CN1289676C - 经扩增zwf基因发酵制备L－氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及-种通过发酵棒状细菌制备L-氨基酸的方法，其包括进行以下步骤：a)发酵产生所需L-氨基酸的细菌，该细菌中至少zwf基因是扩增的，b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及c)分离产生的L-氨基酸。

Description

经扩增zwf基因发酵制备L-氨基酸的方法
本发明涉及用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸，特别是L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-色氨酸的方法，其中棒状细菌中至少zwf基因是扩增的。
现有技术
L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸用于用于动物营养，人用药物及制药工业。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于L-氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如苏氨酸类似物α-氨基-β-羟戊酸(AHV)有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸如苏氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于改良生产L-氨基酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
发明目的
本发明目的是提供新的用棒状细菌经发酵制备L-氨基酸的改良方法。
发明描述
L-氨基酸用于人用药物及制药工业，食品工业，特别是动物营养。因此提供生产这些氨基酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
本发明提供了用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，L-苏氨酸，和L-色氨酸的方法，在该棒状细菌中编码Zwf蛋白的核苷酸序列(zwf基因)是扩增的，尤其是过表达的。
使用的菌株优选在zwf基因扩增之前已生产L-氨基酸。
优选的实施方案见于权利要求。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应的DNA编码的-或多种酶(蛋白质)的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或使用强启动子或编码高活性相应酶(蛋白质)的基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉，纤维素或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。所述微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属，在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
以下已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒杆菌ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020
和从中获得的生产L-氨基酸的突变株，
如生产L-苏氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC21649
黄色短杆菌BB69
黄色短杆菌DSM5399
乳发酵短杆菌FERM-BP 269
乳发酵短杆菌TBB-10
以及如生产L-异亮氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC 14309
谷氨酸棒杆菌ATCC 14310
谷氨酸棒杆菌ATCC 14311
谷氨酸棒杆菌ATCC 15168
产氨棒杆菌ATCC6871
以及如生产L-色氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌ATCC21850
谷氨酸棒杆菌KY9218(pKW9901)
以及如生产L-赖氨酸的菌株
谷氨酸棒杆菌FERM-P1709
黄色短杆菌FERM-P1708
乳发酵短杆菌FERM-P1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
谷氨酸棒杆菌DSM58-1
谷氨酸棒杆菌DSM12866
是棒杆菌属，尤其谷氨酸棒杆菌合适菌株的实例。
已发现在编码Zwf蛋白的zwf基因过表达之后，棒状细菌以改良方式生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸，L-苏氨酸，和L-色氨酸。
得自遗传密码简并或由于中性功能的有义突变所导致的zwf基因的等位基因也可使用。
JP-A-09224661揭示了黄色短杆菌MJ-223(FERM BP-1497)的葡糖-6-磷酸脱氢酶基因的核苷酸序列，称为zwf基因。JP-A-09224661阐述了Zwf多肽的N末端氨基酸序列为Met Val Ile Phe GlyVal Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu。
然而，还不能证实这些序列，相反却发现以下N末端氨基酸序列：Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp。N位的缬氨酰基在翻译后修饰中可脱落，而后获得Ser Thr Asn Thr Thr ProSer Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp作为N末端的氨基酸序列。
为获得扩增(如过表达)，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增加表达也是可能的。延长mRNA寿命的措施也可改善表达。另外，通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))，Reischeid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191-195(1998))，及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，Zwf蛋白已借助于质粒被过表达。为此使用图1所示的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。在将zwf基因掺入pEC-T18mob2的KpnI/SalI切割位点之后，形成图2所示的质粒pEC-T18mob2zwf。
能在谷氨酸棒杆菌中复制的其它质粒载体如pEKEx1(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))，或pZ8-1(EP-B-0375889)也可以同样方式使用。
另外，除扩增zwf基因之外，特定生物合成途径，糖酵解，添补反应，戊糖磷酸途径或氨基酸输出的-或多种酶的扩增，对L-氨基酸的生产可以是有益的。
因此，例如选自以下-组的-或多个基因可被同时扩增、尤其是过表达是以生产L-苏氨酸：
·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2，63-72(1988))，或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因(Archer等，基因107，53-59(1991))，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Peters-Wendisch等，微生物学144：915-927(1998))，
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395-403)，
·编码转酮酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377)，
·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-09224661)，
·编码苏氨酸输出的thrE基因(DE 199 41 478.5；DSM12840)，
·zwal基因(DE 199 59 328.0；DSM13115)，
·编码烯醇酶的eno基因(DE：19941478.5)。
因此，例如选自以下-组的-或多个基因可被同时扩增、尤其是过表达以生产L-赖氨酸：
·编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，
·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遗传学224：317-324)，
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076-6086)，
·编码转酮酶的tkt基因(欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国)的数据库，登记号AB023377)，
·编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(JP-A-09224661)，
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-195 48 222)，
·zwal基因(DE 19959328.0，DSM13115)，
·编码烯醇酶的eno基因(DE：19947791.4)。
除扩增zwf基因之外，同时弱化以下基因对L-氨基酸的生产也可以是有益的：
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE 199 50 409.1，DSM13047)，
·编码葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US 09/396478，DSM12969)，
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE19951975.7，DSM13114)，
·zwa2基因(DE19959327.2，DSM13113)。
除过表达Zwf蛋白之外，消除非所需的副反应对L-氨基酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或非连续地通过分批法，补料分批法或重复补料发批法培养，以生产L-氨基酸。已知培养法见于由Chmiel(生物方法技术学1，生物工程入门，Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991)所著教材，或由Storhas(生物反应器及外周设备，Vieweg Verlag，Brunswick/Wieshaden，1994)所著教材中所述。
所用培养基必须以适当方式符合特定菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C..USA，1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性，氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至L-氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经过如Spackman等(分析化学30(1958)1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或通过如Lindroth等(分析化学(1979)51：1167-1174)所述反相HPLC进行。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
大肠杆菌K-12DH5α/pEC-T18mob2，保藏号DSM13244。
本发明包括以下附图：
图1：质粒pEC-T18mob2图。
图2：质粒pEC-T18mob2zwf图。
图3：质粒pAMC1图。
图4：质粒pMC1图。
图5：质粒pCR2.1poxBint图。
所述碱基对数目是根据再现性所得的大约值。
图中所采用的缩写和符号有如下含义：
图1和图2所用缩写有如下含义：
Tet：四环素抗性基因
oriV：大肠杆菌的质粒编码的复制源点
RP4mob：转移质粒的mob区域
rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制源点
per：pGA1的控制拷贝数的基因
lacZ-alpha：β-半乳糖苷酶基因的lacZα基因片段(N末端)
lacZ-alpha′：lacZα基因片段的5’末端
′lacZ-alpha：lacZα基因片段的3’末端
图3和图4所用缩写有如下含义：
Neo r：新霉素/卡那霉素抗性
ColE1 ori：质粒ColE1的复制源点
CMV：巨细胞病毒的启动子
lacP：乳糖启动子
pgi：磷酸葡糖异构酶基因
lacZ：β-半乳糖苷酶基因的-部分
SV403’剪接：猴病毒40的3’剪接位点
SV40polyA：猴病毒40的聚腺苷酸化位点
f1(-)ori：丝状噬菌体f1的复制源点
SV40ori：猴病毒40的复制源点
Kan r：卡那霉素抗性基因
pgi插入：pgi基因的内部片段
ori：质粒pBGS8的复制源点
图5所用缩写有如下含义：
ColE1 ori：质粒ColE1的复制源点
lacZ：lacZα基因片段的克隆残存片段
f1 ori：噬菌体f1的复制源点
KmR：卡那霉素抗性
ApR：氨苄青霉素抗性
poxBint：poxB基因的内部片段
本领域已知各种限制酶缩写(如BamHI，EcoRI等)的含义，并例如Kessler和Holtke(基因47，1-153(1986))或Poberts等(核酸研究27，312-313(1999))所综述。
实施例
以下实施例进一步举例说明了本发明。所使用的分子生物学技术如质粒DNA分离，限制酶处理，连接，大肠杆菌的标准转化等方法，除非特别说明，均如Sambrook等所述进行(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室，美国)。
实施例1：Zwf蛋白的表达
1.1制备质粒pEC-T18mob2
