KR20020012578A

KR20020012578A - ｚｗｆ 유전자의 증폭에 의한 Ｌ-아미노산의 발효 제조방법

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Publication number: KR20020012578A
Application number: KR1020017014792A
Authority: KR
Inventors: 버크케빈; 잠헤르만; 에크겔링로타르; 모리츠베른트; 두니칸엘.카.; 므코르맥애쉴링; 스테이플톤클리오나; 뫼켈벳티나; 티어바하게오르크
Original assignee: 펠드만 마르틴 및 봅 후베르트; 데구사 아게; 추후제출; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하; 내셔널 유니버시티 오브 아일랜드
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2002-02-16
Also published as: CN101029310B; CA2374261C; EP1179073B1; EP1179073A1; BR0011283A; SK287997B6; SK16532001A3; PL205611B1; CN1353758A; KR100715641B1; WO2001070995A1; MXPA01011644A; DE60033026T2; DE60033026D1; HK1047136A1; CN101029310A; ATE351908T1; CA2374261A1; MX244419B; CN1289676C

Abstract

본 발명은

적어도 zwf 유전자가 증폭된 목적하는 L-아미노산을 생성시키는 세균을 발효시키는 단계(a),

배지 또는 세균 세포 내의 L-아미노산을 농축시키는 단계(b) 및

생성된 L-아미노산을 분리하는 단계(c)를 포함하여, 코리네형 세균의 발효에 의해 L-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

ｚｗｆ 유전자의 증폭에 의한 Ｌ-아미노산의 발효 제조방법{Process for the fermentative preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene}

본 발명은 적어도 zwf 유전자가 증폭된 코리네형 세균을 사용하는, L-아미노산, 특히 L-라이신, L-트레오닌 및 L-트립토판의 발효 제조방법에 관한 것이다.

선행 기술

L-아미노산은 동물의 영양 섭취, 사람 약물 및 약제 산업에서 사용된다.

아미노산은 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주를 발효시켜 제조하는 것으로 공지되어 있다. 이것은 매우 중요하기 때문에, 제조공정을 개선하기 위한 연구가 지속적으로 수행되고 있다. 공정에 대한 개선은 발효 수단, 예를 들면, 교반 및 산소 공급, 또는 영양 배지 조성, 예를 들면, 발효 동안의 당 농도, 또는 예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산성에 관한 것이다.

돌연변이 유발, 선택 및 돌연변이주 선택 방법을 사용하여 이들 미생물의 생산성을 개선시킨다. 항대사물질, 예를 들면, 트레오닌 유사체 α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV)에 내성이거나 규칙적으로 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이고 L-아미노산, 예를 들면, 트레오닌을 생산하는 균주를 이러한 방법으로 수득한다.

L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 개선시키는 데 또한 재조합 DNA 기술 방법이 수년 동안 사용되어 왔다.

발명의 목적

본 발명자들은 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산을 발효 제조하는 개선된 신규한 방법을 제공함을 목적으로 하였다.

발명의 설명

L-아미노산은 사람 약물, 약제 산업, 식품 산업 및 특히 동물의 영양 섭취에 사용된다. 따라서, 아미노산을 제조하는 개선된 신규한 방법을 제공하는 것은 일반적인 관심사이다.

본 발명은 zwf 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(zwf 유전자)이 증폭된, 특히 과발현된 코리네형 세균을 사용하여 L-아미노산, 특히 L-라이신, L-트레오닌 및 L-트립토판을 발효에 의해 제조하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 사용된 균주는 zwf 유전자의 증폭 전에 L-아미노산을 이미 생산한다.

바람직한 양태는 청구의 범위에 기재되어 있다.

이와 관련하여 용어 "증폭"은, 예를 들면, 강력한 프로모터를 사용하거나 활성이 높은 상응하는 효소(단백질)를 암호화하는 유전자를 사용하고, 임의로 이들 수단을 결합시켜, 유전자 또는 유전자들의 카피 수를 증가시킴으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화된 미생물의 하나 이상의 효소(단백질)의 세포내 활성을 증가시키는 것을 나타낸다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로즈로부터 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산을 제조할 수 있다. 이들은 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 세균의 대표적인 예이다. 코리네박테리움 속 중에서, 특히 당해 전문가들에게 L-아미노산의 생산 능력으로 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 종을 언급할 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 균주는 예를 들면, 공지된 야생형 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067,

브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및

이로부터 제조된 L-아미노산을 생산하는 돌연변이주, 예를 들면, L-트레오닌을 생산하는 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21649,

브레비박테리움 플라붐 BB69,

브레비박테리움 플라붐 DSM5399,

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-BP 269 및

브레비박테리움 락토퍼멘툼 TBB-10, 및

예를 들면, L-이소루신을 생산하는 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14309,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14310,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC14311,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC15168 및

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC6871, 및

예를 들면, L-트립토판을 생산하는 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC21850 및

코리네박테리움 글루타미쿰 KY9218(pKW9901), 및

예를 들면, L-라이신을 생산하는 균주인

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032,

코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12866이다.

코리네형 세균은 zwf 단백질을 암호화하는 zwf 유전자의 과발현 후 개선된 방법으로 L-아미노산, 특히 L-라이신, L-트레오닌 및 L-트립토판을 생산하는 것으로 밝혀졌다.

추가로, 유전자 코드의 축퇴(degeneracy) 또는 중성 기능의 감각 돌연변이로 인한 zwf 유전자의 대립유전자도 사용할 수 있다.

일본 공개특허공보 제(평)9-224661호에는 브레비박테리움 플라붐 MJ-223(FERM BP-1497)의, zwf라 지칭되는 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열이 기재되어 있다. 일본 공개특허공보 제(평)9-224661호에는 zwf 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산 서열이 Met Val Ile Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu로서 기재되어 있다.

그러나, 이를 확인할 수 없었다. 대신에 다음의 N-말단 아미노산 서열이 밝혀졌다: Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp. N-위치의 발릴 라디칼은 후-번역 수식(post-translational modification)의 상황에서분리제거될 수 있고, 이어서 Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp가 N-말단 아미노산 서열로서 수득된다.

증폭(예를 들면, 과발현)시키기 위해, 상응하는 유전자의 카피 수를 증가시키거나 프로모터 및 조절 영역 또는 구조 유전자의 상부 스트림의 리보솜 결합 부위를 돌연변이시킨다. 구조 유전자의 상부 스트림에 혼입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해, L-아미노산의 발효 생산 과정에서 발현을 증가시키는 것이 또한 가능하다. 마찬가지로 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 향상된다. 게다가, 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 또한 증가된다. 유전자 또는 유전자 작제물은 다양한 카피 수를 갖는 플라미드 내에 존재하거나 염색체 내에서 통합 및 증폭된다. 또한, 배지 조성과 배양 과정을 변화시켜 해당 유전자를 추가로 과발현시킬 수 있다.

