菌置于10mM MgSO₄中并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox.1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。实施例6：poxB基因的分离与测序

用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离单个菌落的粘粒DNA(实施例5)，并用限制性内切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AJ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharrnacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044，Weiterstadt，德国)，在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29：1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。

所得原始序列数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行进一步分析。

获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，对该核苷酸序列的分析显示一1737碱基对的开放读框，其被称为poxB基因，poxB基因编码579个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：4)。实施例7：制备整合载体以整合诱变poxB基因

从菌株ATCC13032中，通过Eikmanns等所述方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离染色体DNA。基于从实施例8中已知的谷氨酸棒杆菌的poxB基因序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应：

poxBint1：5’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG3’

poxBint2：5’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC3’

所示引物是通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成的，通过Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法指导和应用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，分离大约0.9kb的DNA片段，其携带poxB基因的内部片段，并如SEQ ID NO：5所示。

将扩增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，美国；Catalogue Number K4500-01)，连接在载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技术9：657-663)中。然后将连接混合物电穿孔入大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿DC，美国，1985)。将转化混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞，所用LB琼脂已补加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。此质粒称为pCR2.1poxBint(图4)。

质粒pCR2.1poxBint以大肠杆菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ；Braunschweig，德国)，保藏号DSM13114。实施例8：在赖氨酸生产菌DSM5715中整合诱变poxB基因

将实施例7中所述的载体pCR2.1poxBint，通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123：343-347(1994))，电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715是一种AEC抗性赖氨酸生产菌。载体pCR2.1poxBint在DSM5715中不能独立复制，并只有已整合入DSM5715的染色体中时才能在细胞中保留。通过将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择具有整合入染色体的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB琼脂已补加15mg/l卡那霉素。为检测整合情况，将poxBint片段用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒，通过Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，德国，1993)的“进行滤膜杂交的DIG系统使用指导”进行标记。潜在整合子的染色体DNA是通过Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离的，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并在68℃用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒杂交。实施例9中所述的质粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715的染色体中的染色体poxB基因内。此菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint。实施例9：过表达tkt基因同时消除poxB基因对赖氨酸制备的作用9.1制备菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B

通过Libel等所述电穿孔方法(FEMS微生物学通信，53：299-303(1989))，将菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用质粒pMS82B转化。在含有18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl，和18g/l Bacto-琼脂，并补加5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃温育2天。

通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915-927)从转化体中分离质粒DNA，用限制性内切酶AccI酶切，并通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测此质粒。以此方式获得的菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B。9.2制备L-赖氨酸

将实施例9.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。

首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。

培养基CgIII

NaCl 2.5g/l

Bacto-肽胨 10g/l

Bacto-酵母膏 10g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 2％(w/v)pH调节为7.4。

加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。

培养基MM：

CSL(玉米浆) 5g/l

MOPS(吗啉代丙磺酸) 20g/l

葡萄糖(单独高压灭菌) 58g/l

(NH₄)₂SO₄ 25g/l

KH₂PO₄ 0.1g/l

MgSO₄·7H₂O 1.0g/l

CaCl₂·2H₂O 10mg/l

FeSO4·7H₂O 10mg/l

MnSO₄·H₂O 5.0mg/l

生物素(过滤灭菌) 0.3m/l

硫胺素·HCl(过滤灭菌) 0.2mg/l

L-亮氨酸(过滤灭菌) 0.1g/l

CaCO₃ 25g/l

以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。

实验结果示于表2。

表2

菌株	OD	赖氨酸HCl(g/l)
菌株	OD	赖氨酸HCl(g/l)	DSM5715	10.8	15.9
DSM5715∷pCR2.1poxBint	7.1	16.7	DSM5715	10.8	15.9
DSM5715∷pCR2.1poxBint	7.1	16.7	DSM5715∷pCR2.1poxBint/pMS82B	7.7	17.3

序列表<110>国立爱尔兰大学戈尔韦分校

德古萨-于尔斯股份公司<120>用棒状细菌发酵制备L-氨基酸的方法<130>000019 BT<140><141><160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2350<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(205)..(2295)<223>tkt<400>1cgggtcagat taagcaaaga ctactttcgg ggtagatcac ctttgccaaa tttgaaccaa 60ttaacctaag tcgtagatct gatcatcgga tctaacgaaa acgaaccaaa actttggtcc 120cggtttaacc caggaaggat tgaccaccta acgaaaacga accaaaactt tggtcccggt 180ttaacccagg aaggattgac cacc ttg acg ctg tca cct gaa ctt cag gcg 231

Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala

1 5ctc act gta cgc aat tac ccc tct gat tgg tcc gat gtg gac acc aag 279Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys10 15 20 25gct gta gac act gtt cgt gtc ctc gct gca gac gct gta gaa aac tgt 327Ala Val Asp Thr Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys

30 35 40ggc tcc ggc cac cca ggc acc gca atg agc ctg gct ccc ctt gca tac 375Gly Ser Gly His Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr

45 50 55acc ttg tac cag cgg gtt atg aac gta gat cca cag gac acc aac tgg 423Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp

60 65 70gca ggc cgt gac cgc ttc gtt ctt tct tgt ggc cac tcc tct ttg acc 471Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr

75 80 85cag tac atc cag ctt tac ttg ggt gga ttc ggc ctt gag atg gat gac 519Gln Tyr Ile Gln Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp90 95 100 105ctg aag gct ctg cgc acc tgg gat tcc ttg acc cca gga cac cct gag 567Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu

110 115 120tac cgc cac acc aag ggc gtt gag atc acc act ggc cct ctt ggc cag 615Tyr Arg His Thr Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln

125 130 135ggt ctt gca tct gca gtt ggt atg gcc atg gct gct cgt cgt gaq cgt 663Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg

140 145 150ggc cta ttc gac cca acc gct gct gag ggc gaa tcc cca ttc gac cac 711Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His

155 160 165cac atc tac gtc att gct tct gat ggt gac ctg cag gaa ggt gtc acc 759His Ile Tyr Val Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr170 175 180 185tct gag gca tcc tcc atc gct ggc acc cag cag ctg ggc aac ctc atc 807Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile

190 195 200gtg ttc tgg gat gac aac cgc atc tcc atc gaa gac aac act gag atc 855Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile

205 210 215gct ttc aac gag gac gtt gtt gct cgt tac aag gct tac ggc tgg cag 903Ala Phe Asn Glu Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln

220 225 230acc att gag gtt gag gct ggc gag gac gtt gca gca atc gaa gct gca 951Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala

235 240 245gtg gct gag gct aag aag gac acc aag cga oct acc ttc atc cgc gtt 999Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val250 255 260 265cgc acc atc atc ggc ttc cca gct cca act atg atg aac acc ggt gct 1047Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala

270 275 280gtg cac ggt gct gct ctt ggc gca cgt gaa gtt gca gca acc aag act 1095Val His Gly Ala Ala Leu Gly Ala Arg Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr

285 290 295gag ctt gga ttc gat cct gag gct cac ttc gcg atc gac gat gag gtt 1143Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val

300 305 310atc gct cac acc cgc tcc ctc gca gag cgc gct gca cag aag aag gct 1191Ile Ala His Thr Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala

315 320 325gca tgg cag gtc aag ttc gat gag tgg gca gct gcc aac cct gag aac 1239Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn330 335 340 345aag gct ctg ttc gat cgc ctg aac tcc cgt gag ctt cca gcg ggc tac 1287Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr

350 355 360gct gac gag ctc cca aca tgg gat gca gat gag aag ggc gtc gca act 1335Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr

365 370 375cgt aag gct tcc gag gct gca ctt cag gca ctg ggc aag acc ctt cct 1383Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro

380 385 390gag ctg tgg ggc ggt tcc gct gac ctc gca ggt tcc aac aac acc gtg 1431Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val

395 400 405atc aag ggc tcc cct tcc ttc ggc cct gag tcc atc tcc acc gag acc 1479Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr410 415 420 425tgg tct gct gag cct tac ggc cgt aac ctg cac ttc ggt atc cgt gag 1527Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu

430 435 440cac gct atg gga tcc atc ctc aac ggc att tcc ctc cac ggt ggc acc 1575His Ala Met Gly Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr

445 450 455cgc cca tac ggc gga acc ttc ctc atc ttc tcc gac tac atg cgt cct 1623Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro

460 465 470gca gtt cgt ctt gca gct ctc atg gag acc gac gct tac tac gtc tgg 1671Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp

475 480 485acc cac gac tcc atc ggt ctg ggc gaa gat ggc cca acc cac cag cct 1719Thr His Asp Ser Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro490 495 500 505gtt gaa acc ttg gct gca ctg cgc gcc atc cca ggt ctg tcc gtc ctg 1767Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu

510 515 520cgt cct gca gat gcg aac gag acc gcc cag gct tgg gct gca gca ctt 1815Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu

525 530 535gag tac aag gaa ggc cct aag ggt ctt gca ctg acc cgc cag aac gtt 1863Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val

540 545 550cct gtt ctg gaa ggc acc aag gag aag gct gct gaa ggc gtt cgc cgc 1911Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg

555 560 565ggt ggc tac gtc ctg gtt gag ggt tcc aag gaa acc cca gat gtg atc 1959Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile570 575 580 585ctc atg ggc tcc ggc tcc gag gtt cag ctt gca gtt aac gct gcg aag 2007Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys

590 595 600gct ctg gaa gct gag ggc gtt gca gct cgc gtt gtt tcc gtt cct tgc 2055Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys

605 610 615atg gat tgg ttc cag gag cag gac gca gag tac atc gag tcc gtt ctg 2103Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu

620 625 630cct gca gct gtg acc gct cgt gtg tct gtt gaa gct ggc atc gca atg 2151Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met

635 640 645cct tgg tac cgc ttc ttg ggc acc cag ggc cgt gct gtc tcc ctt gag 2199Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu650 655 660 665cac ttc ggt gct tct gcg gat tac cag acc ctg ttt gag aag ttc ggc 2247His Phe Gly Ala Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly

670 675 680atc acc acc gat gca gtc gtg gca gcg gcc aag gac tcc att aac ggt 2295Ile Thr Thr Asp Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly

685 690 695taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat gattctccgg aattt 2350<210>2<211>697<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gln Ala Leu Thr Val Arg Asn Tyr Pro1 5 10 15Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp Thr Lys Ala Val Asp Thr Val Arg Val

20 25 30Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu Asn Cys Gly Ser Gly His Pro Gly Thr

35 40 45Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln Arg Val Met

50 55 60Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp Arg Phe Val65 70 75 80Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln Leu Tyr Leu

85 90 95Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu Arg Thr Trp

100 105 110Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr Lys Gly Val

115 120 125Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly

130 135 140Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp Pro Thr Ala145 150 155 160Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val Ile Ala Ser

165 170 175Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser Ser Ile Ala

180 185 190Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp Asp Asn Arg

195 200 205Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu Asp Val Val

210 215 220Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val Glu Ala Gly225 230 235 240Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala Lys Lys Asp

245 250 255Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile Gly Phe Pro

260 265 270Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala Ala Leu Gly

275 280 285Ala Arg Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe Asp Pro Glu

290 295 300Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ila Ala His Thr Arg Ser Leu305 310 315 320Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val Lys Phe Asp

325 330 335Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe Asp Arg Leu

340 345 350Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Pro Thr Trp

355 360 365Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser Glu Ala Ala

370 375 380Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly Gly Ser Ala385 390 395 400Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser Pro Ser Phe

405 410 415Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu Pro Tyr Gly

420 425 430Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly Ser Ile Leu

435 440 445Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly Gly Thr Phe

450 455 460Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu Ala Ala Leu465 470 475 480Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser Ile Gly Leu

485 490 495Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu Ala Ala Leu

500 505 510Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp Ala Asn Glu

515 520 525Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu Gly Pro Lys

530 535 540Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu Gly Thr Lys545 550 555 560Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val Leu Val Glu

565 570 575Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser Gly Ser Glu

580 585 590Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Gly Val

595 600 605Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe Gln Glu Gln

610 615 620Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val Thr Ala Arg625 630 635 640Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met Pro Trp Tyr Arg Phe Leu Gly

645 650 655Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala Ser Ala Asp

660 665 670Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Thr Asp Ala Val Val

675 680 685Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly

690 695<210>3<211>2160<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(327)..(2063)<400>3ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta 353

Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu

1 5att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val10 15 20 25ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att 449Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile

30 35 40gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly

45 50 55gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt 545Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys

60 65 70ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga 593Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg

75 80 85aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag 641Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln90 95 100 105att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys

110 115 120gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu

125 130 135cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785Arg Ile Leu His His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val