根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-T18mob2。此载体含有质粒pGA1的包括复制效应子per的复制区rep(US-A-5，175，108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，质粒pAG1的四环素抗性基因tetA(Z)(USA-5158891；国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的基因文库，登记号AF121000)，质粒pMB1(Sutcliffe，关于定量生物学的冷泉港讨论会43，77-90(1979))的复制起点oriV，包括lac启动子及多克隆位点(mcs)(Norrander，J.M.等，基因26，101-106(1983))的lacZα基因片段，和质粒RP4(Simon等，(1983)生物/技术1：784-791)的mob区域。将此构建的载体转化入大肠杆菌菌株DH5α中(Brown编辑，分子生物学实验指导，生物科学出版社，英国牛津，1991)。通过将转化混合物铺板于补加5mg/l四环素的LB平板(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.)上，选择携带质粒的细胞。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并用限制酶EcoRI和HindIII限制，及随后经琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。
此质粒称为pEC-T18mob2并示于图1。其以大肠杆菌K-12菌株DH5α/pEC-T18mob2形式保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Braunschweig，德国)，保藏号DSM 13244。
1.2制备质粒pEC-T18mob2zwf
谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因，首先利用以下寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增：
zwf正向引物：5’-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3’
zwf反向引物：5’-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3’
PCR反应在存在200μM脱氧核苷三磷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)的情况下进行30次循环，用1μM相应的寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，1/10体积的10倍反应缓冲液和2.6单位的热稳定的Taq-/Pwo-DNA聚合酶混合物(RocheDiagnostics的膨胀高保真PCR系统，德国曼海姆)，在热循环仪(PTC-100，MJ研究公司，美国Watertown)中，在以下条件下进行反应：94℃30秒，64℃1分钟，68℃3分钟。
接着将大约1.8kb的扩增的片段，借助于SureClone连接试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)，根据说明书连接于载体pUC18的SmaI切割位点中。用全部连接混合物转化大肠杆菌DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)87：4645-4649)。在含有50μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂平板上，借助于其羧苄青霉素抗性鉴别转化体。从7个转化体中制备质粒，并通过限制分析检测作为插入体的1.8kb的PCR片段的存在情况。以此方式形成的重组质粒在下文称为pUC18zwf。
为构建pEC-T18mob2zwf，将pUC18zwf用KpnI和SalI消化，并借助于Macherey-Nagel(Duren，德国)的NucleoSpin提取试剂盒，根据说明书分离产物，然后与已用KpnI和SalI酶切并去磷酸化的载体pEC-T18mob连接。用全部连接混合物转化大肠杆菌DH5αmcr(Grant等，美国科学院院报(1990)87：4645-4649)。在含有5μg/ml四环素的LB琼脂平板上，借助于其四环素抗性鉴别转化体。从12个转化体中制备质粒，并通过限制分析检测作为插入体的1.8kb的PCR片段的存在情况。以此方式分离的重组质粒之一称为pEC-T18mob2zwf(图2)。
实施例2：制备具有扩增的zwf基因的氨基酸生产菌株
生产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌DSM5715见于EP-B-0435132所述，生产L-苏氨酸的菌株黄色短杆菌DSM5399见于EP-B-0385940所述。这两个菌株根据布达佩斯条约均保藏在德国微生物和细胞培养中心(Braunschweig，德国)。
2.1制备菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf
通过Liebl等所述的电穿孔方法(FEMS微生物通信，53：299-303(1989))用质粒pEC-T18mob2zwf转化菌株DSM5715和DSM5399。在含有18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-tryptone，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl和18g/l Bacto-琼脂，并已补加5mg/l四环素的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃温育2天。
用常规方法(Peters-Wendish等，1998，微生物学144，915-927)从转化子中分离质粒DNA，用限制性内切酶XbaI和KpnI酶切，并随后经琼脂糖凝胶电泳检查质粒。以此方式获得的菌株称为DSM5715/pEC-T18mob2zwf和DSM5399/pEC-T18mob2zwf。
2.2制备L-苏氨酸
将实施例2.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5399/pEC-T18mob2zwf，在适于生产苏氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中苏氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                     2.5g/l
Bacto-肽胨                10g/l
Bacto-酵母膏              10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)      2％(w/v)
pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                        5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)                 20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)               50g/l
(NH4)2SO4                      25g/l
KH2PO4                          0.1g/l
MgSO4·7H2O                    1.0g/l
CaCl2·2H2O                    10mg/l
FeSO4·7H2O                    10mg/l
MnSO4·H2O                     5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                  0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)             0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)                0.1g/l
CaCO3                            25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定苏氨酸生成量。
实验结果示于表1。
表1
  菌株   OD   L-苏氨酸(g/l)
  DSM5399   12.3   0.74
  DSM5399/pEC-T18mob2zwf   10.2   1.0
2.3制备L-赖氨酸
将实施例2.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pEC-T18mob2zwf，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                            2.5g/l
Bacto-肽胨                       10g/l
Bacto-酵母膏                     10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)             2％(w/v)
pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                           5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)                    20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)                  58g/l
(NH4)2SO4                         25g/l
KH2PO4                             0.1g/l
MgSO4·7H2O                       1.0g/l
CaCl2·2H2O                       10mg/l
FeSO4·7H2O                       10mg/l
MnSO4·H2O                        5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                      0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)                 0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)                    0.1g/l
CaCO3                                25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表2。
  菌株  OD(660)   赖氨酸HCl(g/l)
  DSM5715   10.8   16.0
  DSM5715/pEC-T18mob2zwf   7.1   13.7
实施例3：谷氨酸棒杆菌菌株AS019基因文库的构建
用λZap ExpressTM系统(Short等，(1988)核酸研究，16：7583-7600)构建了谷氨酸棒杆菌菌株AS019(Yoshihama等，细菌生物学杂志162，591-597(1985))的DNA文库，如O′Donohue所述(O′Donohue，M.(1997)，谷氨酸棒杆菌四种常见芳香族氨基酸生物合成基因的克隆与分子分析，博士论文，国立爱尔兰大学，Galway)。λZap ExpressTM系统试剂盒购自Stratagene(Stratagene，11011North Torrey Pines Rd.，LaJolla，California 92037)并按说明书使用。AS019-DNA用限制性内切酶Sau3A消化后连接到用BamHI消化并去磷酸化的λZap ExpressTM臂上。
实施例4：pgi基因的克隆和测序
1.克隆
将携带如Kupor和Fraenkel所述的pgi和pgl基因中的突变的大肠杆菌菌株DF1311(细菌学杂志100：1296-1301(1969))，用实施例3所述的大约500ng的AS019λZap ExpressTM质粒文库转化。在含有50mg/l卡那霉素的M9基本培养基(Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，美国)上，在37℃温育48小时选择转化体。根据Bimboim和Doly所述(核酸研究7：1513-1523(1979))从一个转化体中分离质粒DNA，并称为pAMC1(图3)。
2.测序
通过Sanger等的方法(美国科学院院报74，5463-5467(1977))，用经有色荧光标记而差示标记的引物，对pAMC1中克隆的插入体进行序列分析，使用的是Perkin Elmer应用生物系统的ABI prism 310遗传分析仪(Perkin Elmer公司，Norwalk，Connecticut，美国)，和也是Perkin Elmer的ABI prism Big DyeTM终止循环测序反应试剂盒。
用得自Pharmacia Biotech(St.Albans，Herts，AL13AW，英国)的通用正向和M13反向引物，进行初始序列分析：
通用正向引物：GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C
M13反向引物：GGA AAC AGC TAT GAC CAT G
接着从所得序列中设计内部引物，以推导完整pgi基因。内部引物的序列如下：
内部引物1：GGA AAC AGG GGA GCC GTC
内部引物2：TGC TGA GAT ACC AGC GGT
