CN109423504B

CN109423504B - 生产l-色氨酸的菌株及用途

Info

Publication number: CN109423504B
Application number: CN201710735581.7A
Authority: CN
Inventors: 娄春波; 陶勇; 赵会伟; 季翔宇; 张莎莎; 吴涛; 毛贤军; 李岩; 刁刘洋
Original assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Current assignee: Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date: 2017-08-24
Filing date: 2017-08-24
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2037-08-24
Also published as: CN109423504A

Abstract

本发明涉及生产L‑色氨酸的菌株及其在发酵中的用途。具体而言，本发明利用基因工程方法减弱或阻断工程菌(例如大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌)的磷酸戊糖途径的氧化阶段，大幅提高菌株产L‑色氨酸的能力。

Description

生产L-色氨酸的菌株及用途

技术领域

本发明涉及微生物工程领域。更具体而言，本发明通过对工程细菌的L-色氨酸生物合成途径进行改进，提高菌株的L-色氨酸产量。

背景技术

色氨酸的化学名称为β-吲哚基丙氨酸。其作为人和动物的必需氨基酸之一，被广泛用于医疗、制药、食品和饲料工业中。通常可通过化学合成、蛋白水解、酶促转化、直接发酵等方法生产L-色氨酸。

就发酵方法而言，本领域已报道通过改良发酵工艺本身(例如调整搅拌和氧气供给、优化培养基组成、实时调控发酵液中的糖浓度或产物浓度等)、或者借助传统的诱变筛选方法来弱化竞争性通路或降低中间产物反馈抑制，提高氨基酸发酵产量(DE102008040352A1和 CA2663711A1)。然而，对于生物合成路线较长的芳香族氨基酸，由于调控步骤多、调控网络复杂，可能的关键性节点较多，通过这样的传统方式仅能有限地提高氨基酸的产量(Ikeda M，appl.Microbiol.Biotechnol.2006，69：615-626)。

近二十年发展的遗传工程和代谢工程方法使得能够对细菌自身的氨基酸合成通路进行定向优化设计，去除通路瓶颈或代谢反馈、调整碳中心代谢途径以增加前体供应量，以及进一步地增强芳香族氨基酸的转运出胞以减少胞内的产物积累，从而提高发酵产量。

本领域已知的是，在几乎全部的物种中，芳香族氨基酸的生物合成首先是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)缩合生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，随后经催化生成分支酸。然后，通过不同的途径生成L-苯丙氨酸、L-酪氨酸或L-色氨酸。基于此，对L-色氨酸生物合成通路的改造可通过两种方式进行：增强分支酸的碳代谢流以提高分支酸的产量(即，对芳香族氨基酸共同通路的改造)；以及对由分支酸生成L-色氨酸的色氨酸合成支路的改造。例如，Ikeda M等在产色氨酸的谷氨酸棒状杆菌中过表达tktA，增加 E4P的供应量(Ikead M，production of tryptophan by CorynebacteriumGlutamicum with the modified pentose phosphate pathway，1999)。Berry A提出在大肠杆菌中过表达去除反馈抑制的aroG和TrpEDCBA基因，使得葡萄糖的糖酸转化率超过22％(Berry A，Improving production of aromatic compounds in Escherichia coliby metabolic engineering，1996)。

需要指出的是，L-色氨酸合成的关键前体PEP、E4P、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺以及5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)等分别来自不同的代谢通路：PEP和L-丝氨酸来自糖酵解(EMP)途径，而E4P和PRPP来自于磷酸戊糖(PPP，也称为HMP)途径。因此，对于L-色氨酸的调控不但需要增强这些来自不同代谢流的前体的产量，还需要进行流平衡(CN104388330A)。考虑到合成途径较长且调控复杂，目前所报道的L-色氨酸的发酵产量仍远低于非芳香族氨基酸：发酵罐中L-色氨酸的糖酸转化率估计为20-23％，L-苯丙氨酸约为25％；而其他氨基酸则均可实现相对高的产量：L-赖氨酸(盐酸盐)的糖酸转化率为40-50％，L-谷氨酸为45-55％，L-精氨酸为30-40％，L-苏氨酸为40-50％，L-缬氨酸为30-40％，L-丙氨酸为45-55％(Ikeda M，2006)。

就这一点而言，目前仍存在对L-色氨酸的合成通路进行进一步优化的需求。

发明内容

本发明提出可通过降低磷酸戊糖途径氧化阶段中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/ 或活性，来减弱或阻断L-色氨酸发酵菌株中磷酸戊糖途径的氧化阶段，减少由于脱羧造成的碳损失，增加碳中心代谢流，从而提高L-色氨酸发酵产量。

在第一方面，本发明提供了一种用于生产L-色氨酸的细菌，其中，所述细菌具有降低的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性。

在第二方面，本发明提供了一种提高细菌的L-色氨酸产量的方法，所述方法包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低。

在第三方面，本发明提供了一种生产L-色氨酸的方法，所述方法包括：在培养基中接种第一方面所述的细菌并进行发酵，并收集L-色氨酸。

在第四方面，本发明提供了第一方面所述的细菌在发酵生产L-色氨酸中的用途。

附图说明

图1为细菌L-色氨酸生物合成途径的关键步骤示意图。其中，双箭头表示可逆反应，虚线表示多步反应。DAHP：3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸；pts：编码磷酸烯醇式丙酮酸- 糖磷酸转移酶系统的基因；zwf：编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因；tkt：编码转酮醇酶的基因；rpe：编码核酮糖-5-磷酸差向异构酶的基因；rpi：编码核糖-5-磷酸异构酶的基因；ppsA：编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的基因；prs：编码磷酸核糖焦磷酸合成酶A的基因；aroG：编码DAHP合成酶的基因；serA：编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的基因。

图2显示根据本发明的实施例2，TS102、TS52、TS41和TS49菌株在摇瓶条件下发酵生产L-色氨酸的相对产量、相对得率和生物量。

图3显示根据本发明的实施例3，TS102、TS401和TS412菌株在摇瓶条件下发酵生产L-色氨酸的相对产量、相对得率和生物量。

在图2和图3中，相对产量和相对得率均以TS102菌株为100％计算。

具体实施方式

如上所述，本发明以改造磷酸戊糖途径的氧化阶段作为切入点，通过降低磷酸戊糖途径氧化阶段中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性，减弱或阻断L-色氨酸发酵菌株中磷酸戊糖途径的氧化阶段，从而减少由于脱羧造成的碳损失，增加碳中心代谢流。在优选的实施方式中，在去除脱羧造成的碳损失的基础上通过对碳中心代谢流进行再平衡、提高前体供应和/或对辅酶代谢途径进行重构，大幅提高L-色氨酸的生产效率。在本发明中，对L-色氨酸合成通路的改造可包括如下的一种或多种方式：磷酸戊糖途径的氧化阶段的阻断或弱化、磷酸戊糖途径的非氧化阶段的强化、NADPH循环的重构以及磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统的改造；也可在此基础上对L-色氨酸合成支路进行进一步改进(例如，去除反馈抑制)。

