CN1539015A - 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸 - Google Patents

用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸 Download PDF

Info

Publication number
CN1539015A
CN1539015A CNA028154460A CN02815446A CN1539015A CN 1539015 A CN1539015 A CN 1539015A CN A028154460 A CNA028154460 A CN A028154460A CN 02815446 A CN02815446 A CN 02815446A CN 1539015 A CN1539015 A CN 1539015A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
methionin
site
bar shaped
lysc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028154460A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100554426C (zh
Inventor
布里吉特・巴瑟
布里吉特·巴瑟
・赖内恩
卡罗琳·赖内恩
・默克尔
贝蒂娜·默克尔
格・蒂尔巴赫
格奥尔格·蒂尔巴赫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Evonik Operations GmbH
Original Assignee
Degussa GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa GmbH filed Critical Degussa GmbH
Publication of CN1539015A publication Critical patent/CN1539015A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100554426C publication Critical patent/CN100554426C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Abstract

本发明涉及棒状细菌及通过发酵这些细菌制备化合物的方法，所述细菌除了在天然位点(基因座)具有编码蛋白质或RNA合成的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下，在每种情况下第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合进染色体形式的这种开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝。

Description

用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产L-赖氨酸
现有技术
化合物，尤其L-氨基酸、维生素、核苷和核苷酸以及D-氨基酸，用于人用药、用于制药业、用于化妆品、用于食品业及用于动物营养。
众多的这些化合物是从棒状细菌尤其谷氨棒杆菌菌株中发酵制备的。由于其及其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施。如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或例如通过离子交换层析对产物形式的加工，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变、选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物有抗性或有调节重要性的代谢物是营养缺陷的并产生氨基酸的菌株。
一些年以来，重组DNA技术的方法也已经用于棒杆菌菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。
一种通用的方法包括通过附加型复制质粒扩增特定微生物中某些生物合成基因。这种方法的缺点是在发酵期间(在工业过程中发酵通常进行许多代)，所述质粒自发丧失(分离不稳定性)。
另一种方法包括利用在特定微生物中不复制的质粒倍增一些生物合成基因。在这种方法中，将包括克隆的生物合成基因的质粒整合进该微生物的染色体生物合成基因中(Reinscheid等，应用和环境微生物学60(1)，126-132(1994)；Jetten等，应用微生物学和生物技术学43(1)：76-82(1995))。这种方法的缺点是质粒的核苷酸序列及选择所必需的抗生素抗性基因的核苷酸序列保留在微生物中，这例如对生物量的处理和利用是一个不利因素。另外，专家预期这种菌株由于在相应于工业发酵中常用的代次中通过“坎贝尔典型交换(Campbell typecross over)”的去整合(disintegration)而不稳定。
发明目的
本发明人提供了改良使用棒状细菌发酵生产化合物的新措施。
发明概述
本发明提供了生产化合物的棒状细菌，特征在于这些细菌除了在天然位点(基因座)存在编码蛋白质或RNA合成的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合进染色体形式的这种开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制或转座(is capable of/enables episomal replication or transposition)的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，该第二个、任选地第三个或第四个位点与细菌生长和所希望的化合物生产必需的开放读框(ORF)、基因或等位基因不相关。
本发明还提供了制备一或多种化合物的方法，其中进行以下步骤：
a)发酵这样的棒状细菌，
a1)这些细菌除了在天然位点(基因座)存在编码蛋白质或RNA合成的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在第二个、任选地第三个或第四个位点具有整合进染色体形式的这种开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制或转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，该第二个、任选地第三个或第四个位点与细菌生长和所希望的化合物生产必需的开放读框(ORF)、基因或等位基因不相关，
a2)所述细菌中相应蛋白质的胞内活性提高，尤其是编码这种蛋白质的核苷酸序列被过表达，
b)浓缩发酵肉汤和/或细菌细胞中的化合物，
c)分离所述化合物，任选地
d)伴有＞(大于)0-100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
本发明还提供了制备一或多种化合物的方法，包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下，发酵棒状细菌，特别是棒杆菌菌属，这些细菌除了在天然位点(基因座)存在编码蛋白质或RNA合成的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下，在每种情况下第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合形式的这种开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制或转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤和/或细菌细胞中的化合物，
c)分离所述化合物，任选地
d)伴有＞(大于)0-100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
发明详述
应理解所述化合物特别是指氨基酸，维生素，核苷和核苷酸。现有技术已知并可获得这些化合物的生物合成途径。
氨基酸优选是指L-氨基酸，尤其是蛋白原性L-氨基酸，选自L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸，及它们的盐，特别是L-赖氨酸，L-甲硫氨酸和L-苏氨酸。特别优选L-赖氨酸。
蛋白原性氨基酸应理解为在天然蛋白质中存在的氨基酸，天然蛋白质即微生物、植物、动物和人的蛋白质。
维生素特别是指维生素B1(硫胺素)，维生素B2(核黄素)，维生素B5(泛酸)，维生素B6(吡哆醇)，维生素B12(氰钴胺素)，烟酸/烟酰胺，维生素M(叶酸)和维生素E(生育酚)及它们的盐，优选泛酸。
核苷及核苷酸特别是指S-腺苷甲硫氨酸，肌苷-5′-单磷酸及鸟苷-5′-单磷酸及它们的盐。
棒状细菌特别是棒杆菌属那些细菌。在棒杆菌属中优选谷氨酸棒杆菌，产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)和嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)。这组细菌菌株的分类信息见于Kampfer和Kroppenstedt(加拿大微生物学杂志42，989-1005(1996))及US-A-5,250,434所述。
谷氨酸棒杆菌菌种的合适菌株特别是那些已知的野生型菌株：
    Corynebacterium glutamicum ATCC13032
    Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
    Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
    Corynebacterium lilium ATCC15990
    Corynebacterium melassecola ATCC17965
    Corynebacterium herculis ATCC13868
    Arthrobacter sp.ATCC243
    Brevibacterium chang-fua ATCC14017
    Brevibacterium flavum ATCC14067
    Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
    Brevibacterium divaricatum ATCC14020
    Brevibacterium taipei ATCC13744和
    Microbacterium ammoniaphilum ATCC21645及从中产生的生产化合物的突变体或菌株，如本领域已知的那些突变体或菌株。
产氨棒杆菌(C.ammoniagenes)菌种的合适菌株特别是已知的野生型菌株：
    Brevibacterium ammoniagenes ATCC6871
    Brevibacterium ammoniagenes ATCC15137和
    Corynebacterium sp.ATCC21084及从中产生的生产化合物的突变体或菌株，如本领域已知的那些突变体或菌株。
嗜热产氨棒杆菌(C.thermoaminogenes)菌种的合适菌株特别是已知的野生型菌株：
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1540
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1541和
Corynebacterium thermoaminogenesFERM BP-1542及从中产生的生产化合物的突变体或菌株，如本领域已知的那些突变体或菌株。
具有ATCC标号的菌株可得自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA，美国)。具有FERM标号的菌株可得自国立产业技术综合研究所(National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，AIST Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba Ibaraki，日本)。提及的嗜热产氨棒杆菌菌株(FERM BP-1539，FERM BP-1540，FERM BP-1541和FERM BP-1542)在US-A 5,250,434中描述。
开放读框(ORF)描述了一段编码或可编码一种蛋白质或多肽或核糖核酸的核苷酸序列，现有技术中没有对其功能的描述。
在将一种功能指定给提及的核苷酸序列节段后，其一般称为基因。
等位基因一般是指给定基因的另外的形式。该形式通过核苷酸序列中的不同加以区别。
在本发明中，优选使用内源的即物种特征性开放读框、基因或等位基因。这些应理解为存在于物种群体例如谷氨酸棒杆菌中的开放读框、基因或等位基因或其核苷酸序列。
本发明文中“在天然位点(基因座)存在的开放读框(ORF)、基因或等位基因的一个拷贝”是指ORF或基因或等位基因相对于相邻的ORF或基因或等位基因的位置和情况如存在于相应野生型或相应亲代生物体或起始生物体中一样。
因此，例如lysC基因或编码谷氨酸棒杆菌的反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因的天然位点是lysC位点或lysC基因座或lysC基因位点，其一侧是直接相邻的基因或开放读框orfX和leuA，另一侧是asd基因。
反馈抗性天冬氨酸激酶是指，与野生形式相比，对赖氨酸和苏氨酸的混合物或者AEC(氨基乙基半胱氨酸)和苏氨酸的混合物或者赖氨酸自身或者AEC自身的抑制具有较低敏感性的天冬氨酸激酶。生产L-赖氨酸的菌株典型含有这种反馈抗性或脱敏的天冬氨酸激酶。
已知谷氨酸棒杆菌染色体的核苷酸序列，并可见于专利申请EP-A-1108790及欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，德国和Cambridge，英国)的核苷酸序列数据库登录号AX114121。orfX的核苷酸序列，leuA基因和asd基因的登录号为AX120364(orfX)，AX123517(leuA)和AX123519(asd)。
另外，也可以使用其它数据库例如国立生物技术信息中心数据库(NCBI，Bethesda，MD，美国)或者瑞士生物信息学研究所数据库(Swissprot，Geneva，Switzerland)或者蛋白质信息资源数据库(PIR，Washington，DC，美国)。
“在每种情况下第二个、任选地第三个或第四个位点”是指与天然位点不同的一个位点。在下文也称为“靶位点”或“靶序列”。其也可以称为“整合位点”或“转化位点”。这种第二个、任选地第三个或第四个位点，或者存在于这些相应位点的核苷酸序列，优选在染色体内，而且一般对生长及所希望的化合物的产生是非必需的。
为产生本发明的棒状细菌，分离任选地包括表达和/或调节信号的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，在其末端提供靶位点的核苷酸序列，然后优选借助于在棒状细菌中不复制或只有限复制的载体将这些序列转移进所希望的棒状细菌中，分离所希望的ORF、基因或等位基因掺入靶位点的那些细菌，在该靶位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种生产棒状细菌的方法，所述细菌产生一或多种化合物，所述方法包括：
a)分离至少一种所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任选地包括表达和/或调节信号，
b)将靶位点核苷酸序列提供给所述ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，
c)优选地将具有靶位点核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列掺入一个载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或仅有限程度复制，
d)将b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述棒状细菌中a)的核苷酸序列掺入在靶位点，在该靶位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
优选地，在所述的靶位点没有所用载体的序列或者物种外源DNA的残余，例如限制切割位点。任选地，在该靶位点保留掺入的ORF、基因或等位基因上游或下游的这种DNA的最多24个，优选最多12个，特别优选最多6个核苷酸。
通过本发明的措施，棒状细菌或者制备化合物的发酵方法的产率在选自以下一组的一或多个方面得以改良至少0.5-1.0％或者至少1.0-1.5％或者至少1.5-2.0％：浓度(形成的化合物，基于单位体积)，产量(形成的化合物，基于消耗的碳源)，产物形成速率(形成的化合物，基于时间)。
关于常规的遗传工程方法的指导，例如分离染色体DNA，质粒DNA，操作限制酶等，见于Sambrook等(分子克隆实验指导(1989)，冷泉港实验室出版社)。关于在棒状细菌中转化和接合的指导见于Thierbach等(应用微生物学和生物技术29，356-362(1988))，Schafer等(细菌学杂志172，1663-1666(1990)及基因145，69-73(1994))，及Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84-87(1991))。
仅有限程度复制的载体是指质粒载体，其根据宿主或载体培养条件下而复制或不复制。因此，仅在低于31℃才能复制的棒状细菌的温度敏感性质粒已经由Nakamura等描述(US-A-6,303，383)。
本发明还提供了产生L-赖氨酸的棒状细菌，特别是棒杆菌菌属，其特征在于这些细菌除了在天然位点(基因座)存在用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下，在每种情况下第二个、任选地第三个或第四个位点具有整合形式的相应开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了生产L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下，发酵棒状细菌尤其谷氨酸棒杆菌，这些细菌特征在于除了在天然位点(基因座)存在用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下，在每种情况下第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合形式的相应开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤中的L-赖氨酸，
c)从发酵肉汤中分离L-赖氨酸，任选地
d)伴有＞(大于)0-100％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
“用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有的优选内源性的开放读框、基因或等位基因，其增强/过表达可以具有改良赖氨酸生产的作用。增强是指特定的基因产物、蛋白质或酶的胞内浓度或活性提高。
这些特别包括以下开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T。这些在表1中概括及说明。
这些特别包括编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因。各种lysCFBR等位基因在表2中概括及说明。
优选以下lysCFBR等位基因：lysC A279T(用苏氨酸置换SEQ IDNO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸)，lysC A279V(用缬氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第279位丙氨酸)，lysC S301F(用苯丙氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第301位丝氨酸)，lysC T308I(用异亮氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第308位苏氨酸)，lysCS301Y(用酪氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第301位丝氨酸)，lysC G345D(用天冬氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第345位甘氨酸)，lysC R320G(用甘氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第320位精氨酸)，lysC T311I(用异亮氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第311位苏氨酸)，lysC S381F(用苯丙氨酸置换SEQ ID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第381位丝氨酸)。
特别优选的是lysCFBR等位基因lysC T311I(用异亮氨酸置换SEQID NO：2所示编码的天冬氨酸激酶蛋白的第311位苏氨酸)，其核苷酸序列示于SEQ ID NO：3；编码的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
所述用于赖氨酸生产的开放读框、基因或等位基因的第二，任选地第三或第四拷贝在每种情况下可以整合进第二个、任选地第三个或第四个位点。可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi，poxB和zwa2，特别是基因aecD，gluA，gluB，gluC，gluD和pck。这些在表3中概括并说明。
所述位点当然不仅包括所述开放读框或基因的编码区，还包括位于上游的与表达和调节相关的区域或核苷酸序列，例如核糖体结合位点，启动子，调节蛋白的结合位点，调节核糖核酸的结合位点及弱化子。这些区域一般位于编码区上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，还包括位于下游的区域，例如转录终止子，这些区域一般位于编码下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25个核苷酸范围内。
另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
原噬菌体是指一种噬菌体，特别是其基因组，其与宿主的基因组一起复制且不发生感染颗粒的形成。缺陷噬菌体是指一种原噬菌体，特别是其基因组，其由于各种突变的结果而丧失形成所谓感染颗粒的能力。缺陷噬菌体也称为隐性噬菌体。原噬菌体和缺陷噬菌体通常以整合形式存在于其宿主的染色体中。现有技术中关于其的进一步详述例如Edward A.Birge的教材所述(细菌和噬菌体遗传学，3rded.，Springer-Verlag，美国纽约1994)，或者S.Klaus等的教材所述(Bakterienviren，Gustav Fischer Verlag，Jena，德国1992)。
表1：用于赖氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 名称 所编码的酶或蛋白质的描述  参考文献  登录号
 accBC 酰基辅酶A羧化酶EC 6.3.4.14(酰基辅酶A羧化酶)  Jager et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805  U35023AX123524AX066441
 accDA 酰基辅酶A羧化酶EC 6.4.1.2(酰基辅酶A羧化酶)  EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
 cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A)  EP1108790WO0100804  AX120811AX066109
 cysD 硫酸腺苷酰转移酶亚基IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链)  EP1108790  AX123177
 cysE 丝氨酸乙酰转移酶EC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶)  EP1108790WO0100843  AX122902AX063961
 cysH 3’-磷酸腺苷硫酸还原酶EC 1.8.99.4(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶)  EP1108790WO0100842  AX123178AX066001
 cysK 半胱氨酸合酶EC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶)  EP1108790WO0100843  AX122901AX063963
 cysN 硫酸腺苷酰转移酶亚基IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶)  EP1108790  AX123176AX127152
 cysQ 转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ)  EP1108790WO0100805  AX127145AX066423
 dapA 二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶EC 4.2.1.52(二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶)  Bonnassie et al.NucleicAcids Research 18：6421(1990)Pisabarro et al.，Journal ofBacteriology 175：2743-2749(1993)EP1108790WO0100805EP0435132EP1067192EP1067193  X53993Z21502AX123560AX063773
 dapB 二氢-2，6-吡啶二羧酸还原酶EC 1.3.1.26(二氢-2，6-吡啶二羧酸还原酶)  EP1108790WO0100843EP1067192  AX127149AX063753AX137723
 EP1067193Pisabarro et al.，Journal ofBacteriology175：2743-2749(1993)JP1998215883JP1997322774JP1997070291JP1995075578  AX137602X67737Z21502E16749E14520E12773E08900
 dapC N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶EC 2.6.1.17(N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶)  EP1108790WO0100843EP1136559  AX127146AX064219
 dapD 四氢-2，6-吡啶二羧酸琥珀酰化酶EC 2.3.1.117(四氢-2，6-吡啶二羧酸琥珀酰化酶)  EP1108790WO0100843Wehrmann et al.Journal ofBacteriology180：3159-3165(1998)  AX127146AX063757AJ004934
 dapE N-琥珀酰二氨基酸庚二酸脱琥珀酰化酶EC 3.5.1.18(N-琥珀酰二氨基酸庚二酸脱琥珀酰化酶)  EP1108790WO0100843Wehrmann et al.Microbiology140：3349-3356(1994)  AX127146AX063749X81379
 dapF EC 5.1.1.7(二氨基酸庚二酸差向异构酶)  EP1108790WO0100843EP1085094  AX127149AX063719AX137620
 ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC 1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶)  EP1108790WO0100843Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch 15：3917-3917(1987)JP1997322774JP1993284970Kim et al.，Journal ofMicrobiology andBiotechnology 5：250-256(1995)  AX127152AX063759Y00151E14511E05776D87976
 dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白)  EP1108790  AX127153
 eno 烯醇化酶EC 4.2.1.11(烯醇化酶)  EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998)  AX127146AX064945AX136862
 gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12  EP1108790WO0100844  AX127148AX064941