본원의 지침은 전문가, 특히 마틴(Martin) 등[참조: Bio/Technology 5, 137-146 (1987)], 게레로(Guerrero) 등[참조: Gene 138, 35-41 (1994)], 쓰치야(Tsuchiya)와 모리나가(Morinaga)[참조: Bio/Technology 6, 428-430 (1988)], 아이크만스(Eikmanns) 등 [참조: Gene 102, 93-98 (1991)], 유럽 특허 명세서 제0 472 869호, 미국 특허 제4,601,893호, 슈바르처(Schwarzer)와 퓔러(Puhler)[참조: Bio/Technology 9, 84-87 (1991)], 라인샤이드(Reinscheid) 등[참조: Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)], 라바레(LaBarre) 등[참조: Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)], 국제특허공보 WO 제96/15246호, 말룸브레스(Malumbres) 등[참조: Gene 134, 15-24(1993)], 일본 공개특허공보 제(평)10-229891호, 젠센(Jensen)과 해머(Hammer)[참조: Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)]에 의해 기재되어 있고 또한 공지된 유전학 및 분자 생물학 교본에 기재되어 있다.

예를 들면, zwf 단백질은 플라스미드를 사용하여 과발현시킨다. 이를 위해 도 1에 나타낸 E. 콜라이 - C. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 사용한다. pEC-T18mob2의 KpnI/SalI 절단 영역에 zwf 유전자를 혼입한 후, 도 2에 나타낸 플라스미드 pEC-T18mob2zwf를 형성시킨다.

C. 글루타미쿰에서 복제할 수 있는 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면, pEKEx1[참조: Gene 102: 93-98 (1991), Eikmanns et al.] 또는 pZ8-1[참조: 유럽 특허공보 제0 375 889호]을 사용할 수 있다.

또한, L-아미노산의 제조를 위해, zwf 유전자를 증폭시킬 뿐만 아니라, 특정 생합성 경로, 당분해, 보충반응(anaplerosis), 펜토스 포스페이트 경로 또는 아미노산 수송의 하나 이상의 효소를 증폭시키는 것이 유리하다.

따라서, 예를 들면, 특히 L-트레오닌의 제조를 위해,

·호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자[참조: Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988), Peoples et al.] 또는 "피드백 저항성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립유전자[참조: Gene 107, 53-59 (1991), Archer et al.],

·글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Journal of Bacteriology 174: 6076-6068 (1992), Eikmanns et al.],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조: Microbiology 144: 915-927 (1998), Peters-Wendisch et al.],

·말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998), Molenaar et al.],

·트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자[유로피언 몰리큘러 바이올로지즈 래버러토리즈 데이타뱅크(EMBL, 독일 하이델베르크 소재)의 수탁번호 AB023377],

·6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자[참조: 일본 공개특허공보 제(평)9-224662호],

·트레오닌 수송을 암호화하는 thrE 유전자[참조: 독일 특허원 제199 41 478.5호; DSM 12840],

·zwal 유전자[참조: 독일 특허원 제199 59 328.0호; DSM 13115] 및

·에놀라제를 암호화하는 eno 유전자[참조: 독일 특허원 제199 41 478.5호]로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시킬 수 있다.

따라서, 예를 들면, L-라이신의 제조를 위해,

·디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[참조: 유럽 특허공보 제0 197 335호],

·피드백 저항성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조: Molecular and General Genetics 224: 317-324 (1990), Kalinowski et al.],

·글리세롤알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Journal of Bacteriology 174: 6076-6068 (1992), Eikmanns],

·피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참조: 독일 특허원 제198 31 609호],

·라이신 수송을 암호화하는 lysE 유전자[참조: 독일 특허원 제195 48 222호],

·zwal 유전자[참조: 독일 특허원 제199 59 328.0호; DSM 13115] 및

·에놀라제를 암호화하는 eno 유전자[참조: 독일 특허원 제199 47 791.4호]로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 특히 과발현시킬 수 있다.

zwf 유전자의 증폭 이외에,

·포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참조: 독일 특허원 제199 50 409.1호; DSM 13047],

·글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참조: 미국 특허원 제09/396,478호, DSM 12969],

·피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[참조: 독일 특허원 제19951 975.7호; DSM 13114] 및

·zwa2 유전자[참조: 독일 특허원 제199 59 327.2호; DSM 13113]로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나의 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 L-아미노산의 제조에 더욱 유리할 수 있다.

zwf 단백질의 과발현 이외에, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 L-아미노산의 제조에 더욱 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 제조되는 미생물은 L-아미노산 제조를 위해 배치 공정(배치 배양) 또는 공급 배치(공급 공정) 또는 반복 공급 배치 공정(반복 공급 공정)에서 연속적 또는 비연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법이 Chmiel(크미엘)의 교본[참조: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Bioprocess Technology 1. Introduction to Biopress Technology(Gustav Fisher Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 스토르하스(Storhas)의 교본[참조: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Bioreactions and Peripheral Equipment)(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 요약되어 있다.

사용할 배양 배지는 적합한 방법으로 특정 미생물의 필요조건을 충족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배양 배지에 대한 내용이 안내서[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology" of the American Society forBacteriology(Washington D. C., USA, 1981]에 기재되어 있다. 당 및 탄수화물, 예를 들면, 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로즈, 오일 및 지방, 예를 들면, 대두유, 해바라기유, 낙화생유 및 코코넛 지방, 지방산, 예를 들면, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예를 들면, 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들면, 아세트산을 탄소 공급원으로서 사용할 수 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 유기 질소 함유 화합물, 예를 들면, 펜토스, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예를 들면, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 질소 공급원으로서 사용할 수 있다. 질소 공급원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 인 공급원으로서 사용할 수 있다. 추가로, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속 염을 포함하여야 한다. 마지막으로, 상기 물질 이외에 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 사용할 수 있다. 게다가, 적합한 전구체를 배양 배지에 가할 수 있다. 상기 출발 물질들은 단일 배치 형태로 배양물에 가하거나 적합한 방법으로 배양 동안 공급할 수 있다.

