JP2019213544A - L−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物及びそれを用いたl−トリプトファンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ン生産能を有するエシェリキア属微生物、及び前記微生物を用いてL−トリプトファンを
製造する方法に関する。
剤などの医薬品原料及び健康食品の素材などとして広く使用されてきた。このような、L
−トリプトファンは、化学合成法、酵素反応法、発酵法などを経て製造されることができ
るが、現在では微生物を用いた直接発酵法が主に用いられている。
スホエノールピルビン酸(phosphoenol pyruvate、PEP)とペントースリン酸経路(pento
se phosphate pathway)の生成物である、エリスロース-4-リン酸(erythrose-4-phosph
ate、E4P)がDAHPシンターゼ(3-Deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate synth
ase、EC 2.5.1.54)により重合反応を始める芳香族生合成経路を有している。前記経路上
でPEPとE4Pはそれぞれリン酸塩(phosphate)と結合されていて、高いエネルギー
を含有した物質である。また、続いた芳香族生合成経路でもEPSPシンターゼ(5-enol
pyruvylshikimate-3-phosphate synthase、EC 2.5.1.19)反応時PEPが反応に参加し、
アントラニル酸塩PRPPトランスフェラーゼ(anthranilate phosphoribosyl transfer
ase、EC 2.4.2.18)の反応でPRPPが使用される。このように、トリプトファン生合成
のためには高エネルギーの物質を多く必要とすると知られている。先行研究によると、2
0個のアミノ酸の中トリプトファン生合成時、最も高い水準のエネルギーを必要とするこ
とが細胞内実際定量分析により証明されたことがある(非特許文献1)。ここで、トリプ
トファンを高濃度に生産する菌株でPEPとE4Pは、前駆体の継続的な供給とエネルギ
ー効率的利用の面で重要な役割をすると考えられる。
2.1.1)をコードするtktA遺伝子(NCBI gene ID: 12931960)の発現を強化させて生
合成を増加させる方法が主に使用されていた(非特許文献2)。また、細胞内エネルギー
水準を維持させるための研究としては高エネルギー物質であるATPを少なく使用させる
方向の研究が多く進行されていた(非特許文献3)。しかし、依然としてL−トリプトフ
ァンを高効率で生産するための方法開発の必要性が高かった。
開発するために鋭意努力した結果、トリプトファン生産菌株内で合成されるE4Pの分解
を防ぎ細胞内E4P濃度を維持し、付随的に不必要に消費されるエネルギーを保存する方
法を開発し、その結果としてトリプトファン生成能が向上されることを確認して、本発明
を完成した。
供することにある。
−トリプトファンを製造する方法を提供することにある。
有するホスファターゼの活性が不活性化されるように変異された、L−トリプトファン生
産能を有するエシェリキア属(Escherichia)微生物を提供する。例えば、前記L−トリ
プトファン生産能を有するエシェリキア属微生物は内在的ホスファターゼの活性が不活性
化されるように変異されないL−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物に
比べて、トリプトファン生産能が増加された微生物であってもよい。
つで、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式がC11H12N2O2
である芳香族L−アミノ酸をいう。微生物において、生産能を増加させるために、既存に
はトリプトファン生産菌株からエリスロース-4-リン酸(erythorse-4-phosphate、E4P)
のような前駆体の継続的な供給とエネルギーの効率的な利用のため、tktA遺伝子の発
現を強化させるか、生合成経路での側枝経路を遮断して生合性を増加させる方法またはA
TPを少なく使用する方法などが使用されてきた。
去する反応を触媒するタンパク質であってもよい。本発明における「配列番号1のアミノ
酸配列を有するホスファターゼ」は、遺伝子yidAによりコードされるタンパク質であ
って、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)DBには糖リン酸ホスファターゼと命
名されており、(NCBI gene ID: 12933583)、EcoCycDB(http://www.ecocyc.or
g)上には糖ホスファターゼと命名されている。前記タンパク質は糖リン酸を基質として
、糖とリン酸に分解する反応を触媒する。しかし、前記酵素とトリプトファン生産強化に
対する関連性は明らかにされていない。
体的には80%以上、より具体的には90%以上、さらに具体的には95%以上、もっと
さらに具体的には98%以上、最も具体的には99%以上の相同性を示すアミノ酸配列と
して実質的に前記酵素と同一または相応する効能を示す酵素であれば、制限なく含まれる
。また、このような相同性を有し、各酵素に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、
一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する酵素変異体も本発
