KR20090075549A - 향상된 ｌ-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한ｌ-쓰레오닌의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 arcA 유전자의 천연 프로모터가 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자의 프로모터로 교체되고, 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제 유전자(ppc)의 프로모터가 리보솜 조절 인자(ribosome modulation factor)의 유전자(rmf)의 프로모터로 교체된 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 형질전환 대장균 및 이를 이용한 L-쓰레오닌 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 대장균은 L-쓰레오닌을 고수율로 생산할 수 있어, 인간 의약 및 약학산업, 사료산업, 특히 동물 사료에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

L-쓰레오닌, 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제(ppc) 유전자, rmf 프로모터, yddG 프로모터, arcA 유전자

Description

향상된 Ｌ-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균 및 이를 이용한 Ｌ-쓰레오닌의 생산 방법{Escherichia coli strain with enhanced L-threonine productivity and method of producing L-threonine using the same}

본 발명은 쓰레오닌 생산성이 향상된 형질전환된 대장균 및 이를 이용하여 L-쓰레오닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

L-쓰레오닌은 필수 아미노산의 일종으로 글루탐산과 더불어 가장 큰 시장을 형성하고 있는 주요 품목 중 하나이다. L-쓰레오닌은 사료 및 식품첨가제, 그리고 동물 성장 촉진제로 널리 사용되고 있으며, 의약품의 합성원료 및 의약용 수액제로도 유용하게 사용되고 있다.

L-쓰레오닌은 주로 인공변이법 또는 유전자 재조합 방법에 의해 개발된 대장균 또는 코리네형 세균(Corynebacterium)을 이용한 발효법으로 생산된다. 대장균, 코리네형 세균, 세라티아속 세균 및 프로덴시아속 세균의 야생형 균주로부터 유도된 인공변이주가 L-쓰레오닌의 생산을 위해 널리 사용되고 있다. 이러한 변이 균주들로는 아미노산 유사체 및 약제 변이 내성주 또는 이들 내성주에 디아미노피멜산, 메티오닌, 라이신 및 이소루이신 영양요구성을 부여한 인공변이주가 공지되어 있 다. 인공변이주를 이용한 L-쓰레오닌 생산방법으로는 대장균 속(Escherichia coli species)에 속하고, 디아미노피멜산(diaminopimelic acid) 및 메티오닌(methionine) 요구성을 가지며, L-쓰레오닌의 생합성이 쓰레오닌의 피드백 저해작용(feedback inhibition)에 의해 영향받지 않도록 변이된 미생물을 이용하는 방법(일본 특허공고 제10037/81호) 등이 있다.

일반적으로 특정 유전자의 발현량을 높이기 위한 방법으로 1개의 미생물이 가지는 유전자의 수를 높여주는 방법이 있으며, 이를 위해 통상 카피 수가 높게 유지되는 플라스미드를 사용한다(Sambrook et al, Molecular cloning, 2판, 1989, 1.3~1.5). 그러나 플라스미드를 이용한 방법은 대부분 최종 목적물이 단백질이거나 2차 대사산물인 경우에 해당된다. 미생물의 생장과 동시에 생성이 시작되는 1차 대사산물의 경우는 생장기에 목적 유전자의 발현 효과를 보지 못하면 유전자 발현에 의한 1차 대사산물의 증가 효과를 기대하기 어렵다. 1차 대사산물의 일종인 쓰레오닌도 동일한 경우에 해당한다. 따라서, 1차 대사산물인 쓰레오닌의 생산성을 높이기 위해 쓰레오닌 생합성 관련 유전자를 포함하는 플라스미드를 균주에 도입하는 방법이 아니라, 쓰레오닌 생합성 관련 유전자를 염색체 DNA 중에 삽입하는 방법이 이용되기도 한다(미국특허: 5,939,307).