磷酸戊糖途径的氧化阶段的阻断或弱化

如图1所示，磷酸戊糖途径是葡萄糖氧化的旁路，该途径可分为氧化和非氧化两个阶段。在氧化阶段，6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)的催化下脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，并水解为6-磷酸葡萄糖酸，6-磷酸葡萄糖酸在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的催化下再次脱氢并自发脱羧，生成核酮糖-5-磷酸(也称为5-磷酸核酮糖)。核酮糖-5-磷酸经异构生成 5-磷酸核糖。氧化磷酸戊糖阶段产生2分子NADPH和1分子CO₂。该步骤的限速酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。通过阻断G6PD能够实现对从6-磷酸葡萄糖生成核酮糖-5-磷酸这一过程的阻断。6-磷酸葡萄糖脱氢酶在本领域中也称为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。

本领域已提出对编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的zwf基因进行修饰来提高L-色氨酸的产量。例如，CN 101029310B公开了通过增强zwf基因的表达来提高前体供应，从而提高包括L-色氨酸在内的L-氨基酸的产量。然而，该方法并未提及通过减少碳损失来提高L-氨基酸的产量。

在本发明的实施方式中，通过降低细菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.49)的表达水平和/或活性，减少由于二氧化碳的释放而造成的碳损失。

葡萄糖经EMP和PPP生成L-色氨酸的总反应为：

2.5×D-葡萄糖+2×H₃N<＝>L-色氨酸+4CO₂；该途径下葡萄糖的理论糖酸转化率为204.2/(2.5×180)＝45.4％。

葡萄糖不经PPP生成L-色氨酸的总反应为：

2×D-葡萄糖+2×H₃N<＝>L-色氨酸+CO₂；该途径下葡萄糖的理论糖酸转化率为204.2/(2 ×180)＝56.7％。

可见，从合成途径的理论得率来计算，在阻断或弱化磷酸戊糖途径的氧化阶段后，葡萄糖的理论糖酸转化率能够由45.4％提高到56.7％。

本领域知晓降低某一基因表达或活性的方法，例如将基因组上编码该基因的片段进行整体或部分删除、在一个或多个位点插入无功能片段、或者通过对一个或多个位点进行替换来改变蛋白的活性，使得该片段不能编码蛋白或编码的蛋白活性降低；也可对启动子区域进行调整、通过添加降解标签来减小蛋白的半衰期等。还可通过改变培养基的组分和培养条件，实现相关基因的降低表达。可通过如上所述的任何方式降低G6PD的表达或活性，例如敲除基因组上zwf基因的一部分(例如编码区域的一部分和/或启动子区域的一部分)。

磷酸戊糖途径的非氧化阶段的强化

如上所述，降低G6PD的表达水平和/或活性能够减少碳损失。然而，磷酸戊糖途径的氧化阶段的阻断可能引起包括4-磷酸赤藓糖(E4P)和5-磷酸核糖在内的磷酸戊糖途径中间产物的减少。4-磷酸赤藓糖与磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)共同为分支酸途径的前体。并且，5-磷酸核糖参与下游5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)的生成。PRPP能够与邻苯二甲酸反应形成磷酸核糖邻氨基苯甲酸，并经重排、脱羧和关环形成吲哚甘油磷酸，然后在色氨酸合成酶催化下先脱去3-磷酸甘油醛生成吲哚，最后吲哚与丝氨酸缩合生成色氨酸。可以通过对培养基进行调整来实现4-磷酸赤藓糖和5-磷酸核糖的回补。在优选的实施方式中，通过对磷酸戊糖途径中的非氧化阶段步骤进行加强，回补由于磷酸戊糖途径氧化阶段的阻断造成的4-磷酸赤藓糖和5-磷酸核糖的减少。

如图1所示，磷酸戊糖途径的非氧化阶段实质上是通过一系列基团的重排，将5-磷酸核酮糖转变成6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛而进入糖酵解途径。为了提高4-磷酸赤藓糖和5-磷酸核糖的浓度，可通过提高如下的一种或多种酶的表达或活性，促进糖酵解途径中间产物进入磷酸戊糖途径的非氧化阶段：转酮醇酶(大肠杆菌内源表达两种转酮醇酶，分别为转酮醇酶A和转酮醇酶B；谷氨酸棒状杆菌仅内源表达一种转酮醇酶)、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶(大肠杆菌内源表达核糖-5-磷酸异构酶A和核糖-5-磷酸异构酶B，谷氨酸棒状杆菌仅内源表达一种核糖-5-磷酸异构酶)和磷酸核糖焦磷酸合成酶A。

本领域知晓提高某一基因表达或活性的方法，例如增加质粒或基因组上该基因的拷贝数、对启动子区域进行调整(例如将启动子替换为强启动子)、延长mRNA的寿命、减少酶的分解等。也可通过改变培养基的组分和培养条件，获得相关基因的增加表达。对于大肠杆菌而言，可通过如上任一种方法提高tktA、tktB、rpe、rpiA、rpiB和/或prs的表达。优选地，过表达tktA、tktB、rpe、rpiA、rpiB和/或prs。对于谷氨酸棒状杆菌而言，可通过如上任一种方法提高tkt、rpe、rpi和/或prs的表达。优选地，过表达tkt、rpe、rpi和/或prs。不希望被理论所限地，也可表达外源的上述基因(例如，在谷氨酸棒状杆菌中表达大肠杆菌的tktA、 tktB、rpe、rpiA、rpiB和/或prs基因，或者在大肠杆菌中表达谷氨酸棒状杆菌的上述基因) 来提高相关蛋白表达。

