SK16532001A3

SK16532001A3 - Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou zosilnenia génu zwf

Info

Publication number: SK16532001A3
Application number: SK1653-2001A
Authority: SK
Inventors: Kevin Burke; Hermann Sahm; Lothar Eggeling; Bernd Moritz; L. Kieran - Dunican (Zosnul�); Ashling Mccormack; Cliona Stapelton; Bettina M�Ckel; Georg Thierbach
Original assignee: Degussa Ag; Forschungszentrum J�Lich Gmbh; National University Of Ireland
Priority date: 2000-03-20
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2002-07-02
Also published as: EP1179073B1; ATE351908T1; CA2374261C; SK287997B6; BR0011283A; CN1353758A; CN101029310A; KR20020012578A; AU6821900A; WO2001070995A1; EP1179073A1; PL358914A1; CN101029310B; MX244419B; KR100715641B1; DE60033026T2; PL205611B1; DE60033026D1; MXPA01011644A; CA2374261A1

Description

Oblasť techniky

I

Vynález sa týka spôsobu fermentačnej prípravy L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, L-treonínu a L-tryptofánu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén zwf.

Doterajší stav techniky

L-Aminokyseliny sa používajú vo výžive zvierat, v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle.

Je známe, že aminokyseliny sa pripravujú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli ich veľkému významu sa stále pracuje na zlepšení týchto preparačných spôsobov. Zlepšenia spôsobov sa ,môžu týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom, alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných produkčných vlastností samotného mikroorganizmu.

Na zlepšenie produkčných vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získavajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analócj treonínu kyselina a-amino-p-hydroxyvalérová (AHV), alebo sú auxotrofné vzhladom na regulačné významné metabolity a produkujú L-aminokyseliny, ako napríklad L-treonín.

Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na zlepšenie kmeňa Corynebacterium glutamicum produkujúceho L-aminokyseliny.

¹ I

Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové zlepšené postupy fermentačnej prípravy L-aminokyselín pomocou koryneformných baktérií.

L-Aminokyseliny sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle, v potravinárskom priemysle a najmä vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov prípravy týchto aminokyselín.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín najmä L-lyzínu, L-treonínu a L-tryptofánu, použitím, koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje, najmä zvýšene exprimuje nukleotidová sekvencia kódujúca proteín Zwf (gén zwf) .

Použité kmene prednostne už produkujú L-aminokyseliny pred zosilnením génu zwf.

Prednostné uskutočnenia sa nachádzajú v patentových nárokoch.

Pojem „zosilnenie opisuje v tejto súvislosti.zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov (proteínov) v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, napríklad zvýšením počtu kópií génu alebo génov, použitím silného promótora alebo použitím génu (proteínu), ktorý kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.

Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-aminokyseliny z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Jedná sa o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.

Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu

Corynebacterium glutamicum ATCC13032,

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 a Brevibacterium divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty produkujúce L-aminokyseliny, ako napríklad kmene produkujúce L-treonín

Corynebacterium glutamicum ATCG21649,

Brevibacterium flavum BB69,

Brevibacterium flavum DSM5399,

Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269,

Brevibacterium lactofermentum TBB-10 a napríklad kmene produkujúce L-izoleucín

Corynebacterium glutamicum ATCC 14309,

Corynebacterium glutamicum ATCC 14310,

Corynebacterium glutamicum ATCC 14311,

Corynebacterium glutamicum ATCC 15168,

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 a napríklad kmene produkujúce L-tryptofán

Corynebacterium glutamicum ATCC21850 a

Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901), a napríklad kmene produkujúce L-lyzín

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,

Brevibacterium flavum FERM-P 1708,

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464,

Corynebacterium glutamicum ATCC13032,

Corynebacterium glutamicum DM58-1,

Corynebacterium glutamicum DSM12866.

Zistilo sa, že koryneformná baktérie produkujú L-aminokyseliny, najmä L-lyzín, L-treonín a L-tryptofán, zlepšeným spôsobom po zvýšenej expresii génu zwf, ktorý kóduje proteín Zwf.

Ďalej sa môže použiť alela génu zwf, ktorá je výsledkom degenerácie genetického kódu alebo je spôsobená mutáciou neutrálnej funkcie so zmyslom.

JP-A-09224661 zverejňuje nukleotidovú sekvenciu génu pre glukóza-6-fosfátdehydrogenázu, nazývaného zwf, z Brevibacterium flavum MJ-223 (FERM-BP-1497). JP-A-09224661 opisuje Nkoncovú aminokyselinovú sekvenciu polypeptidu Zwf ako Met Val íle Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu.

Avšak nebolo možné potvrdiť to. Namiesto toho sa našla nasledovná N-koncová aminokyselinová sekvencia: Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp. Valylový zvyšok v N-polohe sa môže odštiepiť v súvislosti s posttranslačnou modifikáciou a potom sa získa N-koncová aminokyselinová sekvencia Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp.

Na dosiahnutie zosilnenia (t.j. zvýšenej expresie) sa napríklad zvýši počet kópií príslušných génov alebo sa mutuje promótorová a regulačná oblasť alebo miesto pre naviazanie ribozómov, ktoré sa nachádza v protismere štruktúrneho génu. Rovnakým spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré sá vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovatelných promótorov možno dodatočne zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-aminokyseliny. Opatreniami na predĺženie životnosti m-RNA sa expresia taktiež zlepšuje.

Ďalej sa enzýmová aktivita taktiež zvyšuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópií, alebo môžu byť v chromozóme integrované a amplifikované. Ďalej sa môže alternatívne dosiahnuť zvýšená expresia príslušných génov zmenou zloženia médií a zmenou postupu kultivácie.

Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrpro et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), v európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v US patente 4,601,893, v práci Schwarzer and Piihler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)), Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) , v patentovej prihláške WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), v japonskom zverejnenom spise JP-A-10-229891, v práci Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie.

Proteín Zwf sa napríklad zvýšene exprimoval pomocou plazmidu. Na to sa použil kyvadlový vektor pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum znázornený na obrázku 1. Po vložení génu zwf do štiepneho miesta KpnI/Sall vektora pEC-T18mob2 sa vytvoril plazmid pEC-T18mob2zwf znázornený na obrázku 2.

Taktiež sa môžu použiť iné plazmidové' vektory, ktoré sú schopné replíkácie v C. glutamicum, ako je napríklad pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) alebo pZ8-l (EP-B- 0 375 889) .

Prídavné môže byť pre produkciu L-aminokyselín výhodné okrem génu zwf zosilniť jeden alebo viac enzýmov príslušnej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky, pentózafosfátovej dráhy alebo prenosu aminokyselín.

Teda napríklad sa môže na produkciu L-treonínu súčasne zosilniť, najmä zvýšene exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) alebo alelu hom^dr kódujúcu homoseríndehydrogenázu rezistentnú na spätnú väzbu (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 174:

6076-6086 (1992)), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Peters-Wendish et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)), • gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998) ) , • gén tkt kódujúci transketolázu (prírastkové číslo AB023377, European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Nemecko), • gén gnd kódujúci 6-fosfoglukonátdehydrogenázu (JP-A-9224662), • gén thrE kódujúci prenos treonínu (DE 199 41 478.5; DSM 12840), • gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • gén eno kódujúci enolázu (DE: 199 41 478.5).

Teda napríklad najmä na prípravu L-lyzínu sa môže súčasne zosilniť, prednostne zvýšene exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu (Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • gén gap kódujúci glyceraldehyď-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns et al., (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (Eikmanns et al., (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén tkt kódujúci transketolázu (prírastkové číslo AB023377, European Molecular Biologies Laboratories databank (EMBL, Heidelberg, Nemecko), « • súčasne gén gnd kódujúci 6-fosfoglukonátdehydrogenázu (JP-A-9-224662), • súčasne gén lysE kódujúci prenos lyzínu (DE-A-195 48 222), • súčasne gén zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • gén eno kódujúci enolázu (DE: 199 47 791.4).

Ďalej môže byť výhodné pre produkciu L-aminokyselín navyše k zosilneniu génu zwf súčasne zoslabiť jeden alebo viac génov zvolených zo súboru zahŕňajúceho:

• gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE

199 50 409.1, DSM 13047), • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478, DSM 12969), • gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu (DE 199 51 975.7, DSM 13114), • gén zwa2 (DE 199 59 327.2; DSM 13113). ;

Ďalej môže byť pre produkciu aminokyselín okrem zvýšenej expresie proteínu Zwf výhodné vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn,

Veľká Británia, 1982).

Mikroorganizmy vytvorené podľa vynálezu sa môžu na účely produkcie L-aminokyselín kultivovať kontinuálnym spôsobom alebo spôsobmi diskontinuálnymi, či už vsádzkovou (batoh) kultiváciou alebo vsádzkovou kultiváciou s prítokom živín (fed batch) alebo vsádzkovou kultiváciou s opakovaným prídavkom živín (repeated fed batch). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Biotechnológia 1. Úvod do biotechnológie, nakladateľstvo Gustáv Fischer, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici Storhas: Bioreaktoren und Periphere Einrichtungen (Bioreaktory a periférne zariadenia, nakladateľstvo Vieweg Verlag, Braunschweig'/Wiesbaden, 1994) ).

Použité kultivačné médium musí patričným spôsobom vyhovovať nárokom príslušného mikroorganizmu. Opisy rôznych známych kultivačných médií pre mikroorganizmy sú uvedené príručke Manual of Methods for General Bacteriology (Metodický manuál pre všeobecnú baktériológiu) vydaný Americkou bakteriologickou spoločnosťou (American Society for Bacteriology) , Washington D.C., USA, 1981. Ako zdroje uhlíka sa môžu použiť sacharidy, ako napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový tuk;

mastné kyseliny, ako napríklad kyselina palmitová, kyselina stearová a kyselina linolová, alkoholy, ako napríklad glycerol a etanol, a organické kyseliny, ako napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu použiť buď jednotlivo, alebo v zmesi. Ako zdroje dusíka sa môžu použiť organické zlúčeniny obsahujúce dusík, ako napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múčka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Tieto zdroje dusíka sa môžu použiť buď jednotlivo, alebo v zmesi. Ako zdroje fosforu možno použiť hydrogenfosforečnan alebo dihydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ktoré sú nutné na rast, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý. A napokon môže byť kultivačné médium okrem vyššie uvedených látok obohatené o esenciálne rastové látky, ako napríklad aminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu ešte pridať vhodné prekurzory. Uvedené východiskové látka sa môžu pridať do média jednorazovo na začiatku alebo vhodným spôsobom v priebehu kultivácie.

Na kontrolu pH v priebehu kultivácie sú vhodné zásadité zlúčeniny, ako napríklad hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak, alebo kyslé zlúčeniny, ako napríklad kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Penenie kultivačnej zmesi možno kontrolovať prídavkom činidiel potláčajúcich tvorbu peny, ako sú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Stabilitu plazmidov možno udržiavať prostredníctvom vhodného selekčného činidla, napríklad antibiotika. Vhodné aeróbne podmienky možno udržiavať privádzaním kyslíka alebo zmesi plynov obsahujúcej kyslík, napríklad vzduchu, do kultivačného média. Vhodná teplota na pestovanie baktérií je zvyčajne od 20 °C do 45 °C a výhodne od 25 °C do 40 °C. Čas kultivácie by mal byť taký, aby sa dosiahlo maximum tvorby aminokyselín. Toto maximum sa obvykle dosiahne v priebehu 10 až 160 hodín.