유전자 재조합 기술이 발전함에 따라 무작위적 돌연변이법에 의해 개발된 L-쓰레오닌 생산주를 대상으로 부위특이적인 유전자 치환, 유전자증폭 및 결실 등을 도입하여 보다 향상된 L-쓰레오닌 생산주의 개발에 대한 기술들이 보고되고 있다. 최근에는 보다 진일보한 기술로서 미생물의 염색체상의 특정 유전자의 프로모 터(promoter)를 타 유전자의 프로모터로 바꾸어 줌으로써 목적하는 대사산물의 생성을 증가시킨 사례가 있었다(Luke Z. et al , Metabolic Engineering . 8: 79-90, 2006).

쓰레오닌의 생합성에 관련된 유전자 및 이들의 발현을 증가시키는 방법이 다양하게 개발되었으나 보다 경제적으로 높은 수율의 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다.

이에 따라, 본 발명자들은 염색체상의 특정 유전자의 프로모터를 타유전자의 프로모터로 교체하는 기술을 이용하여 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제와 TCA(Tricarboxylic Acid) 사이클의 효소들의 활성에 변화를 주어 L-쓰레오닌을 고수율로 생산하는 미생물을 개발하고자 하였다. L-쓰레오닌을 고수율로 생산하기 위하여 대장균의 염색체상의 천연 프로모터를 교체하여 해당과정 후 L-쓰레오닌 생합성 경로의 첫번째 효소인 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제를 코딩하는 유전자(ppc)의 발현량과 아라비노오스 대사에 관여하는 유전자를 코딩하는 오페론의 전사를 조절하는 ArcA 단백질을 코딩하는 유전자(arcA)의 발현량을 변화시키고, 이에 의해 기존 균주에 비해 L-쓰레오닌 생산능이 향상된 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 고 수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 대장균을 이용하여 L-쓰레오닌을 고 수율로 생산할 수 있는 L-쓰레오닌 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 미생물로서, 염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 유전자(arcA)의 천연 프로모터가 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자(yddG)의 서열번호 16으로 표시된 프로모터로 교체되고, 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)의 천연 프로모터가 리보솜 조절 인자(ribosome modulation factor)를 코딩하는 유전자(rmf)의 서열번호 18로 표시된 프로모터로 교체된 미생물을 제공한다.

본 발명의 미생물에서 천연 프로모터가 교체된 ppc 유전자는 L-쓰레오닌의 생합성 과정 중 포스포에놀파이루베이트(PEP)에서 옥살로아세테이트(OAA)로 전환되는 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 그 발현량이 L-쓰레오닌 생산량과 직접적인 관련이 있다. 또한, 본 발명의 미생물에서 천연 프로모터가 교체된 arcA 유전자는 염색체상의 아라비노오스 대사에 관여하는 유전자를 코딩하는 오페론의 전사를 조절하는 ArcA 단백질을 코딩하며, 그 발현량이 증가되면, TCA 사이클에 관 여하는 효소를 코딩하는 유전자들의 발현량이 감소되는 것으로 알려져 있다(Liu X. et al , J. Biol . Chem . 279:12588-12597, 2006). 한편, ppc 유전자의 산물에 의한 반응에서 생성된 옥살로아세테이트는 시트레이트 신타아제 모노머(gltA)에 의해 TCA(Tricaroboxylic Acid) 사이클로 가는 경로와 L-쓰레오닌 합성 경로인 아스파테이트 아미노트렌스퍼레이즈(aspC)에 의해 L-아스파테이트(ASP)로 가는 두 가지 경로로 나누어지게 된다. 따라서, 본 발명의 미생물은 포스포에놀파이루베이트로부터 보다 많은 양의 옥살로아세테이트를 생성시키고, 생성된 옥살로아세테이트가 TCA 사이클로 가는 양과 아스파테이트 합성 경로로 가는 양의 분배에 변화를 주어 L-쓰레오닌의 생합성량을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 미생물은 L- 쓰레오닌을 생산할 수 있고, 염색체상의 arcA 유전자의 프로모터가 yddG 유전자의 프로모터로 교체되고, ppc 유전자의 프로모터가 rmf 유전자의 프로모터로 교체된 원핵 및 진핵 미생물을 포함할 수 있다. 예를 들면 에스케리키아 (Escherichia) 속, 어위니아 (Erwinia) 속, 세라티아 (Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움 (Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 본 발명의 미생물은 바람직하게는, 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae) 과에 속하는 미생물이고, 더욱 바람직하게는 에스케리키아 속에 속하는 미생물이다. 가장 바람직하게는 대장균(Escherichia coli) CA30054 (KCCM 10911)이다.