염기성 화합물, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 산 화합물, 예를 들면, 인산 또는 황산을 적합한 방법으로 사용하여 pH를 조절할 수 있다. 소포제, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 기포 발생을 조절할 수 있다. 선택적 작용을 하는 적합한 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 가하여 플라스미드의 안정성을 유지할 수 있다. 혐기성 조건을 유지하기 위해 산소 또는 산소 함유 기체 혼합물, 예를 들면, 공기를 배양물에 도입한다. 배양물의 온도는 일반적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 최대량의 L-아미노산이 형성될 때까지 계속 배양한다. 이러한 목표는 일반적으로 10 내지 160시간 내에 달성된다.

L-아미노산의 분석은 스팩크만(Spackman) 등[참조: Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]이 기재한 바와 같이 음이온교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화에 의해 수행할 수 있거나, 린드로쓰(Lindroth) 등[참조: Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174]이 기재한 바와 같이 역상 HPLC에 의해 수행할 수 있다.

부다페스트 조약에 따라 아래의 미생물이 도이췌 잠룽 퓌르 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에 기탁되었다:

에스케리치아 콜라이 K-12 DH5α/pEC-T18mob2 (수탁번호 DSM 13244)

아래의 도면이 첨부되어 있다:

·도 1: 플라스미드 pEC-T18mob2의 지도

·도 2: 플라스미드 pEC-T18mob2zwf의 지도

·도 3: 플라스미드 pAMC1의 지도

·도 4: 플라스미드 pMC1의 지도

·도 5: 플라스미드 pCR2.1poxBint의 지도

언급된 염기쌍 번호는 재현성의 의미에서 수득된 대략의 값이다.

도 1 및 도 2에 관하여:

사용된 약어는 다음의 의미를 갖는다:

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

oriV: E. 콜라이의 플라미스-암호화된 복제 개시점

RP4mob: 플라스미드를 이동시키기 위한 mob 영역

rep: C. 글루타쿰 플라스미드 pGA1로부터의 플라미드-암호화된 복제 개시점

per: pGA1로부터의 카피 수를 조절하는 유전자

lacZ-alpha: β-갈락토시다제 유전자의 lacZα 유전자 단편(N-말단)

lacZalpha': lacZα 유전자 단편의 5'-말단

'lacZalpha: lacZα 유전자 단편의 3'-말단

도 3 및 도 4에 관하여:

사용된 약어는 아래의 의미를 갖는다:

Neo r: 네오마이신/카나마이신 내성

ColE1 ori: 플라스미드 ColE1의 복제 개시점

CMV: 시토메갈로바이러스 프로모터

lacP: 락토스 프로모터

pgi: 포스포글루코스 이소머라제 유전자

lacZ: β-갈락토시다제 유전자의 일부

SV40 3' 스플라이스: 원숭이 바이러스(Simian virus) 40의 3' 스플라이스 영역

SV40 polyA: 원숭이 바이러스 40의 폴리아데닐화 영역

f1(-)ori: 섬유상 파아지 f1의 복제 개시점

SV40 ori: 원숭이 바이러스 40의 복제 개시점

kan r: 카나마이신 내성

pgi insert: pgi 유전자의 내부 단편

ori: 플라스미드 pBGS8의 복제 개시점

도 5에 관하여:

사용된 약어는 아래의 의미를 갖는다:

ColE1 ori: 플라스미드 ColE1의 복제 개시점

lacZ: lacZα 유전자 단편의 클로닝 잔존물

f1 ori: 파아지 f1의 복제 개시점

KmR: 카나마이신 내성

ApR: 암피실린 내성

poxBint: poxB 유전자의 내부 단편

각종 제한 효소에 대한 약어(예: BamHI, EcoRI 등)의 의미는 선행 기술에 공지되어 있으며, 예를 들면, 케슬러(Kessler)와 횔트케(Holtke)[참조: Gene 47, 1-153 (1986)] 또는 로버츠(Roberts) 등[참조: Nucleic Acids Research 27, 312-313 (1999)]에 의해 요약되어 있다.

실시예

아래의 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다. 사용된 분자 생물학 기술, 예를 들면, 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 처리, 연결(ligation), E. 콜라이의 표준 형질전환 등은(달리 언급되어 있지 않으면) 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[참조: Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA]에 기재되어 있다.

실시예 1

zwf 유전자의 발현

1.1 플라스미드 pEC-T18mob2의 제조

E. 콜라이 - C. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-T18mob2를 선행 기술에 따라 작제한다. 벡터는 문헌[참조: 미국 특허 제5,175,108호; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)]에 따라 복제 작용인자 per을 함유하는 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep[참조: 미국 특허 제5,175,108호; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)], 플라스미드 pAG1의 테트라사이클린 내성-부여 tetA(Z) 유전자[참조: 미국 특허 제5,158,891호; gene library entry at the National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda,MD, USA), 수탁번호 AF121000], 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV[참조: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)], lac 프로모터 및 다중 클로닝 영역(mcs)을 포함하는 lacZα 유전자 단편[참조: Norrander et al. Gene 26, 101-106 (1983)] 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참조: Simon et al, (1983) Bio/Technology 1:784-791]을 함유한다. 작제된 벡터는 E. 콜라이 균주 DH5α 내에서 형질전환된다[참조: Brown (ed.) Molecular Biology Labfax, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK, 1991]. 플라스미드-운반 세포의 선택은 테트라사이클린 5mg/ℓ로 보충된 LB 한천[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 상에서 형질전환 배치를 플레이팅함으로써 수행된다. 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep Kit(제조사: Qiagen)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 EcoRI 및 HindIII에 의한 제한 및 이어서 아가로스 겔 전기영동법에 의해 검사한다(0.8%).

이 플라미스를 pEC-T18mob2라 지칭하고 도 1에 나타내었다. 이것은 DSM 13244로서 도이췌 잠룽 퓌르 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에 균주 E. 콜라이 K-12 균주 DH5αpEC-T18mob2의 형태로 기탁되었다.

1.2 플라스미드 pEC-T18mob2zwf의 제조

먼저 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 유전자를 아래의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시킨다:

zwf-정방향:

5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3'

zwf-역방향:

5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3'

PCR 반응은 아래의 조건하에 Thermocycler(PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) 속에서 200μM의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 각각의 경우, 상응하는 올리고뉴클레오타이드 1μM, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 염색체 DNA 100ng, 10배 반응 완충액 1/10 용적 및 내열성 Taq-/Pwo-DNA 폴리머라제 혼합물(Expand High Fidelity PCR System(제조사: Roche Diagnotics, Mannheim, Germany)) 2.6유니트의 존재하에 30주기로 수행한다: 94℃에서 30초, 64℃에서 1분 및 68℃에서 3분.