Analýza L-aminokyselín sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v práci Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) alebo sa môže uskutočňovať HPLC s reverznou fázou, ako sa opisuje v práci Lindroth et al. (Analytical Chemistry, (1979) 51: 1167-1174).

Nasledujúce mikroorganizmy boli uložené v Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Nemecká zbierka mikroorganizmov a bunkových kultúr, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy:

- Éscherichia coli K-12 DH5a/pEC-T18mob2 ako DSM 13244.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Priložené sú nasledovné obrázky:

Obrázok 1: Mapa plazmidu pEC-T18mob2

Obrázok 2: Mapa plazmidu pEC-T18mob2zwf

Obrázok 3: Mapa plazmidu pAMCl

Obrázok 4: Mapa plazmidu pMCl

Obrázok 5: Mapa plazmidu pCR2.lpoxBint

Stanovené počty párov báz sú približné hodnoty získané v súvislosti s rep'rodukovatelnosťou.

Obrázok 1 a 2:

Použité skratky majú nasledovný význam:

Tet: gén pre rezistenciu na tetracyklín

OriV: plazmidom kódovaný počiatok replikácie E.coli

RP4mob: oblasť mob na mobilizáciu plazmidu rep: plazmidom kódovaný počiatok replikácie z plazmidu pGAl z C. glutamicum per: gén na kontrolu počtu kópií z pGAl lacZ-alpha: génový fragment lacZa (N-koniec) génu pre β-galaktozidázu lacZ-alpha': 5'-koniec génového fragmentu lacZa 'lacZ-alpha': 3'-koniec génového fragmentu lacZa

Obrázok 3 a 4:

Použité skratky majú nasledovný význam:

Neo r: rezistencia na neomycín/kanamycín

ColEl ori: počiatok replikácie plazmidu ColEl

CMV: promótor cytomegalovírusu lacP: promótor laktózy pgi: gén pre fosofglukózaizomerázu lacZ: čast génu pre β-galaktozidázu

SV40 3'-pripojenie: 3'-pripojovácie miesto opičieho vírusu 40 SV40 polyA: polyadenylačné miesto opičieho vírusu 40 fl(-)ori: počiatok replikácie vláknitého fága f 1,

SV40 ori: počiatok replikácie opičieho vírusu 40 kan r: rezistencia na kanamycín pgi insert: interný fragment génu pgi ori: počiatok replikácie plazmidu pBGS8

Obrázok 5:

Použité skratky majú nasledovný význam:

ColEl:

lacZ:

f 1 ori

KmR:

ApR:

počiatok replikácie plazmidu ColEl klonovací relikt génového fragmentu lacZa počiatok replikácie fága fl rezistencia na kanamycín rezistencia na ampicilin poxBint: vnútorný fragment génu poxB

Význam skratiek pre rozličné reštrikčné enzýmy (napríklad BamHI, EcoRI atď.) sú známe z doterajšieho stavu techniky a sú zhrnuté napríklad v práci Kessler a Hóltke (Gene 47, 1-153 (1986)) alebo Roberts et al., (Nucleic Acids Research 27, 312313 (1999)).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledovné príklady bližšie vysvetľujú tento vynález. Použili sa metódy molekulovej biológie, napríklad izolácia plazmidovej DNA, spracovanie reštrikčnými enzýmami, ligácie, štandardné transformácie Escherichia coli atď. (pokiaľ nie je stanovené inak), opísané v práci Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories, USA).

Príklad 1

Expresia proteínu Zwf

1.1 Príprava plazmidu pEC-T18mob2

Kyvadlový vektor pEC-T18mob2 z E. coli - C. glutamicum sa skonštruoval podlá doterajšieho stavu techniky. Tento vektor obsahuje replikačnú oblasť rep plazmidu pGAl vrátane replikačného efektora per (US-A- 5,175,108; Nesvera,et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), gén tetA(Z) plazmidu pAGl sprostredkovávajúci rezistenciu na tetracyklín (US-A- 5,158,891; zápis do génovej banky v National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) s prírastkovým číslom AF121000), replikačnú oblasť oriV plazmidu pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quntitative Biology 43, 77-90 (1979)), génový fragment lacZa zahŕňajúci promótor lac a viacnásobné klonovacie miesto (multiple cloning site, mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101-106 (1983) a oblasť mob plazmidu RP4 (Šimon et al., (1983), Bio/Technology 1: 784-791). Skonštruovaný vektor sa transformoval do kmeňa E. coli Drf5a (Brown (ed.), Molecular Biology Labfax,

BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK 1991). Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na platne s agarom LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 5 mg/l tetracyklínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím kitu QIAprep Spin Miniprep od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a HindlII a potom elektroforézou v agarózovom géle (0,8%).

Plazmid sa nazval pEC-Tl8mob2 a je znázornený na obrázku 1. Je uložený vo forme kmeňa Escherichla coli K-12, kmeň DH5apEC-T18mob2 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) ako DSM 13244.

1.2 Príprava plazmidu pEC-Tl8mob2zwf

Najskôr sa polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) amplifikoval gén z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 prostredníctvom nasledovného oligonukleotidového priméru:

zwf smerujúci dopredu:

5'-TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3' zwf reverzný:

5'-CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3'

PCR reakcia sa uskutočňovala v 30 cykloch v prítomnosti 200 μΜ deoxynukleotid-trifosfátov (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) vždy s 1 μΜ príslušného oligonukleotidu, 100 ng chromozómovej

DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 objemu.10násobného reakčného tlmivého roztoku a 2,6 jednotiek tepelne stabilnej zmesi Taq-/Pwo-DNA-polymerázy (Expand High Fidelity PCR System od firmy Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko) v termocykléri (Thermocycler PTC-100, MJ Research', Inc., Watertown, USA) za nasledovných podmienok: 30 sekúnd pri 94 ’C, 1 minútu pri 64 °C a 3 minúty pri 68 °C.