明の範囲内に含まれることは自明である。
ドすることができる配列であれば、制限なく含まれてもよく、yidA遺伝子と表すこと
ができる。具体的に、前記酵素をコードする遺伝子は配列番号2で記載した塩基配列だけ
でなく、前記配列と80%以上、具体的には90%以上、より具体的には95%以上、さ
らに具体的には98%以上、最も具体的には99%以上の相同性を示す塩基配列であって
、実質的に前記酵素を同一または相応する効能を示す酵素をコードする遺伝子配列であれ
ば、制限なく含まれる。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列
が欠失、変形、置換または付加された塩基配列も本発明の範囲内に含まれることは自明で
ある。
(moiety)との間の同一性のパーセントをいう。一つの部分から、もう一つの部分までの
配列間相同性は、公知となった当該技術により決定することができる。例えば、相同性は
、配列情報を整列し、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて2つのポリヌク
レオチド分子または2つのポリペプチド分子間の配列情報、例えば、スコア(score)、
同一性(identity)及び類似度(similarity)などのパラメータ(parameter)を直接整
列して決定することができる(例えば、BLAST2.0)。また、ポリヌクレオチド間
の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドを混成化
した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解し、分解された断片の大きさを決定することに
より、決定することができる。
に有している酵素の活性状態を意味する。
天然型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現されない場合及び/または発現してもそ
の活性がないか、減少されたことを意味する。
たは変形前の状態で有している酵素の活性と比較したとき、その活性がないか、減少され
たことを意味する。前記減少は、前記酵素をコードする遺伝子の変異などにより酵素自体
の活性が本来の微生物が有している酵素の活性に比べて低い場合と、これをコードする遺
伝子の発現阻害または翻訳(translation)阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の
程度が、天然型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む概
念である。
知られている様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、前記
酵素の活性が削除された場合を含めて、前記酵素の活性が減少されるように突然変異され
た遺伝子で、染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法;前記酵素をコード
する遺伝子の一部または全体を欠失させる方法;前記酵素をコードする遺伝子の発現調節
配列を活性が弱いか、またはない配列で交替する方法;前記酵素をコードする染色体上の
遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法;前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の
全体または一部を欠失させる方法;前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前
記mRNAから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、アン
チセンスRNA)を導入する方法;前記酵素をコードする遺伝子のSD配列の前段にSD
配列と相補的な配列を人為的に付加して2次構造を形成させ、リボソーム(ribosome)の
付着を不可能にする方法及び該当配列のORF(open reading frame)の3’末端に逆転
写されるようにプロモータを付加するRTE(Reverse transcription engineering)方
法などがあり、これらの組み合わせでも達成することができるが、前記例により、特に制
限されるものではない。
体挿入用ベクターを通じて染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチ
ドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交換するこ
とにより行うことができる。このような遺伝子の一部または全体を欠失する方法の一例と
して、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を使用することができる。
1〜300個、具体的には1〜100個、より具体的には1〜50個であり得るが、特に
これらに制限されるものではない。
する遺伝子鎖の座位で連結交換を通じて起こる遺伝子組み換えを意味する。
入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を
誘導して行うか、またはさらに弱いプロモーターで交替するなどの方法により行うことが
できる。前記発現調節配列にはプロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位を
コードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含む。
うに遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによ
り配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに弱い活性を有するように改良された遺伝
子配列または活性がないように改良された遺伝子配列で交換することにより行うことがで
きる。
の内在的活性を不活性化させるため、当該ホスファターゼをコードする遺伝子であるyi
dAを欠失させた、トリプトファン生産能を有する多様な大腸菌がyidAを欠失させな
い親菌株に比べてL−トリプトファンの生産能が増加することを確認して、内在的ホスフ
ァターゼの活性を不活性化させた、変異されたL−トリプトファン生産能を有するエシェ
リキア属微生物がL−トリプトファンを効率的に生産することができることを確認した。
L−トリプトファンを生産することができる微生物をいう。また、前記L−トリプトファ
ンを生産する微生物は組換え微生物であってもよい。具体的に、L−トリプトファンを生
産することができれば、その種類が特に制限されないが、エンテロバクタ(Enterbacter
)属、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serrat
ia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属
及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物であってもよく、具体的に
はエシェリキア(Escherichia)属に属する微生物であってもよい。
herichia coli)であってもよいが、ホスファターゼ活性が不活性化されL−トリプトフ
ァン生産能が増加されることができるエシェリキア属に属する微生物は制限なく含まれる
。
産能を有するエシェリキア属微生物の親菌株は、トリプトファン生産能を有する微生物で
あれば特に制限されない。トリプトファン生産能を有する微生物は、その例として、トリ
プトファン生合成経路を強化するために、競争経路の遺伝子、トリプトファンオペロンの
方向性経路の調節者、トリプトファン流入遺伝子、トリプトファン流入及び分解遺伝子の
活性の弱化または不活性化させるか、及び/またはトリプトファンオペロンの活性を過発
現させた微生物であってもよい。前記活性の弱化または不活性化方法は、前記で説明した
通りであり、公知の方法は制限なく含まれことができる。また、トリプトファンオペロン
活性の過発現は、公知の方法は制限なく含まれるが、その例としてオペロン遺伝子の塩基
配列の一部または全部、そのもの、あるいは外部から導入された発現調節部位を含むポリ
ヌクレオチドをさらに染色体に挿入する方法、ベクターシステムに導入する方法によりコ
ピー数を増加させる方法、遺伝子の発現を調節する発現調節部位を他の調節配列に置換、
発現調節部位の塩基配列の全体または一部の突然変異が誘発された変形、遺伝子自体の変
異導入によるオペロン活性強化などによる方法などを含むことができるが、これに限定さ
れるものではない。具体的には、pheA、trpR、mtr及びtnaAB遺伝子の全
体または一部が欠失、及び/またはトリプトファンオペロンが過発現された大腸菌であっ
てもよい。
オペロン及び、これらがコードするタンパク質配列を初めとして、本発明で使用される遺
伝子及びタンパク質の配列は、公知のデータベースから得ることができ、その例としてN
CBIのGenBankなどから得られるが、これに限定されない。また、pheA、t
rpR、mtr及びtnaAB遺伝子に関する具体的な内容は、特許文献4、特許文献1
に記載されている内容を参考にすることができ、前記特許の明細書全体は、本発明の参考
資料として含めることができる。
性化させた結果、トリプトファン生産能を有しているエシェリキア属微生物であれば、親
菌株の種類に関係なく、前記ホスファターゼの活性を不活性化させる場合には、L−トリ
プトファンの生産能が有意に向上することが確認された。
ターゼの活性が不活性化されるように変異された、L−トリプトファン生産能を有するエ
シェリキア属微生物を培地で培養する段階;及び前記培養による培地または前記微生物か
らL−トリプトファンを回収する段階を含む、L−トリプトファンの製造方法を提供する
。
ア属微生物の培養に使用される培地であれば特に制限なく、いずれも使用することができ
るが、具体的には、本発明の微生物を適切な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミ
ノ酸、及び/またはビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件の下で温度、pH
などを調節しながら培養することができる。
トース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物;糖アルコール、グリセロール、ピ
ルビン酸、乳酸、クエン酸などのアルコール;有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシ
ンなどのアミノ酸などが含まれることができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラック
ストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄
養源を使用することができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜(すなわ
ち、還元糖に転換された糖蜜)などの炭水化物を使用することができ、その他の滴定量の
炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用したり、
2種以上を組み合わせて使用することができるが、これに限定されるものではない。
モニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
;グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、NZ-アミン、肉類
抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類また
はその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源を使用するこ
とができる。これらの窒素源は、単独で使用したり、2種以上を組み合わせて使用するこ
とができるが、これに限定されるものではない。
トリウム含有塩などが含まれることができる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩
化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなど
が使用されることができ、その他に、アミノ酸、ビタミン、及び/または適切な前駆体な
どが含まれることができる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式
で添加することができる。
、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のpHを調整するこ
とができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用して
気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物
内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体
の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。
とができるが、これに限定されない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるま
で継続することができ、具体的には10時間〜100時間であることができるが、これに
限定されない 。
式、連続式または流加式培養方法などにより、当該技術分野において公知となった適切な
方法を用いて培養液から目的とするL−トリプトファンを回収することができる。
前記回収段階は、精製工程を含むことができる。前記精製工程は当該技術分野で公知とな
った適合した方法を利用して、回収されたL−トリプトファンを精製することができる。
ように変異された、L−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物を提供して
、これを利用しL−トリプトファンをより高収率で効率的かつ経済的に製造することがで
きる効果を示す。これにより、製造されたL−トリプトファンは、動物飼料または飼料添
加剤だけでなく、人間の食品または食品添加物、医薬品などの様々な製品に応用すること
ができる。
明を例示的に説明するためのものに過ぎないため、本発明の範囲がこれら実施例により限
定されると解釈されてはならない。
本実施例では、トリプトファン生産能を有する菌株におけるホスファターゼ活性が不活
性化された菌株を製作しようとした。
プトファン生産能を強化させるため、コリスミ酸ムターゼ(chorismate mutase)/プレフ
ェン酸脱水酵素(prephenate dehydratase、CM-PDT)をコードするpheA遺伝子(NCBI
gene ID: 12934467)とトリプトファン分解酵素(Tryptophanase)をコードするtna
A遺伝子(NCBI gene ID: 12933600)、トリプトファンインポーター(importer)をコー
ドするtnaB遺伝子(NCBI gene ID: 12933602)のオペロン形態であるtnaAB遺伝
子が欠失された、トリプトファン生産能が強化されたW3110trpΔ2菌株(特許文
献1)から、ホスファターゼ(phosphotase)をコードするyidA遺伝子を相同組換え
により欠失させた。
nkoKAなどが開発したラムダレッド組換え酵素(lambda Red recombinase)を用いた
、1段階不活性化(one step inactivation)方法を使用した(非特許文献4)。遺伝子
内部への挿入を確認するためのマーカーとして、pUC19(New England Biolabs (USA
))にrmfプロモーターをライゲーションさせて、pACYC184(New England Bio
lab)から収得された突然変異loxP-CmR-loxPカセットをライゲーションさせて
収得されたpUCprmfmloxPのクロラムフェニコール遺伝子を使用した(特許文
献2)。
ール(chloramphenicol)耐性遺伝子の一部塩基配列を有する配列番号3及び4のプライ
マー組合せを用いてpUCprmfmloxPを鋳型とし、94℃で30秒間変性、55