또한, 본 발명의 미생물은 천연 미생물 외에, L-쓰레오닌 생산용 변이 미생 물도 포함할 수 있다. 이와 같은 변이 미생물은 예를 들면, L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균에 속하는 미생물일 수 있다. 즉, 본 발명의 미생물은 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 라이신 유사체에 대한 내성, 이소루이신 유사체에 대한 내성 및 메티오닌 유사체에 대한 내성을 갖는 대장균일 수 있다. L-메티오닌 유사체는 예를 들면, D,L-에티오닌, 노르루이신, α-메틸메티오닌, 및 L-메티오닌-D,L-술폭시민으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있고, L-쓰레오닌 유사체는 α-아미노-β-히드록시 발레르산 및 D,L-쓰레오닌 히드록사메이트로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있으며, L-라이신 유사체는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 및 δ-메틸-L-라이신으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 변이 미생물은 L-쓰레오닌 생합성 중간체인 옥살로아세테이트 (OAA)를 포스포에놀파이루베이트(PEP)로 전환하는데 관여하는 pckA 유전자가 불활성화된 미생물, 또는 옥살로아세테이트로부터 아스파테이트로 전환하는 lysC 유전자를 억제하는 tyrR 유전자가 불활성화된 미생물, 또는 포도당 유입에 관여하는 galP 유전자의 발현을 억제하는 galR 유전자가 불활성화된 미생물을 포함할 수 있다.

본 발명의 미생물에서 염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 유전자(arcA) 및 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제 유전자(ppc)의 프로모터는 각 각 그 발현을 증가시키기 위해 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자(yddG) 및 리보솜 조절 인자를 코딩하는 유전자(rmf)의 프로모터로 교체된다. 본 발명에서 사용된 yddG 및 rmf의 프로모터는 각각 높은 발현율을 갖는 yddG 및 rmf 유전자로부터 유래될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 16 및 18로 표시되는 서열을 가질 수 있다.

또한 본 발명은 염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 유전자(arcA)의 천연 프로모터가 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자(yddG)의 서열번호 16으로 표시된 프로모터로 교체되고, 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)의 천연 프로모터가 리보솜 조절 인자(ribosome modulation factor)를 코딩하는 유전자(rmf)의 서열번호 18로 표시된 프로모터로 교체된 미생물을 배양하는 단계 및 상기 미생물의 배양액으로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 L-쓰레오닌 제조 방법에서 상기 형질전환된 미생물은 대장균일 수 있고, 바람직하게는 상기 미생물은 대장균 CA30054(KCCM 10911)일 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되지 않는다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따르면 염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 유전자(arcA)의 천연 프로모터가 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자(yddG)의 서열번호 16으로 표시된 서열의 프로모터로 교체되고, 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)의 천연 프로모터가 리보솜 조절 인자(ribosome modulation factor)를 코딩하는 유전자(rmf)의 서열번호 18로 표시된 서열의 프로모터로 교체된 대장균의 경우 포스포에놀파이루베이트로부터 L-쓰레오닌 생합성의 전구체인 옥살로아세테이트 (oxaloacetate)로 전환해 주는 효소인 ppc 유전자의 발현량 및 TCA 사이클에 관여하는 효소의 발현량에 영향을 미치는 arcA 유전자의 발현량이 증가되어 L-쓰레오닌 생산량을 8.7 % 이상 향상시키는 효과가 있다. 본 발명의 미생물은 고수율로 L-쓰레오닌을 생산할 수 있어 의약 및 약학산업, 사료산업, 특히 동물 사료에 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

실시예 1. 재조합 벡터 pUCprmfmloxP 의 제작

(1) Prmf 단편의 준비

rmf 유전자의 프로모터(서열번호 18)를 포함하는 DNA 단편 0.3 kb를 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생주인 W3110의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다. rmf 프로모터를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 1 및 2의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 55℃에서 30 초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 2분30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다.