이어서, 약 1.8kb 크기의 증폭된 단편을 제조업자의 지시에 따라 SureClone Ligation Kit(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 사용하여 벡터 pUC18의 SmaI 절단 영역내로 연결시킨다. E. 콜라이 균주 DH5αmcr[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA(1990) 87: 4645-4649]를 전체 연결 배치로 형질전환시킨다. 50㎍/㎖의 카르베니실린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에서의 카르베니실린 내성을 이용하여 형질전환체를 확인한다. 플라미스미드를 형질전환체 중 7개로부터 제조하고 제한 분석에 의해 삽입물(insert)로서의 1.8kb PCR 단편의 존재 여부를 검사한다. 이렇게 형성된 재조합 플라스미드를 이후에는 pUC18zwf라 지칭한다.

pEC-T18mob2zwf의 작제를 위해, pUC18zwf를 KpnI 및 SalI로 분해시키고, 제조업자의 지시에 따라 NucleoSpin Extraction Kit(제조사: Macherey-Nagel(Duren, Germany))를 사용하여 생성물을 분리한 후, KpnI 및 SalI로 절단하고 탈인산화시킨 벡터 pEC-T18mob2와 연결시킨다. E. 콜라이 균주 DH5αmcr[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA(1990) 87: 4645-4649]를 전체 연결 배치로 형질전환시킨다. 5㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에서의 테트라사이클린 내성을 이용하여 형질전환체를 확인한다. 플라미스미드를 형질전환체 중 12개로부터 제조하고 제한 분석에 의해 삽입체로서의 1.8kb PCR 단편의 존재 여부를 검사한다. 이렇게 분리된 재조합 플라스미드를 pEC-T18mob2zwf라 지칭한다(도 2).

실시예 2

증폭된 zwf 유전자를 사용한 아미노산 생산 균주의 준비

L-라이신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715는 유럽 특허공보 제0 435 132호에 기재되어 있고, L-트레오닌 생산 균주 브레비박테리움 플라붐 DSM5399는 유럽 특허공보 제0 385 940호에 기재되어 있다. 두 가지 균주 모두 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운슈베이크 소재의 도이췌 잠룽 퓌르 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)에 기탁되었다.

2.1 균주 DSM5715/pEC-T18mob2zwf 및 DSM5399/pEC-T18mob2zwf의 제조

균주 DSM5715 및 DSM5399를 리블(Liebl) 등의 문헌[참조: FEMS Microbiology Letters, 53:299-303(1989)]에 기재된 전기천공법을 사용하여 플라스미드 pEC-T18mob2zwf로 형질전환시킨다. 형질전환체의 선택은 5mg/ℓ의 테트라사이클린으로 보충된, 18.5g/ℓ의 브레인-허트 육수 배지, 0.5M의 소르비톨, 5g/ℓ의 박토-트립톤, 2.5g/ℓ의 박토-이스트 추출물, 5g/ℓ의 NaCl 및 18g/ℓ의 박토-아가를 포함하는 LBHIS 한천 상에서 수행한다. 33℃에서 2일 동안 배양한다.

각각의 경우, 플라스미드 DNA를 통상적인 방법으로 형질전환로부터 분리하고[참조: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927], 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 KpnI로 절단시킨 후, 플라스미드를 아가로스 겔 전기영동에 의해 검사한다. 이렇게 수득한 균주를 DSM5715/pEC-T18mob2zwf 및 DSM5399/pEC-T18mob2zwf라 지칭한다.

2.2 L-트레오닌의 제조

실시예 2.1에서 수득한 C. 글루타미쿰 균주 DSM5399/pEC-T18mob2zwf를 트레오닌 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양물 상등액 중의 트레오닌 함량을 측정한다.

이를 위해, 먼저 균주를 상응하는 항생제를 포함하는 한천 플레이트(테트라사이클린 5mg/ℓ를 포함하는 브레인-허트 한천) 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 이 한천 플레이트 배양물로부터 시작하여 예비배양물을 씨딩한다(100㎖ 삼각 플라스크 속의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII를 예비배양용 배지로서 사용한다.

배지 Cg III

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-이스트 추출물 10g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 2%(w/v)

pH는 7.4로 한다.

여기에 테트라사이클린(5mg/ℓ)을 가한다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 주 배양물을 당해 예비배양물로부터 씨딩한다. 배지 MM을 주 배양물로서 사용한다.

배지 MM

CSL (옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄·7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂·2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄·7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄·H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴 (멸균-여과한 것) 0.3mg/ℓ

티아민·HCl (멸균-여과한 것) 0.2mg/ℓ

L-루신 (멸균-여과한 것) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

수성 암모니아를 사용하여 CLS, MOPS 및 염 용액의 pH를 7로 조정하고 오토클레이브 처리한다. 이어서, 무수 상태의 오토클레이브 처리된 CaCO₃뿐만 아니라 멸균 기질과 비타민 용액을 가한다.

배플달린 100㎖ 삼각 플라스크 속의 10㎖ 용적으로 배양한다. 테트라사이클린(5mg/ℓ)을 가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양한다.

72시간 후, OD 값을 Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)으로 660nm의 파장에서 측정한다. 생성된 트레오닌의 양을 이온교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 사용하는 후-컬럼 유도체화에 의해 아미노산 분석기[제조사: Eppendorf-BioTronik(Hamburg, Germany)]를 사용하여 측정한다.

실험 결과는 표 1에 나타내었다.

균주	OD	L-트레오닌(g/ℓ)
DSM5399	12.3	0.74
DSM5399/pEC-T18mob2zwf	10.2	1.0

2.3 L-라이신의 제조

실시예 2.1에서 수득한 C. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pEC-T18mob2zwf를 라이신 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양물 상등액 중의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 먼저 균주를 상응하는 항생제를 포함하는 한천 플레이트(테트라사이클린(5mg/ℓ)을 포함하는 브레인-허트 한천) 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 이 한천 플레이트 배양물로부터 시작하여 예비배양물을 씨딩한다(100㎖ 삼각 플라스크 속의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII를 예비배양용 배지로서 사용한다.

배지 Cg III

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-이스트 추출물 10g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 2%(w/v)

pH는 7.4로 한다.

여기에 테트라사이클린(5mg/ℓ)을 가한다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 주 배양물을 당해 예비배양물로부터 씨딩한다. 배지 MM을 주 배양용으로 사용한다.