Amplifikovaný fragment s veľkosťou približne 1,8 kb sa potom následne ligoval pomocou ligačného kitu SureClone (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko) podľa údajov výrobcu do štiepneho miesta Smal vektora pUC18. Kmeň E. coli DH5a mcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of he United States of America USA (1990) 87: 46454649) sa transformoval s celkovou ligačnou zmesou. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na karbenicilín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 pg/mL karbenicilínu. Zo 7 transformantov sa pripravili plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúšali na prítomnosť 1,8 kb PCR-fragmentu ako inzertu. Takto vzniknutý rekombinantný plazmid sa ďalej označoval ako pUCISzwf.

Na konštrukciu pEC-T18mob2zwf sa pUC18zwf štiepil pomocou KpnI a Sali a produkt sa izoloval pomocou extrakČného kitu NucleoSpin od firmy Macherey-Nagel (Duren, Nemecko) podľa návodu výrobcu a potom ligoval s vektorom pEC-T18m'ob2, ktorý sa tiež štiepil pomocou KpnI a Sali a defosforyloval. Kmeň E. coli DH5amcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) sa transformoval celkovou ligfačnou zmesou. Transformanty sa identifikovali na základe svojej rezistencie na tetracyklín na agarových platniach LB obsahujúcich 50 pg/mL tetracyklínu. Z 12 transformantov sa pripravili plazmidy a reštrikčnou analýzou sa preskúšali na prítomnosť 1,8 kb PCRfragmentu ako inzertu. Takto sa izoloval jeden z rekombinantných plazmidov a nazval pEC-T18mob2zwf (obrázok 2).

Príklad 2

Príprava producenta aminokyseliny pomocou zosilneného génu zwf

Kmeň Corynebacterium glutamicum DSM5715 produkujúci L-lyzín je opísaný v EP-B-0435132 a kmeň Brevibacterium flavum DSM5399 produkujúci L-treonín je opísaný v EP-B-0385940.

Obidva kmene sú uložené v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa

Budapeštianskej zmluvy.

2.1 Príprava kmeňov DSM5715/pEC-T18mob2zwf a DSM5399/pECT18mob2zwf

Kmene DSM5715 a DSM5399 sa transformovali s plazmidom pEC-T18mob2zwf použitím elektroporačnej metódy opísanej v práci Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989)). Selekcia transformantov sa uskutočňovala na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bactokvasnicového extraktu, 5 g/1 NaCI a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 °C.

Plazmidová DNA sa izolovala vo všetkých prípadoch z transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnými endonukleázami Xbal a KpnI a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získané kmene sa nazvali DSM5715/pEC-T18mob2zwf a DSM5399/pEC-T18mob2zwf.

2.2 Príprava L-treonínu

Kmeň C. glutamicum DSM5399/pEC-T18mob2zwf získaný v príklade 2.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu treonínu a obsah treonínu sa stanovoval v kultivačnom super'natante.

Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/l)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predpestovanú kultúru bolo úplné médium CglII.

Médium Cg III

NaCl

Bacto-peptón

Bacto-kvasnicový extrakt Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.

2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem)

K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/l). Predpestovaná kultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávač.ke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM: ¹

CSL (kukuričná maceračná tekutina) 5 g/1

MOPS (kyselina morfolinopropán- 20 g/1 sulfónová)

Glukóza (oddelene autoklávovaná) 50 g/1 (NH₄)₂SO₄ 25 g/1

KH₂PO₄ 0,1 g/1

MgSO₄.7H₂O	1,0 g/1
CaCl₂.2H₂O	10 mg/1
FeSO₄.7H₂O	10 mg/1
MnSO₄.H₂O	5,0 mg/1
Biotín (sterilné filtrovaný)	0,3 mg/1
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný)	0,2 mg/1
L-Leucín (sterilné filtrovaný)	0,1 g/1
CaCO₃	25 g/1

CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO3.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo treonínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizácicu na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou. detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 1 Tabulka 1

Kmeň	Optická hustota	L-Treonín.HCI g/1
DSM5399	12,3	0,74
DSM5399/pEC-T18mob2zwf	10,2	1,0

2.3 Príprava L-lyzínu

Kmeň Corynebacterium glutamicum DSM5715/pEC-T18mob2zwf získaný v príklade 2.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 , °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1)). Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predpestovanú kultúru bolo úplné médium CglII.

Médium Cg III

NaCl

Bacto-peptón

2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem)

K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1). Predpestovaná kultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predpestovanou kultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (kukuričná maceračná tekutina) 5 g/1

MOPS (kyselina morfolinopropán- 20 g/1 sulfónová)

Glukóza (oddelene autoklávovaná) g/1

(NH₄)₂SO₄	25 g/1
kh₂po₄	0,1 g/1
MgSO₄.7H₂O	1,0 g/1
CaCl₂.2H₂O	10 mg/l
FeSO₄.7H₂O	10 mg/l
MnSO₄.H₂O	5,0 mg/l
Biotín (sterilné filtrovaný)	0,3 mg/l
Tiamín.HCI (sterilné filtrovaný)	0,2 mg/l
L-Leucín (sterilné filtrovaný)	0,1 g/1
CaCO₃	25 g/1

CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaCO₃.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objeme v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/l). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-Bioľronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 2.