상기 PCR 결과물을 KpnI과 EcoRV로 절단하여 0.3Kb 크기의 DNA 단편(이하, "Prmf 단편"이라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다.

(2) 재조합 벡터 pUC - Prmf 의 제작

도 1은 rmf의 프로모터를 포함하는 재조합 벡터 pUC-Prmf의 제작 과정을 도시한다.

pUC19 (New England Biolabs (USA)) 플라스미드 및 실시예 1-1에서 수득한 Prmf 단편을 각각 제한효소 KpnI과 SmaI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC-Prmf 플라스미드를 제작하였다.

(3) 재조합 벡터 pUCprmfmloxP 의 제조

도 2는 재조합 벡터 pUCprmfmloxP의 제작 과정을 도시한다.

일반적으로, 1-단계 불활성화(One-step inactivation)에 의한 유전자 결실 실험시 한 개의 유전자 결실마다 염색체 DNA에 재조합효소(recombinase)의 인식 부위인 loxP 서열이 1개씩 남게 된다. 이와 같이 염색체 내에 남게 되는 loxP 서열로 인해 추가적인 균주제작시 제작 효율이 크게 떨어질 수 있다는 것이 보고된 바 있다(Nagy A., Genesis, 26:99, 2000). 한편, Suzuki 등은 lox71과 lox66으로 명명한 돌연변이 loxP를 이용한 개선된 유전자 결실방법에 대해 보고한바 있다(Appl. Environ. Microbiol. 71:8472, 2005). 이에 본 발명자들은 돌연변이 loxP를 이용하여 보다 용이하게 염색체상의 ppc 유전자의 프로모터를 교체하고자 돌연변이 loxP-Cm^R-loxP 카세트와 rmf 유전자의 프로모터를 동시에 가지는 벡터 pUCprmfmloxP를 제작하였다.

도 2에 도시된 바와 같이, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하고 pACYC184 플라스미드(New England Biolab)를 주형으로 하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하였으며, 그 결과 1.1kb의 PCR 단편을 수득하였다. 상기 실시예 1-2에서 획득한 pUC-Prmf 벡터와 pACYA184를 주형으로 얻은 1.1kb의 DNA를 각각 제한효소 NdeI/KpnI으로 절단한 후 라이게이션 반응을 수행하고 대장균에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균으로부터 통상의 방법으로 정확하게 라이게이션된 DNA를 가진 세포주를 선별하고 이의 배양액으로부터 플라스미드 pUCprmfmloxP를 분리 정제하였다.

실시예 2. 재조합 벡터 pUCpyddGmloxP 의 제작

(1) PyddG 단편의 준비

yddG 유전자의 프로모터(서열번호 16)를 포함하는 DNA 단편 0.3 kb를 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 대장균 야생주인 W3110의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. yddG 프로모터를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링, 및 72℃에서 2분30초의 신장으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다.

상기 PCR 결과물을 KpnI과 EcoRV로 절단하여 0.3Kb 크기의 DNA 단편(이하, "PyddG 단편"이라 명명함)을 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동한 후 용리하여 수득하였다.

(2) 재조합 벡터 pUC - PyddG 의 제작

상기 실시예 1-2와 동일한 방법에 의해, pUC19 (New England Biolabs (USA)) 플라스미드 및 실시예 2-1에서 수득한 PyddG 단편을 각각 제한효소 KpnI과 SmaI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC-PyddG 벡터를 제작하였다.

(3) 재조합 벡터 pUCprmfmloxP 의 제조

상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로, 돌연변이 loxP를 이용하여 보다 용이하게 염색체상의 arcA 유전자의 프로모터를 교체하고자 돌연변이 loxP-Cm^R-loxP 카세트와 yddG 유전자의 프로모터를 동시에 가지는 벡터 pUCpyddGmloxP를 제작하였다.