辅酶NADPH循环的重构

如上所述，氧化磷酸戊糖阶段产生2分子NADPH和1分子CO₂。对该阶段的阻断使得磷酸戊糖途径不再产生NADPH，由此可能造成细胞内的还原力不足。因此，设想可通过促进NADH向NADPH的转化来补足还原力，进而实现NADP+/NADPH平衡。可通过对培养基进行调整从外部补足还原力。在优选的实施方式中，通过促进NADH向NADPH的转化来重构NADP+/NADPH平衡。例如，在大肠杆菌中，通过使得NAD(P)H转氢酶A和/或 NAD(P)H转氢酶B的表达或活性增强来促进NADH向NADPH的转化。可通过在质粒或基因组上过表达pntA和/或pntB来消除磷酸戊糖途径氧化阶段的阻断造成的NADP+/NADPH 比例的升高甚至NADP+的积累。在谷氨酸棒状杆菌中，可以通过外源表达大肠杆菌的 NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B来促进NADH向NADPH的转化。可通过在质粒或基因组上过表达pntA和/或pntB来消除磷酸戊糖途径氧化阶段的阻断造成的 NADP/NADPH比例的升高甚至NADP的积累。

磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统的改造

本领域已知的是，野生型大肠杆菌利用磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS 系统)转运并磷酸化葡萄糖。PTS系统转运1摩尔葡萄糖需消耗1摩尔磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP)。当大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的限制性培养基中生长时，PTS系统消耗了约50％的PEP用于葡萄糖的转运和磷酸化，直接影响以PEP为前体的L-色氨酸的合成。PTS系统缺陷型大肠杆菌可通过半乳糖/氢离子协同转运蛋白(D-Galactose/H+symporter，GalP，也称为半乳糖透过酶)和葡萄糖激酶(Glucokinase，GLk)协同作用转运葡萄糖入胞。因此，在优选的实施方式中，可通过使得PTS系统的酶表达水平和/或活性降低，并增强半乳糖转运通路来进一步提高作为前体的PEP的供应(CN105543154A)。

因此，在进一步优选的实施方式中，可通过对PTS的改造进一步增加PEP前体的供应。优选地，所述PTS系统的蛋白选自于由如下基因编码的蛋白中的一种或多种：ptsH、ptsI、 crr或ptsG，优选为ptsG。优选地，所述半乳糖转运通路的蛋白选自于如下的一种或多种蛋白：半乳糖透过酶或葡萄糖激酶，优选同时提高半乳糖透过酶和葡萄糖激酶的表达水平和/或活性。优选地，同时过表达galP和glK。

解除中间产物的反馈抑制

如前所述，本领域知晓能够通过解除DAHP合成酶和分支酸变位酶的反馈抑制使得分支酸能够在细胞内积累，进而提高芳香族氨基酸(例如L-酪氨酸和L-色氨酸)的产量。可通过敲除或失活基因组AroF、AroG和/或TrpEDCBA操纵子，并表达对负反馈不敏感的突变酶AroF^fbr或AroG^fbr和/或TrpE^fbrDCBA来解除反馈抑制(US5,939,295A)。

此外，还可通过增强L-色氨酸合成支路的碳代谢流来积累L-色氨酸的合成前体——吲哚，例如可通过增强3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平或活性来实现这一效果，例如可增强 serA基因的表达(Ileda M，2006)。

对于以上提及的细菌L-色氨酸合成通路中的酶和编码这些酶的基因，本领域已就多种模式菌和工程菌中的这些酶及其编码基因进行了研究和表征。表1和表2分别示出本发明主要涉及的酶在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中相应的蛋白和基因序列的NCBI登录号。本领域技术人员能够基于表中的编号获取上述蛋白和基因的序列。

表1

表2

在本发明的多个实施方式中，本发明的产L-色氨酸的大肠杆菌可具有如下的一种或多种特征：

6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低；

磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强，所述磷酸戊糖途径的非氧化阶段的酶选自于转酮醇酶A、转酮醇酶B、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖- 5-磷酸异构酶A、核糖-5-磷酸异构酶B以及磷酸核糖焦磷酸合成酶A；

NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B的表达水平和/或活性增强；

PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低，且一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性增强；

表达突变酶AroF^fbr或AroG^fbr和/或TrpE^fbrDCBA，且AroF、AroG和/或TrpEDCBA操纵子被敲除或失活；以及

3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

在更为优选的实施方式中，本发明的产L-色氨酸的细菌可为大肠杆菌TS412菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC No.14047，保藏日期为2017年4月19日。

在本发明的多个实施方式中，本发明的产L-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌可具有如下的一种或多种特征：

6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低；

磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强，所述磷酸戊糖途径的非氧化阶段的酶选自于转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶以及磷酸核糖焦磷酸合成酶A；

表达大肠杆菌的pntA和/或pntB；

3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

定义

虽然本发明实施例主要利用大肠杆菌(Escherichia coli，也称为大肠埃希氏菌)实现，然而如上所述，在几乎所有的工程菌，甚至多种真核生物(例如子囊菌(ascomycetes)、顶复门原生动物(apicomplexans)和植物)中，芳香族氨基酸的生物合成均利用极为相似的途径，首先是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)缩合生成3-脱氧D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)，随后经催化产生分支酸(Rodriguez等，Microbial Cell Factories 2014， 13:126)。因此，本发明的原理同样适用于本领域公知的发酵工程菌，特别是谷氨酸棒状杆菌、乳酸发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)和Corynebacterium efficiens。本发明的大肠杆菌可为任何大肠杆菌菌株，包括但不限于K12、W3110、BW25113、MG1655、BL21 (DE3)、JM109、DH5a、DH10B、C600、ER2925、HB101、JM110、S17-1、T1R、TOP10、 W、XL1-blue、SURE、RR1、LE392、MC1061、IJ1126、AG1以及AB1157。

本文所使用的全部术语“减少/降低”、“抑制”或“阻断”通常是指相对于未进行基因改造的对照菌株而言降低了统计学上显著的量。然而，为了避免疑义，“降低”、“减少”、“抑制”或“阻断”通常是指与未进行改造的对照相比，减少至少10％，并且可包括例如：与对照相比，减少至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％，并包括相对于对照而言完全不存在给定的实体或参数(例如，突变的酶可完全失活，或者在基因敲除的情况下完全不表达该酶)。

本文使用的全部术语“增加/增高”、“增强”、“活化”或“过表达”通常是指相对于未进行基因改造的对照菌株而言增高了统计学上显著的量；为了避免疑义，术语“增加/增高”、 “增强”、“活化”或“过表达”通常是相对于未进行基因改造的对照菌株而言增高至少10％，例如：与未进行基因改造的对照菌株相比而言，增高至少约20％、或至少约30％、或至少约 40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括100％增高，或与对照相比而言的10％-100％之间的任意增高；或与对照相比，增高至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或2倍至 10倍以上的任意增高。特别地，增强表达包括在宿主细菌内表达外源的相应蛋白。