(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)  Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)  X59403
 gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)  EP1108790WO0100844  AX127146AX064939
 gdh 谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology 6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI  AX127150AX063811X59404X72855
 gnd 6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844  AX127147AX121689AX065125
 lysC 天冬氨酸激酶EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)  EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，MolecularMicrobiology 5：1197-204(1991)  AX120365AX063743X57226
 lysCFBR 天冬氨酸激酶反馈抗性(fbr)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr)  见表2
 lysE 赖氨酸输出蛋白(赖氨酸输出蛋白)  EP1108790WO0100843Vrljic et al.，MolecularMicrobiology 22：815-826(1996)  AX123539AX123539X96471
 msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白)  EP1108790  AX120892
 opcA 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基)  WO0104325  AX076272
 oxyR 转录调节物(转录调节物)  EP1108790  AX122198AX127149
 ppcFBR 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性)  EP0723011WO0100852
 ppc 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)  EP1108790O′Reagan et al.，Gene 77(2)：237-251(1989)  AX127148AX123554M25819
 pgk 磷酸甘油酸激酶EC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)  EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：  AX121838AX127148AX064943X59403
6076-6086(1992)
 pknA 蛋白激酶A(蛋白激酶A) EP1108790  AX120131AX120085
 pknB 蛋自激酶B(蛋白激酶B) EP1108790  AX120130AX120085
 pknD 蛋白激酶D(蛋白激酶D) EP1108790  AX127150AX122469AX122468
 pknG 蛋白激酶G(蛋白激酶G) EP1108790  AX127152AX123109
 ppsA 磷酸烯醇丙酮酸合酶EC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶) EP1108790  AX127144AX120700AX122469
 ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844  AX122210AX127149AX069154
 ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC 2.7.3.9 EP1108790  AX122206AX127149
 ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994)  L18874
 pyc 丙酮酸羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶) WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144：915-927(1998)  A97276Y09548
 pycP458S 丙酮酸羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S EP1108790
 sigC Sigma因子CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C) EP1108790  AX120368AX120085
 sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子) EP1108790  AX120753AX127144
 sigE Sigma因子EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E) EP1108790  AX127146AX121325
 sigH Sigma因子HEC 2.7.7.6(sigma因子SigH) EP1108790  AX127145AX120939
 sigM Sigma因子MEC 2.7.7.6(sigma因子SigM) EP1108790  AX123500AX127145
 tal 转醛酶 WO0104325  AX076272
EC 2.2.1.2(转醛酶)
 thyA 胸苷酸合酶EC 2.1.1.45(胸苷酸合酶) EP1108790  AX121026AX127145
 tkt 转酮酶EC 2.2.1.1(转酮酶) Ikeda et al.，NCBI  AB023377
tpi 丙糖磷酸异构酶EC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶) Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)  X59403
 zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1) EP1111062  AX133781
 zwf 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶) EP1108790WO0104325  AX127148AX121827AX076272
 zwfA213T 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T EP1108790
表2  编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因
 等位基因名称  进一步信息  参考文献 登录号
 lysCFBR-E05108  JP 1993184366-A(序列1) E05108
 lysCFBR-E06825  lysC A279T  JP 1994062866-A(序列1) E06825
 lysCFBR-E06826  lysC A279T  JP 1994062866-A(序列2) E06826
 lysCFBR-E06827  JP 1994062866-A(序列3) E06827
 lysCFBR-E08177  JP 1994261766-A(序列1) E08177
 lysCFBR-E08178  lysC A279T  JP 1994261766-A(序列2) E08178
 lysCFBR-E08179  lysC A279V  JP 1994261766-A(序列3) E08179
 lysCFBR-E08180  lysC S301F  JP 1994261766-A(序列4) E08180
 lysCFBR-E08181  lysC T308I  JP 1994261766-A(序列5) E08181
 lysCFBR-E08182  JP 1994261766-A(序列6) E08182
 lysCFBR-E12770  JP 1997070291-A(序列13) E12770
 lysCFBR-E14514  JP 1997322774-A(序列9) E14514
 lysCFBR-E16352  JP 1998165 180-A(序列3) E16352
 lysCFBR-E16745  JP 1998215883-A(序列3) E16745
 lysCFBR-E16746  JP 1998215883-A(序列4) E16746
 lysCFBR-I74588  US 5688671-A(序列1) I74588
 lysCFBR-I74589  lysC A279T  US 5688671-A(序列2) I74589
 lysCFBR-I74590  US 5688671-A(序列7) I74590
 lysCFBR-I74591  lysC A279T  US 5688671-A(序列8) I74591
 lysCFBR-I74592  US 5688671-A(序列9) I74592
 lysCFBR-I74593  lysC A279T  US 5688671-A(序列10) I74593
  lysCFBR-I74594   US 5688671-A(序列11)   I74594
  lysCFBR-I74595  lysC A279T   US 5688671-A(序列12)   I74595
  lysCFBR-I74596   US 5688671-A(序列13)   I74596
  lysCFBR-I74597  lysC A279T   US 5688671-A(序列14)   I74597
  lysCFBR-X57226  lysC S301Y   EP0387527Kalinowski et al.，Molecular andGeneral Genetics224：317-324(1990)   X57226
  lysCFBR-L16848  lysC G345D   Follettie and SinskeyNCBI NucleotideDatabase(1990)   L16848
  lysCFBR-L27125  lysC R320GlysC G345D   Jetten et al.，AppliedMicrobiologyBiotechnology43：76-82(1995)   L27125
  lysCFBR  lysC T311I   WO0063388(序列17)
  lysCFBR  lysC S301F   US3732144
  lysCFBR  lysC S381F
  lysCFBR   JP6261766(序列1)
  lysCFBR  lysC A279T   JP6261766(序列2)
  lysCFBR  lysC A279V   JP6261766(序列3)
  lysCFBR  lysC S301F   JP6261766(序列4)
  lysCFBR  lysC T308I   JP6261766(序列5)
表3  用于整合赖氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的靶位点
 基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 aecD βC-S裂合酶EC 2.6.1.1(βC-S裂合酶) Rossol et a1.，Journal ofBacteriology 174(9)：2968-77(1992)  M89931
 ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790  AX065267AX127147
 ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790  AX065267AX121594
 citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790  AX120161
 citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790  AX120163
 citE 柠檬酸裂合酶EC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790  AX065421AX127146
 fda 果糖二磷酸醛缩酶EC 4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von der Osten et al.，MolecularMicrobiology 3(11)：1625-37(1989)  X17313
 gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790  AX065953AX123320
 luxS 组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS) EP1108790  AX123323AX127145
 lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790  AX064673AX127144
 lysR2 转录激活物LysR2(转录调节物LysR2) EP1108790  AX123312
 lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790  AX065957AX127150
 menE O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶EC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶) WO0100843EP1108790  AX064599AX064193AX127144
 mqo 苹果酸-醌氧化还原酶(苹果酸-醌氧化还原酶) Molenaar et al.，Eur.Journal ofBiochemistry 1；254(2)：395-403(1998)  AJ224946
 pck 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶) WO0100844  AJ269506AX065053
 pgi 葡萄糖-6-磷酸异构酶EC 5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶) EP1087015EP1108790  AX136015AX127146
 poxB 丙酮酸氧化酶EC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013  AX064959AX137665
 zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790  AX113822AX127146
本发明还提供了一种生产棒状细菌的方法，所述细菌产生L-赖氨酸，所述方法包括：
a)分离用于赖氨酸生产的至少一个所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任选地包括表达和/或调节信号，
b)将靶位点的核苷酸序列提供给所述用于赖氨酸生产的ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，
c)优选地将具有靶位点核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列掺入一个载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或仅有限程度复制，
d)将b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述棒状细菌中a)核苷酸序列掺入靶位点，在该靶位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了产生L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的棒状细菌，特别是棒杆菌菌属，其特征在于除了在天然位点(基因座)存在用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下，在第二个、任选地第三个或第四个位点具有整合形式的相应开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种生产L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸的方法，其包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵棒状细菌，特别是谷氨酸棒杆菌，这些细菌的特征在于除了在天然位点(基因座)存在用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下在第二个、任选地第三个或第四个位点具有整合形式的开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤中的L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸，
c)从发酵肉汤中分离L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸，任选地
d)任选地伴有＞(大于)0-100％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
“用于甲硫氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有的优选地内源的开放读框、基因或等位基因，其增强/过表达可以具有改良甲硫氨酸生产的作用。
这些包括以下开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，aecD，cstA，cysD，cysE，cysH，cysR，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，glyA，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，metA，metB，metE，metH，metY，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwa1，zwf和zwfA213T。这些在表4中概括并说明。这些特别包括编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(见表2)，及编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的homFBR等位基因。
所述用于甲硫氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝在每种情况中可以整合在第二个、任选地第三个或第四个位点。可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：bmE，bmF，bmQ，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，metD，metK，pck，pgi，poxB和zwa2。这些在表5中概括并说明。。
所述位点当然不仅包括所述开放读框或基因的编码区，还包括位于上游的与表达和调节相关的区域或核苷酸序列，例如核糖体结合位点，启动子，调节蛋白的结合位点，调节核糖核酸的结合位点及弱化子。这些区域一般位于编码区上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，还包括位于下游的区域，例如转录终止子，这些区域一般位于编码区下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25个核苷酸范围内。
另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表4：用于甲硫氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 accBC 酰基辅酶A羧化酶EC 6.3.4.14(酰基辅酶A羧化酶) Jager et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805  U35023AX123524AX066441
 accDA 酰基辅酶A羧化酶EC 6.4.1.2(酰基辅酶A羧化酶) EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
 aecD 胱硫醚-β-裂合酶EC 4.4.1.8(胱硫醚-β-裂合酶) Rossol et al.，Joumal ofBacteriology174：2968-2977(1992)  M89931
 cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804  AX120811AX066109
 cysD 硫酸腺苷酰转移酶亚基IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链) EP1108790  AX123177
 cysE 丝氨酸乙酰转移酶EC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶) EP1108790WO0100843  AX122902AX063961
 cysH 3’-磷酸腺苷硫酸还原酶EC 1.8.99.4(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶) EP1108790WO0100842  AX123178AX066001
 cysK 半胱氨酸合酶EC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶) EP1108790WO0100843  AX122901AX063963
 cysN 硫酸腺苷酰转移酶亚基IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶) EP1108790  AX123176AX127152
 cysQ 转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ) EP1108790WO0100805  AX127145AX066423
 dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790  AX127153
 eno 烯醇化酶EC 4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998)  AX127146AX064945AX136862
 fda 果糖二磷酸醛缩酶EC 4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von der Osten et a1.，Molecular Microbiology 3(11)：1625-37(1989)  X17313
 gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 EP1108790  AX127148
EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)  WO0100844Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)  AX064941X59403
 gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)  EP1108790WO0100844  AX127146AX064939
 gdh 谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology 6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI  AX127150AX063811X59404X72855
 glyA 甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶EC 2.1.2.1(甘氨酸/丝氨酸羟甲基转移酶)  EP1108790  AX127146AX121194
 gnd 6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844  AX127147AX121689AX065125
 hom 高丝氨酸脱氢酶EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶)  Peoples et al.，MolecularMicrobiology2：63-72(1988)  Y00546
 homFBR 高丝氨酸脱氢酶反馈抗性EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr)  Reinscheid et al.，Journal ofBacteriology 173：3228-30(1991)
 lysC 天冬氨酸激酶EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)  EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，MolecularMicrobiology 5：1197-204(1991)  AX120365AX063743X57226
  lysCFBR 天冬氨酸激酶反馈抗性(fbr)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr)  见表2
  metA 高丝氨酸乙酰转移酶EC 2.3.1.31(高丝氨酸乙酰转移酶)  Park et al.，Molecular Cells8：286-94(1988)  AF052652
  metB 胱硫醚-γ-裂合酶EC 4.4.1.1(胱硫醚-γ-合酶)  Hwang et al.，MolecularCells 9：300-308(1999)  AF126953
  metE 高丝氨酸甲基转移酶EC 2.1.1.14(高丝氨酸甲基转移酶)  EP1108790  AX127146AX121345
  metH 高丝氨酸甲基转移酶(维生素B12依赖性)EC 2.1.1.14(高丝氨酸甲基转移酶)  EP1108790  AX127148AX121747
 metY 乙酰高丝氨酸sulfhydrolase(乙酰高丝氨酸sulfhydrolase) EP1108790  AX120810AX127145
 msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白) EP1108790  AX120892
 opcA 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基) WO0104325  AX076272
 oxyR 转录调节物(转录调节物) EP1108790  AX122198AX127149
 ppcFBR 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性) EP0723011WO0100852
 ppc 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶) EP1108790O′Reagan et al.，Gene 77(2)：237-251(1989)  AX127148AX123554M25819
 pgk 磷酸甘油酸激酶EC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶) EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)  AX121838AX127148AX064943X59403
 pknA 蛋白激酶A(蛋白激酶A) EP1108790  AX120131AX120085
 pknB 蛋白激酶B(蛋白激酶B) EP1108790  AX120130AX120085
 pknD 蛋白激酶D(蛋白激酶D) EP1108790  AX127150AX122469AX122468
 pknG 蛋白激酶G(蛋白激酶G) EP1108790  AX127152AX123109
 ppsA 磷酸烯醇丙酮酸合酶EC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶) EP1108790  AX127144AX120700AX122469
 ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844  AX122210AX127149AX069154
 ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC 2.7.3.9 EP1108790  AX122206AX127149
 ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994)  L18874
 pyc 丙酮酸羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶) WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144：915-927(1998)  A97276Y09548
 pycP458S 丙酮酸羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S  EP1108790
 sigC Sigma因子CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C)  EP1108790  AX120368AX120085
 sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子)  EP1108790  AX120753AX127144
 sigE Sigma因子EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E)  EP1108790  AX127146AX121325
 sigH Sigma因子HEC 2.7.7.6(sigma因子SigH)  EP1108790  AX127145AX120939
 sigM Sigma因子MEC 2.7.7.6(sigma因子SigM)  EP1108790  AX123500AX127145
 tal 转醛酶EC 2.2.1.2(转醛酶)  WO0104325  AX076272
 thyA 胸苷酸合酶EC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)  EP1108790  AX121026AX127145
 tkt 转酮酶EC 2.2.1.1(转酮酶)  Ikeda et al.，NCBI  AB023377
 tpi 丙糖磷酸异构酶EC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)  Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)  X59403
 zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1)  EP1111062  AX133781
 zwf 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)  EP1108790WO0104325  AX127148AX121827AX076272
 zwfA213T 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T  EP1108790
表5  用于整合甲硫氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的靶位点
 基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 brnE 支链氨基酸转运蛋白(支链氨基酸转运蛋白) EP1096010  AX137709AX137714
 brnF 支链氨基酸转运蛋白(支链氨基酸转运蛋白) EP1096010  AX137709AX137714
 brnQ 支链氨基酸载体蛋白(支链氨基酸转运系统载体蛋白) Tauch et al.，Archives ofMicrobiology169(4)：303-12(1998)WO0100805EP1108790  M89931AX066841AX127150
 ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790  AX065267AX127147
 ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790  AX065267AX121594
 citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790  AX120161
 citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790  AX120163
 citE 柠檬酸裂合酶EC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790  AX065421AX127146
 ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC 1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch 15：3917-3917(1987)EP1108790  S07384AX127152
 gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790  AX065953AX123320
 luxS 组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS) EP1108790  AX123323AX127145
 lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790  AX064673AX127144
 lysR2 转录激活物LysR2 EP1108790  AX123312
(转录调节物LysR2)
 lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3)  WO0100842EP1108790  AX065957AX127150
 menE O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶EC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶)  WO0100843EP1108790  AX064599AX064193AX127144
 metD 转录调节物MetD(转录调节物MetD)  EP1108790  AX123327AX127153
 metK 甲硫氨酸酰苷转移酶EC 2.5.1.6(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)  WO0100843EP1108790  AX063959AX127148
 pck 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)  WO0100844  AJ269506AX065053
pgi 葡萄糖-6-磷酸异构酶EC 5.3.1.9(葡萄糖-6-磷酸异构酶)  EP1087015EP1108790  AX136015AX127146
 poxB 丙酮酸氧化酶EC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶)  WO0100844EP1096013  AX064959AX137665
 zwa2 细胞生长因子2(生长因子2)  EP1106693EP1108790  AX113822AX127146
“用于苏氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有的其增强/过表达可以具有改良苏氨酸生产的作用的开放读框、基因或等位基因。
这些包括以下开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysI，cysN，cysQ，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，gnd，hom，homFBR，lysC，lysCFBR，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，thrB，thrC，thrE，zwal，zwf和zwfA213T。这些在表6中概括并说明。这些特别包括编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysCFBR等位基因(见表2)及编码反馈抗性高丝氨酸脱氢酶的homFBR等位基因。
用于苏氨酸生产的开放读框、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝在每种情况下可以整合入第二个、任选地第三个或第四个位点。为此可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，ilvBN，ilvC，ilvD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，mdh，menE，metA，metD，pck，poxB，sigB和zwa2。这些在表7中概括并说明。
所述位点当然不仅包括所述开放读框或基因的编码区，还包括位于上游的与表达和调节相关的区域或核苷酸序列，例如核糖体结合位点，启动子，调节蛋白的结合位点，调节核糖核酸的结合位点及弱化子。这些区域一般位于编码区上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，还包括位于下游的区域，例如转录终止子，这些区域一般位于编码下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25个核苷酸范围内。
另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表6  用于苏氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 accBC 酰基辅酶A羧化酶EC 6.3.4.14(酰基辅酶A羧化酶) Jager et al.Archives ofMicrobiology(1996)166：76-82EP1108790；WO0100805  U35023AX123524AX066441
 accDA 酰基辅酶A羧化酶EC 6.4.1.2(酰基辅酶A羧化酶) EP1055725EP1108790WO0100805 AX121013AX066443
 cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804  AX120811AX066109
 cysD 硫酸腺苷酰转移酶亚基IIEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶小链) EP1108790  AX123177
 cysE 丝氨酸乙酰转移酶EC 2.3.1.30(丝氨酸乙酰转移酶) EP1108790WO0100843  AX122902AX063961
 cysH 3’-磷酸腺苷硫酸还原酶EC 1.8.99.4(3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸还原酶) EP1108790WO0100842  AX123178AX066001
 cysK 半胱氨酸合酶EC 4.2.99.8(半胱氨酸合酶) EP1108790WO0100843  AX122901AX063963
 cysN 硫酸腺苷酰转移酶亚基IEC 2.7.7.4(硫酸腺苷酰转移酶) EP1108790  AX123176AX127152
 cysQ 转运蛋白CysQ(转运蛋白cysQ) EP1108790WO0100805  AX127145AX066423
 dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790  AX127153
 eno 烯醇化酶EC4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998)  AX127146AX064945AX136862
 fda 果糖二磷酸醛缩酶EC 4.1.2.13(果糖-1，6-二磷酸醛缩酶) von der Osten et al.，Molecular Microbiology 3(11)：1625-37(1989)  X17313
 gap 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)  AX127148AX064941X59403
 gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2)  EP1108790WO0100844  AX127146AX064939
 gdh 谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology 6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI  AX127150AX063811X59404X72855
 gnd 6-磷酸葡糖酸脱氢酶EC 1.1.1.44(6-磷酸葡糖酸脱氢酶)  EP1108790WO0100844  AX127147AX121689AX065125
 hom 高丝氨酸脱氢酶EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶)  Peoples et al.，MolecularMicrobiology2：63-72(1988)  Y00546
 homFBR 高丝氨酸脱氢酶反馈抗性EC 1.1.1.3(高丝氨酸脱氢酶fbr)  Reinscheid et al.，Journal ofBacteriology 173：3228-30(1991)
 lysC 天冬氨酸激酶EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶)  EP1108790WO0100844Kalinowski et al.，MolecularMicrobiology 5：1197-204(1991)  AX120365AX063743X57226
 lysCFBR 天冬氨酸激酶反馈抗性(fbr)EC 2.7.2.4(天冬氨酸激酶fbr)  见表2
 msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白)  EP1108790  AX120892
 opcA 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶亚基)  WO0104325  AX076272
 oxyR 转录调节物(转录调节物)  EP1108790  AX122198AX127149
 ppcFBR 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶反馈抗性)  EP0723011WO0100852
 ppc 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶EC 4.1.1.31(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶)  EP1108790O′Reagan et al.，Gene 77(2)：237-251(1989)  AX127148AX123554M25819
 pgk 磷酸甘油酸激酶EC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)  EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)  AX121838AX127148AX064943X59403
 pknA 蛋白激酶A  EP1108790  AX120131
(蛋白激酶A)  AX120085
 pknB 蛋白激酶B(蛋白激酶B) EP1108790  AX120130AX120085
 pknD 蛋白激酶D(蛋白激酶D) EP1108790  AX127150AX122469AX122468
 pknG 蛋白激酶G(蛋白激酶G) EP1108790  AX127152AX123109
 ppsA 磷酸烯醇丙酮酸合酶EC 2.7.9.2(磷酸烯醇丙酮酸合酶) EP1108790  AX127144AX120700AX122469
 ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H) EP1108790WO0100844  AX122210AX127149AX069154
 ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC 2.7.3.9 EP1108790  AX122206AX127149
 ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II) Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994)  L18874
 pyc 丙酮酸羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶) WO9918228Peters-Wendisch et al.，Microbiology 144：915-927(1998)  A97276Y09548
 pycP458S 丙酮酸羧化酶EC 6.4.1.1(丙酮酸羧化酶)氨基酸交换P458S EP1108790
 sigC Sigma因子CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C) EP1108790  AX120368AX120085
 sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子) EP1108790  AX120753AX127144
 sigE Sigma因子EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E) EP1108790  AX127146AX121325
 sigH Sigma因子HEC 2.7.7.6(sigma因子SigH) EP1108790  AX127145AX120939
 sigM Sigma因子MEC 2.7.7.6(sigma因子SigM) EP1108790  AX123500AX127145
 tal 转醛酶EC 2.2.1.2(转醛酶) WO0104325  AX076272
 thrB 高丝氨酸激酶EC 2.7.1.39(高丝氨酸激酶)  Peoples et al.，MolecularMicrobiology2：63-72(1988)  Y00546
 thrC 苏氨酸合酶EC 4.2.99.2(苏氨酸合酶)  Han et al.，MolecularMicrobiology 4：1693-1702(1990)  X56037
 thrE 苏氨酸输出蛋白(苏氨酸输出载体)  EP1085091  AX137526
 thyA 胸苷酸合酶EC 2.1.1.45(胸苷酸合酶)  EP1108790  AX121026AX127145
 tkt 转酮酶EC 2.2.1.1(转酮酶)  Ikeda et al.，NCBI  AB023377
 tpi 丙糖磷酸异构酶EC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)  Eikmanna，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)  X59403
 zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1)  EP1111062  AX133781
 zwf 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)  EP1108790WO0104325  AX127148AX121827AX076272
  zwfA213T 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶EC 1.1.1.49(葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶)氨基酸交换A213T  EP1108790
表7  用于整合苏氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的靶位点
 基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790  AX065267AX127147
 ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790  AX065267AX121594
 citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790  AX120161
 citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790  AX120163
 citE 柠檬酸裂合酶EC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790  AX065421AX127146
 ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC 1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch 15：3917-3917(1987)EP1108790  S07384AX127152
 gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 glyA 甘氨酸羟甲基转移酶EC 2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶) WO0100843  AX063861AF327063
 ilvA 苏氨酸脱水酶EC 4.2.1.16(苏氨酸脱水酶) Mockel et al.，Journal ofBacteriology 174(24)，8065-8072(1992)EP1108790  A47044L01508AX127150
 ilvBN 乙酰乳酸合酶EC 4.1.3.18(乙酰乳酸合酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology 175(17)：5595-603(1993)EP1108790  L09232AX127147
 ilvC 还原异构酶EC 1.1.1.86(乙酮醇酸还原异构酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology 175(17)：5595-603(1993)EP1108790  C48648AX127147
 ilvD 二羟酸脱水酶 EP1006189  AX136925
EC 4.2.1.9(二羟酸脱水酶)
 luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790  AX065953AX123320
 luxS 组氨酸激酶LuxS(组氨酸激酶LuxS) EP1108790  AX123323AX127145
 lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790  AX064673AX127144
 lysR2 转录激活物LysR2(转录调节物LysR2) EP1108790  AX123312
 lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790  AX065957AX127150
 mdh 苹果酸脱氢酶EC 1.1.1.37(苹果酸脱氢酶) WO0100844  AX064895
 menE O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶EC 6.2.1.26(O-琥珀酰苯甲酸辅酶A裂合酶) WO0100843EP1108790  AX064599AX064193AX127144
 metA 高丝氨酸-O-乙酰转移酶EC 2.3.1.31(高丝氨酸-O-乙酰转移酶) Park et al.，Molecular Cells 30；8(3)：286-94(1998)WO0100843EP1108790  AX063895AX127145
 metD 转录调节物MetD(转录调节物MetD) EP1108790  AX123327AX127153
 pck 磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(磷酸烯醇丙酮酸羧激酶) WO0100844  AJ269506AX065053
 poxB 丙酮酸氧化酶EC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013  AX064959AX137665
 sigB RNA聚合酶转录因子(RNA聚合酶转录因子) EP1108790  AX127149
 zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790  AX113822AX127146
本发明还提供了生产棒状细菌的方法，所述细菌产生L-甲硫氨酸和/或L-苏氨酸，所述方法包括：
a)分离用于甲硫氨酸生产或苏氨酸生产的至少一个所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任选地包括表达和/或调节信号，
b)将靶位点的核苷酸序列提供给用于赖氨酸生产的ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，
c)优选地将具有靶位点核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列掺入一个载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或仅有限程度复制，
d)将b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述中a)核苷酸序列掺入靶位点，在该靶位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了产生L-缬氨酸的棒状细菌，特别是棒杆菌菌属，其特征在于除了在天然位点(基因座)存在用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合形式的相应开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
本发明还提供了一种制备L-缬氨酸的方法，其包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵棒状细菌，特别是谷氨酸棒杆菌，这些细菌的特征在于除了在天然位点(基因座)存在用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合形式的相应开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，
b)浓缩发酵肉汤中的L-缬氨酸，
c)从发酵肉汤中分离L-缬氨酸，任选地
d)伴有＞(大于)0-100％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
“用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的拷贝”是指所有的其增强/过表达可以具有改良缬氨酸生产的作用的开放读框、基因或等位基因。
这些包括以下开放读框、基因或等位基因：brnE，brnF，brnEF，cstA，cysD，dps，eno，fda，gap，gap2，gdh，ilvB，ilvN，ilvBN，ilvC，ilvD，ilvE，msiK，pgk，ptsH，ptsI，ptsM，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tpi，zwa1。这些在表8中概括并说明。这些特别包括编码缬氨酸抗性的乙酰乳酸合酶的ilvBN等位基因。
用于缬氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝在每种情况下可以整合入第二个、任选地第三个或第四个位点。为此可以使用以下开放读框、基因或核苷酸序列：aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，ddh，gluA，gluB，gluC，gluD，glyA，ilvA，luxR，lysR1，lysR2，lysR3，panB，panC，poxB和zwa2。这些在表9中概括并说明。
所述位点当然不仅包括所述开放读框或基因的编码区，还包括位于上游的与表达和调节相关的区域或核苷酸序列，例如核糖体结合位点，启动子，调节蛋白的结合位点，调节核糖核酸的结合位点及弱化子。这些区域一般位于编码区上游的1-800，1-600，1-400，1-200，1-100或1-50个核苷酸范围内。同样，还包括位于下游的区域，例如转录终止子，这些区域一般位于编码区下游的1-400，1-200，1-100，1-50或1-25个核苷酸范围内。