이를 위해, 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하고 pACYC184 플라스미드(New England Biolab)를 주형으로 하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하였으며, 그 결과 1.1kb의 PCR 단편을 수득하였다.1.1kb의 PCR 단편을 수득하였다. 상기 실시예 2-2에서 획득한 pUC-PyddG 벡터와 pACYA184를 주형으로 얻은 1.1kb의 DNA를 각각 제한효소 NdeI/KpnI으로 절단한 후 라이게이션 반응을 수행하고 대장균에 형질전환하여 통상의 방법으로 정확하게 라이게이션된 DNA를 가진 세포주를 선별하고 이의 배양액으로부터 플라스미드 pUCpyddGmloxP를 분리 정제하였다.

실시예 3. 대장균 KCCM 10541- Prmf - ppc - PyddG - arcA 의 제작

염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 유전자(arcA)(서열번호 15)의 천연 프로모터가 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자(yddG)의 서열번호 16으로 표시된 프로모터로 교체되고, 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)(서열번호 17)의 천연 프로모터가 리보솜 조절 인자(ribosome modulation factor)를 코딩하는 유전자(rmf)의 서열번호 18로 표시된 프로모터로 교체된 대장균을 제조하기 위해, 대장균 KCCM 10541을 대상으로 공지된 1 단계 불활성화(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000)방법을 수행하였다. 본 실시예에서 사용된 대장균 KCCM 10541은 L-쓰레오닌 생산용 균주인 대장균 KFCC 10718(한국특허공고 제92-8395호)로부터 유도된 균주로, 그 친주인 대장균 KFCC 10718은 L-메티오닌 유사체에 대한 내성을 가지며, 메티오닌 영양요구성, L-쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티르산 내성을 가지며, L-쓰레오닌을 생산할 수 있는 대장균이다.

먼저, 염색체상의 ppc 유전자의 프로모터를 rmf 프로모터로 교체하기 위해, 실시예 1에서 제작한 pUCprmfmloxP 플라스미드를 주형으로 서열번호 7 및 9의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하였다. 그 결과 수득한 DNA 단편을 분리 정제하여, 서열번호 8 및 10의 프라이머와 상기 분리정제된 DNA 절편을 주형으로 사용하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 2차 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 얻어진 최종의 DNA 단편을 사용하여 1 단계 불활성화(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000) 방법과 동일한 방법으로 대장균 KCCM 10541의 ppc 유전자에 삽입한 후, 항생제 내성 표식 유전자를 제거하여 ppc의 원형 프로모터가 rmf 프로모터로 교체된 재조합 대장균 KCCM 10541-Prmf-ppc를 제작하였다.

그 후, 염색체상의 arcA 유전자의 프로모터를 yddG 프로모터로 교체하기 위해, 실시예 2에서 제작한 pUCpyddGmloxP 플라스미드를 주형으로 서열번호 11 및 13의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 수득한 DNA 단편을 분리 정제하여, 서열번호 12 및 14의 프라이머와 상기 분리정제된 DNA 절편을 주형으로 사용하여 94℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분의 신장으로 구성된 사이클을 30회 반복하는 2차 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 얻어진 최종의 DNA 단편을 사용하여 1 단계 불활성화(Warner et al., PNAS, 6;97(12):6640, 2000) 방법과 동일한 방법으로 대장균 KCCM 10541-Prmf-ppc의 arcA 유전자에 삽입한 후, 항생제 내성 표식 유전자를 제거하여 arcA의 원형 프로모터가 yddG 프로모터로 교체된 재조합 대장균 KCCM 10541-Prmf-ppc-PyddG-arcA를 제작하였다.

실시예4 . 재조합 미생물의 L- 쓰레오닌 생산성 비교

상기 실시예 3에서 제조한 재조합 미생물을 표 1의 쓰레오닌 역가 배지를 이용하여 삼각플라스크에서 배양하여 L-쓰레오닌 생산성 향상을 확인하였다.

표 1.

조성물	농도 (리터당)
포도당	70 g
KH2PO4	2 g
(NH4)2SO4	25 g
MgSO4 ·7H2O	1 g
FeSO4 ·7H2O	5 mg
MnSO4 ·4H2O	5 mg
DL-메티오닌	0.15 g
효모 추출물	2 g
탄산칼슘	30 g
pH	6.8

33℃ 배양기(incubator)에서 LB 고체 배지 중에 밤새 배양한 대장균 KCCM 10541 및 대장균 KCCM 10541-Prmf-ppc-PyddG-arcA를 각각 표 1의 25 mL 역가 배지에 한 백금이씩 접종한 다음, 이를 33℃, 200 rpm의 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 그 결과가 표 2에 기재된다. 　