所得的序列在苹果麦金托什计算机上用DNA Strider程序1.0版(Marck，(1998).核酸研究16：1829-1836)进行分析。这一程序可以进行限制性位点使用、开放读框分析和密码子使用分析。使用BLAST程序(Altschul等，(1997)核酸研究，25：3389-3402)在所得DNA序列和EMBL和Genbank中的序列之间进行查询。DNA和蛋白质序列比较使用Clustal V和Clustal W程序(Higgins and Sharp，1988基因73：237-244)。
所得的序列如SEQ ID NO：1所示。对所得核苷酸序列分析揭示-1650个碱基对的开放读框，命名为pgi基因，其编码一个550个氨基酸的蛋白质，如SEQ ID NO：2所示。
实施例5：制备整合载体以整合诱变pgi基因
用分离自谷氨酸棒杆菌AS019(Heery和Dunican，(1993)，应用和环境微生物学59：791-799)的基因组DNA作模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增pgi基因的内部区段。使用的pgi引物是：
正向引物：ATG GAR WCC AAY GGH AA
反向引物：YTC CAC GCC CCA YTG RTC
其中R＝A+G；Y＝C+T；W＝A+T；H＝A+T+C。
PCR参数如下：35次循环94℃1分钟
                     47℃1分钟
                     72℃30秒
                     1.5mM MgCl2
                     大约150-200ng DNA模板
将所得PCR产物克隆入商购自Promega公司(Promega UK，Southampton)的pGEM-T载体中，用大肠杆菌菌株JM109(Yanisch-Perron等，1985，基因33：103-119)作宿主。PCR产物的序列示于SEQ ID NO：3。然后将克隆的插入体用EcoRI酶切为片段，并连接于用EcoRI预处理的质粒pBGS8(Spratt等，基因41：337-342(1986))。所用限制酶得自英国Boehringer Mannheim公司(Bell Lane，Lews East Sussex BN7 1LG，英国)并根据说明书使用。然后用此连接混合物转化大肠杆菌JM109，在补加1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，0.02％XGAL(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-吡喃半乳糖苷)和50mg/l卡那霉素的Luria琼脂上选择电转化体。将琼脂板在37℃温育12小时。从一个转化体中分离质粒DNA，通过用EcoRI，BamHI和SalI进行限制酶分析鉴定，称为pMC1(图4)。
质粒pMC1以大肠杆菌菌株DH5α/pMC1形式，根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心，DSMZ；Braunschweig，德国)，保藏号DSM12969。
实施例6：在生产赖氨酸的DSM5715中整合诱变pgi基因
将实施例5中所述的载体pMC1，通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123：343-347(1994))，电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715是一种AEC抗性赖氨酸生产菌。载体pMC1在DSM5715中不能独立复制，并只有已整合入DSM5715的染色体中时，才在细胞中保留。通过将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择具有整合入染色体的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB琼脂已补加15mg/l卡那霉素。为检测整合情况，将内部pgi片段(实施例5)用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒，通过Boehringer Mannheim GmbH的“进行滤膜杂交的DIG系统使用指导”(Mannheim，德国，1993)进行标记。转化体的染色体DNA是通过Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离的，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并在68℃用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒杂交。以此方式发现质粒pMC1插入菌株DSM5715的染色体pgi基因中。此菌株称为DSM5715∷pMC1。
实施例7：过表达zwf基因同时消除pgi基因对赖氨酸制备的作用
7.1制备菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf
将实施例1.2所述载体pEC-T18mob2zwf，通过Tauch等的电穿孔方法(1994，FEMS微生物学通信123：343-347)，电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715∷pMC1中。将电穿孔混合物铺板于已补加15mg/l卡那霉素和5mg/l四环素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞，并通过限制酶KpnI和SalI处理及随后的琼脂糖凝胶电泳检测。此菌株称为DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf。
7.2制备赖氨酸
将实施例7.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                       2.5g/l
Bacto-肽胨                  10g/l
Bacto-酵母膏                10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)        2％(w/v)
pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                      5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)               20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)             50g/l
(NH4)2SO4                    25g/l
KH2PO4                        0.1g/l
MgSO4·7H2O                  1.0g/l
CaCl2·2H2O                  10mg/l
FeSO4·7H2O                  10mg/l
MnSO4·H2O                   5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                     0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)                0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)                   0.1g/l
CaCO3                               25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表3。
表3
  菌株   OD   赖氨酸HCl(g/l)
  DSM5715   7.3   14.3
  DSM5715/pEC-T18mob2zwf   7.1   14.6
  DSM5715∷pMC1/pEC-T18mob2zwf   10.4   15.2
实施例8：制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒文库
如Tauch等(1995，质粒33：168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体Super Cosl(Wahl等，(1987)美国科学院院报84：2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI编码27-0948-02)酶切，并也用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性的内切酶BamHI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27-0868-04)酶切。将以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC 13032DNA混合，并用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563-1575)，将细菌置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬浮液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例9：poxB基因的分离与测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离单个菌落的粘粒DNA(实施例7)，并用限制性内切酶Sau 3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AJ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酶酶(Roche分子生物化学，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。经凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。将得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，将DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biobech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123343-7)进大肠杆菌菌株DH5Q MCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645-4649)，并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot 9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”(产品号403044，Weiterstadt，德国)，在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29∶1)(产品号A124.1，Roth，Karlsmhe，德国)中，进行凝胶电泳分离和序列分析。
所得原始序列数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217-231)版本97-0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217-231)进行计算机辅助编码区分析。用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389-3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行进一步分析。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，对该核苷酸序列的分析显示-1737碱基对的开放读框，其被称为poxB基因，poxB基因编码579个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：5)。
实施例10：制备整合载体以整合诱变poxB基因
从菌株ATCC13032中，通过Eikmanns等所述方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离染色体DNA。基于从实施例8中已知的谷氨酸棒杆菌的poxB基因序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应：
poxBint1：5’TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3’
poxBint2：5’GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3’
所示引物是通过MWG Biotech(Ebersberg，德国)合成的，通过Innis等的标准PCR方法(PCR方案，方法指导和应用，1990，Academic出版社)，用Boehringer的Pwo-聚合酶进行PCR反应。借助于聚合酶链反应，分离大约0.9kb的DNA片段，其携带poxB基因的内部片段，并如SEQ ID NO：6所示。
将扩增的DNA片段用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒(Carlsbad，CA，美国；Catalogue Number K4500-01)，连接在载体pCR2.1-TOPO(Mead等，(1991)，生物/技术9：657-663)中。然后将连接混合物电穿孔入大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，牛津，华盛顿DC，美国，1985)。将转化混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择携带质粒的细胞，所用LB琼脂已补加25mg/ml卡那霉素。借助于Qiagen公司的QIAprep Spin微量制备试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制酶EcoRI限制及随后的琼脂糖凝胶电泳(0.8％)检测。此质粒称为pCR2.1poxBint(图5)。