另外可以使用染色体内的基因间区域，即无编码功能的核苷酸序列。最后，还可以使用染色体中包含的原噬菌体或缺陷噬菌体。
表8  用于缬氨酸生产的开放读框、基因和等位基因
 名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 brnEF 支链氨基酸的输出蛋白(支链氨基酸的输出蛋白) EP1096010Kennerknecht et al.，NCBI AF454053
 cstA 碳饥饿蛋白A(碳饥饿蛋白A) EP1108790WO0100804  AX120811AX066109
 dps DNA保护蛋白(饥饿过程中的保护蛋白) EP1108790  AX127153
 eno 烯醇化酶EC 4.2.1.11(烯醇化酶) EP1108790WO0100844EP1090998Hermann et al.，Electrophoresis19：3217-3221(1998)  AX127146AX064945AX136862
 fda 果糖二磷酸醛缩酶EC 4.1.2.13(果糖，1，6-二磷酸醛缩酶) von der Osten et al.，Molecular Microbiology 3(11)：1625-37(1989)  X17313
 gap 甘油醛，3，磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Eikmanns et al.，Journal ofBacteriology174：6076-6086(1992)  AX127148AX064941X59403
 gap2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶EC 1.2.1.12(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2) EP1108790WO0100844  AX127146AX064939
 gdh 谷氨酸脱氢酶EC 1.4.1.4(谷氨酸脱氢酶) EP1108790WO0100844Boermann et al.，MolecularMicrobiology 6：317-326(1992).Guyonvarch et al.，NCBI  AX127150AX063811X59404X72855
 ilvBN 乙酰乳酸合酶EC 4.1.3.18(乙酰乳酸合酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology175(17)：5595-603(1993)EP1108790  L09232AX127147
 ilvC 还原异构酶EC 1.1.1.86(乙酰羟酸还原异构酶) Keilhauer et al.，Journal ofBacteriology175(17)：5595-603(1993)EP1108790  C48648AX127147
 ilvD 二羟酸脱水酶EC 4.2.1.9(二羟酸脱水酶) EP1006189  AX136925
 ilvE 转氨酶BEC2.6.1.42(转氨酶B) EP1108790  AX136925
 msiK 糖输入蛋白(多种糖输入蛋白)  EP1108790  AX120892
 pgk 磷酸甘油酸激酶EC 2.7.2.3(磷酸甘油酸激酶)  EP1108790WO0100844Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1 992)  AX121838AX127148AX064943X59403
 ptsH 磷酸转移酶系统蛋白HEC 2.7.1.69(磷酸转移酶系统成分H)  EP1108790WO0100844  AX122210AX127149AX069154
 ptsI 磷酸转移酶系统酶IEC 2.7.3.9  EP1108790  AX122206AX127149
 ptsM 葡萄糖特异性磷酸转移酶系统酶IIEC 2.7.1.69(葡萄糖磷酸转移酶系统酶II)  Lee et al.，FEMSMicrobiology Letters119(1-2)：137-145(1994)  L18874
 sigC Sigma因子CEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子C)  EP1108790  AX120368AX120085
 sigD RNA聚合酶Sigma因子DEC 2.7.7.6(RNA聚合酶sigma因子)  EP1108790  AX120753AX127144
 sigE Sigma因子EEC 2.7.7.6(胞质外功能替代性sigma因子E)  EP1108790  AX127146AX121325
 sigH Sigma因子HEC 2.7.7.6(sigma因子SigH)  EP1108790  AX127145AX120939
 sigM Sigma因子MEC 2.7.7.6(sigma因子SigM)  EP1108790  AX123500AX127145
tpi 丙糖磷酸异构酶EC 5.3.1.1(丙糖磷酸异构酶)  Eikmanns，Journal ofBacteriology 174：6076-6086(1992)  X59403
 zwa1 细胞生长因子1(细胞生长因子1)  EP1111062  AX133781
表9  用于整合缬氨酸生产的开放读框、基因和等位基因的靶位点
 基因名称 所编码的酶或蛋白质的描述 参考文献  登录号
 aecD βC-S裂合酶EC 2.6.1.1(βC-S裂合酶) Rossol et al.，Journal ofBacteriology 174(9)：2968-77(1992)  M89931
 ccpA1 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A1) WO0100844EP1108790  AX065267AX127147
 ccpA2 分解代谢物控制蛋白(分解代谢物控制蛋白A2) WO0100844EP1108790  AX065267AX121594
 citA 传感蛋白激酶CitA(传感蛋白激酶CitA) EP1108790  AX120161
 citB 转录调节物CitB(转录调节物CitB) EP1108790  AX120163
 citE 柠檬酸裂合酶EC 4.1.3.6(柠檬酸裂合酶) WO0100844EP1108790  AX065421AX127146
 ddh 二氨基酸庚二酸脱氢酶EC 1.4.1.16(二氨基酸庚二酸脱氢酶) Ishino et al.，Nucleic AcidsResearch 15：3917-3917(1987)EP1108790  S07384AX127152
 gluA 谷氨酸转运ATP结合蛋白(谷氨酸转运ATP结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluB 谷氨酸结合蛋白(谷氨酸结合蛋白) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluC 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 gluD 谷氨酸转运通透酶(谷氨酸转运系统通透酶) Kronemeyer et al.，Journal ofBacteriology 177(5)：1152-8(1995)  X81191
 glyA 甘氨酸羟甲基转移酶EC 2.1.2.1(甘氨酸羟甲基转移酶) WO0100843  AX063861AF327063
 ilvA 苏氨酸脱水酶EC 4.2.1.16(苏氨酸脱水酶) Mockel et al.，Journal ofBacteriology 174(24)，8065-8072(1992)EP1108790  A47044L01508AX127150
 luxR 转录调节物LuxR(转录调节物LuxR) WO0100842EP1108790  AX065953AX123320
 lysR1 转录调节物LysR1(转录调节物LysR1) EP1108790  AX064673AX127144
 lysR2 转录激活物LysR2(转录调节物LysR2) EP1108790  AX123312
 lysR3 转录调节物LysR3(转录调节物LysR3) WO0100842EP1108790  AX065957AX127150
 panB 酮泛解酸羟甲基转移酶EC 2.1.2.11(酮泛解酸羟甲基转移酶) US6177264  X96580
 panC 泛酸合成酶EC 6.3.2.1(泛酸合成酶) US6177264  X96580
 poxB 丙酮酸氧化酶EC 1.2.3.3(丙酮酸氧化酶) WO0100844EP1096013  AX064959AX137665
 zwa2 细胞生长因子2(生长因子2) EP1106693EP1108790  AX113822AX127146
本发明提供了一种生产棒状细菌的方法，所述细菌产生L-缬氨酸，所述方法包括：
a)分离用于缬氨酸生产的至少一个所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任选地包括表达和/或调节信号，
b)将靶位点的核苷酸序列提供给用于赖氨酸生产的ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，
c)优选地将具有靶位点核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列掺入一个载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或仅有限程度复制，
d)将b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，所述棒状细菌中a)核苷酸序列掺入靶位点，在该靶位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
在实施本发明期间，可以将lysCFBR等位基因的第二个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的gluB基因中，同时使该gluB基因位点中没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，没有授予的抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM13994glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带lysCFBR等位基因lysC T311I，在第二个位点(靶位点)即gluB基因携带lysCFBR等位基因lysCT311I的第二个拷贝。可以用于实现将lysCFBR等位基因掺入gluB基因的质粒示于图1。所述质粒称为pK18mobsacBglu1_1。
在实施本发明期间，还可以将lysCFBR等位基因的一个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的gluB基因的靶位点中，同时使得该gluB基因位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM12866glu∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带野生型形式的lysC基因，在第二个位点(靶位点)即gluB基因携带lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝。这一菌株已经保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心，保藏号为DSM15039。可以用于实现将lysCFBR等位基因掺入gluB基因的质粒示于图1。所述质粒称为pK18mobsacBglu1_1。
在实施本发明期间，还可以将lysCFBR等位基因的一个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的aecD基因的靶位点中，同时使在该aceD基因位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM12866aecD∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带野生型形式的lysC基因，在第二个位点(靶位点)即aecD基因携带lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝。可以用于实现将lysCFBR等位基因掺入aecD基因的质粒示于图2。所述质粒称为pK18mobsacBaecD1_1。
在实施本发明期间，还可以将lysCFBR等位基因的一个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的pck基因的靶位点中，同时使该pck基因位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM12866pck∷lysC的菌株，在其天然lysC位点携带野生型形式的lysC基因，在第二个位点(靶位点)即pck基因携带lysCFBR等位基因lysCT311I形式的lysC基因的第二个拷贝。可以用于实现掺入pck基因中的质粒示于图3。所述质粒称为pK18mobsacBpck1_1。
在实施本发明期间，还可以将ddh基因的一个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的gluB基因中，同时使该gluB基因位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM12866glu∷ddh的菌株，在其天然ddh位点携带ddh基因的一个拷贝，在第二个位点(靶位点)即gluB基因携带ddh基因的第二个拷贝。可以用于实现将ddh基因掺入gluB基因的质粒示于图4。所述质粒称为pK18mobsacBgluB2_1。
在实施本发明期间，还可以将dapA基因的一个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的aecD基因中，同时使该aecD基因位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM12866aecD∷dapA的菌株，在其天然dapA位点携带dapA基因的一个拷贝，在第二个位点(靶位点)即aecD基因携带dapA基因的第二个拷贝。可以用于实现将dapA基因掺入aecD基因的质粒示于图5。所述质粒称为pK18mobsacBaecD2_1。
在实施本发明期间，可以将pyc基因的一个拷贝掺入谷氨酸棒杆菌的pck基因的靶位点中，同时使该pck基因位点没有能/使得能在微生物中附加型复制的核苷酸序列，没有能转座/使得发生转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。这个称为DSM12866pck∷pyc的菌株，在其天然pyc位点携带野生型形式的pyc基因的一个拷贝，在第二个位点(靶位点)即pck基因携带pyc等位基因pyc P458S形式的pyc基因的第二个拷贝。可以用于实现将pyc等位基因掺入pck基因的质粒示于图6。所述质粒称为pK18mobsacBpck1_3。
为生产化合物，根据本发明产生的棒状细菌可以连续培养或者不连续培养，所述不连续培养是分批培养或补料分批培养或者重复补料分批培养。已知培养方法的概述见Chmiel所著教材(Bioprozesstechnik1.Einfhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或者Storhas所著教材(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(美国华盛顿D.C.，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中，上述物质可以单批形式或在培养期间适当补加。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃-40℃。持续培养直至所需产物形成最大量。此目的通常在10～160小时范围内达到。
已经发现本发明的棒状细菌，尤其产生L-赖氨酸的棒状细菌，具有令人意想不到的高稳定性。它们在至少10-20，20-30，30-40，40-50个，优选至少50-60，60-70，70-80和80-90个代次或细胞分裂周期过程中保持稳定。
以下微生物已经保藏：
谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866glu∷lysC以纯培养物形式于2002年6月5日根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM15039。
质粒pK18mobsacBglu1_1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的纯培养物形式，根据布达佩斯条约于2001年4月20日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)，保藏号DSM14243。
质粒pK18mobsacBaecD1_1以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的纯培养物形式，根据布达佩斯条约于2002年6月5日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM15040。
实施例1：将lysCFBR等位基因的第二个拷贝掺入菌株DSM13994和菌株DSM12866的染色体中
谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中通过多次非定向诱变、选择和突变体选择而产生。该菌株对赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸有抗性，并具有一种反馈抗性天冬氨酸激酶，其对赖氨酸和苏氨酸的混合物(各25mM)的抑制作用不敏感。这个菌株的lysCFBR等位基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：3。在下文也称为lysC T311I。所编码的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。这个菌株的纯培养物根据布达佩斯条约于2001年1月16日保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。
菌株DSM12866从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中通过非定向诱变及选择具有最佳L-赖氨酸积累的突变体而产生，其是甲硫氨酸敏感性的。在包含L-甲硫氨酸的基本培养基上的生长可以通过加入苏氨酸而再建立。这个菌株具有野生型形式的lysC基因，示于SEQ IDNO：1。野生型天冬氨酸激酶蛋白的相应氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。这个菌株的纯培养物根据布达佩斯条约于1999年6月10日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)。
1.1 分离和测序菌株DSM13994的lysC等位基因的DNA
通过常规方法从菌株DSM13994中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶反应，扩增携带lysC基因或等位基因的一个DNA节段。基于已知的谷氨酸棒杆菌lysC基因的序列(Kalinowski等，分子微生物学5(5)，1197-1204(1991)；登记号X57226)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
lysC1beg(SEQ ID No：5)：
5’TA(G GAT CC)T CCG GTG TCT GAC CAC GGT G3’
lysC2end：(SEQ ID NO：6)：
5’AC(G GAT CC)G CTG GGA AAT TGCGCT CTT CC3’
所示引物由MWG Biotech合成，PCR反应通过Innis等所述标准PCR方法进行(PCR方案，方法与应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增长度大约为1.7kb的一个DNA节段，其携带lysC基因或等位基因。所述引物另外还含有限制性内切酶BamHI的切割位点的序列，其在以上所示核苷酸序列中用括号标示。
携带菌株DSM13994的lysC等位基因的长度大约为1.7kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳鉴别，从凝胶中分离并通过常规方法纯化(QIA快速凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后利用Topo TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，The Netherlands，Cat.Number K4600-01)，在载体pCRII-TOPO中进行片段连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中。将转化混合物铺板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
获得的质粒通过在分离DNA后限制切割而检测，并在琼脂糖凝胶中电泳。所得质粒称为pCRIITOPOlysC。
扩增的DNA片段或PCR产物的核苷酸序列通过Sanger等所述双脱氧链终止方法测定(美国科学院院报74：5463-5467(1977))，使用PE Applied Biosystems的ABI Prism377测序设备(Weiterstadt，德国)。所述PCR产物的编码区序列示于SEQ ID No：3。相关天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO：4。
碱基胸腺嘧啶在菌株DSM13994的lysCFBR等位基因编码区的核苷酸序列的第932位发现(SEQ ID NO：3)。碱基胞嘧啶在野生型基因的相应位置发现(SEQ ID NO：1)。
异亮氨酸在菌株DSM13994的天冬氨酸激酶蛋白的氨基酸序列的第311位发现(SEQ ID No：4)。苏氨酸在野生型蛋白的相应位置蛋白发现(SEQ ID No：2)。
在编码区第932位含有胸腺嘧啶并因此编码在氨基酸序列第311位含有异亮氨酸的天冬氨酸激酶蛋白的lysC等位基因，在下文称为lysCFBR等位基因或lysC T311I。
携带lysCFBR等位基因lysC T311I的质粒pCRIITOPOlysC，根据布达佩斯条约于2001年4月20日以大肠杆菌菌株TOP10/pCRIITOPOlysC的纯培养物形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM14242。
1.2 构建置换载体pK18mobsacBglu1_1
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032用作染色体DNA的供体。使用常规方法从菌株ATCC13032中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带gluB基因和周围区域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌gluABCD基因簇的序列(Kronemeyer等，细菌学杂志177：1152-1158(1995))(登记号X81191)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
gluBg11(SEQ ID NO：7)：
5’TA(AGAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G3’
gluBg12(SEQ ID NO：8)：
5’AC(A GAT CT)T GAA GCC AAG TAC GGC CAA G3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增大约1.7kb的DNA片段，其携带gluB基因和周围区域。所述周围区域是代表gluA基因的3’末端的位于gluB基因上游的大约0.33kb的序列节段，和代表gluC基因的5’末端的gluB基因下游的大约0.44kb的序列节段。所述引物还含有限制性内切酶BglII的切割位点序列，在上述核苷酸序列中用括号加以标示。
携带gluB基因和周围区域的大约1.7kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后在载体pCRII-TOPO中利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，荷兰，Cat.Number K4600-01)进行片段连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中。通过将转化物铺板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
获得的质粒在分离DNA后通过限制切割而检测，并在琼脂糖凝胶中鉴别。所得质粒称为pCRII-TOPOglu。
将质粒pCRII-TOPOglu用限制酶BglII(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，并在琼脂糖凝胶(0.8％)中借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)分离后，从该琼脂糖凝胶中分离大约1.7kb的gluB片段，用于与Sch_fer所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14：69-73(1994))连接。预先将该载体用限制酶BamHI切割及用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，BoehringerMannheim)，与大约1.7kb的gluB片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645-4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBglu1。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分离质粒DNA(见实施例1.1)，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1.7kb的含有lySCFBR的DNA片段从琼脂糖凝胶中分离，并用于与上述载体pK18mobsacBglu1连接。该载体预先用限制酶BamHI切割，用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，与大约1.7kb的lysCFBR片段混合，将所述混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德国)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBglu1_1。该质粒图示于图1。
质粒pK18mobsacBglu1_1根据布达佩斯条约，于2001年4月20日以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的纯培养物形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM14243。
1.3 利用置换载体pK18mobsacBglu1_1将lySCFBR等位基因lysC T311I的第二个拷贝掺入菌株DSM13994的染色体中(靶位点：gluB基因)
通过Schafer等所述方法(微生物学杂志172：1663-1666(1990))，将实施例1.2所述载体pK18mobsacBglu1_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994中。所述载体在DSM13994中不能独立复制，只有整合进染色体中才保留在细胞中。将接合混合物铺板于补加15mg/l卡那霉素和50mg/萘啶酸的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)上选择具有整合的pK18mobsacBglu1_1的克隆或转接合子。将卡那霉素抗性转接合子铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂上，在33℃温育48小时。
为选择由于第二次重组已经切除所述质粒的突变体，将克隆在LB液态培养基中培养20小时，然后铺板于具有10％蔗糖的LB琼脂上并温育48小时。
与起始质粒pK18mobsacB相似，质粒pK18mobsacBglu1_1除了卡那霉素抗性基因之外还含有编码Bacillus subtilis的果聚糖蔗糖酶的sacB基因的一个拷贝。可由蔗糖酶诱导的表达导致果聚糖蔗糖酶形成，其催化对谷氨酸棒杆菌有毒性的产物果聚糖合成。因此只有由于第二次重组已经切除整合的pK18mobsacBglu1_1的那些克隆在LB琼脂上生长。根据第二次重组事件的位置，在切除后，lysCFBR等位基因的第二个拷贝在染色体gluB基因座显示出，或者宿主的原始gluB基因座得以保留。