표 2에 기재된 바와 같이, 모 균주인 KCCM10541 균주는 48시간 배양하였을 경우 30.0 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하였으나, 본 발명의 상기 실시예 3에서 수득된 대장균 KCCM 10541-Prmf-ppc-PyddG-arcA 균주는 32.7 g/L의 L-쓰레오닌을 생산하여 모 균주에 비해 생산 수율이 8.7% 향상된 L-쓰레오닌 생산성을 나타내었다. 따라서 ppc 유전자의 프로모터를 rmf 유전자의 프로모터로 교체하고, arcA 유전자의 프로모터를 yddG 유전자의 프로모터로 교체한 재조합 균주의 경우, L-쓰레오닌의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다. 상기 형질전환된 대장균 KCCM 10541-Prmf-ppc- PyddG-arcA를 대장균 CA30054로 명명하고 2007년 12월 20일에 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, 이하 "KCCM"라 약칭함)에 수탁번호 KCCM 10911로 기탁하였다.

표 2.

균주	L-쓰레오닌 (g/L)
KCCM 10541 (모균주)	30.0
KCCM 10541-Prmf-ppc-PyddG-arcA	32.7

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.　　　

도 1은 재조합 벡터 pUC-Prmf 제작 과정을 도시한다.

도 2는 재조합 벡터 pUCprmfmloxP의 제작 과정을 도시한다.