本文所述各方面的实施方式可由如下编号的段落说明：

1.一种生产L-色氨酸的细菌，其中，所述细菌具有降低的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性。

2.如段落1所述的细菌，其中，所述细菌中zwf基因被敲除或失活。

3.如段落2所述的细菌，其中，对所述zwf基因的启动子进行改造，使得zwf基因失活。

4.如段落1-2中任一项所述的细菌，其中，所述细菌选自于由如下细菌所组成的组：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌和Corynebacterium efficiens。

5.如段落4所述的细菌，其中，所述细菌为大肠杆菌。

6.如段落5所述的细菌，其中，所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强，所述磷酸戊糖途径的非氧化阶段的酶选自于转酮醇酶A、转酮醇酶B、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶A、核糖-5-磷酸异构酶B以及磷酸核糖焦磷酸合成酶A。

7.如段落6所述的细菌，其中，所述细菌中如下的一个或多个基因被过表达：tktA、tktB、 rpe、rpiA、rpiB以及prs。

8.如段落5-7中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H 转氢酶B的表达水平和/或活性增强。

9.如段落8所述的细菌，其中，所述细菌的pntA和/或pntB基因被过表达。

10.如段落5-9中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低，且一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性升高。

11.如段落10所述的细菌，其中，所述非PEP底物的葡萄糖转运蛋白为半乳糖透过酶和/或葡萄糖激酶。

12.如段落10或11所述的细菌，其中，所述细菌中如下的一个或多个基因被敲除或失活：ptsH、ptsI、crr或ptsG；优选地，所述细菌中ptsG基因被敲除或失活。

13.如段落10-12中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中galP和/或glK被过表达；优选地，所述细菌过表达galP和glK。

14.如段落5-13中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达突变酶AroF^fbr或AroG^fbr和 /或TrpE^fbrDCBA，且AroF、AroG和/或TrpEDCBA操纵子被敲除或失活。

15.如段落5-14中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

16.如段落15所述的细菌，其中，所述细菌过表达serA。

17.一种细菌，所述细菌为大肠埃希氏菌TS412菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.：14047，保藏日期为2017年4月19日。

18.如段落4所述的细菌，其中，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌。

19.如段落18所述的细菌，其中，所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强，所述磷酸戊糖途径的非氧化阶段的酶选自于转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶以及磷酸核糖焦磷酸合成酶A。

20.如段落19所述的细菌，其中，所述细菌中如下的一个或多个基因被过表达：tkt、 rpe、rpi以及prs。

21.如段落18-20中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达大肠杆菌的NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B。

22.如段落21所述的细菌，其中，所述细菌表达大肠杆菌的pntA和/或pntB基因。

23.如段落18-22中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和 /或活性降低，且一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性升高。

24.如段落23所述的细菌，其中，所述非PEP底物的葡萄糖转运蛋白为半乳糖透过酶和/或葡萄糖激酶。

25.如段落23或24所述的细菌，其中，所述细菌中如下的一个或多个基因被敲除或失活：ptsH、ptsI、crr或ptsG；优选地，所述细菌中ptsG基因被敲除或失活。

26.如段落23-25中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中galP和/或glK被过表达；优选地，所述细菌过表达galP和glK。

27.如段落18-26中任一项所述的细菌，其中，所述细菌表达突变酶AroF^fbr或AroG^fbr和/或TrpE^fbrDCBA，且AroF、AroG和/或TrpEDCBA操纵子被敲除或失活。

28.如段落18-27中任一项所述的细菌，其中，所述细菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

29.如段落28所述的细菌，其中，所述细菌过表达serA。

30.一种提高细菌的L-色氨酸产量的方法，所述方法包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低。

31.如段落30所述的方法，其中，将所述细菌中的zwf基因敲除或失活，使得所述细菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低。

32.如段落31所述的方法，其中，对所述zwf基因的启动子进行改造，使得所述细菌中的zwf基因失活。

33.如段落30-32中任一项所述的方法，其中，所述细菌选自于由如下细菌所组成的组：大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌和Corynebacterium efficiens。

34.如段落33所述的方法，其中，所述细菌为大肠杆菌。

35.如段落34所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强，

其中，所述磷酸戊糖途径的非氧化阶段的酶选自于转酮醇酶A、转酮醇酶B、核酮糖-5- 磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶A、核糖-5-磷酸异构酶B以及磷酸核糖焦磷酸合成酶 A。

36.如段落35所述的方法，其中，通过将如下的一个或多个基因过表达，使得所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强：tktA、tktB、rpe、 rpiA、rpiB以及prs。

37.如段落34-36中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B的表达水平和/或活性增强。

38.如段落37所述的方法，其中，通过将pntA和/或pntB基因过表达，使得所述细菌中NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B的表达水平和/或活性增强。

39.如段落34-38中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低，且一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性升高。

40.如段落39所述的方法，其中，所述非PEP底物的葡萄糖转运蛋白为半乳糖透过酶和/或葡萄糖激酶。

41.如段落39或40所述的方法，其中，将如下的一个或多个基因敲除或失活，使得所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低：ptsH、ptsI、crr或ptsG；优选地，将ptsG 基因敲除或失活，使得所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低。

42.如段落39-41中任一项所述的方法，其中，将如下的一个或多个基因过表达，使得一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性升高：galP和glK；优选地，同时过表达galP和glK。

43.如段落34-42中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌表达突变酶AroF^fbr或AroG^fbr和/或TrpE^fbrDCBA，并且敲除或失活所述细菌的AroF、AroG和/或TrpEDCBA操纵子。

44.如段落34-43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

45.如段落44所述的方法，其中，使得所述细菌过表达serA，从而所述细菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

46.如段落33所述的方法，其中，所述细菌为谷氨酸棒状杆菌。

47.如段落46所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强，

其中，所述磷酸戊糖途径的非氧化阶段的酶选自于转酮醇酶、核酮糖-5-磷酸差向异构酶、核糖-5-磷酸异构酶以及磷酸核糖焦磷酸合成酶A。

48.如段落47所述的方法，其中，通过将如下的一个或多个基因过表达，使得所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强：tkt、rpe、rpi以及 prs。

49.如段落46-48中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌表达大肠杆菌的NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B。

50.如段落49所述的方法，其中，将大肠杆菌的pntA和/或pntB基因转入所述细菌，使得所述细菌表达大肠杆菌的NAD(P)H转氢酶A和/或NAD(P)H转氢酶B。

51.如段落46-50中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低，且一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性升高。