배지 MM

CSL (옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 58g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄·7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂·2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄·7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄·H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴 (멸균-여과한 것) 0.3mg/ℓ

티아민·HCl (멸균-여과한 것) 0.2mg/ℓ

L-루신 (멸균-여과한 것) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

수성 암모니아를 사용하여 CLS, MOPS 및 염 용액의 pH를 7로 조정하고 오토클레이브 처리한다. 이어서, 무수 상태의 오토클레이브 처리된 CaCO₃뿐만 아니라멸균 기질과 비타민 용액을 가한다.

72시간 후, OD 값을 Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)으로 660nm의 파장에서 측정한다. 생성된 라이신의 양을 이온교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 사용하는 후-컬럼 유도체화에 의해 아미노산 분석기[제조사: Eppendorf-BioTronik(Hamburg, Germany)]를 사용하여 측정한다.

실험 결과는 표 2에 나타내었다.

균주	OD	L-라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715	10.8	16.0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7.2	17.1

실시예 3

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 AS019의 유전자 라이브러리의 작제

코리네박테리움 글루타미쿰 균주 AS019의 DNA 라이브러리[참조: Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)]를 오도노휴(O'Donohue)의 문헌[참조: O'Donohue, M. (1997). The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amono Acid Biosynthetic Genes form Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway]에 기재된 바와 같이 λ Zap Express^TM시스템[참조: Short et al., (1988) Nucleic AcidsResearch, 16: 7583-7600]을 사용하여 작제한다. λ Zap Express^TM키트를 Stratagene(Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 92037)로부터 구입하고 제조업자의 지시에 따라 사용한다. AS019-DNA를 제한 효소 Sau3A로 분해시키고, BamHI 처리 및 탈인산화된 λ Zap Express^TM아암에 연결시킨다.

실시예 4

pgi 유전자의 클로닝 및 서열화

1. 클로닝

쿠포르(Kupor)와 프라엔켈(Fraenkel)의 문헌[참조: Journal of Bacteriology 100: 1296-1301 (1969)]에 기재된 바와 같이 pgi 및 pgl 유전자 내에 돌연변이성을 갖는 에스케리치아 콜라이 균주 DF1311을 실시예 3에 기재된 AS019 λ Zap Express^TM플라스미드 라이브러리 약 500ng을 사용하여 형질전환시킨다. 형질전환체의 선택은 50mg/ℓ 농도의 카나마이신을 함유하는 M9 최소 배지[참조: Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratories, USA] 상에서 48시간 동안 37℃에서 배양하여 수행한다. 플라스미드 DNA를 번보임(Birnboim)과 돌리(Doly)[참조: Nucleic Acids Reserach 7: 1513-1523(1979)]에 따라 하나의 형질전환체로부터 분리하고 pAMC1로 나타낸다(도 3).

2. 서열화

pAMC1의 클로닝된 삽입체의 서열 분석을 위해, 착색된 형광 표지로 차별적으로 표지된 프라이머를 사용하여 생어(Sanger) 등의 방법[참조: Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467 (1977)]을 적용한다. 이는 Perkin Elmer Applied Biosystems로부터 구입한 ABI prism 310 유전자 분석기(Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, U.S.A) 및 역시 Perkin Elmer로부터 구입한 ABI prism Big Dye^TMTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit를 사용하여 수행한다.

초기 서열 분석은 Pharmacia Biotech(St. Albans, Herts, AL1 3AW, UK)로부터 구입한 통상적인 정방향 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 수행한다:

통상적인 정방향 프라이머: GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C

M13 역방향 프라이머: GGA AAC AGC TAT GAC CAT G

이어서, 내부 프라이머를 수득된 서열로부터 디자인하여 전체 pgi 유전자를 추정한다. 내부 프라이머의 서열은 다음과 같다:

내부 프라이머 1: GGA AAC AGG GGA GCC GTC

내부 프라이머 2: TGC TGA GAT ACC AGC GGT

이어서 수득한 서열을 Apple Macintosh 컴퓨터 상에서 DNA Strider 프로그램[참조: Marck, (1988). Nucleic Acids Research 16: 1829-1836] 버전 1.0을 사용하여 분석한다. 이 프로그램으로 제한 영역 사용, 개방 판독 프레임 분석및 코돈 사용 측정과 같은 분석을 수행할 수 있다. 수득된 DNA 서열과 EMBL과 Genbank 데이터베이스 내의 DNA 서열 사이의 조사를 BLAST 프로그램[참조: Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Reserach, 25: 3389-3402]을 사용하여 수행한다. DNA와 단백질 서열을 Clustal V 및 Clustal W 프로그램[참조: Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 238-244]을 사용하여 배열시킨다.

이렇게 하여 수득한 서열이 서열 확인번호 제1번에 나타나 있다. 수득된 뉴클레오타이드 서열의 분석에 의하면 1650개 염기 쌍의 개방 판독 프레임이 나타나고, 이를 pgi 유전자로서 표시한다. 이것은 서열 확인번호 제2번에 나타낸 550개 아미노산의 단백질을 암호화한다.

실시예 5

pgi 유전자의 통합 돌연변이 유발을 위한 통합 벡터의 제조

주형으로서 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019로부터 분리된 게놈 DNA[참조: Heery and Dunican, (1993) Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799]를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 pgi 유전자의 내부 단편을 증폭시킨다. 사용한 pgi 프라이머는 다음과 같다:

정방향 프라이머: ATG GAR WCC AAY GGH AA

역방향 프라이머: YTC CAC GCC CCA YTG RTC

(여기서, R=A+G; Y=C+T; W=A+T; H=A+T+C).

PCR 파라미터는 다음과 같다: 35주기

94℃에서 1분

47℃에서 1분

72℃에서 30초

MgCl₂1.5mM

DNA 주형 약 150 내지 200ng.

숙주로서 균주 E. 콜라이 JM109[참조: Yanisch-Perron et al., 1985. Gene, 33: 103-119]를 사용하여, Promega Corp.(Promega UK, Southampton.)로부터 공급된 시판중인 pGEM-T 벡터로 수득된 PCR 생성물을 클로닝시킨다. PCR 생성물의 서열은 서열 확인번호 제3번으로서 나타나 있다. 이어서, 클로닝된 삽입체를 EcoRI 단편으로서 절단하고 EcoRI로 예비처리한 플라스미드 pBGS8[참조: Spratt et al., Gene 41: 337-342(1986)]에 연결시킨다. 사용된 제한 효소는 Boehringer Mannheim UK Ltd.(Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK.)로부터 구입하고 제조업자의 지시에 따라 사용한다. 이어서, E. 콜라이 JM109를 당해 연결 혼합물을 사용하여 형질전환시키고 전기전공 형질전환체(electrotransformant)를 각각 1mM, 0.02% 및 50mg/ℓ 농도의 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드), XGAL (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-갈락토피라노시드) 및 카나마이신으로 보충된 루리아(Luria) 한천 상에서 선택한다. 한천 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 배양한다. EcoRI, BamHI 및 SalI를 사용하는 제한 효소 분석에 의해 특정화된 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 분리하고 pMC1로 나타낸다(도 4).