质粒pCR2.1poxBint以大肠杆菌菌株DH5α/pCR2.1poxBint形式，根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ；Braunschweig，德国)，保藏号DSM13114。
实施例11：在赖氨酸生产菌DSM5715中整合诱变poxB基因
将实施例10中所述的载体pCR2.1poxBint，通过Tauch等的电穿孔方法(FEMS微生物学通信，123：343-347(1994))，电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中。菌株DSM5715是一种AEC抗性赖氨酸生产菌。载体pCR2.1poxBint在DSM5715中不能独立复制，并只有已整合入DSM5715的染色体中时，才在细胞中保留。通过将电穿孔混合物铺板于LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.，1989)上，选择具有整合入染色体的pCR2.1poxBint的克隆，所用LB琼脂已补加15mg/l卡那霉素。为检测整合情况，将poxBint片段用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒，通过Boehringer Mannheim GmbH的“进行滤膜杂交的DIG系统使用指导”(Mannheim，德国，1993)进行标记。潜在整合子的染色体DNA是通过Eikmanns等的方法(微生物学140：1817-1828(1994))分离的，并分别用限制酶SalI，SacI和HindIII酶切。形成的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，并在68℃用Boehringer公司的Dig杂交试剂盒杂交。实施例9中所述的质粒pCR2.1poxBint已插入DSM5715染色体的染色体poxB基因内。此菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint。
实施例12：过表达zwf基因同时消除poxB基因对赖氨酸制备的作用
12.1制备菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf
通过Libel等所述电穿孔方法(FEMS微生物学通信，53：299-303(1989))，将菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint用质粒pEC-T18mob2zwf转化。在含有18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨糖醇，5g/l Bacto-胰化蛋白胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl，和18g/l Bacto-琼脂，并补加5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃温育2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915-927)从转化体中分离质粒DNA，用限制性内切酶XbaI和KpnI酶切，并通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测此质粒。以此方式获得的菌株称为DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf。
12.2制备L-赖氨酸
将实施例12.1中所得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf，在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃在具有适当抗生素的琼脂板(含5mg/l四环素和25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII
NaCl                      2.5g/l
Bacto-肽胨                 10g/l
Bacto-酵母膏               10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)       2％(w/v)
pH调节为7.4。
加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM用作主培养物。
培养基MM：
CSL(玉米浆)                     5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)              20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)            58g/l
(NH4)2SO4                   25g/l
KH2PO4                       0.1g/l
MgSO4·7H2O                 1.0g/l
CaCl2·2H2O                 10mg/l
FeSO4·7H2O                 10mg/l
MnSO4·H2O                  5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                     0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)                0.2mg/l
L-亮氨酸(过滤灭菌)                   0.1g/l
CaCO3                               25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至PH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入四环素(5mg/l)和卡那霉素(25mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)测定在660nm波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表4。
表4
  菌株   OD   赖氨酸HCl(g/l)
  DSM5715   10.8   16.0
  DSM5715/pEC-T18mob2zwf   8.3   17.1
  DSM5715∷pCR2.1poxBint   7.1   16.7
  DSM5715∷pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf   7.8   17.7
原始表格(为递交)-2000年7月3日02:54:24PM打印
  0-10-1-1   PCT/RO/134(EASY)表关于保藏微生物或其他生物材料的说明(PCT细则13之二)使用如右栏程序制备 PCT-EASY版本2.90(2000年3月8日更新)
  0-2   国际申请号   PCT/EP00/06303
  0-3   申请人或代理人文档号   990239BT
  11-11-2   如下说明涉及的保藏微生物或其他生物材料见说明书页行 7倒5
  1-31-3-11-3-21-3-31-3-4   保藏事项保藏单位名称保藏单位地址保藏日期保藏编号 德意志微生物保藏中心德国不伦瑞克2000年1月20日DSMZ 13244
  1-4   补充说明   无
  1-5   本说明是为下列指定国作的   所有指定国
  1-6   单独提供说明下列说明将随后向国际局提供   无
  由受理局填写
  0-4   本页已经和国际申请一起收到(是或否)   是
  0-4-1   受权官员
  由国际局填写
  0-5   国际局收到本页日期
  0-5-1   受权官员
序列表
<110>德古萨-于乐斯股份公司
国立爱尔兰大学戈尔韦分校
于利希研究中心有限公司
<120>用zwf基因发酵制备L-氨基酸的方法
<130>9902398T
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>2811
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(373)..(2022)
<223>pgi
<400>1
aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat      60
taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc      120
aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa      180
gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg      240
acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac      300
cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa      360
gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac      411
              Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp
                1               5                  10
att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac        459
Ile Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn
     15                  20                  25
ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc        507
Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala
 30                  35                  40                  45
gag aag tac acc ttc tcc gcg gct ggc ctc cac gtc gac ctg tcg aag        555
Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys
                 50                  55                  60
aat ctg ctt gac 9ac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa        603
Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu
             65                  70                  75
gaa tct ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cac       651
Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His
         80                  85                  90
ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cac acc gcg ctg cgc ctt       699
Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu
     95                 100                 105
cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat       747
Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp
110                 115                 120                 125
gtc cac gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc       795
Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg
                130                 135                 140
tca ggc aac tgg ttg gga cac acc ggc cac acg atc aag aag atc gtc       843
Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val
            145                 150                 155
aac att ggt atc ggt ggc tct gac ctc gga cca gcc atg gct acg aag       891
Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys
        160                 165                 170
gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt atc tca gca gaa ttc gtc tcc       939
Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser
    175                 180                 185
aac gtc gac cca gca gac ctc gtt tct gtg ttg gaa gac ctc gat gca       987
Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala
190                 195                 200                 205
gaa tcc aca ttg ttc gtg atc gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag       1035
Glu Ser Thr Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu
                210                 215                 220
acg ctg tcc aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc       1083
Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu
            225                 230                 235
ggt gaa gag gct gtc gcg aag cac ttc gtc gca gtg tcc acc aat gct       1131
Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala
        240                 245                 250
gaa aag gtc gca gag ttc ggt atc gac acg gac aac atg ttc ggc ttc       1179
Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe
    255                 260                 265
tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tcc gtg gac tcc gca gtt ggt ctt        1227
Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu
270                 275                 280                 285
tcc ctc atg gca gtg atc ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt        1275
Ser Leu Met Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly
                290                 295                 300
gga ttc cac gcg atg gat gaa cac ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag      1323
Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu
            305                 310                 315
aac gtt cca atc ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tcc gat ttc      1371
Asn Val Pro Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe
        320                 325                 330
tat ggt gca gaa acc cac gct gtc cta cct tat tcc gag gat ctc agc      1419
Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser
    335                 340                 345
cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag      1467
Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys
350                 355                 360                 365
tca gtc cac cgc gac ggc tcc cct gtt tcc act ggc act ggc gaa att      1515
Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile
                370                 375                 380
tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cac gct ttc ttc cag ctg      1563
Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu
            385                 390                 395
atc cac cag ggc act cgc ctt gtt cca gct gat ttc att ggt ttc gct      1611
Ile His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala
        400                 405                 410
cgt cca aag cag gat ctt cct gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt      1659
Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu
    415                 420                 425
ttg atg agc aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag      1707
Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys
430                 435                 440                 445
aac gct gaa gag atc gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac      1755
Asn Ala Glu Glu Ile Ala Gla Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn
                450                 455                 460
cac aag gtc gtg cca ggt aat cgc cca acc acc acc att ttg gcg gag      1803
His Lys Val Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu
            465                 470                 475
gaa ctt acc cct tct att ctc ggt gcg ttg atc gct ttg tac gaa cac      1851
Glu Leu Thr Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His
        480                 485                 490
acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gac atc aac tcc ttc gac caa      1899
Thr Val Met Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln
    495                 500                 505
tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac ctc gct ccg gct      1947
Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala
510                 515                 520                 525
gtc tct ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tct tcc act gat tca      1995
Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser
                530                 535                 540
ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt             2042
Leu Ile Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg
            545                 550
caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa     2102
tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg     2162
ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc     2222
tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc     2282
catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat     2342
ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc     2402
tgttagggag tattttccgc gtcacgtcgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt     2462
ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgccgtgccg atttctcagt gggctacaca     2522
tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc     2582
ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc     2642
gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg     2702
gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc     2762
aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc                 2811
<210>2
<211>550
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>2
Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp Ile Ser Thr
  1               5                  10                  15
Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala
             20                  25                  30
Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr
         35                  40                  45
Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu
     50                  55                  60
Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly
 65                  70                  75                  80
Leu Arg Glu Arg Ile Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn
                 85                  90                  95
Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu
            100                 105                 110
Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His Glu
        115                 120                 125
Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn
    130                 135                 140
Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr Ile Lys Lys Ile Val Asn Ile Gly
145                 150                 155                 160
Ile Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg
                165                 170                 175
Ala Tyr Ala Thr Ala Gly Ile Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp
            180                 185                 190
Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala Glu Ser Thr
        195                 200                 205
Leu Phe Val Ile Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser
    210                 215                 220
Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu
225                 230                 235                 240
Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val
                245                 250                 255
Ala Glu Phe Gly Ile Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp
            260                 265                 270
Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met
        275                 280                 285
Ala Val Ile Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His
    290                 295                 300
Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu Asn Val Pro
305                 310                 315                 320
Ile Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala
                325                 330                 335
Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala
            340                 345                 350
Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His
        355                 360                 365
Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu Ile Tyr Trp Gly
    370                 375                 380
Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu Ile His Gln
385                 390                 395                 400
Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe Ile Gly Phe Ala Arg Pro Lys
                405                 410                 415
Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser
            420                 425                 430
Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu
        435                 440                 445
Glu Ile Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val
    450                 455                 460
Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr Ile Leu Ala Glu Glu Leu Thr
465                 470                 475                 480
Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met
                485                 490                 495
Val Gln Gly Val Ile Trp Asp Ile Asn Ser Phe Asp Gln Tro Gly Val
            500                 505                 510
Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly
        515                 520                 525
Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu Ile Lys
    530                 535                 540
Trp Tyr Arg Ala Asn Arg
545                 550
<210>3
<211>462
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>3
atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc      60
gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac      120
cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt      180
cctgccggtg agcgcaccat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag      240
gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg      300
gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt      360
accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acaccgtgat ggttcagggc      420
gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa                         462
<210>4
<211>2160
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(327)..(2063)
<223>poxB
<400>4
ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt      60
cgaggcgacc agacaggcgt gcccacgatg tttaaatagg cgatcggtgg gcatctgtgt      120
ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt      180
gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg     240
aagcgtggca acaactggaa tttaagagca caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac     300
aatagccata acgttgagga gttcag atg gca cac agc tac gca gaa caa tta      353
                             Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu
                               1               5
att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg       401
Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val
 10                  15                  20                  25
ggt gac agc ctt aat ccg atc gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att       449
Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile
                 30                  35                  40
gag tgg gtg cac gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt       497
Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly
             45                  50                  55
gcg gaa tcg ttg atc act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tct tgt       545
Ala Glu Ser Leu Lle Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys
         60                  65                  70
ggt cct gga aac aca cac ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga       593
Gly Pro Gly Asn Thr His Leu Lle Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg
     75                  80                  85
aat ggt gcg aag gtg ttg gcc atc gct agc cat att ccg agt gcc cag       641
Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln
 90                  95                 100                 105
att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag       689
Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys
                110                 115                 120
gaa tgc tct ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa       737
Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu
            125                 130                 135
cgc att ttg cat cac gcg att cag tcc acc atg gcg ggt aaa ggt gtg       785
Arg Ile Leu His His Ala Ile Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val