52.如段落51所述的方法，其中，所述非PEP底物的葡萄糖转运蛋白为半乳糖透过酶和/或葡萄糖激酶。

53.如段落51或52所述的方法，其中，将如下的一个或多个基因敲除或失活，使得所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低：ptsH、ptsI、crr或ptsG；优选地，将ptsG 基因敲除或失活，使得所述细菌中PTS系统蛋白的表达水平和/或活性降低。

54.如段落51-53中任一项所述的方法，其中，将如下的一个或多个基因过表达，使得一个或多个非PEP底物的葡萄糖转运蛋白的表达水平和/或活性升高：galP和glK；优选地，同时过表达galP和glK。

55.如段落46-54中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌表达突变酶AroF^fbr或AroG^fbr和/或TrpE^fbrDCBA，并且敲除或失活所述细菌的AroF、AroG和/或TrpEDCBA操纵子。

56.如段落46-55中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

57.如段落56所述的方法，其中，使得所述细菌过表达serA，从而所述细菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达水平和/或活性升高。

58.一种生产L-色氨酸的方法，所述方法包括：在培养基中接种段落1-29中任一项所述的细菌并进行发酵，并收集L-色氨酸。

59.段落1-29中任一项所述的细菌在发酵生产L-色氨酸方面的用途。

实施例

试剂和培养基

如无特别说明，全部试剂来自于Fisher Scientific。

Luria-Bertani(LB)液体培养基：

蛋白胨 10g/L；

NaCl 10g/L；

酵母粉 5g/L。

调节pH至7.0，121℃高压灭菌20min。

LB固体培养基：与LB液体培养基的配方相同，添加2wt％琼脂粉。

卡那霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度50μg/ml。

壮观霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度50μg/ml。

氯霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度34μg/ml。

氨苄青霉素(Acros)：溶于LB培养基，终浓度100μg/ml。

异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)(USB Corporation)储液浓度1M，终浓度为100μM。

种子培养基：

调节pH至7.2，过滤灭菌。

摇瓶发酵培养基：

调节pH至7.0，过滤灭菌。

种子培养基加葡萄糖10g/L。发酵培养基加葡萄糖20g/L。

实施例中使用的引物在表3中列出。

表3

实施例1菌株的构建

本发明实施例构建的菌株名称和基因型特征如表4所示。

表4

根据专利申请WO198701130A1及Mascarenhas等描述的方法(Mascarenhas D，Ashworth DJ，Chen CS，Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis in agenetically engineered strain of Escherichia coli.，Appl Environ Microbiol，1991，57(10)：2995-2999)构建菌株TS102，即，对W3110野生型菌株基因组上的基因tnaA、serA和trpR进行敲除。所使用的初始菌株为大肠杆菌野生型W3110(US5,939,295A)。所使用的质粒为p5LRPS2，该质粒在US5,939,295A 中描述，为pBR322来源，包含serA、aroG^fbr和TrpE^fbrDCBA基因片段。

1.TS05菌株的构建

以TS102菌株作为出发菌株，首先用glK基因序列替换ptsG序列，随后敲除galR，得到TS05菌株。

(1)用J23119-glk片段替换掉TS102菌株基因组上的ptsG片段(NCBI GeneID：945651)

利用引物SEQ ID NO.：1和SEQ ID NO.：2，以glK表达载体pS95s-glk^[1]为模板进行扩增，得到P119-glk-TrrnB片段。利用Gibson同源重组的方法将P119-glk-TrrnB片段插入到 pSLM载体^[1]的NotI/NheI酶切位点之间。利用引物SEQ ID NO.：3和SEQ ID NO.：4对所获得的载体进行扩增，得到J23119-glk片段。

J23119-glk片段的1-60bp为上游同源臂，对应于ptsG翻译起始位点-60至-1位；该片段 61-218bp为119启动子；237-1203bp为glK基因序列(Gene ID:946858)；1396-1552bp为终止子trrnB；1956-2750bp为卡那霉素编码序列；3014-3073bp为下游同源臂，对应于ptsG翻译起始位点+1414至+1473。

将J23119-glk片段电转化至经阿拉伯糖诱导的TS102(含pKD46质粒)菌株中，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆。pKD46载体来源于Datsenko,KA,BL Wanner 2000.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12):6640-5.，accession number：AY048746。

同源重组后，上下游同源臂之间的ptsG序列被替换为J23119-glk，并且基因组上带有 glK基因和编码卡那霉素的序列。转入重组酶质粒pSCre^[1]，消除卡那霉素抗性。

(2)敲除galR(NCBI Gene ID:947314)

利用引物SEQ ID NO.：5和SEQ ID NO.：6，以pSLM载体为模板进行扩增，得到同源臂打靶DNA片段。该同源臂打靶DNA片段1-63bp为上游同源臂，对应于galR翻译起始位点-60至+3位；第458-1252bp为卡那霉素编码序列；第1516-1578位为下游同源臂，对应于 galR翻译起始位点+1033至+1092。

将该同源臂打靶DNA片段电转化至经阿拉伯糖诱导的第(1)步构建的菌株(含pKD46 质粒)中，在含有卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆。

2.TS52和TS401菌株的构建

以TS05和TS102作为出发菌株，分别用如下的方法敲除基因组上的zwf基因，得到TS52和TS401菌株。

以大肠杆菌MG1655菌株(CGSC#：6300)基因组为模板，分别以引物对SEQ ID NO.：7和SEQ ID NO.：8、SEQ ID NO.：9和SEQ ID NO.：10进行PCR，扩增得到同源臂U和同源臂R后，进行融合PCR，获得打靶片段。该打靶片段的第1bp-488bp为zwf基因翻译起始位点上游-506到-19bp；第489bp-986bp为zwf基因翻译起始位点+1479到+1976bp。

使用CRISPR/Cas9介导的重组技术^[2]，分别向TS05和TS102菌株中转入pCas质粒^[2]。对于转化后的菌株，在0℃进行100倍稀释接种，加10mM阿拉伯糖摇菌，O.D.600达到0.5 左右时，4℃4000rpm离心收菌，10％甘油洗菌4次制作感受态细胞。

在zwf基因上选择序列CGCAGGAAATCAATGATCAG(SEQ ID NO.：55)构建打靶 sgRNA。以ptarget^[2]为模板，利用引物对SEQ ID NO.：49和SEQ ID NO.：50进行反向PCR 后，利用Gibson Assembly方法自连；获得对应的sgRNA质粒。将sgRNA与打靶片段共同电转入经阿拉伯糖诱导的含有pCas质粒的菌株中，在壮观霉素和卡那霉素双抗平板上筛选阳性克隆。