플라스미드 pMC1은 부다페스트 조약에 따라 DSM 12969로서 도이췌 잠룽 퓌르 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(DSMZ, Braunschweig, Germany)에 E. 콜라이 균주 DH5α/pMC1 형태로 기탁되었다.

실시예 6

라이신 생산균주 DSM 5715 중의 pgi 유전자의 통합 돌연변이 발생

실시예 5에 언급된 벡터 pMC1을 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715에서 타우치(Tauch) 등의 전기천공법[참조: FEMS Microbiology Letters, 123: 343-347 (1994)]으로 전기천공시킨다. 균주 DSM 5715는 AEC-내성 라이신 생산균주이다. 벡터 pMC1은 DSM5715에서 독립적으로 복제될 수 없고, 이것이 DSM 5715의 염색체 속으로 통합되기만 하면 세포 내에 유지된다. 염색체 속으로 통합된 pMC1을 갖는 클론의 선택은 카나마이신 15mg/ℓ로 보충된 LB 한천 상에서 전기천공 배치를 플레이팅함으로써 수행된다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 통합을 검출하기 위해, 내부 pgi 단편(실시예 5)을 Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim, Germany, 1993)의 "The Dig System Users Guide for Filter Hybridization" 방법에 따라 Dig hybridization kit(제조사: Boehringer Mannheim)로 표지시킨다. 형질전환체의 염색체 DNA를 아이크만스(Eikmanns) 등의 방법[참조: Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]으로 분리하고 각각의 경우 제한 효소 SalI, SacI 및 HindIII으로 절단한다. 형성된 단편을 아가로스 겔 전기영동법으로분리하고 Dig hybridization kit(제조사: Boehringer Mannheim)를 사용하여 68℃에서 하이브리드화한다. 이렇게 하여, 플라스미드 pMC1을 균주 DSM5715의 염색체 pgi 유전자 내에 삽입한다. 이 균주를 DSM5715::pMC1이라고 지칭한다.

실시예 7

pgi 유전자를 제거하는 동시에 zwf 유전자를 과발현시키는 경우 라이신 제조에 대한 영향

7.1 균주 DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715::pMC1에 실시예 1.2에서 언급된 벡터 pEC-T18mob2zwf를 타우치 등의 전기천공법[참조: FEMS Microbiology Letters, 123: 343-347 (1994)]으로 전기천공시킨다. 플라스미드 운반 세포의 선택은 카나마이신 15mg/ℓ 및 테트라사이클린 5mg/ℓ로 보충된 LB 한천 상에서 전기천공 배치를 플레이팅함으로써 수행된다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]. 염색체 DNA를 통상적인 방법[참조: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]으로 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 KpnI 및 SalI로 처리한 후 아가로스 겔 전기영동법에 의해 검사한다. 이 균주를 DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf라고 지칭한다.

7.2 라이신의 제조

실시예 7.1에서 수득한 C. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf를 라이신 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양물 상등액 중의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 먼저 균주를 상응하는 항생제를 포함하는 한천 플레이트(테트라사이클린(5mg/ℓ) 및 카나마이신(25mg/ℓ)을 포함하는 브레인-허트 한천) 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 항생제에 대한 이들의 내성에 따라 비교 균주의 배양물을 보충한다. 이 한천 플레이트 배양물로부터 시작하여 예비배양물을 씨딩한다(100㎖ 삼각 플라스크 속의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII를 예비배양용 배지로서 사용한다.

배지 Cg III

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-이스트 추출물 10g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 2%(w/v)

pH는 7.4로 한다.

여기에 테트라사이클린(5mg/ℓ) 및 카나마이신(5mg/ℓ)을 가한다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 주 배양물을 당해 예비배양물로부터 씨딩한다. 배지 MM을 주 배양용으로 사용한다.

배지 MM

CSL (옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄·7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂·2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄·7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄·H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴 (멸균-여과한 것) 0.3mg/ℓ

티아민·HCl (멸균-여과한 것) 0.2mg/ℓ

L-루신 (멸균-여과한 것) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

배플달린 100㎖ 삼각 플라스크 속의 10㎖ 용적으로 배양한다. 테트라사이클린(5mg/ℓ) 및 카나마이신(25mg/ℓ)을 가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양한다.

72시간 후, OD 값을 Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)으로 660nm의 파장에서 측정한다. 생성된 라이신의 양을 이온교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 사용하는 후-컬럼 유도체화에 의해 Eppendorf-BioTronik(Hamburg, Germany)의 아미노산 분석기를 사용하여 측정한다.

실험 결과는 표 3에 나타내었다.

균주	OD	L-라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715	7.3	14.3
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7.1	14.6
DSM5715::pMC1/pEC-T18mob2zwf	10.4	15.2

실시예 8

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 게놈 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 염색체 DNA를 타우치 등의 문헌[참조: Plasmid 33: 168-179, 1995]에 기재된 바와 같이 분리하고 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02)를 사용하여 부분 절단한다. 새우 알칼리성 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)를 사용하여 DNA 단편을 탈인산화시킨다.Stratagene(La Jolla, USA, Product Description SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301)로부터 수득된 코스미드 벡터 SuperCos1[참조: Wahl et al. (1987) Prodeedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02)로 절단하고 마찬가지로 새우 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04)로 절단한다. 이렇게 처리한 코스미드 DNA를 처리된 ATCC13032 DNA와 혼합하고 배치를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이어서 연결 혼합물을 Gigapack II XL Packing Extracts(Stratagene, La Jolla, USA, Product Descripton Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217)를 사용하여 파아지에 충전시킨다. E. 콜라이 균주 NM554[참조: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16: 1563-1575]를 감염시키기 위해, 세포를 10mM MgSO₄에 용해시키고 파아지 현탁액 분획량과 혼합한다. 코스미드 라이브러리의 감염 및 적정은 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor]에 기재된 바와 같이 수행하고 세포를 암피실린 100㎍/㎖가 첨가된 LB 한천[참조: Lennox, Virology, 1:190(1995)] 상에서 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 재조합 개별 클론을 선택한다.