Tabulka 2

Kmeň	Optická hustota	L-Lyzín.HCI g/1
DSM5715	10,8	16,0. ·
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7,2	17,1

Príklad 3

Konštrukcia génovej banky kmeňa Corynebacterium glutamicum AS019

Génová banka kmeňa Corynebacterium glutamicum AS019 (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)) sa skonštruovala použitím systému λ Zap Express™ (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), ako opisuje O'Donohue (O'Donohue, M. (1997), The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway). Kit λ Zap Express™ sa zakúpil od firmy Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines Rd., La Jolla, California 920037) a použil podľa návodu výrobcu. AS019-DNA sa rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3A a ligovala s vetvami λ Zap Express™ spracovanými BamHI a defosforylovanými.

Príklad 4

Klonovanie a sekvenovanie génu pgi

1. Klonovanie

Kmeň Escherichia coli DF1311 nesúci mutácie v génoch pgi a pgi, ako opisuje Kupor a Fraenkel (Journal of Bacteriology 100: 1296-1301 (1969)), sa transformoval s približne 500 ng plazmidovou knižnicou AS019 λ Zap Express™ opísanou v príklade

3. Selekcia transformantov sa uskutočnila na minimálnom médiu M9 (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratories, USA) obsahujúcom kanamycín v koncentrácii 50 mg/1 a inkubácia sa uskutočňovala 48 hodín pri 37 °C. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu podlá Birnboima a Dolyho (Nucleic- Acids Research 7: 1513-1523 (1979)) a označila ako pAMCl (obrázok 3).

2. Sekvenovanie

Na sekvenčnú analýzu klonovaného inzertu pAMCl sa použila metóda od Sangera et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463-5467 (1977)) použitím primérov odlišne označených farebnou fluorescenčnou značkou. Uskutočnila sa použitím genetického analyzátora ABI prism 310 od firmy Perkin Elmer Applied Biosystems (Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut, U.S.A) a kitu ABI prism Big Dye™ Terminátor Cycle Sequencing Reaction Kit taktiež od firmy Perkin Elmer.

Počiatočná analýza sekvencií sa uskutočnila použitím univerzálneho dopredného a reverzného priméru M13 získaného od firmy .Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, ALI 3AW, UK):

univerzálny dopredný primér: GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C reverzný primér M13: GGA AAC AGC TAT GAC CAT G

Interné priméry sa potom skonštruovali zo získanej sekvencie, ktorá poskytla celý gén pgi, ktorý.sa má odvodiť. . Sekvencia interných primérov:

Interný primér 1: GGA AAC AGG GGA GCC GTC

Interný primér 2: TGC TGA GAT ACC AGC GGT

Získaná sekvencia sa potom analyzovala použitím programu DNA Strider (Marek (1988), Nucleic Acids Research 16: 18291836), verzia 1.0 na počítači Apple Macintosh. Tento program umožnil analýzy, ako je napríklad stanovenie použitím reštrikčného miesta, analýza otvoreného čítacieho rámca a stanovenie použitím kodónu. Vyhľadávanie medzi získanou sekvenciou DNA a sekvenciami v databázach EMBL a Genbank sa dosiahlo použitím programu BLAST (Altschuľ et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402). Sekvencie DNA a proteínu sa vyrovnali použitím programov Clustal V a Clustal W (Higgins and Sharp, 1988 Gene 73: 237-244).

Takto získaná sekvencia je znázornená v SEQ ID NO 1. Analýza získanej nukleotidovej sekvencie odhalila otvorený čítací rámec s 1650 pármi báz, ktorý sa označil ako gén pgi. Kóduje proteín s 550 aminokyselinami znázornený v SEQ ID NO 2.

Príklad 5

Príprava integračného vektora na integračnú mutagenézu génu pgi

Interný segment génu pgi sa amplifikoval polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím genómovej DNA izolovanej z Corynebacterium glutamicum AS019 (Heery and Dunican, (1993) Applied and Enviromental Microbiology 59: 791-799) ako templátu. Použité priméry pgi:

dopredný primér: ATG'GAR WCC AAY GGH AA .

reverzný primér: YTC CAC GCC CCA YTG RTC s R=A+G; Y=C+T; W=A+T; H=A+T+C.

Parametre PCR boli nasledovné:

cyklov °C počas 1 minúty °C počas 1 minúty °C počas 30 sekúnd

1,5mM MgCl₂ približne 150 až 200 ng templát DNA.

Získaný produkt PCR sa klonoval do komerčne dostupného vektora pGEM-T zakúpeného od firmy Promega Corp. (Promega UK, Southampton) použitím kmeňa E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119 (1985)) ako hostiteľského mikroorganizmu. Sekvencia produktu PCR je znázornená v ako SEQ ID NO 3. Klonovaný inzert sa potom excidoval ako fragment EcoRI a ligoval k plazmidu pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)) predbežne spracovanému pomocou EcoRI. Použité reštrikčné enzýmy sa získali od firmy Boehringer Mannheim UK Ltd., (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK.) a použili podľa návodu výrobcu. E. coli^ JM109 sa potom transformoval s touto ligačnou zmesou a elďErotransformanty sa selektovali na agare Luria doplnenom IPTG (izopropyl-p-D-tiogalaktopyranozid), XGAL (5-bróm-4-chlór-3-indolyl-D-galaktopyranozid) a kanamycínom s koncentráciami 1 mM, 0,02 % á 50 mg/l. Agarcvé platne sa inkubovali 12 hodín pri 37 ’C. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu, charakterizovala reštrikčnou analýzou použitím enzýmov EcoRI, BamHI a Sali a označila ako pMCl (obrázok 4).

Plazmid pMCl bol uložený vo forme kmeňa Escherichia coli DH5a/pMCl v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podía Budapeštianskej zmluvy ako DSM 12969.