3.TS412菌株的构建

以TS401作为出发菌株，用pntAB基因序列替换serA序列，得到TS412菌株。其中，pntAB(NCBI Gene ID：946628和NCBI Gene ID：946144)为共用一个启动子的pntA和pntB。

以大肠杆菌MG1655菌株基因组为模板，分别以引物对SEQ ID NO.：16和SEQ IDNO.： 17、SEQ ID NO.：14和SEQ ID NO.：15以及SEQ ID NO.：11和SEQ ID NO.：12进行PCR，扩增得到上下游同源臂以及pntAB片段，将三个片段进行融合PCR，获得打靶片段。该打靶片段的1bp-498bp为serA(NCBI Gene ID:945258)基因翻译起始位点+844bp到+1341bp；499bp-536bp为启动子J101(cagtttacagctagctcagtcctaggtataatgctagc，SEQ ID NO.：56)；541bp- 3507bp为pntAB基因翻译起始位点-39bp到+2932bp；第3508bp-3951bp为serA基因翻译起始位点+1582bp到+2025bp；

在serA基因上选择序列TGCGTTGTGTTTATTTAAT(SEQ ID NO.：57)构建打靶sgRNA。以ptarget^[2]为模板，利用引物对SEQ ID NO.：48和SEQ ID NO.：50进行反向PCR后，利用Gibson Assembly方法自连；获得对应的sgRNA质粒。将sgRNA与打靶片段共同电转入经阿拉伯糖诱导TS401中，在壮观霉素和卡那霉素双抗平板上筛选阳性克隆。

4.TS41和TS49菌株的构建

以TS52作为出发菌株，过表达tktA、rpe、rpiA和prs，得到TS41和TS49菌株。

(1)构建质粒TP2、TP4、TP5和TP7。

①以pgRNA-bacteria^[3]作为模板，利用引物对SEQ ID NO.：18和SEQ ID NO.：19进行 PCR，得到质粒骨架1。

②以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：20和SEQ ID NO.：21扩增得到P100-prs(prs的NCBI refseq ID：NP_415725.1：947420；启动子P100序列为： ttgacggctagctcagtcctaggtacagtgctagc，SEQ ID NO.：58)。

③以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：22和SEQ ID NO.：23扩增得到prs编码片段(NCBI refseq ID：NP_415725.1)。

④以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：24和SEQ ID NO.：25扩增得到rpiA编码片段(NCBI refseq ID：NP_417389.1)。

⑤以质粒PSB1C3(http://parts.igem.org/Part:pSB1C3)为模板，利用引物对SEQID NO.： 26和SEQ ID NO.：27重叠扩增，得到终止子1(序列为：ccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctctactagagtcacactggctcaccttcgggtgggcctttct gcgtttata，SEQ ID NO.：59)。

将上述步骤①-⑤获得的各片段混合，利用Gibson Assembly连接，得到质粒TP2。

⑥以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：28和SEQ ID NO.：29扩增出P106-prs(prs的NCBI refseq ID：NP_415725.1；启动子P106序列为： tttacggctagctcagtcctaggtatagtgctagc，SEQ ID NO.：60)

将上述步骤①和③-⑥获得的各片段混合，利用Gibson Assembly连接，得到质粒TP4。

⑦以pgRNA-bacteria^[3]作为模板，利用引物对SEQ ID NO.：30和SEQ ID NO.：31进行 PCR，得到质粒骨架2。

⑧以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：32和SEQ ID NO.：33扩增出J119-TKTA(tktA的NCBI refseq ID为WP_000098614.1；J119启动子的序列为： ttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagc，SEQ ID NO.：61)

⑨以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：34和SEQ ID NO.：35扩增得到rpe片段(NCBI refseq ID：NP_417845.1)。

⑩利用引物对SEQ ID NO.：36和SEQ ID NO.：37重叠扩增，得到终止子2 (CTCGGTACCAAATTCCAGAAAAGAGGCCTCCCGAAAGGGGGGCCTTTTTTCGTTTTG GTCC，SEQ ID NO.：62)。

将上述步骤⑦-⑩获得的各片段混合，利用Gibson Assembly连接，得到质粒TP5。

以pgRNA-bacteria^[3]作为模板，利用引物对SEQ ID NO.：38和SEQ ID NO.：30扩增，得到质粒骨架3。

以大肠杆菌MG1655基因组为模板，利用引物对SEQ ID NO.：39和SEQ ID NO.：33扩增出J107-TKTA(J107序列为：tttacggctagctcagccctaggtattatgctagc，SEQ ID NO.：63)。

将上述步骤

获得的各片段混合，利用Gibson Assembly连接，得到质粒TP7。

利用限制性内切酶EagI和XmaI，分别对质粒TP2和TP4进行双酶切。利用限制性内切酶EagI和NgoMIV，分别对质粒TP5和TP7进行双酶切。将TP2酶切片段与TP5酶切片段连接，得到质粒TP8。将TP4酶切片段与TP7酶切片段连接，得到质粒TP16。分别利用限制性内切酶EagI和sbfI对质粒TP8(带有P100_prs_rpiA-J119_tktA_rpe片段)和TP16(带有P106_prs_rpiA-J107_tktA_rpe片段)进行酶切。利用引物对SEQ ID NO.：53和SEQ ID NO.：54以POSIP-KO质粒(ACS Synth.Biol.,2013,2(9),pp 537-541)为模板进行PCR扩增，得到线性化的POSIP-KO质粒。通过Gibson Assembly分别将线性化的TP8或TP16片段与线性化的POSIP-KO质粒相连。对连接产物进行转化，37℃复苏培养，卡那霉素抗性筛选。在POSIP-KO质粒介导下，TP8或TP16片段被整合到基因组。将整合有TP8片段的基因组的克隆命名为TS41。将整合有TP16片段的基因组的克隆命名为TS49。

所构建的全部菌株均经测序验证。

上述各步骤的实验条件如下。

PCR扩增体系为：NEB Q5 5×缓冲液10μl，dNTP(每种dNTP各10mM)1μl，正向和反向引物(20μM)各1μl，Q5DNA聚合酶(2.5U/μl)，蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。

Gibson Assembly：将各DNA片段(总体积5μl)加入至15μl Gibson反应缓冲液(E2611L， NEB)，50℃反应1小时。随后，用氯化钙法转化将连接的片段转入大肠杆菌。