对大约40-50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”的表型。对示出“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”表型的大约20个菌落借助于聚合酶链反应进行研究。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带gluB基因和周围区域的DNA片段。选择与实施例1.2中构建整合质粒相同的引物进行PCR。
gluBg11(SEQ ID NO：7)：
5’TA(A GAT CT)G TGT TGG ACG TCA TGG CAA G3’
gluBg12(SEQ ID NO：8)：
5′AC(A GATCT)T GAA GCCAAG TAC GGC CAA G3’
所述引物在具有原始gluB基因座的对照克隆中可以扩增出大约1.7kb的DNA片段。在染色体gluB基因座具有lysCFBR等位基因第二个拷贝的克隆中，大约3.4kb的DNA片段被扩增。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳加以鉴别。
以这种方式鉴别一种克隆，所述克隆除了存在于lysC基因座的拷贝之外，在染色体gluB基因座还具有lysCFRB等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM13994glu∷lysC。
1.4通过置换载体pK18mobsacBglu1_1将lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：gluB基因)
如实施例1.3所述，将质粒pK18mobsacBglu1_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866中。以实施例1.3所述方式鉴别一个克隆，所述克隆除了在lysC基因座存在野生型基因的拷贝之外，在染色体的gluB基因座还具有lysCFBR等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM12866glu∷lysC。
携带在gluB基因中的lysCFBR等位基因第二个拷贝的本发明谷氨酸棒杆菌菌株，根据布达佩斯条约于2002年6月5日以谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866glu∷lysC的纯培养物形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM15039。
1.5 构建置换载体pK18mobsacBpck1_1
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032用作染色体DNA的供体。使用常规方法从菌株ATCC13032中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带pck基因和周围区域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌pck基因的序列(EP1094111及Riedel等，分子和微生物技术杂志3：573-583(2001))(登录号AJ269506)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
pck_beg(SEQ ID NO：9)：
5’TA(AGAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT3’
pck_end(SEQ ID NO：10)：
5’AC(A GAT CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTTATT3’
所示引物由MWG Biotech合成，通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约2.9kb的DNA片段，其携带pck基因和周围区域。所述引物还含有限制性内切酶BglII的切割位点序列，在上述核苷酸序列中用括号加以标示。
携带pck基因和周围区域的大约2.9kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后在载体pCRII-TOPO中利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，荷兰，Cat.Number K4600-01)进行片段连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中。通过将转化物铺板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
获得的质粒在分离DNA后通过限制切割而检测，并在琼脂糖凝胶中鉴别。所得质粒称为pCRII-TOP0pck。
将质粒pCRII-TOPOpck用限制酶BglII(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，并在琼脂糖凝胶(0.8％)中借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)分离后，从该琼脂糖凝胶中分离大约2.9kb的pck片段，用于与Sch_fer所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14：69-73(1994))连接。预先将该载体用限制酶BamHI切割及用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，BoehringerMannheim)，与大约2.9kb的pck片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645-4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBpck1。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分离质粒DNA(见实施例1.1)，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1.7kb的含有lySCFBR的DNA片段从琼脂糖凝胶中分离，并用于与上述载体pK18mobsacBpck1连接。将该载体预先用限制酶BamHI切割，用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，与大约1.7kb的lysCFBR片段混合，将所述混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德国)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBpck1_1。该质粒图示于图3。1.6通过置换载体pK18mobsacBpck1_1将lysCFBR等位基因lysCT311I形式的lysC基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体(靶位点：pck基因)中
如实施例1.3所述，将实施例1.5所述载体pK18mobsacBpck1_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866中。如实施例1.3所述在谷氨酸棒杆菌DSM12866的染色体中针对定向重组事件进行选择。根据第二次重组事件的位置，在切除后，lysCFBR等位基因的第二个拷贝在染色体中的pck基因座显示出，或者宿主的原始pck基因座得以保留。
对大约40-50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”的表型。对示出“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”表型的大约20个菌落借助于聚合酶链反应进行研究。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带pck基因和周围区域的DNA片段。选择与实施例1.5中构建整合质粒相同的引物进行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO：9)：
5’TA(A GAT CT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT3’
pck_end(SEQ ID NO：10)：
5’AC(A GAT.CT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTTATT3’
所述引物在具有原始pck基因座的对照克隆中可以扩增出大约2.9kb的DNA片段。在染色体pck基因座具有lysCFBR等位基因第二个拷贝的克隆中，大约4.6kb的DNA片段被扩增。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳加以鉴别。
以这种方式鉴别一种克隆，所述克隆除了在lysC基因座存在野生型基因的拷贝之外，在染色体pck基因座还具有lysCFRB等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM12866pck∷lysC。
1.7 构建置换载体pK18mobsacBaecD1_1
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032用作染色体DNA的供体。使用常规方法从菌株ATCC13032中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带aecD基因和周围区域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌aecD基因的序列(Kronemeyer等，细菌学杂志177：1152-1158(1995))(登记号X81191)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG3’
所示引物由MWG Biotech合成，通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约2.1kb的DNA片段，其携带aecD基因和邻近区域。
该大约2.1kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
将纯化的DNA片段用限制酶BamHI和EcoRV切割(AmershamPharmacia，Freiburg，德国)。然后在载体pUC18中进行片段连接(Norrander等，基因26：101-106(1983))。预先将该载体用限制酶BglII和SmaI切割，去磷酸化，与大约1.5kb的携带aecD的片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。将连接混合物在大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中转化。通过将转化物铺板于含有50mg/l卡那霉素的具有X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
获得的质粒在分离DNA之后通过限制切割检测，并在琼脂糖凝胶中鉴别。所得质粒称为pUC18aecD。
从携带质粒pCRIITOPOlysC的菌株DSM14242中分离质粒DNA(见实施例1.1)，用限制酶BamHI切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，然后用Klenow聚合酶处理。借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约1.7kb的含有lySCFBR的DNA片段从琼脂糖凝胶中分离，并用于与上述载体pUC18aecD连接。将该载体预先用限制酶StuI切割，用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim，德国)，与大约1.7kb的lysCFBR片段混合，将所述混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德国)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pUC18aecD1。
将质粒pUC18aecD1用限制酶KpnI切割然后用Klenow聚合酶处理。然后该质粒用限制酶SalI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离后，将大约3.2kb的携带aecD和lysC的片段从琼脂糖凝胶中分离，并用于与Schafer等人(基因14：69-73(1994))所述的可移动克隆载体pK18mobsacB连接。将该载体预先用限制酶SmaI和SalI切割，用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，BoehringerMannheim，德国)，与大约3.2kb的该携带aecD和lysC的片段混合，将所述混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等人，美国科学院院报87(1990)4645-4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBaecD1_1。该质粒图示于图2。
质粒pK18mobsacBaecD1_1根据布达佩斯条约，于2002年6月5日以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的纯培养物形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)，保藏号DSM15040。
1.8 通过置换载体pK18mobsacBaecD1_1，将lysCFBR等位基因形式的lysC基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：aecD基因)
如实施例1.3所述，将实施例1.4所述质粒pK18mobsacBaecD1_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866中。如实施例1.3所述在谷氨酸棒杆菌DSM12866的染色体中针对定向重组事件进行选择。根据第二次重组事件的位置，在切除后，lysCFBR等位基因的第二个拷贝在染色体aecD基因座中显示出，或者宿主的原始aecD基因座得以保留。
对大约40-50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”的表型。对示出“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”表型的大约20个菌落借助于聚合酶链反应进行研究。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带aecD基因和周围区域的DNA片段。选择与实施例1.7中构建整合质粒相同的引物进行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG3’
所述引物在具有原始aecD基因座的对照克隆中可以扩增出大约2.1kb的DNA片段。在染色体aecD基因座具有lysCFBR等位基因第二个拷贝的克隆中，大约3.8kb的DNA片段被扩增。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳加以鉴别。
以这种方式鉴别一种克隆，所述克隆除了在lysC基因座存在野生型基因的拷贝之外，在染色体aecD基因座还具有lysCFRB等位基因lysC T311I形式的lysC基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM12866aecD∷lysC。
实施例2：将ddh基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：gluB)
2.1 构建置换载体pK18mobsacBglu2_1
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032用作染色体DNA的供体。使用常规方法从菌株ATCC13032中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带gluB基因和周围区域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌gluABCD基因簇的序列(Kronemeyer等，细菌学杂志177：1152-1158(1995))(登记号X81191)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
gluA_beg(SEQ ID NO：13)：
5’CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC3’
gluD_end(SEQ ID NO：14)：
5’CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约4.4kb的DNA片段，其携带gluB基因和周围区域。
扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
然后在载体pCRII-TOPO中利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Leek，荷兰，Cat.Number K4600-01)进行片段连接。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中。通过将转化物铺板于含有卡那霉素(50mg/l)的具有X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
获得的质粒在分离DNA后通过限制切割而检测，并在琼脂糖凝胶中鉴别。所得质粒称为pCRII-TOPOglu2。
将质粒pCRII-TOPOglu2用限制酶EcoRI和SalI(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)切割，并在琼脂糖凝胶(0.8％)中借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)分离后，从该琼脂糖凝胶中分离大约3.7kb的gluB片段，用于与Sch_fer所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14：69-73(1994))连接。预先将该载体用限制酶EcoRI和SalI切割及用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim)，与大约3.7kb的gluB片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645-4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBglu2。
如实施例2.1所述，借助于聚合酶反应扩增携带ddh基因和周围区域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌ddh基因簇的序列(Ishino等，核酸研究15，3917(1987))(登录号Y00151)，选择以下引物进行PCR：
ddh_beg(SEQ ID NO：15)：
5’CTG AAT CAA AGG CGG ACA TG3′
ddh_end(SEQ ID NO：16)：
5’TCG AGCTAA ATT AGA CGT CG3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约1.6kb的DNA片段，其携带ddh基因。
携带ddh基因的大约1.6kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
在纯化后，将携带ddh基因的片段连接在所述载体pK18mobsacBglu2中。所述载体预先用限制酶BamHI部分切割。在用Klenow聚合酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理载体后，切割末端的突出端完全成为平端，然后将此载体与携带ddh基因的大约1.6kb的DNA片段混合，将混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。通过使用Vent聚合酶(New England Biolabs，Frankfurt，德国)进行PCR反应，产生一个携带ddh的DNA片段，其具有平端并适于连接在预处理的载体pK18mobsacBglu2中。
然后将大肠杆菌菌株DH5αmcr((Life Technologies GmbH，Karlsmhe，德国))用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBglu2_1。该质粒图示于图4。
2.2 通过置换载体pK18mobsacBglu2_1将ddh基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：gluB基因)
如实施例1.3所述，将实施例2.1所述载体pK18mobsacBglu2_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866中。如实施例1.3所述在谷氨酸棒杆菌DSM12866的染色体中针对定向重组事件进行选择。根据第二次重组事件的位置，在切除后，ddh基因的第二个拷贝在染色体gluB基因座中显示，或者宿主的原始gluB基因座得以保留。
对大约40-50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”的表型。对示出“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”表型的大约20个菌落借助于聚合酶链反应进行研究。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带glu区域的DNA片段。选择与实施例2.1中构建置换质粒相同的引物进行PCR。
gluA_beg(SEQ ID NO：13)：
5’CAC GGT TGC TCA TTG TAT CC3’
gluD_end(SEQ ID NO：14)：
5’CGA GGC GAA TCA GAC TTC TT3’
所述引物在具有原始glu基因座的对照克隆中可以扩增出大约4.4kb的DNA片段。在染色体gluB基因座具有ddh基因第二个拷贝的克隆中，大约6kb的DNA片段被扩增。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳加以鉴别。
以这种方式鉴别一种克隆，所述克隆除了在ddh基因座存在的拷贝之外，在染色体gluB基因座还具有ddh基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM12866glu∷ddh。
实施例3：将dapA基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：aecD基因)
3.1 构建置换载体pK18mobsacBaecD2_1
谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032用作染色体DNA的供体。使用常规方法从菌株ATCC13032中分离染色体DNA(Eikmanns等，微生物学140：1817-1828(1994))。借助于聚合酶链反应，扩增携带aecD基因和周围区域的DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌aecD基因的序列(Rossol等，细菌学杂志174：2968-2977(1992))(登录号M89931)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG 3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约2.1kb的DNA片段，其携带aecD基因和邻近区域。
大约2.1kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
将纯化的DNA片段用限制酶BglII和EcoRV切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。然后在载体pUC18中进行片段连接(Norrander等，基因26：101-106(1983))。所述载体预先用限制酶BamHI和SmaI切割及去磷酸化，与大约1.5kb的携带aecD基因的片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株TOP10(Invitrogen，Leek，荷兰)中。通过将转化物铺板于含有50mg/l卡那霉素的具有X-Gal(64mg/l)的LB琼脂上选择携带质粒的细胞。
所得质粒在分离DNA后通过限制切割检测，并在琼脂糖凝胶中鉴别。所得质粒称为pUC18aecD。
借助于聚合酶反应，扩增携带dapA基因和周围区域的另一个DNA片段。基于已知的谷氨酸棒杆菌dapA基因的序列(Bonassi等，核酸研究18，6421(1990))(登录号X53993和AX127149)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
dapA_beg(SEQ ID NO：17)：
5’AGA GCC AGT GAA CAT GCA GA3’
dapA_end(SEQ D NO：18)：
5’CTT GAG CAC CTT GCG CAG CA3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约1.4kb的DNA片段，其携带dapA基因和邻近区域。
大约1.4kb的扩增的DNA片段，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
在纯化后，将大约1.4kb的含有dapA基因的DNA片段在上述载体pUC18aecD中连接。所述载体预先用限制酶StuI切割，与大约1.4kb的DNA片段混合，将混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德国)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pUC18aecD2。
将质粒pUC18aecD2用限制酶SalI切割及用EcoRI部分切割(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)，并在琼脂糖凝胶(0.8％)中借助于QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)分离后，从该琼脂糖凝胶中分离大约2.7kb的携带aecD和dapA的片段，用于与Sch_fer所述可移动克隆载体pK18mobsacB(基因14：69-73(1994))连接。预先将该载体用限制酶EcoRI和SalI切割及用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim)，与大约2.7kb的携带aecD和dapA的片段混合，并将混合物用T4 DNA连接酶处理(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)。
然后将大肠杆菌菌株DH5α(Grant等，美国科学院院报87(1990)4645-4649)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBaecD2_1。该质粒图示于图5。
3.2 通过置换载体pK18mobsacBaecD2_1，将dapA基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：aecD基因)
如实施例1.3所述，将实施例3.1所述载体pK18mobsacBaecD2_1通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866中。如实施例1.3所述在谷氨酸棒杆菌DSM12866的染色体中针对定向重组事件进行选择。根据第二次重组事件的位置，在切除后，dapA基因的第二个拷贝在染色体aecD基因座中显示出，或者宿主的原始aecD基因座得以保留。
对大约40-50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”的表型。对示出“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”表型的大约20个菌落借助于聚合酶链反应进行研究。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带aecD基因和周围区域的DNA片段。选择与实施例3.1中构建整合质粒相同的寡核苷酸引物进行PCR。
aecD_beg(SEQ ID NO：11)：
5’GAA CTT ACG CCA AGC TGT TC3’
aecD_end(SEQ ID NO：12)：
5’AGC ACC ACA ATC AAC GTG AG3’
所述引物在具有原始aecD基因座的对照克隆中可以扩增出大约2.1kb的DNA片段。在染色体aecD基因座具有dapA基因第二个拷贝的克隆中，大约3.6kb的DNA片段被扩增。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳加以鉴别。