<110> CJ Corporation <120> Escherichia coli strain with enhanced L-threonine productivity and method of producing L-threonine using the same <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for rmf promoter <400> 1 cagaggtacc caggaagccg cttctattgc cagaggtacc ccagcctgtt tacgatgatc 60 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for rmf promoter <400> 2 gactgatatc gcctcgtttc cctcatactg gactgatatc gtgaccgata gtcagcgagt 60 60 <210> 3 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atatcatatg taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttatctgccc tgaaccgacg 60 accg 64 <210> 4 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aattccatgg taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgcatca cccgacgcac 60 tttgc 65 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yddG promoter <400> 5 cagaggtacc gggcaaagcc caatgccgct 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for yddG promoter <400> 6 gactgatatc gctcgctgtt ttgtctctct 30 <210> 7 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st PCR primer for rmf promoter <400> 7 cttgcgcatc ttatccgacc tacacctttg gtgttacttg gggcgatttt aaggcgatta 60 agttgggtaa cttgcgcatc ttatccgacc tacacctttg gtgttacttg gggcgatttt 120 aaggcgatta agttgggtaa 140 <210> 8 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR primer for rmf promoter <400> 8 atccggcact gttgccaaac tccagtgccg caataatgtc ggatgcgata cttgcgcatc 60 ttatccgacc atccggcact gttgccaaac tccagtgccg caataatgtc ggatgcgata 120 cttgcgcatc ttatccgacc 140 <210> 9 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st PCR for rmf promoter <400> 9 ttgccgagca tactgacatt actacgcaat gcggaatatt gttcgttcat gatatctttc 60 cctcatactg gttgccgagc atactgacat tactacgcaa tgcggaatat tgttcgttca 120 tgatatctcc ttaactgtat g 141 <210> 10 <211> 140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR for rmf promoter <400> 10 gttcaagaat gtgttctccc aacgcatcct tgatggtttc tcccagcact ttgccgagca 60 tactgacatt gttcaagaat gtgttctccc aacgcatcct tgatggtttc tcccagcact 120 ttgccgagca tactgacatt 140 <210> 11 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st PCR for yddG promoter <400> 11 ccgcgaaccg ggtgatcact gtcaacttat tacgcggtgc gaatttacaa aaggcgatta 60 agttgggtaa 70 <210> 12 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR for yddG promoter <400> 12 cgaccagaat aatcgttata cgcatattgc cactcttctt gatcaaataa ccgcgaaccg 60 ggtgatcact 70 <210> 13 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st PCR for yddG promoter <400> 13 ttgcgtgtta ccaactcgtc ttcaacgata agaatgtgcg gggtctgcat gatatctgtt 60 ttgtctctct tg 72 <210> 14 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd PCR primer for yddG promoter <400> 14 tcgcttcgaa aacatcatag ccttccgctt cgaaaatact tttcaacgtg ttgcgtgtta 60 ccaactcgtc 70 <210> 15 <211> 717 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> gene <222> (1)..(717) <223> arcA gene <400> 15 atgcagaccc cgcacattct tatcgttgaa gacgagttgg taacacgcaa cacgttgaaa 60 agtattttcg aagcggaagg ctatgatgtt ttcgaagcga cagatggcgc ggaaatgcat 120 cagatcctct ctgaatatga catcaacctg gtgatcatgg atatcaatct gccgggtaag 180 aacggtcttc tgttagcgcg tgaactgcgc gagcaggcga atgttgcgtt gatgttcctg 240 actggccgtg acaacgaagt cgataaaatt ctcggcctcg aaatcggtgc agatgactac 300 atcaccaaac cgttcaaccc gcgtgaactg acgattcgtg cacgcaacct actgtcccgt 360 accatgaatc tgggtactgt cagcgaagaa cgtcgtagcg ttgaaagcta caagttcaat 420 ggttgggaac tggacatcaa cagccgttcg ttgatcggcc ctgatggcga gcagtacaag 480 ctgccgcgca gcgagttccg cgccatgctt cacttctgtg aaaacccagg caaaattcag 540 tcccgtgctg aactgctgaa gaaaatgacc ggccgtgagc tgaaaccgca cgaccgtact 600 gtagacgtga cgatccgccg tattcgtaaa catttcgaat ctacgccgga tacgccggaa 660 atcatcgcca ccattcacgg tgaaggttat cgcttctgcg gtgatctgga agattaa 717 <210> 16 <211> 300 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> promoter <222> (1)..(300) <223> yddG promoter <400> 16 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gatcttcgcc 2160 tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220 gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280 tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340 tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400 ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460 gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520 gtattgcagg ccgagttgct gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg 2580 gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640 aataccggct aa 2652 <210> 18 <211> 317 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> promoter <222> (1)..(317) <223> rmf promoter <400> 18 tggccggtgt ctggagtcag gaagccgctt ctattgcaca agagataaag cgtctacctt 60 aattataaag atttgtaaat ataaccgtct ccggtatgtt gcctgaggcg gtttttttgt 120 ttctaacgtg cggaaaaatt tgttcctctt cacatttttt gtacaaccga catgcccgtg 180 tagctcacaa atatgacagt ggcgtgaatt ttgcgcattg acggcagtta tgattcgcgg 240 tattgcttaa ctgtgattgc acatttagta atcactgttt tcttttccac cagaaaccag 300 tatgagggaa acgaggc 317

Claims (4)

1. 염색체상의 전사 조절자인 ArcA 단백질을 코딩하는 arcA 유전자의 천연 프로모터가 메틸바이올로겐 배출 관련 단백질인 YddG를 코딩하는 유전자의 서열번호 16으로 표시된 서열의 프로모터로 교체되고, 염색체상의 포스포에놀파이루베이트 카르복실라제 유전자(ppc)의 프로모터가 리보솜 조절 인자(ribosome modulation factor)를 코딩하는 유전자(rmf)의 서열번호 18로 표시된 서열의 프로모터로 교체된, L-쓰레오닌 생산능을 갖는 대장균(Escherichia coli).
2. 제1항에 있어서, 상기 대장균은 메티오닌 요구성, 쓰레오닌 유사체에 대한 내성, 라이신 유사체에 대한 내성, 이소루이신 유사체에 대한 내성 및 메티오닌 유사체에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 것인 대장균.
3. 제1항에 있어서, 상기 대장균은 대장균 CA30054(수탁번호 KCCM 10911)인 것인 대장균.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 대장균을 배양하는 단계 및 상기 대장균의 배양액으로부터 L-쓰레오닌을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 L-쓰레오닌을 생산하는 방법.

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