氯化钙法转化：取2μl反应液(包含连接产物)，加入50μl Trans5a(Cat.NB.CD201,北京全式金生物技术有限公司)，冰浴30分钟，42℃热激45秒，立即置于冰上2分钟。立即加入500μl LB培养基，200rpm摇床孵育，37℃复苏1小时。取200μl菌液，涂在含有相应抗性的LB平板上。37℃过夜培养，挑取3个阳性单菌落，进行菌落PCR验证，送样测序分析，结果正确的为阳性克隆。

电转化：首先将宿主细胞制备为感受态细胞，取50μl感受态细胞置于冰上，在其中加入待转化的DNA200ng，冰上放置2分钟。随后，将冰浴的混合物转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用Micro-Pulser(Bio-Rad)电穿孔仪，电极参数为电压2.5KV。电击后迅速将900μlLB培养基转移至电击杯中，反复吹打后转移至试管中，200rpm、30℃孵育1.5小时。取200μl菌液涂在含有壮观霉素和卡那霉素的双抗平板上，37℃过夜培养后，挑选单菌落进行PCR验证。

实施例2 TS102、TS52、TS41和TS49菌株发酵生产L-色氨酸效率的测定

从固体平板挑取各菌株，置于含4mL LB液体培养基的试管中，35℃、220rpm培养8-14h；按1:500至1:1000的接种量将菌株转接至含有20mL种子培养基的带挡板的锥形瓶中，35℃、220rpm培养10-12h；将菌株转接至含有500mL摇瓶发酵培养基的发酵摇瓶中，使得初始OD 600为0.6-0.8，35℃、220rpm培养12h。

使用Eclipse XDB-C18反相色谱柱对培养基中的L-色氨酸含量进行测定。流动相A组分：20mM醋酸钠+0.2v/v％三乙胺，85％；B组分：甲醇，15v/v％；流速0.6mL/min；检测器：紫外检测器280nm吸收峰。L-色氨酸的产量以每升发酵液的色氨酸浓度(浓度为g/L)计。

通过如下的方法计算转化率：

生物量为根据培养基的O.D.600测得。

图2示出相对于对照菌株TS102而言，TS52、TS41和TS49菌株发酵生产L-色氨酸的相对产量、相对得率(即，相对转化率)以及生物量。培养基中添加20g/L葡萄糖时，TS52 相对于TS102产量提高34％，TS41相对于TS102产量提高53％，TS49相对于TS102产量提高53％。对照菌株TS102检测到2.05g/L色氨酸，转化率为9.75％。

实施例3 TS102、TS401和TS412菌株发酵生产L-色氨酸效率的测定

根据与实施例2相同的方法，以TS102为对照菌株，测定TS401和TS412菌株发酵生产L-色氨酸的效率。结果如图3所示。TS401菌株相对于TS102产量提高6％，TS412菌株相对于TS102产量提高23％。对照菌株TS102检测到1.74g/L色氨酸，转化率为8.44％。

参考文献

[1]WANG Yao,XU Yang,CHEN Nan,XU Xin-Yi,LIU Wei-Feng,TAO Yong.Novelefficient strategy forλ-Red-mediated gene knock-out/in in Escherichiacoliusing SCLM system[J]. Microbiology China,2015,42(4):699-711.

[2]Appl.Environ.Microbiol.April 2015vol.81no.7 2506-2514.

[3]Cell.2013 Feb 28；152(5):1173–1183.

序列表

<110> 廊坊梅花生物技术开发有限公司

<120> 生产L-色氨酸的菌株及用途

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

acgttaaggg attttgggcg gccgcggcat gccacagcta acaccacgtc g 51

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctatacc aagttatgaa gctagcaggc ccagtctttc gactgagcct t 51

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccccccttgc cacgcgtgag aacgtaaaaa aagcacccat actcaggagc actctcaatt 60

gcatgccaca gctaacacca 80

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agccatctgg ctgccttagt ctccccaacg tcttacggat tagtggttac ggatgtactc 60

gacggatccc tgcagactag 80

<210> 5

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccaacgggcg ttttccgtaa cactgaaaga atgtaagcgt ttacccacta aggtattttc 60

atgataactt ggtatagcat aca 83

<210> 6

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggttgattc gccgtcgcca gaccatcgaa gaattactgg cgctggaatt gctttaactg 60

cgggacggat ccctgcagac tag 83

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgcgacagaa acgattcacc 20

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aggataagcg cagaactaac ccggtactta agcca 35

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taagtaccgg gttagttctg cgcttatcct ttatggtt 38

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctggatagt gttcataagg ctg 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgtgaattcg acaacgtcct 20

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgctagcatt atacctagga ctgagctagc tgtaaactgt ctggagcaga ctcgcaaag 59

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgttccgca agtttttgc 19

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctagctcagt cctaggtata atgctagcac gtaaccatca tcaataaaac cgatggaag 59

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttacagagct ttcaggattg catc 24

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agcgtggatg caatcctgaa agctctgtaa aatcaacgat gtcaatcagg g 51

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccagccact catagaacaa c 21

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cggccgagat ctttagaatt ccagaaatca tcctta 36

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatccttac tcgagtctag actgcagg 28

<210> 20

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttctggaatt ctaaagatct cggccgttga cggctagctc agtcctaggt acagtgcta 59

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgagaagaac ctcaggcatg cgtccattgg tggaaactgc tagcactgta cctaggact 59

<210> 22

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caatggacgc atgcctgagg ttcttctcat gcctgatatg aagctttttg ctggtaa 57

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tggtatgaaa tttcacacgc attagtgttc gaacatggca gagatcgatt 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccatgttcga acactaatgc gtgtgaaatt tcataccaca ggcgaaacga 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gttttatttg atgcctggct catttcacaa tggttttgac accgtcaggt 50

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aaccattgtg aaatgagcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 50

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agactcgagt aaggatcccg ggtataaacg cagaaaggcc cacccgaa 48

<210> 28

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ttctggaatt ctaaagatct cggccgttta cggctagctc agtcctaggt atagtgcta 59

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gagaagaacc tcaggcatgc gtccattggt ggaaactgct agcactatac ctaggactg 59

<210> 30

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggcctttttt cgttttggtc ctgcaggatc cttactcgag tctagactgc aggct 55

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

taggactgag ctagctgtca aggccggcca tcggccgaga tctttagaat tccagaaat 59

<210> 32

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcagagg gcgtgccctt catcatccg 59

<210> 33

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tttcatccgc ttctccttga gaattatttt ttcgcgggtg attacagcag tt 52