以这种方式鉴别一种克隆，所述克隆除了在dapA基因座存在的拷贝之外，在染色体aecD基因座还具有dapA基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM12866aecD∷dapA。
实施例4：将pyc等位基因pycP458S形式的pyc基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：pck基因)
4.1 构建置换载体pK18mobsacBpck1_3
将实施例1.5所述置换载体pK18mobsacBpck1用作插入pyc等位基因的基础载体。
如实施例2.1所述，借助于聚合酶链反应扩增携带pyc基因和周围区域的一个DNA片段。基于已知谷氨酸棒杆菌pyc基因簇的序列(Peters-Wendisch等，微生物学杂志144：915-927(1998))(登记号Y09548)，选择以下寡核苷酸引物进行PCR：
pyc_beg(SEQ ID NO：19)：
5’TC(A CGC GT)C TTG AAG TCG TGC AGG TCA G3’
pyc_end(SEQ ID NO：20)：
5’TC(A CGC GT)C GCC TCC TCC ATG AGG AAG A3’
所示引物由MWG Biotech合成，并通过Innis所述标准PCR方法进行PCR(PCR方案，方法和应用指导，1990，学术出版社)。所述引物可以扩增出大约3.6kb的携带pyc基因DNA片段。所述引物另外还含有限制性内切酶MluI的切割位点的序列，在上述核苷酸序列中用括号加以标示。
携带pyc基因的大约3.6kb的扩增的DNA片段用限制性内切酶MluI切割，通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳及从凝胶中分离并通过常规方法纯化而鉴别(QIAquick凝胶提取试剂盒，Qiagen，Hilden)。
在纯化后，将携带pyc基因的DNA片段在上述载体pK18mobsacBpck1中连接。所述载体预先用限制酶BssHII切割，用碱性磷酸酶去磷酸化(碱性磷酸酶，Boehringer Mannheim)，与大约3.6kb的携带pyc基因的DNA片段混合，将混合物用T4 DNA连接酶(Amersham-Pharmacia，Freiburg，德国)处理。
然后将大肠杆菌菌株DH5αmcr(Life Technologies GmbH，Karlsruhe，德国)用连接混合物转化(Hanahan，DNA克隆实用方案，第1卷，ILR-出版社，冷泉港，纽约，1989)。通过将转化物铺板于补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择携带质粒的细胞(Sambrook等，分子克隆实验指导，第2版，冷泉港，纽约，1989)。
借助于得自Qiagen的QIAprep Spin Miniprep试剂盒从转化体中分离质粒DNA，并通过限制切割及随后的琼脂糖凝胶电泳而检测。所述质粒称为pK18mobsacBpck1_2。
4.2 通过位点特异性诱变野生型pyc基因构建pyc等位基因pyc P458S
用QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，美国)进行定点诱变。EP-A-1108790描述了谷氨酸棒杆菌pyc基因的点突变，其使L-赖氨酸的生产得以改良。基于pyc基因第1372位胞嘧啶置换为胸腺嘧啶的核苷酸序列中的点突变，因此导致其氨基酸序列中脯氨酸置换为丝氨酸。该等位基因称为pyc P458S。为产生所述突变，选择以下寡核苷酸引物进行线性扩增：
P458S-1(SEQ ID NO：21)：
5′GGATTCATTGCCGATCAC(TCG)CACCTCCTTCAGGCTCCA3′
P458S-2(SEQID NO：22)：
5′GTGGAGGAAGTCCGAGGT(CGA)GTGATCGGCAATGAATCC3′
所述引物由MWG Biotech合成。置换第458位脯氨酸的丝氨酸密码子在上述核苷酸序列中用括号标示。将实施例4.1所述质粒pK18mobsacBpck1_2与两个引物一起用于通过Pfu Turbo DNA聚合酶进行线性扩增，所述引物均互补于所述质粒链。通过引物的这种延伸，形成具有断裂的环形链的突变质粒。将线性扩增的产物用DpnI处理，这种内切酶特异性切割甲基化和半甲基化的模板DNA。将新合成的断裂的突变载体DNA转化进大肠杆菌菌株XL1 Blue(Bullock，Fernandez和Short，生物技术(5)376-379(1987))中。在转化后，XL1 Blue细胞修补突变质粒中的断裂之处。在具有50mg/l卡那霉素的LB培养基上选择转化体。获得的质粒在分离DNA后通过限制性切割检测，并在琼脂糖凝胶中鉴别。突变DNA片段的DNA序列通过测序检测。PCR产物的序列与Ohnishi等(2002)所述序列一致。所得质粒称为pK18mobsacBpck1_3。该质粒图示于图6。
4.3 通过置换载体pK18mobsacspck1_3，将pyc等位基因pycP458S形式的pyc基因的第二个拷贝掺入菌株DSM12866的染色体中(靶位点：pck基因)
将实施例4.2所述质粒pK18mobsacBpck1_3如实施例1.3所述通过接合转移进谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866中。如实施例1.3所述在谷氨酸棒杆菌DSM12866的染色体中针对定向重组事件进行选择。根据第二次重组事件的位置，在切除后，pyc等位基因的第二个拷贝在染色体中pck基因座显示出，或者宿主的原始pck基因座得以保留。
对大约40-50个菌落测试“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”的表型。对示出“在蔗糖存在下生长”及“在卡那霉素存在下不生长”表型的大约20个菌落借助于聚合酶链反应进行研究。从所述菌落的染色体DNA中扩增携带pck基因和周围区域的DNA片段。选择与实施例1.5中构建置换质粒相同的寡核苷酸引物进行PCR。
pck_beg(SEQ ID NO：9)：
5’TA(A GATCT)G CCG GCA TGA CTT CAG TTT3’
pck_end(SEQ ID NO：10)：
5’AC(A GATCT)G GTG GGA GCC TTT CTT GTTATT3’
所述引物在具有原始pck基因座的对照克隆中可以扩增出大约2.9kb的DNA片段。在染色体pck基因座具有pyc基因第二个拷贝的克隆中，大约6.5kb的DNA片段被扩增。
扩增的DNA片段通过在0.8％琼脂糖凝胶中电泳加以鉴别。
以这种方式鉴别一种克隆，所述克隆除了在pyc基因座存在的野生型基因的拷贝之外，在染色体pck基因座还具有pyc等位基因pycP458S形式的pyc基因的第二个拷贝。这个克隆称为菌株DSM12866pck∷pyc。
实施例5：生产赖氨酸
将在实施例1，2，3和4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株DSM13994glu∷lysC，DSM12866glu∷lysC，DSM12866pck∷lysC，DSM12866aecD∷lysC，DSM12866glu∷ddh，DSM12866aecD∷dapA和DSM12866pck∷pyc，在适于赖氨酸生产的营养培养基中培养，测定培养上清中赖氨酸含量。
首先，在33℃将培养物在脑心琼脂板(Merck，Darmstadt，德国)上温育24小时。此琼脂板培养物用于接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是MM培养基。在摇床上于33℃以240rpm温育预培养物24小时。用这些预培养物接种主培养物，由此主培养物的起始OD(波长660nm)为0.1。培养基MM也用作主培养物。
培养基MM：
CSL                             5g/l
MOPS                            20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)            50g/l
(NH4)2SO4                   25g/l
KH2PO4                        0.1g/l
MgSO4·7H2O                   1.0g/l
CaCl2·2H2O                   10mg/l
FeSO4·7H2O                    10mg/l
MnSO4·H2O                    5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)                0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)           0.2mg/l
CaCO3                          25g/l
用氨水将CSL(玉米浆)，MOPS(吗啉代丙磺酸)和所述盐溶液的pH调节为7，并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，以及在干燥状态下高压灭菌的CaCO3。
在具有挡板的100ml锥形瓶中以10ml体积进行培养。在33℃和80％湿度下进行培养。
48小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH，Munich)在660nm测定波长下测定OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定赖氨酸生成量。
实验结果示于表10。
表10
  菌株     OD(660nm)    盐酸赖氨酸g/l
  DSM13994     12.0    19.1
  DSM13994glu∷lysC     9.9    20.0
  DSM12866     12.5    14.9
  DSM15039     11.4    16.2
  DSM12866pck∷lysC     12.6    16.5
  DSM12866aecD∷lysC     12.0    15.9
  DSM12866glu∷ddh     11.0    15.5
  DSM12866aecD∷dapA     11.1    16.2
  DSM12866pck∷pyc     10.9    16.9
附图简述：
指定的碱基对数目是在重复测定中获的近似值。
图1：质粒pK18mobsacBglu1_1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
HindIII：限制酶HindIII的切割位点
BamHI：限制酶BamHI的切割位点
lysC：lysCFBR等位基因，lysC T311I
′gluA：gluA基因的3’末端片段
gluB′：gluB基因的5’末端片段
′gluB：gluB基因的3’末端片段
gluC′：gluC基因的5’末端片段
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图2：质粒pK18mobsacBaecD1_1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
SalI：限制酶SalI的切割位点
lysC：lysC等位基因，lysC T311I
aecD′：aecD基因的5’末端
′aecD：aecD基因的3’末端
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图3：质粒pK18mobsacBpck1_1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
BamHI：限制酶BamHI的切割位点
lysC：lysCFBR等位基因，lysC T311I
pck′：pck基因的5’末端片段
′pck：pck基因的3’末端片段
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图4：质粒pK18mobsacBgluB2_1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
SalI：限制酶SalI的切割位点
EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点
BamHI：限制酶BamHI的切割位点
ddh：ddh基因
gluA：gluA基因
gluB′：gluB基因的5’末端片段
′gluB：gluB基因的3’末端片段
gluC：gluC基因
gluD′：gluD基因的5’末端片段
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图5：质粒pK18mobsacBaecD2_1图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
EcoRI：限制酶EcoRI的切割位点
SalI：限制酶SalI的切割位点
dapA：dapA基因
aecD′：aecD基因的5’末端片段
′aecD：aecD基因的3’末端片段
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
图6：质粒pK18mobsacBpck1_3图。
所用缩写和名称具有以下含义：
KanR：卡那霉素抗性基因
pyc：pyc等位基因，pyc P458S
pck′：pck基因的5’末端片段
′pck：pck基因的3’末端片段
sacB：sacB基因
RP4mob：具有用于转移的复制起点(oriT)的mob区域
oriV：复制起点V
                     序列表
<110>德古萨股份公司
<120>通过遗传修饰的谷氨酸菌株生产L-赖氨酸
<130>DEDEG0213
<160>22
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1263
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1263)
<223>lysC野生型基因
<400>1
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg        48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct        96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat       144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt       192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc       240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg       288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc       336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc       384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc       432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg       480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt       528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag       576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc       624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat       672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg       720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc       768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att       816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat       864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa       912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc       960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc      1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct      1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg      1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt      1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca      1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat      1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                     415
gca ggc acc gga cgc                                                  1263
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>2
<211>421
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>2
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>3
<211>1263
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(12 63)
<223>lysC-fbr allele lysC T311I
<400>3
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg        48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct        96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat       144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt       192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc       240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg       288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc       336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc       384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc       432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg       480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt       528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag       576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc       624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat       672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg       720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc       768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att       816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat       864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa       912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
gac ggc acc acc gac atc atc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc       960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc      1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct      1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg      1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt      1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca      1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat      1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
gca ggc acc gga cgc                                                  1263
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>4
<211>421
<212>PRT
<213>Corynebacterium glutamicum
<400>4
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1               5                   10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
            20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
        35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Ile Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物lysc1beg
<400>5
taggatcctc cggtgtctga ccacggtg                                         28
<210>6
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(29)
<223>引物lysC2end
<400>6
acggatccgc tgggaaattg cgctcttcc                                        29
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物gluBgl1
<400>7
taagatctgt gttggacgtc atggcaag                                         28
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物gluBgl2
<400>8
acagatcttg aagccaagta cggccaag                                         28
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>引物pck_beg
<400>9
taagatctgc cggcatgact tcagttt                                          27
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(30)
<223>引物pck_end
<400>10
acagatctgg tgggagcctt tcttgttatt                                       30
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物aecD_beg
<400>11
gaacttacgc caagctgttc                                                  20
<210>12
<211>20
<212>DMA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物aecD_end
<400>12
agcaccacaa tcaacgtgag                                                  20
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物gluA_beg
<400>13
cacggttgct cattgtatcc                                                  20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物gluD_end
<400>14
cgaggcgaat cagacttctt                                                  20
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh_beg
<400>15
ctgaatcaaa ggcggacatg                                                  20
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物ddh_end
<400>16
tcgagctaaa ttagacgtcg                                                  20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物dapA_beg
<400>17
cgagccagtg aacatgcaga
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>引物dapA_end
<400>18
cttgagcacc ttgcgcagca
<210>19
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物pyc_beg
<400>19
tcacgcgtct tgaagtcgtg caggtcag
<210>20
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>引物pyc_end
<400>20
tcacgcgtcg cctcctccat gaggaaga
<210>21
<211>39
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(39)
<223>引物P458S-1
<400>21
ggattcattg ccgatcactc gcacctcctt caggctcca
<210>22
<211>39
<212>DNA
<213>Corynebacterium glutamicum
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(39)
<223>引物P458S-2
<400>22
gtggaggaag tccgaggtcg agtgatcggc aatgaatcc