실시예 9

poxB 유전자의 분리 및 서열화

개별 군체의 코스미드 DNA(실시예 7)를 제조업자의 지시에 따라 QIAprep Spin Miniprep Kit(제품 번호 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 분리하고 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, 제품 번호. 27-0913-02)를 사용하여 부분 절단한다. 새우 알칼리성 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, 제품 번호. 1758250)를 사용하여 DNA 단편을 탈인산화시킨다. 겔 전기영동법에 의해 분리한 후, QiaExII Gel Extraction Kit(제품 번호 20021, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 1500 내지 2000bp의 크기 범위의 코스미드 단편을 분리한다. Invitrogen(Groningen, Holland, Product Description Zero Background Cloning Kit, 제품 번호 K2500-01)으로부터 수득한 서열화 벡터 pZero-1의 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, 제품 번호. 27-0868-04)로 절단한다. 서열화 벡터 pZero-1 내의 코스미드 단편의 연결은 샘브룩 등의 문헌[참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour]에 기재된 바와 같이 수행하고 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 배양한다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 E. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조: Grant, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A, 87: 4645-4649]에 전기천공[참조: Tauch et al., FEMS Microbiology Letters, 123: 343-7 (1994)]시키고 제오신 50㎍/㎖를 포함하는 LB 한천[참조: Lennox, Virology, 1:190(1995)] 상에서 플레이팅한다. 재조합 클론의 플라스미드 제조를 Biorobot 9600(제품 번호 900200, Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 수행한다. 침머만(Zimmermann) 등 [참조: Nucleic Acids Research, 18:1067, 1990]에 따라 변경시킨 생어(Sanger) 등의 디데옥시 쇄-정지방법[참조: Proceedings of the National Academies of Sciences USA, 74:5463-5467 (1977)]에 의해 서열화시킨다. PE Applied Biosystems로부터 구입한 "RP dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit"(제품 번호 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. PE Applied Biosystems(Weiterstadt, Germany)로부터 구입한 "ABI Prism 377" 시퀀서를 사용하여 "Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide" 겔(29:1)(제품 번호 A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany)에서 겔 전기영동법에 의한 분리 및 서열화 반응의 분석을 수행한다.

이어서, 수득된 원래의 서열 데이터를 Staden 프로그램 팩키지[참조: Nucleic Acids Research, 14:217-231(1986)]버젼 97-0을 사용하여 가공한다. pZero1 유도체의 개별 서열을 연속 콘티그(continuous contig)에 조립한다. 컴퓨터-보조된 암호화 영역 분석을 XNIP 프로그램으로 준비한다[참조: Staden, Nucleic Acids Research, 14:217-231 (1986)]. "National Center for Biotechnology Information"(NCBI, Bethesda, MD. USA)의 충분하지 않은 데이터뱅크에 대해 "BLAST search program"[참조: Altschul et al., Nucleic Acids Reserach, 25:3389-3402(1997)]을 사용하여 추가로 분석한다.

수득된 뉴클레오타이드 서열을 서열 확인번호 제4번으로 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열 분석에 의하면 1737개의 염기 쌍의 개방 판독 프레임이 나타나며, 이를 poxB 유전자라고 지칭한다. poxB 유전자는 579개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 암호화한다(서열 확인번호 제5번).

실시예 10

poxB 유전자의 통합 돌연변이 유발을 위한 통합 벡터의 제조

아이크만스 등의 방법[참조: Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]으로 균주 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 분리한다. 실시예 8로부터 C. 글루타미쿰에 대해 공지된 poxB 유전자의 서열을 근거로 하여 폴리머라제 쇄 반응을 위해 아래의 올리고뉴클레오타이드를 선택한다:

poxBint1:

5' TGC GAG ATG GTG AAT GGT GG 3'

poxBint2:

5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3'

제시된 프라이머는 MWG Biotech(Ebersberg, Germany)에 의해 합성하고, Pwo-Polymerase(제조사: Boehringer)를 사용하여 이니스(Innis) 등의 표준 PCR 방법[참조: PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press]으로 PCR 반응시킨다. 폴리머라제 쇄 반응을 이용하여 크기가 약 0.9kb인 DNA 단편을 분리하며, 이는 poxB 유전자의 내부 단편을 운반하고 서열 확인번호 제6번으로 나타낸다.

증폭된 DNA 단편을 Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA, USA; 목록 번호 K4500-01)으로부터 구입한 TPOP TA Cloning Kit를 사용하여 벡터 pCR2.1-TOPO[참조: Mead et al. (1991) Bio/Techology 9:657-663]에 연결시킨다. 이어서, E. 콜라이 균주 DH5α를 연결 배치를 사용하여 전기천공시킨다[참조: Hanahan, In: DNA Cloning, A practical approach. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985] 플라스미드 운반 세포의 선택은 카나마이신 25mg/ℓ로 보충된 LB 한천[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 상에서 형질전환 배치를 플레이팅시켜 수행한다. 플라스미드 DNA를 QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen로부터 구입)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 EcoRI에 의한 제한 및 이어서 아가로스 겔 전기영동법에 의해 검사한다(0.8%). 이 플라스미드를 pCR2.1poxBint라고 지칭한다(도 5).

플라스미드 pCR2.1poxBint는 부다페스트 조약에 따라 도이췌 잠룽 퓌르 미크로오르가니즈멘 운트 첼쿨투렌(DSMZ=German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Braunschweig, Germany)에 DSM 13114로서 균주 E. 콜라이 DH5α/pCR2.1poxBint 형태로 기탁되었다.

실시예 11

라이신 생산균주 DSM 5715 중의 poxB 유전자의 통합 돌연변이 발생

실시예 10에 언급된 벡터 pCR2.1poxBint를 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 5715에서 타우치 등의 전기천공법[참조: FEMS Microbiology Letters, 123: 343-347 (1994)]으로 전기천공시킨다. 균주 DSM 5715는 AEC-내성 라이신 생산균주이다. 벡터 pCR2.1poxBint은 DSM5715에서 독립적으로 복제될 수 없고, 이것이 DSM 5715의 염색체 속으로 통합되기만 하면 세포 내에 유지된다. 염색체 속으로 통합된 pCR2.1poxBint을 갖는 클론의 선택은 카나마이신 15mg/ℓ로 보충된 LB 한천 상에서 전기천공 배치를 플레이팅함으로써 수행된다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]. 통합을 검출하기 위해, poxBint 단편을 Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim, Germany, 1993)의 "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" 방법에 따라 Dig hybridization kit(제조사: Boehringer Mannheim)로 표지시킨다. 잠재적 통합체(integrant)의 염색체 DNA를 아이크만스(Eikmanns) 등의 방법[참조: Microbiology 140: 1817-1828 (1994)]으로 분리하고 각각의 경우 제한 효소 SalI, SacI 및 HindIII으로 절단한다. 형성된 단편을 아가로스 겔 전기영동법으로 분리하고 Dig hybridization kit(제조사: Boehringer Mannheim)를 사용하여 68℃에서 하이브리드화한다. 이렇게 하여, 실시예 9에 언급된 플라스미드 pCR2.1poxBint을 DSM5715의 염색체 poxB 유전자 내에 삽입한다. 이 균주를 DSM5715::pCR2.1poxBint이라고 지칭한다.