        140                 145                 150
tcg gtg gta gtg att cct ggt gat atc gct aag gaa gac gca ggt gac       833
Ser Val Val Val Ile Pro Gly Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp
    155                 160                 165
ggt act tat tcc aat tcc act att tct tct ggc act cct gtg gtg ttc       881
Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe
170                 175                 180                 185
ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aec gct       929
Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala
                190                 195                 200
aag tct gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg       977
Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala
            205                 210                 215
cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg atc ggg cat gcg       1025
Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala
        220                 225                 230
ctg ggt ggt aag cag tac atc cag cat gag aat ccg ttt gag gtc ggc       1073
Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly
    235                 240                 245
atg tct ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tcc aat gag       1121
Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu
250                 255                 260                 265
gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tct gat ttc       1169
Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe
                270                 275                 280
ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat atc aac ggt gcg cac att       1217
Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile
            285                 290                 295
ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca       1265
Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala
        300                 305                 310
aca atc gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tcc       1313
Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser
    315                 320                 325
ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cac gag cgt aag ttg agc tcg gtg       1361
Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val
330                 335                 340                 345
gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cac cct       1409
Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro
                350                 355                 360
gaa tac gtt gcc tct att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg       1457
Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val
            365                 370                 375
ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac atc       1505
Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile
        380                 385                 390
gag aat ccg gag gga acg cgc gac ttt gtg ggt tca ttc cgc cac ggc       1553
Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly
    395                 400                 405
acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat       1601
Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp
410                 415                 420                 425
cga aac cgc cag gtg atc gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg       1649
Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met
                430                 435                 440
ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cac caa ctt ccg ctg aag       1697
Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys
            445                 450                 455
gct gtg gtg ttt aac aac agt tct ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg       1745
Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met
        460                 465                 470
ctc gtg gag gga cag cca gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat       1793
Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn
    475                 480                 485
ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt atc aaa tcg gta cgc atc acc       1841
Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr
490                 495                 500                 505
gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg gca tat cct       1889
Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro
                510                 515                 520
gga cct gta ctg atc gat atc gtc acg gat cct aat gcg ctg tcg atc       1937
Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile
            525                 530                 535
cca cca acc atc acg tgg gaa cag gtc atg gga ttc agc aag gcg gcc       1985
Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala
        540                 545                 550
acc cga acc gtc ttt ggt gga gga gta gga gcg atg atc gat ctg gcc       2033
Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala
    555                 560                 565
cgt tcg aac ata agg aat att cct act cca tgatgattga tacacctgct         2083
Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile Pro Thr Pro
570                 575
gttctcattg accgcgagcg cttaactgcc aacatttcca ggatggcagc tcacgccggt     2143
gcccatgaga ttgccct                                                    2160
<210>5
<211>579
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>5
Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu Ile Asp Thr Leu Glu Ala Gln
  1               5                  10                  15
Gly Val Lys Arg Ile Tyr Gly Leu Val Gly Asp Ser Leu Asn Pro Ile
             20                  25                  30
Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp Ile Glu Trp Val His Val Arg Asn
         35                  40                  45
Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu Ile Thr Gly
     50                 55                 60
Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu
 65                  70                  75                  80
Ile Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala
                 85                  90                  95
Ile Ala Ser His Ile Pro Ser Ala Gln Ile Gly Ser Thr Phe Phe Gln
            100                 105                 110
Glu Thr His Pro Glu Ile Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu
        115                 120                 125
Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg Ile Leu His His Ala Ile
    130                 135                 140
Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val Ile Pro Gly
145                 150                 155                 160
Asp Ile Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr
                165                 170                 175
Ile Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala
            180                 185                 190
Ala Leu Val Glu Ala Ile Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys
        195                 200                 205
Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu
    210                 215                 220
Lys Ile Lys Ser Pro Ile Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr Ile
225                 230                 235                 240
Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr
                245                 250                 255
Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu Ile Leu Leu
            260                 265                 270
Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala
        275                 280                 285
Gln Val Asp Ile Asn Gly Ala His Ile Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys
    290                 295                 300
Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr Ile Glu Asn Ile Leu Pro
305                 310                 315                 320
His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys
                325                 330                 335
Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn
            340                 345                 350
Val Glu Lys His Val Pro Ile His Pro Glu Tyr Val Ala Ser Ile Leu
        355                 360                 365
Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met
    370                 375                 380
Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr Ile Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg
385                 390                 395                 400
Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro
                405                 410                 415
His Ala Ile Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val Ile Ala
            420                 425                 430
Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr
        435                 440                 445
Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser
    450                 455                 460
Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu
465                 470                 475                 480
Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu Ile Ala Ala Ala
                485                 490                 495
Ala Gly Ile Lys Ser Val Arg Ile Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu
            500                 505                 510
Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile
        515                 520                 525
Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser Ile Pro Pro Thr Ile Thr Trp Glu
    530                 535                 540
Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly
545                 550                 555                 560
Gly Val Gly Ala Met Ile Asp Leu Ala Arg Ser Asn Ile Arg Asn Ile
                565                 570                 575
Pro Thr Pro
<210>6
<211>875
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>6
tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc      60
accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac      120
gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg      180
gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg      240
ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt      300
aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt      360
gaggtcggca tgtctggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg      420
gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattctg atttccttcc taaagacaac      480
gttgcccagg tggatatcaa cggtgcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg      540
gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca      600
gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta      660
gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct      720
attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat      780
gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc      840
cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc                                 875

Claims (5)

1.一种通过发酵棒状细菌制备L-赖氨酸或L-苏氨酸的方法，包括进行以下步骤：
a)发酵产生上述L-氨基酸的棒状细菌，该细菌中至少zwf基因是被扩增的，该zwf基因是利用以下寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应，从谷氨酸棒杆菌ATCC13032扩增所得：
zwf正向引物：5’-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3’
zwf反向引物：5’-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3’
该zwf基因编码具有葡糖-6-磷酸脱氢酶活性的多肽，其中所述多肽含有如下N-末端氨基酸序列：Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser TrpThr Asn Pro Leu Arg Asp，
b)浓缩培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及
c)分离产生的L-氨基酸。
2.如权利要求1的方法，其中在已经产生L-赖氨酸的棒状细菌中，选自以下一组的一个或多个基因被同时扩增或过表达：
(1)编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
(2)编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因，
(3)编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的gap基因，
(4)编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
(5)编码转酮酶的tkt基因，
(6)编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因，
(7)编码赖氨酸输出的lysE基因，
(8)zwa1基因，
(9)编码烯醇化酶的eno基因。
3.如权利要求1的方法，其中在已经产生L-苏氨酸的棒状细菌中，选自以下一组的一个或多个基因被同时扩增或过表达：
(1)编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因或编码“反馈抗性”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因，
(2)编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因，
(3)编码丙酮酸羧化酶的pyc基因，
(4)编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因，
(5)编码转酮酶的tkt基因
(6)编码葡糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，
(7)编码苏氨酸输出的thrE基因，
(8)zwa1基因，
(9)编码烯醇化酶的eno基因。
4.权利要求1的方法，其中为制备L-赖氨酸或L-苏氨酸，其中使用的细菌中还有选自以下一组的一个或多个基因被弱化：
(1)编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因，
(2)编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因，
(3)编码丙酮酸氧化酶的poxB基因，
(4)zwa2基因。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中为实现扩增，所述基因或核苷酸序列的拷贝数通过用携带这些基因或核苷酸序列的质粒载体转化棒状细菌而提高。
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