<210> 34

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

taatcacccg cgaaaaaata attctcaagg agaagcggat gaaacagtat ttga 54

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttctggaatt tggtaccgag ttattcatga cttacctttg ccagttcact g 51

<210> 36

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gcaaaggtaa gtcatgaata actcggtacc aaattccaga aaagaggcct cccgaaagg 59

<210> 37

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gtaaggatcc tgcaggacca aaacgaaaaa aggcccccct ttcgggaggc ctcttttct 59

<210> 38

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tagggctgag ctagccgtaa aggccggcca tcggccgaga tctttagaat tccagaaat 59

<210> 39

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tttacggcta gctcagccct aggtattatg ctagcagagg gcgtgccctt catcatccg 59

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

agatgaacga cgcgagttag 20

<210> 41

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ggtttgcaac cactttagcg ctttgcattt tttcggtact actaagacta ttcg 54

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

caaagcgcta aagtggttgc a 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ggaatcgacc tgcgacagta a 21

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ataacgaaat tgtccggcag tg 22

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

catcgtgggt tttccccaat 20

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ctattgggga aaacccacga tgagccaggt gatttctgaa attc 44

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ccactgctga cacttacttg t 21

<210> 48

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ggtataatac tagttgcgtt gtgtttattt aatgttttag agctagaaat agcaagtt 58

<210> 49

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ggtataatac tagtcgcagg aaatcaatga tcaggtttta gagctagaaa tagcaagtt 59

<210> 50

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

actagtatta tacctaggac tgagcta 27

<210> 51

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ggtataatac tagtatcttt ctggttgggc ctatgtttta gagctagaaa tagcaagtt 59

<210> 52

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ggtataatac tagtgtcgaa agggaagagt gggcgtttta gagctagaaa tagcaagtt 59

<210> 53

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

agacaataac cctgataaat gcttcaataa taggatcccc gggtaccgag ctcgaattc 59

<210> 54

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gaaagggggg ccttttttcg ttttggtcct gcatactagt agcggccgct gcaggcatg 59

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

cgcaggaaat caatgatcag 20

<210> 56

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

cagtttacag ctagctcagt cctaggtata atgctagc 38

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

tgcgttgtgt ttatttaat 19

<210> 58

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

<210> 59

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 60

gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt gggcctttct 120

gcgtttata 129

<210> 60

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tttacggcta gctcagtcct aggtatagtg ctagc 35

<210> 61

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagc 35

<210> 62

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

ctcggtacca aattccagaa aagaggcctc ccgaaagggg ggcctttttt cgttttggtc 60

c 61

<210> 63

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

tttacggcta gctcagccct aggtattatg ctagc 35

Claims

1.一种生产L-色氨酸的细菌，其中，所述细菌具有降低的以NCBI refseq ID: NP_416366.1示出的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性；并且所述细菌中的如下的酶的表达或活性提高：以NCBI refseq ID: WP_000098614.1示出的转酮醇酶、以NCBI refseqID: NP_417845.1示出的核酮糖-5-磷酸差向异构酶、以NCBI refseq ID: NP_417389.1示出的核糖-5-磷酸异构酶以及以NCBI refseq ID: NP_415725.1示出的磷酸核糖焦磷酸合成酶A；所述细菌敲除了基因组上的以NCBI Gene ID: 947314示出的galR基因，且使用以NCBI Gene ID: 946858示出的glK基因替换所述细菌基因组上的以NCBI GeneID：945651示出的ptsG基因；

并且其中，所述细菌的出发菌株为大肠杆菌野生型W3110，且所述大肠杆菌野生型W3110的基因组上的基因tnaA、serA和trpR被敲除。

2.如权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌中以NCBI Gene ID: 946370示出的zwf基因被敲除或失活。

3.如权利要求2所述的细菌，其中，对所述zwf基因的启动子进行改造，使得zwf基因失活。

4.如权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌中如下的基因被过表达：以NCBI Gene ID:947420示出的tktA、以NCBI Gene ID: 947896示出的rpe、以NCBI Gene ID: 947407示出的rpiA、以及以NCBI Gene ID: 945772示出的prs。

5.如权利要求1-4中任一项所述的细菌，其中，所述大肠杆菌中以NCBI Gene ID:946370示出的zwf基因被敲除或失活；以及

以NCBI Gene ID: 947314示出的galR基因被敲除，以Gene ID: 946858示出的glK基因被过表达，且以NCBI Gene ID: 947420示出的tktA、以NCBI Gene ID: 947407示出的rpiA、以NCBI Gene ID: 947896示出的rpe以及以NCBI Gene ID: 945772示出的prs基因被过表达。

6.一种提高细菌的L-色氨酸产量的方法，所述方法包括：对所述细菌进行基因修饰，使得所述细菌中以NCBI refseq ID: NP_416366.1示出的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低；并且所述细菌中的如下的酶的表达或活性提高：以NCBI refseq ID: WP_000098614.1示出的转酮醇酶、以NCBI refseq ID: NP_417845.1示出的核酮糖-5-磷酸差向异构酶、以NCBI refseq ID: NP_417389.1示出的核糖-5-磷酸异构酶以及以NCBIrefseq ID: NP_415725.1示出的磷酸核糖焦磷酸合成酶A；还包括对所述细菌进行如下修饰：敲除所述细菌的基因组上的以NCBI Gene ID: 947314示出的galR基因，且使用以NCBIGene ID: 946858示出的glK基因替换所述细菌基因组上的以NCBI GeneID：945651示出的ptsG基因；

7.如权利要求6所述的方法，其中，将所述细菌中的以NCBI Gene ID: 946370示出的zwf基因敲除或失活，使得所述细菌中6-磷酸葡萄糖脱氢酶的表达水平和/或活性降低。

8.如权利要求7所述的方法，其中，对所述zwf基因的启动子进行改造，使得所述细菌中的zwf基因失活。

9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，其中，通过将如下的基因过表达，使得所述细菌中磷酸戊糖途径的非氧化阶段的一种或多种酶的表达水平和/或活性增强：以NCBI GeneID: 947420示出的tktA、以NCBI Gene ID: 947896示出的rpe、以NCBI Gene ID: 947407示出的rpiA、以及以NCBI Gene ID: 945772示出的prs。

10.一种生产L-色氨酸的方法，所述方法包括：在培养基中接种权利要求1-5中任一项所述的细菌并进行发酵，并收集L-色氨酸。

11.权利要求1-5中任一项所述的细菌在发酵生产L-色氨酸方面的用途。