Claims (40)

1.一种生产化合物的棒状细菌，其中这些细菌除了在天然位点(基因座)具有编码蛋白质或RNA合成的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合进染色体形式的这种开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在所述的第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制或转座的核苷酸序列，没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，并且所述第二个、任选地第三个或第四个位点与细菌生长和所希望的化合物生产所必需的开放读框(ORF)、基因或等位基因不相关。
2.权利要求1的生产化合物的棒状细菌，其中所述棒状细菌属于棒杆菌属。
3.权利要求2的棒杆菌属的生产化合物的棒状细菌，其中这些细菌属于谷氨酸棒杆菌菌种。
4.权利要求1的生产化合物的棒状细菌，其中所述化合物是选自以下一组的化合物：L-氨基酸，维生素，核苷和核苷酸。
5.权利要求1的生产化合物的棒状细菌，其中所述化合物是选自以下一组的一或多种L-氨基酸：L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸。
6.权利要求1和4的生产化合物的棒状细菌，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸，而且这些细菌除了在天然位点(基因座)具有用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况中在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合进染色体形式的用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝。
7.权利要求6的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中所述棒状细菌属于棒杆菌属。
8.权利要求7的生产L-赖氨酸的棒杆菌属的棒状细菌，其中这些细菌属于谷氨酸棒杆菌菌种。
9.权利要求6的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因是选自以下一组的一或多个开放读框、基因或等位基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwfA213T。
10.权利要求6的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中所述用于赖氨酸生产的开放读框、基因或等位基因是选自以下一组的一或多个基因或等位基因：dapA，ddh，lysCFBR和pyc P458S。
11.权利要求6的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中所述用于赖氨酸生产的开放读框、基因或等位基因是lysCFBR等位基因，其编码反馈抗性形式天冬氨酸激酶。
12.权利要求11的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中lysCFBR等位基因编码的反馈抗性形式天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，SEQ ID NO：2含有选自以下一组的一或多个氨基酸置换A279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I和S381F。
13.权利要求11的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中由lysCFBR等位基因编码的反馈抗性形式的天冬氨酸激酶包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。
14.权利要求11的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中lysCFBR等位基因的编码区包括SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。
15.权利要求6的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点特别是选自以下一组的一个基因：aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi和poxB。
16.权利要求6的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点特别是选自以下一组的一个位点：染色体的基因间区域，包含于染色体中的原噬菌体及包含于染色体中的缺陷噬菌体。
17.权利要求15的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是aecD基因位点。
18.权利要求15的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是gluB基因位点。
19.权利要求15的生产L-赖氨酸的棒状细菌，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是pck基因位点。
20.通过发酵棒状细菌制备化合物的方法，其中进行以下步骤：
a)发酵这样的棒状细菌，
a1)这些细菌除了在天然位点(基因座)存在编码蛋白质或RNA合成的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合进染色体形式的这种开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝，在所述第二个、任选地第三个或第四个位点没有能/使得能在微生物中附加型复制或转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列，并且所述第二个、任选地第三个或第四个位点与细菌生长和所希望的化合物生产必需的开放读框(ORF)、基因或等位基因不相关，
a2)这些细菌中相应蛋白质的胞内活性提高，尤其编码这种蛋白质的核苷酸序列被过表达，
b)浓缩发酵肉汤和/或细菌细胞中的化合物，
c)分离所述化合物，任选地
d)伴有＞(大于)0-100wt％的发酵肉汤的组分和/或生物量。
21.权利要求20的方法，其中所述棒状细菌属于棒杆菌属。
22.权利要求20的方法，其中棒杆菌属的棒状细菌属于谷氨酸棒杆菌菌种。
23.权利要求20的方法，其中所述化合物是选自以下一组的化合物：L-氨基酸，维生素，核苷和核苷酸。
24.权利要求20的方法，其中所述化合物是选自以下一组的一或多种L-氨基酸：L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-苏氨酸，L-丝氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-丙氨酸，L-半胱氨酸，L-缬氨酸，L-甲硫氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-酪氨酸，L-苯丙氨酸，L-组氨酸，L-赖氨酸，L-色氨酸，L-脯氨酸和L-精氨酸。
25.权利要求24的方法，其中所述化合物是L-赖氨酸。
26.制备L-赖氨酸的方法，包括以下步骤：
a)在使所述开放读框(ORF)、基因或等位基因表达的条件下发酵这样的棒状细菌，所述细菌除了在天然位点(基因座)具有用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的至少一个拷贝之外，在每种情况下在第二个、任选地第三个或第四个位点还具有整合进染色体中形式的用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因的第二个、任选地第三个或第四个拷贝。
27.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中用于赖氨酸生产的开放读框、基因或等位基因是选自以下一组的开放读框(ORF)、基因或等位基因：accBC，accDA，cstA，cysD，cysE，cysH，cysK，cysN，cysQ，dapA，dapB，dapC，dapD，dapE，dapF，ddh，dps，eno，gap，gap2，gdh，gnd，lysC，lysCFBR，lysE，msiK，opcA，oxyR，ppc，ppcFBR，pgk，pknA，pknB，pknD，pknG，ppsA，ptsH，ptsI，ptsM，pyc，pyc P458S，sigC，sigD，sigE，sigH，sigM，tal，thyA，tkt，tpi，zwal，zwf和zwfA213T。
28.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因是选自以下一组的基因或等位基因：dapA，ddh，lysCFBR和pycP458S。
29.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中用于赖氨酸生产的开放读框(ORF)、基因或等位基因是lysCFBR等位基因，其编码反馈抗性形式的天冬氨酸激酶。
30.权利要求29的制备L-赖氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因编码的反馈抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，SEQ ID NO：2含有选自以下一组的一或多个氨基酸置换：A279T，A279V，S301F，T308I，S301Y，G345D，R320G，T311I和S381F。
31.权利要求29的制备L-赖氨酸的方法，其中由lysCFBR等位基因编码的反馈抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。
32.权利要求29的制备L-赖氨酸的方法，其中lysCFBR等位基因编码的反馈抗性形式的天冬氨酸激酶含有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列。
33.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是选自以下一组的位点：aecD，ccpA1，ccpA2，citA，citB，citE，fda，gluA，gluB，gluC，gluD，luxR，luxS，lysR1，lysR2，lysR3，menE，mqo，pck，pgi和poxB。
34.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是aecD基因位点。
35.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是gluB基因位点。
36.权利要求26的制备L-赖氨酸的方法，其中该特定的第二个、任选地第三个或第四个位点是pck基因位点。
37.生产棒状细菌的方法，所述细菌产生一或多种化合物，所述方法包括：
a)优选地从棒状细菌中分离编码蛋白质或RNA的至少一种所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列，其任选地包括表达和/或调节信号，
b)将靶位点的核苷酸序列提供给所述ORF、基因或等位基因的5’和3’末端，
c)优选将所述具有靶位点核苷酸序列的所希望的ORF、基因或等位基因的核苷酸序列掺入一个载体中，所述载体在棒状细菌中不复制或仅有限复制，
d)将b)或c)的核苷酸序列转移进棒状细菌中，
e)分离这样的棒状细菌，其中a)的核苷酸序列掺入在靶位点，在该靶位点没有能/使得能在微生物中附加型复制或转座的核苷酸序列，及没有授予抗生素抗性的核苷酸序列。
38.质粒pK18mobsacBglu1_1，其示于图1，并以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBglu1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBglu1_1)的纯培养物形式保藏，保藏号DSM14243。
39.质粒pK18mobsacBaecD1_1，其示于图2，并以大肠杆菌菌株DH5αmcr/pK18mobsacBaecD1_1(＝DH5alphamcr/pK18mobsacBaecD1_1)的纯培养物形式保藏，保藏号DSM15040。
40.谷氨酸棒杆菌菌株DSM12866glu∷lysC，其以纯培养物形式保藏，保藏号DSM15039。
CNB028154460A 2001-08-06 2002-07-30 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸 Expired - Fee Related CN100554426C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30987801P 2001-08-06 2001-08-06
US60/309,878 2001-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1539015A true CN1539015A (zh) 2004-10-20
CN100554426C CN100554426C (zh) 2009-10-28