℃で30秒間アニーリング、72℃で1分間伸長させることで行われたサイクルを30回
繰り返す1次ポリメラーゼ連鎖反応(以下「PCR」)によって、約1.2kbのPCR
産物ΔyidA1stを収得した。その後、PCRを介して得られた1.2kbのPCR
産物ΔyidA1stを0.8%アガロースゲルでの電気泳動後、溶離して2次PCRの
鋳型として使用した。2次PCRは、1次PCRで得られたPCR産物の5’及び3’領
域の20bpの塩基配列を含む配列番号5及び6プライマーの組合わせを用いて、溶離さ
れた1次PCR産物を鋳型とし、94℃で30秒間変性、55℃で30秒間アニーリング
、72℃で1分間伸長させることで行われたサイクルを30回繰り返すことにより実行し
て、約1.3kbのPCR産物ΔyidAを収得した。収得されたPCR産物を0.8%
アガロースゲルでの電気泳動後、溶離して組換えに使用した。
pKD46ベクターで形質転換された大腸菌W3110trpΔ2をコンピテント(comp
etent)の状態で製造した後、1次及び2次PCRを介して得られた1.3kbの断片Δ
yidAを導入して形質転換させた。以後、クロラムフェニコールを含むLB培地で培養
し、クロラムフェニコール耐性を有する1次形質転換体を選別した。
除去した後、pJW168ベクター(非特許文献5)を導入してクロラムフェニコールマ
ーカー遺伝子を菌体から除去した(非特許文献5)。最終的に収得された菌体から、配列
番号7と8のプライマーを用いたPCRを介して得られた約0.5kbPCR産物によっ
てyidA遺伝子が欠失されたことを確認し、前記遺伝子が欠失された菌株をW3110
trpΔ2yidAと命名した。
本実施例ではトリプトファンを生産する別の代表的な大腸菌であるKCCM11166
P(特許文献3)を親菌株として、前記実施例1で記述された方法と同様にホスファター
ゼ(phosphotase)をコードするyidA遺伝子を相同組換えにより欠失させた。
れた約0.5kbPCR産物によってyidA遺伝子が欠失したことを確認し、CA04
-2805と命名した。
前記実施例1で製造したW3110trpΔ2yidAと親菌株であるW3110tr
pΔ2のトリプトファン生成能を比較するために、それぞれの菌株にpCL-Dtrp_a
tt-trpEDCBAとpBAC-Dtrp_att-trpDCBAを形質転換方法によ
り導入した。導入されたベクターは、トリプトファンオペロン調節部位の調節メカニズム
が解除され、トリプトファンを過剰生産できるようにトリプトファンオペロン発現が強化
されたベクターである(特許文献1)。ベクターが導入された菌株は、下記表2の組成に
従って製造されたトリプトファン評価培地で培養してL−トリプトファン生産能を比較し
た。
の25ml評価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを37℃、200rpの培養器で4
8時間培養してトリプトファン濃度を比較した(表3)。
前記実施例2で作製したyidA欠損株(CA04-2805)と親菌株であるKCC
M11166Pのトリプトファン力価を測定するために下記の表4の組成に従って製造さ
れたトリプトファンの力価培地で培養し、L−トリプトファン生産効率の向上を確認した
。
6P及び大腸菌CA04−2805をそれぞれ前記表4の25ml力価培地に一白金耳ず
つ接種した後、これを37℃、200rpmの培養器で48時間培養して糖消費速度及び
トリプトファン濃度を比較した。
欠損された不活性化された菌株でトリプトファン生産能力が増加されることを確認し、前
記菌株を「 CA04−2805」または「 CA04−2805(KCCM11166P
_ΔyidA 」と命名した後、ブダペスト条約の下、国際寄託機関である韓国微生物保存
センター(KCCM)に2014年12月5日に寄託し、受託番号 KCCM11166
P を与えられた。
特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。こ
れに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なもの
ではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する
特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または
変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
受託番号:KCCM11166P
受託日付:20141205
Claims (3)
- 配列番号1のアミノ酸配列を含むホスファターゼ(phosphatase)の活性が不活性化さ
れるように変異された、L−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属(Escherichi
a)微生物。 - 前記エシェリキア属微生物が、大腸菌(Escherichia coli)である、請求項1に記載の
L−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物。 - (i)請求項1または2のエシェリキア属微生物を培地で培養する段階;及び
(ii)前記培養による培地または前記微生物からL−トリプトファンを回収する段階
を含む、L−トリプトファンの製造方法。
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