실시예 12

poxB 유전자를 동시 제거하는 동시에 zwf 유전자를 과발현시키는 경우 라이신 제조에 대한 영향

12.1 균주 DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf의 제조

균주 DSM5715::pCR2.1poxBint를 리블(Liebl) 등의 전기천공법[참조: FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]을 사용하여 플라스미드 pEC-T18mob2zwf로 형질전환시킨다. 형질전환체의 선택은 카나마이신 25mg/ℓ 및 테트라사이클린 5mg/ℓ로 보충된, 18.5g/ℓ의 브레인-허트 육수 배지, 0.5M의 소르비톨, 5g/ℓ의 박토-트립톤, 2.5g/ℓ의 박토-이스트 추출물, 5g/ℓ의 NaCl 및 18g/ℓ의 박토-아가를 포함하는 LB 한천 상에서 수행한다. 33℃에서 2시간 동안 배양시킨다.

염색체 DNA를 각각의 경우 통상적인 방법[참조: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927]으로 형질전환체로부터 분리하고 제한 엔도뉴클레아제 XbaI 및 KpnI로 절단한 후, 플라스미드를 아가로스 겔 전기영통법에 의해 검사한다. 이렇게 하여 수득된 균주를 DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf라고 지칭한다.

12.2 L-라이신의 제조

실시예 12.1에서 수득한 C. 글루타미쿰 균주 DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf를 라이신 제조에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양물 상등액 중의라이신 함량을 측정한다.

이를 위해, 먼저 균주를 상응하는 항생제를 포함하는 한천 플레이트(테트라사이클린(5mg/ℓ) 및 카나마이신(25mg/ℓ)을 포함하는 브레인-허트 한천) 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 항생제에 대한 이들의 내성에 따라 비교 균주를 보충한다. 이 한천 플레이트 배양물로부터 시작하여 예비배양물을 씨딩한다(100㎖ 삼각 플라스크 속의 배지 10㎖). 완전 배지 CgIII를 예비배양용 배지로서 사용한다.

배지 Cg III

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-이스트 추출물 10g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 2%(w/v)

pH는 7.4로 한다.

여기에 테트라사이클린(5mg/ℓ) 및 카나마이신(25mg/ℓ)을 가한다. 예비배양물을 진탕기에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 주 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 주 배양물을 당해 예비배양물로부터 씨딩한다. 배지 MM을 주 배양용으로 사용한다.

배지 MM

CSL (옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS (모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코스 (별도로 오토클레이브 처리한 것) 58g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄·7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂·2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄·7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄·H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴 (멸균-여과한 것) 0.3mg/ℓ

티아민·HCl (멸균-여과한 것) 0.2mg/ℓ

L-루신 (멸균-여과한 것) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

72시간 후, OD 값을 Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)으로660nm의 파장에서 측정한다. 생성된 트레오닌의 양을 이온교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 사용하는 후-컬럼 유도체화에 의해 아미노산 분석기[제조사: Eppendorf-BioTronik(Hamburg, Germany)]를 사용하여 측정한다.

실험 결과는 표 4에 나타내었다.

균주	OD	L-라이신 HCl(g/ℓ)
DSM5715	10.8	16.0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	8.3	17.1
DSM5715::pCR2.1poxBint	7.1	16.7
DSM5715::pCR2.1poxBint/pEC-T18mob2zwf	7.8	17.7

Claims

적어도 zwf 유전자가 증폭된 목적하는 L-아미노산을 생성시키는 세균을 발효시키는 단계(a),

배지 또는 세균 세포 내의 L-아미노산을 농축시키는 단계(b) 및

생성된 L-아미노산을 분리하는 단계(c)를 포함하여, 코리네형(coryneform) 세균의 발효에 의해 L-아미노산을 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 추가의 유전자가 추가로 증폭된, 특히 과발현된 세균이 사용되는 방법.
제1항에 있어서, L-트레오닌, L-라이신 또는 L-트립토판을 제조하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
제3항에 있어서, L-라이신을 제조하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
제2항에 있어서, 특히 L-라이신을 이미 생성시키는 코리네형 미생물에서,

5.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

5.2 피드백 저항성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

5.3 글리세롤알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap유전자,

5.4 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

5.5 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자,

5.6 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자,

5.7 라이신 수송(export)을 암호화하는 lysE 유전자,

5.8 zwal 유전자 및

5.9 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증폭되거나 과발현되는, L-라이신을 발효 제조하는 방법.
제2항에 있어서, 특히 L-트레오닌을 이미 생성시키는 코리네형 미생물에서,

6.1 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자 또는 "피드백 저항성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립유전자,

6.2 글리세롤알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

6.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

6.4 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자,

6.5 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자,

6.6 글루코스 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

6.7 트레오닌 수송을 암호화하는 thrE 유전자,

6.8 zwal 유전자 및

6.9 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증폭되는, 특히 과발현되는, L-트레오닌을 발효 제조하는 방법.
제2항에 있어서,

7.1 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

7.2 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자,

7.3 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자 및

7.4 zwa2 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 세균이 발효되는, L-아미노산, 특히 L-라이신 또는 L-트레오닌을 제조하는 방법.
제2항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 증폭을 수행하기 위해, 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열의 카피 수를 이들 유전자 또는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 사용하여 미생물을 형질전환시킴으로써 증가시키는 방법.
도 2에 나타낸 E. 콜라이 K-12 DH5α 내의 수탁번호 DSM13244로 기탁된 플라스미드 벡터 pEC-T18mob2.
zwf 유전자를 추가로 함유하는, 제9항에서 청구한 플라스미드 벡터를 도입시켜 형질전환된 코리네형 미생물, 특히 코리네박테리움(Corynebacterium) 속.