Family

ID=23200067

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028154460A Expired - Fee Related CN100554426C (zh) 2001-08-06 2002-07-30 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1414970A2 (zh)
CN (1) CN100554426C (zh)
AU (1) AU2002325923A1 (zh)
BR (1) BR0211723A (zh)
CA (1) CA2455878A1 (zh)
WO (1) WO2003040373A2 (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101688212B (zh) * 2007-01-18 2012-07-04 Cj第一制糖株式会社 产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法
CN101939432B (zh) * 2008-01-31 2013-02-13 Cj第一制糖株式会社 改进的启动子和用其产生l-赖氨酸的方法
CN105838740A (zh) * 2016-05-03 2016-08-10 湖北大学 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法
CN106635944A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN108718529A (zh) * 2016-01-15 2018-10-30 高丽大学校产学协力团 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法
CN109415417A (zh) * 2016-07-08 2019-03-01 赢创德固赛有限公司 通过含有编码糖磷酸转移酶系统(pts)的基因的微生物发酵生产甲硫氨酸或其羟基类似物形式的方法
CN109536428A (zh) * 2018-12-07 2019-03-29 武汉远大弘元股份有限公司 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114181288A (zh) * 2022-02-17 2022-03-15 北京中科伊品生物科技有限公司 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7160711B2 (en) 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
US6844176B1 (en) 2001-10-16 2005-01-18 Degussa Ag Alleles of the lysC gene from corynebacteria
DE10359594A1 (de) 2003-12-18 2005-07-28 Basf Ag PEF-TU-Expressionseinheiten
DE102004035067A1 (de) * 2004-07-20 2006-02-16 Basf Ag P1-35-Expressionseinheiten
DE102005013676A1 (de) 2005-03-24 2006-09-28 Degussa Ag Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005023829A1 (de) 2005-05-24 2006-11-30 Degussa Ag Allele des opcA-Gens aus coryneformen Bakterien
DE102005047596A1 (de) 2005-10-05 2007-04-12 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
DE102006026328A1 (de) * 2006-06-02 2008-01-03 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs
DE102007005072A1 (de) 2007-02-01 2008-08-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
DE102008001874A1 (de) 2008-05-20 2009-11-26 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
DE102009030342A1 (de) 2009-06-25 2010-12-30 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von organisch chemischen Verbindungen
DE102010003419B4 (de) 2010-03-30 2019-09-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Ornithin
DE102010025124A1 (de) 2010-06-25 2011-12-29 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von D-Aminosäuren, Mikroorganismus, sowie Vektor
EP2479279A1 (de) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Aminosäuren
CN103492553B (zh) * 2011-02-22 2018-06-12 巴斯夫欧洲公司 用于生产尸胺的方法和重组微生物
DE102011006716A1 (de) 2011-04-04 2012-10-04 Evonik Degussa Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung einer organisch-chemischen Verbindung
JP2014131487A (ja) 2011-04-18 2014-07-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
DE102011118019A1 (de) 2011-06-28 2013-01-03 Evonik Degussa Gmbh Varianten des Promotors des für die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase kodierenden gap-Gens
AU2012333515B2 (en) 2011-11-02 2015-07-16 Ajinomoto Co., Inc. Method for secreting and producing proteins
BR112013016373B1 (pt) 2011-11-11 2021-05-18 Ajinomoto Co., Inc método para produzir uma substância alvo
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
EP2631298A1 (en) 2012-02-22 2013-08-28 Evonik Industries AG Biotechnological method for producing butanol and butyric acid
WO2013160124A1 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Evonik Industries Ag Feedback-resistant alpha-isopropylmalate synthases
EP2674489A1 (en) 2012-06-15 2013-12-18 Evonik Industries AG Biotechnological 2-hydroxyisobutyric acid production
ES2689754T3 (es) 2012-08-20 2018-11-15 Evonik Degussa Gmbh Procedimiento para la preparación fermentativa de L-aminoácidos utilizando cepas mejoradas de la familia Enterobacteriaceae
DE102012016716A1 (de) 2012-08-22 2014-02-27 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-Inhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
DK2811028T3 (en) 2013-06-03 2017-05-01 Evonik Degussa Gmbh Process for Preparation of L-Valine Using Recombinant Coryn Bacteria Containing the Propionate Inducible IlvBN Operon
CN103374540B (zh) * 2013-08-13 2015-04-22 廊坊梅花生物技术开发有限公司 谷氨酸棒杆菌及其应用
EP2940039A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren in Corynebakterien unter Verwendung eines Glycin spaltenden Systems
DE102014208199A1 (de) 2014-04-30 2015-11-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
EP2940144A1 (de) 2014-04-30 2015-11-04 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Produktion von L-Lysin unter Verwendung eines alkaliphilen Bakteriums
PL2940143T3 (pl) 2014-04-30 2020-06-29 Evonik Operations Gmbh Sposób wytwarzania L-aminokwasów z użyciem bakterii bazofilowych
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11293029B2 (en) 2015-12-07 2022-04-05 Zymergen Inc. Promoters from Corynebacterium glutamicum
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
US10544390B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a bacterial hemoglobin library and uses thereof
US20200239897A1 (en) 2017-06-07 2020-07-30 Zymergen Inc. Promoters from corynebacterium glutamicum and uses thereof in regulating ancillary gene expression
EP3415622A1 (en) 2017-06-14 2018-12-19 Evonik Degussa GmbH Method for production of fine chemicals using a corynebacterium secreting modified alpha-1,6-glucosidases
KR102011994B1 (ko) * 2017-06-30 2019-08-20 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아스파토키나제 변이체 및 이를 이용한 l-아미노산의 제조방법
CN111471638B (zh) * 2020-05-22 2021-11-23 江南大学 一株产l-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌突变株的构建与应用
EP4105332A4 (en) * 2021-05-07 2022-12-28 CJ Cheiljedang Corporation NOVEL PROMOTER AND USE THEREOF

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19931317A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin
JP4526710B2 (ja) * 1999-04-19 2010-08-18 協和発酵バイオ株式会社 新規な脱感作型アスパルトキナーゼ
DE19950409A1 (de) * 1999-10-20 2001-04-26 Degussa Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101688212B (zh) * 2007-01-18 2012-07-04 Cj第一制糖株式会社 产l-精氨酸的谷氨酸棒状杆菌变种及其制备方法
CN101939432B (zh) * 2008-01-31 2013-02-13 Cj第一制糖株式会社 改进的启动子和用其产生l-赖氨酸的方法
CN108718529A (zh) * 2016-01-15 2018-10-30 高丽大学校产学协力团 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法
CN108718529B (zh) * 2016-01-15 2021-12-21 高丽大学校产学协力团 用于产生l-半胱氨酸的突变微生物以及使用其产生l-半胱氨酸的方法
CN105838740A (zh) * 2016-05-03 2016-08-10 湖北大学 一种茶树内生草螺菌制备纳米红色元素硒的方法
CN109415417A (zh) * 2016-07-08 2019-03-01 赢创德固赛有限公司 通过含有编码糖磷酸转移酶系统(pts)的基因的微生物发酵生产甲硫氨酸或其羟基类似物形式的方法
CN106635944A (zh) * 2016-12-29 2017-05-10 廊坊梅花生物技术开发有限公司 一种谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN109536428A (zh) * 2018-12-07 2019-03-29 武汉远大弘元股份有限公司 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN109536428B (zh) * 2018-12-07 2022-08-30 武汉远大弘元股份有限公司 一种产l-异亮氨酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN114181288A (zh) * 2022-02-17 2022-03-15 北京中科伊品生物科技有限公司 制备l-缬氨酸的方法及其所用的基因与该基因编码的蛋白质

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003040373A3 (en) 2003-12-18
WO2003040373A2 (en) 2003-05-15
CN100554426C (zh) 2009-10-28
AU2002325923A1 (en) 2003-05-19
EP1414970A2 (en) 2004-05-06
BR0211723A (pt) 2004-09-21
CA2455878A1 (en) 2003-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100336901C (zh) 生产化合物ⅱ的棒状细菌
CN1539015A (zh) 用遗传修饰的谷氨酸棒杆菌生产l-赖氨酸
CN1748031A (zh) 细菌和用所述细菌生产化合物的方法
CN1161470C (zh) 用于产生l-赖氨酸的方法
CN1210396C (zh) L－氨基酸生产菌以及用于生产l－氨基酸的方法
CN1273592C (zh) 用于产生l－赖氨酸的方法
CN1165619C (zh) 制备l-赖氨酸的方法
CN1247783C (zh) 发酵生产l－氨基酸的方法
CN1198919C (zh) 经过发酵生产l－丝氨酸的方法
CN1246468C (zh) 使用肠细菌科菌株发酵生产l－氨基酸的方法
CN1154716C (zh) 发酵法制造l－异亮氨酸的方法
CN1206342C (zh) 生产l－赖氨酸的棒状菌和制备l－赖氨酸的方法
CN1934265A (zh) 使用棒状细菌生产l－氨基酸的方法
CN1262666C (zh) 用人工转座子扩增基因的方法
CN101080489A (zh) 棒状细菌gnd基因的等位基因
CN101065484A (zh) 产生l－氨基酸的细菌和产生l－氨基酸的方法
CN1079836C (zh) 通过发酵生产l-赖氨酸及l-谷氨酸的方法
CN1908174A (zh) 生产l－赖氨酸的方法
CN1231574C (zh) 生产l－赖氨酸的棒状菌和制备赖氨酸的方法
CN1550546A (zh) 通过发酵生产l—精氨酸或l—赖氨酸的方法
CN1572868A (zh) 生产靶物质的方法
CN1618970A (zh) 用甲基营养菌生产l－氨基酸的方法
CN1230525C (zh) 生产l－氨基酸的方法和新型基因
CN1639350A (zh) 生产氨基酸的细菌及制备l－氨基酸的方法
CN1502690A (zh) 利用甲醇同化细菌生产l-赖氨酸或l-精氨酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C56 Change in the name or address of the patentee

Owner name: EVONIK DEGUSSA CO., LTD.

Free format text: FORMER NAME: DECOUCHY STOCK COMPANY

CP03 Change of name, title or address

Address after: essen

Patentee after: Evonik Degussa GmbH

Address before: Dusseldorf, Germany

Patentee before: Degussa AG

CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Essen, Germany

Patentee after: Evonik Operations Limited

Address before: Essen, Germany

Patentee before: Wingchuang Degusai Co., Ltd.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20091028

Termination date: 20200730