140 145 150tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac 833Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp

155 160 165ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc 881Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe170 175 180 185ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala

190 195 200aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala

205 210 215cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg 1025Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala

220 225 230ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc 1073Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly

235 240 245atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag 1121Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu250 255 260 265gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc 1169Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe

270 275 280ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att 1217Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile

285 290 295ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca 1265Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala

300 305 310aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc 1313Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser

315 320 325ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg 1361Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val330 335 340 345gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct 1409Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro

350 355 360gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val

365 370 375ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc 1505Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile

380 385 390gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc 1553Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly

395 400 405acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat 1601Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp410 415 420 425cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg 1649Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met

430 435 440ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag 1697Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys

445 450 455gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met

460 465 470ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn

475 480 485ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc 1841Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr490 495 500 505gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct 1889Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro

510 515 520gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc 1937Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile

525 530 535cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc 1985Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala

540 545 550acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc 2033Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala

555 560 565cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct 2083Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro570 575gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt 2143gcccatgaga ttgccct 2160<210>4<211>579<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>4Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln1 5 10 15Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile

20 25 30Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn

35 40 45Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly

50 55 60Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu65 70 75 80Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala

85 90 95Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln

100 105 110Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu

115 120 125Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile

130 135 140Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly145 150 155 160Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr

165 170 175Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala

180 185 190Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys

195 200 205Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu

210 215 220Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile225 230 235 240Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr

245 250 255Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu

260 265 270Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala

275 280 285Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys

290 295 300Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro305 310 315 320His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys

325 330 335Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn

340 345 350Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu

355 360 365Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met

370 375 380Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg385 390 395 400Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro

405 410 415His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala

420 425 430Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr

435 440 445Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser

450 455 460Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu465 470 475 480Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala

485 490 495Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu

500 505 510Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile

515 520 525Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu

530 535 540Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly545 550 555 560Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile

565 570 575Pro Thr Pro<210>5<211>875<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<400>5tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac 480gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875

Claims

1.一种通过发酵棒状细菌制备L-氨基酸的方法，包括进行以下步骤：

a)发酵产生所需L-氨基酸的细菌，该细菌中至少tkt基因是扩增的，

b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及

c)分离产生的L-氨基酸。

2.权利要求1的方法，其中使用的细菌中，所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因也被扩增，尤其是过表达。

3.权利要求1的方法，其中使用制备L-苏氨酸，L-赖氨酸或L-异亮氨酸的棒状细菌。

4.权利要求3的方法，其中使用制备L-赖氨酸的的棒状细菌。

5.如权利要求2发酵制备L-赖氨酸的方法，其中在尤其已经产生L-赖氨酸的棒状微生物中，选自以下一组的一或多个基因被同时扩增或过表达：

5.1编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，

5.2编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，

5.3编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，

5.4编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

5.5编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，

5.6编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，

5.7编码赖氨酸输出的lysE基因，

5.8编码苹果酸-醌氧化还原酶的mqo基因，

5.9 zwal基因，

5.10编码烯醇化酶的eno基因。

6.如权利要求2发酵制备L-苏氨酸的方法，其中在尤其已经产生L-苏氨酸的棒状微生物中，选自以下一组的一或多个基因被同时扩增或过表达：

6.1编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的hom^dr等位基因，

6.2编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，

6.3编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，

6.4编码苹果酸∶醌氧化还原酶的mqo基因，

6.5编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，

6.6编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，

6.7编码苏氨酸输出的thrE基因，

6.8 zwal基因，

6.9编码烯醇化酶的eno基因。

7.权利要求2的方法，其中为制备L-氨基酸尤其L-赖氨酸或L-苏氨酸，发酵这样的细菌，该细菌中选自以下一组的一或多个基因被同时弱化：

7.1编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，

7.2编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，

7.3编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，

7.4zwa2基因。

8.权利要求2-6任一项的方法，其中为实现扩增，所述基因或核苷酸序列的拷贝数，通过用携带这些基因或核苷酸序列的质粒载体转化微生物而提高。

9.图1所示的质粒载体pEC-T18mob2，其以在K-12 DH5α中的形式保藏，保藏号DSM13244。

10.权利要求9的质粒载体pEC-T18mob2，其另外还携带tkt基因。

11.一种通过导入权利要求10的质粒载体转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属，其另外还含有tkt基因。