Príklad 6

Integračná mutagenéza génu pgi v kmeni DSM 5715 produkujúcom lyzín

Vektor pMCl uvedený v príklade 5 sa elektroporoval do C. glutamicum DSM 5715 podľa elektroporačnej metódy od Taucha et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). Pri kmeni DSM 5715 sa jedná o producenta lyzínu rezistentného na

AEC. Vektor pMCl sa nemôže samostatne replikovať v DSM5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu DSM 5715. Selekcia klonov pomocou pMCl integrovaného do chromozómu sa uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al.,'Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu. Na dôkaz integrácie sa interný fragment pgi (príklad 5) označil metódou „The DIG Systems Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer. Chromozómová DNA transformantu sa izolovala metódou od Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) a štiepila reštrikčnými enzýmami Sali, Sací a HindlII. Vzniknuté fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer pri 68 °C. Týmto spôsobom sa zistilo, že plazmid pMCl sa vložil do chromozómového génu pgi kmeňa DSM5715. Kmeň sa označil DSM5715::pMCl.

Príklad 7

Účinok zvýšenej expresie génu zwf so súčasnou elimináciou génu pgi na produkciu lyzínu

7.1 Príprava kmeňa DSM5715::pMCl/pEC-T18mob2zwf

Vektor pEC-T18mob2zwf uvedený v príklade 1.2 sa elektroporoval použitím elektroporačnej metódy opísanej v práci/ Tauch et al. (1994, FEMS Microbiology Letters 123: 343-347) do Corynebacterium glutamicum DSM5715::pMCl. Selekcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočňovala roztretím elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu s 5 mg/1 tetracyklínu. Plazmidová

DNA sa izolovala z transformantu obvyklou metódou (PetersWendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), analyzovala štiepením reštrikčnými enzýmami KpnI a Sali s následnou'elektroforézou v agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval DSM5715::pMCl/pEC-T18mob2zwf.

7.2 Príprava lyzínu

Kmeň Corynebacterium glutamicum DSM5715::pMCl/pECT18mob2zwf získaný v príklade 7.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1) a kanamycínom (25 mg/1)).

Kultúry porovnávacích kmeňov sa doplnili podlá ich rezistenice na antibiotiká. Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predpestovanú kultúru bolo úplné médium CglII.

Médium Cg III

NaCl

Bacto-peptón

2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem)

K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1)a kanamycín (5 mg/1). Predpestovaná kultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predpestovanou kultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (kukuričná maceračná tekutina)	5 g/l
MOPS (kyselina morfolinopropán-	20 g/l
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná)	50 g/l
(NH₄)₂SO₄	25 g/l
kh₂po₄	0,1 g/l
MgSO₄.7H₂O	1,0 g/l
CaCl₂.2H₂O	10 mg/1
FeSO₄.7H₂O	10 mg/1
MnSO₄.H₂O	5,0 mg/1
Biotín (sterilné filtrovaný)	0,3 mg/1
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný)	0,2 mg/1
L-Leucín (sterilné filtrovaný)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

CSL, MOPS a roztok solí sa vodným roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridali roztoky sterilného substrátu a roztoky vitamínov, ako aj za sucha autoklávovaný CaC03.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín (5 mg/1) a kanamycín (25 mg/1). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Po 72 hodinách sa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou chromatografiou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 3.

Tabuika $

Kmeň	Optická hustota	L-Lyzín.HCI g/1
DSM5715	7,3	14,3
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	7,1	14,6
DSM5715::pMCl/pECT18mob2zwf	10,4	15,2

Príklad-8

Vytvorenie kozmidovej genómovej knižnice baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromozómová DNA baktérie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala a čiastočne naštiepila (viď Tauch et al., (1995), Plasmid 33: 168 - 179) reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-091302). Izolované fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z morských garnátov (shrimp alkaline phosphatase, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové číslo 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (Wahl et al., (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160 - 2164), získaného od firmy Stratagene (La Jolla, USA, SuperCosl Cosmid Vektor Kit, katalógové č. 251301) , sa naštiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou.

Následne sa kozmidová DNA naštiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0868-04). Týmto spôsobom získané fragmenty kozmidovej DNA sa zmiešali s DNA ATCC13032 a potom spojili pomocou T4-DNA29 ligázy (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0870-04).

Ligačná zmes sa potom pomocou baliaceho extraktu Gigapack II XL Packing (Stratagene, La Jolla, USA, Gigapack II XL

I

Packing Extract, katalógové č. 200217) zabalila do fágových častíc. Tieto fágové častice sa použili na infekciu kmeňa E. coli NM554 (Raleigh et al·., 1988, Nucleic Acid Research 16:

1563 - 1575). Bunky sa resuspendovali v lOmM MgSOý a zmiešali s alikvótom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej knižnice sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v knihe Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) so 100 μς/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony.

Príklad 9

Izolácia a sekvenovanie génu poxB

Kozmidová DNA jednej kolónie (príklad 7) sa izolovala pomocou kitu Qiaprep Spin Miniprep Kit (katalógové č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podlá návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0913-02). Získané fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z morských garnátov (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, katalógové č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia fragmentov kozmidu s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou kitu QiaExII gel Extraction Kit (katalógové č. 20021, Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenačného vektora pZero-1, získaného od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, katalógové č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, katalógové č. 27-0868-04). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenačného vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje, v príručke Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. -Táto ligačná zmes sa následne elektroporovala (Tauch et al..., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343 - 347) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645 - 4649). a naniesli na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s prídavkom 50 μg/ml zeocínu.

Izolácia plazmidov z rekombinantných klonov sa uskutočňovala pomocou zariadenia Biorobot 9600 (katalógové č. 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou ukončenia reťazca (Sanger et al., 1997, Proceedings of the National Academies of. Sciences U. S.A., 74: 5463 - 5467) s modifikáciami podľa Zimmermanna et al., (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Pritom sa použil sekvenačný kit „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od firmy PE Applied Biosystems (katalógové č. 403044, Weiterstadt,

Nemecko). Separácia gélovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphoresis NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (katalógové č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) pomocou prístroja „ABI Prism 377 od firmy PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko).

Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217 - 231), verzia 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov plazmidu pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217 - 231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou programu „BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25: 3389 - 3402) proti neredundantnej databáze NCBI „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).

Výsledná nukleotidová sekvencia je znázornená v SEQ ID Νφ.4. Analýza tejto nukleotidovej sekvencie odhalila, otvorený čítací rámec s veľkosťou 1737 párov báz, ktorý sa označil ako gén poxB. Gén poxB kóduje polypeptid s veľkosťou 579 aminokyselín (SEQ ID NO. 5).

Príklad 10

Príprava integračného vektora na integračnú mutagenézu génu poxB

Z kmeňa ATCC 13032 sa metódou podľa Eikmannsa et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) izolovala chromózomová DNA. Na základe sekvencie génu poxB známej z príkladu 8 pre C glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:

poxBintl:

5' TGC GAG ATG GTG AAT . GGT GG 3' poxBint2:

¹ 5' GCA TGA GGC AAC GCA TTA GC 3

Znázornené priméry syntetizovala firma MWG Biotech (Ebersberg, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila podľa štandardnej metódy PCR od Innisa et al. (PCR protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) . s polymerázou Pwo od firmy Boehringer. Pomocou tejto polymerázovej reťazovej reakcie sa izoloval fragment DNA s veľkosťou približne 0,9 kb, ktorý nesie interný fragment génu poxB a je znázornený v SEQ ID No. 6.

Amplifikovaný fragment DNA sa ligoval pomocou klonovacieho kitu TOPO TA od firmy Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K4500-01) do vektora pCR2.1-T0P0 (Mead et al., (1991), Bio/Technology 9:657-663). Kmeň E. coli DH5a sa potom elektroporoval s ligačnou zmesou (Hanahan, In: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRLPress, Oxford, Washington DC, USA, 1985) . Sele,kcia buniek nesúcich plazmid sa uskutočnila nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, . 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/l kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu použitím kitu QIAprep Spin Miniprep Kit od firmy Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a následnou elektroforézou v agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pCR2.lpoxBint (obrázok 5).

Plazmid pCR2.lpoxBint sa uložil vo forme kmeňa Escheríchia coli DH5a/pCR2.lpoxBint ako DSM 13114 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ,

Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy.

Príklad 11

Integračná mutagenéza génu poxB v kmeni DSM 5715 produkujúcom lyzín

Vektor pCR2.lpoxBint uvedený v príklade 10 sa elektroporoval v Corynebacterium glutamicum DSM 5715 podľa elektroporačnej metódy Taucha et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)). Pri kmeni DSM 5715 sa jedná o producenta lyzínu rezistentného na AEC. Vektor pCR2.lpoxBint sa nemôže samostatne replikovať v DSM5715 a zachováva sa v bunke len vtedy, ak sa integroval do chromozómu DSM 5715. Selekcia klonov pomocou pCR2.lpoxBint integrovaného do chromozómu ša uskutočnila nanesením elektroporačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 15 mg/1 kanamycínu.

Na dôkaz integrácie sa fragment poxBint označil pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer metódou „The DIG Systems Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) . Chromozómová, DNA potenciálneho integrantu sa izolovala metódou od Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)) a štiepila reštrikčným enzýmom Sali, Sací a Hindlll. Vzniknuté fragmenty sa separovali pomocou elektroforézy v agarózovom géle a hybridizovali pomocou hybridizačného kitu Dig od firmy Boehringer pri 68 °C. Plazmid pCR2.lpoxBint uvedený v príklade 9 sa vnútri chromozómového génu poxB vložil do chromozómu DSM5715. Kmeň sa označil DSM5715::pCR2.lpoxBint.

Príklad 12

Účinok zvýšenej expresie génu zwf so súčasnou elimináciou génu poxB na prípravu lyzínu

12.1 Príprava kmeňa DSM5715::pCR2.lpoxBint/pEC-T18mob2zwf

Kmeň DSM5715::pCR2.lpoxBint sa transformoval plazmidom pEC-T18mob2zwf použitím elektroporačnej metódy opísanej v práci Liebl et al. (FEMS Microbiology Letters 53: 299-303 (1989)). Selekcia transformantov sa uskutočňovala na agare LBHIS zloženom z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bactokvasnicového extraktu, 5 g/1 NaCI a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený 5 mg/1 tetracyklínu a 25 mg/1 kanamycínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 °C.

Plazmidová DNA sa izolovala vo všetkých prípadoch z transformantu obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnými endonukle34 ázami Xbal a KpnI a plazmid sa analyzoval následnou elektroforézou v agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval DSM5715::pCR2.lpoxBint/pEC-T18mob2zwf.

12.2 Príprava L-lyzínu

Kmeň C. glutamicum DSM5715::pCR2.lpoxBint/pEC-T18mob2zwf získaný v príklade 12.1 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň najskôr inkuboval 24 hodín pri 31 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s tetracyklínom (5 mg/1) a kanamycínom (25 mg/1) . Porovnávacie kmene boli doplnené podľa ich rezistencie na antibiotiká. Vychádzajúc z kultúry z tejto agarovej platne sa naočkovala predpestovaná kultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predpestovanú kultúru bolo úplné médium CglII.

Médium Cg III

NaCl

Bacto-peptón

Bacto-kvasnicový extrakt Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.'

2,5 g/1 g/1 g/1 % (hmotnosť/objem)

K tomu sa pridal tetracyklín (5 mg/1) a kanamycín (25 mg/1)·. Predpestovaná kultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala touto predpestovanou kultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,1. Pre hlavnú kultúra sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (kukuričná maceračná tekutina)	5 g/1
MOPS (kyselina morfolinopropán-	20 g/1
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná)	58 g/1
(NH₄) ₂SO₄	25 g/1
kh₂po₄	0,1 g/1
MgS0₄.7H₂0	1,0 g/1
CaCl₂.2H₂O	10 mg/l
FeSO₄.7H₂O	10 mg/l
MnSO₄.H₂O	5,0 mg/l
Biotín (sterilné filtrovaný)	0,3 mg/l
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný)	0,2 mg/l
L-Leucín (sterilné filtrovaný)	0,1 g/1
CaCO₃	2 5 g/1

Kultivácia sa uskutočňovala y 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa tetracyklín '(5 mg/l) a kanamycín (25 mg/l). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

Výsledok pokusu'je uvedený v tabuíke 4.

Tabuľka 4

Kmeň	Optická hustota	L-Lyzín.HCI g/1
DSM5715	10,8	16,0
DSM5715/pEC-T18mob2zwf	8,3	17,1
DSM5715::pCR2.lpoxBint	7,1	16,7
DSM5715::pCR2.lpoxBint/	7,8	17,7
pEC-T18mob2zwf

WO 01/70995

PČT/EP00/063O3

PCT 990239 BT

Originál (for SUBMISSION) - printed on 03.07.2000 02:54:24 PM

0-1 0-1-1	Form-PCT/RO/134 (EASY) Indications Relating to Deposited Microorganism(s) or Other Biologícal Materiál (PCT Rule 13bis) Prepareď using	PCT-EASY Version 2.90 (updated 08.03.2000)
0-2	International Application No. .	PCT/EP 00 / 0 6 3 03
0-3	Applicanťs or agenťs filé reference	990239 BT

1 1-1 1-2	The indications made below relate to the deposited microorganism(s) or other biologícal matéria! referred to In the deseríption on: page line	10 24-29
1-3 1-3-1	Identification of Deposit Name of depositary institution	DSMZ-Deutsche Sammlur.g von
1-3-2	Address of depositary institution	Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg lb, D-38124
1-3-3 1-3-4	Dáte of deposit Accession Number .	Braunschweig, Gerxoany 20 January 2000 (20.01.2000) DSMZ 13244
1-4	Additional Indications	ΝΟΝΕ
1-5	Designated States for Which Indications are Made	all designated States
1-6	Separáte Fumishing of Indications	ΝΟΝΕ
	These indications will be submitted to the International Bureau later

FOR RECEIVING OFFICE USE ONLY

0-4	Thls form was recelved with the International application: {yes or no)	yeš
0-4-1	Aúthorized officér	NATHAL5E KUlPEft
FOR INTERNATIONAL BUREAU USE ONLY
0-5	This form was received by the. . International Bureau on:

0-5-1

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob prípravy L-aminokyselín fermentáciou koryneformných baktérií, vyznačujúci· sa i t ý m , že zahŕňa uskutočnenie nasledovných stupňov:

a) fermentácia baktérií produkujúcich žiadanú

L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje aspoň gén zwf,

b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a

c) izolácia produkovanej L-aminokyseliny.
2. Spôsob podía nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú, najmä zvýšene exprimujú, ďalšie gény pre biosyntetickú‘dráhu žiadanej L-aminokyseliny.
3. Spôsob podía nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, ktoré produkujú L-treonín, L-lyzín alebo L-tryptofán.
4. Spôsob podía nároku 3, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, ktoré produkujú L-lyzín.
5. Spôsob fermentačnej prípravy L-lyzínu podľa nároku 2, vyznačuj ú,.c i.. sa t ý m , že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré najmä už produkujú L-lyzín, sa súčasne zosilňuje alebo zvýšene exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej

5.1 gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu,

5.2 gén lysC kódujúci aspartátkinázu rezistentnú na spätnú väzbu,

3 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,

4 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,

I

5 gén tkt kódujúci transketolázu,
6 gén gnd kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu,
7 gén lysE kódujúci prenos lyzínu,
8 gén zwal,
9 gén eno kódujúci enolázu.

6. Spôsob fermentačnej prípravy L-treonínu podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré najmä už produkujú L-treonín, sa súčasne zosilňuje, najmä zvýšene exprimuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej

6.1 gén hom kódujúci homoseríndehydrogenázu alebo alelu hom^dr kódujúcu homoseríndehydrogenázu rezistentnú na spätnú väzbu,

6.2 gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu,

6.3 gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu,

6.4 gén mqo kódujúci malát:chinónoxidoreduktázu,

6.5 gén tkt kódujúci transketolázu,

6.6 gén zwf kódujúci glukóza-6-fosfátdehydrogenázu,

6.7 gén thrE kódujúci prenos treonínu,

6.8 gén zwal,

I

6.9 gén eno kódujúci enolázu.

7. Spôsob podlá nároku 2, vyznačujúci sa tým; že na prípravu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu alebo · L-treonínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej

7.1 gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu,

7.2 gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu,

7.3 gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu,

7.4 gén zwa2.

8. Spôsob podľa nárokov 2 až 6, vyznačujúci sa t ý m , že na dosiahnutie zosilnenia sa pomocou transformácie mikroorganizmov plazmidovým vektorom nesúcim tieto gény alebo nukleotidové sekvencie zvýši počet kópií génov alebo nukleotidových sekvencií.

9. Plazmidový vektor pEC-T18mob2 uložený pod označením DSM 13244 v E. coli K-12 DH5a, znázornený na obrázku 2.
10. Koryneformný mikroorganizmus, najmä rodu Corynebacterium, transformovaný pomocou vloženia plazmidového vektora podľa nároku 9, ktorý prídavné obsahuje gén zwf.