CN1908174A - 生产l－赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

增强编码二氨基庚二酸脱羧酶的DNA和编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA的棒杆菌在培养基上培养，以在培养物中生产和积累L－赖氨酸以及从培养物中回收L－赖氨酸。

Description

生产L-赖氨酸的方法
本申请是申请日为1997年6月5日，申请号为97112960.6，发明名称为“生产L-赖氨酸的方法”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及用培养普通发酵生产氨基酸的棒杆菌的变异菌株或借助于基因工程技术得到的类似菌株生产L-赖氨酸的方法。
用于饲料添加剂的L-赖氨酸通常用棒杆菌的生产L-赖氨酸的变异菌株发酵方法生产的。目前许多已知的L-赖氨酸产生菌都是由属于棒杆菌的野生型菌株经过人工诱变得到。
对于棒杆菌，已经公开的载体质粒在细菌细胞中可以自主复制并有抗药标记基因(见美国专利No.4,514,502)、也阐明了引进基因到细菌细胞中的方法(实施例、日本专利申请特许公开No.2-207791)。同时提出用上述技术培育L-苏氨酸或L-异亮氨酸产生菌的可能性(见美国专利No.4,452,890和No.4,442,208)。关于L-赖氨酸产生菌的育种，已知技术将参与L-赖氨酸生物合成的基因引入到载体质粒中并在细菌细胞中扩增。(实施例、日本专利申请特许公开No.56-160997)。
已知的L-赖氨酸生物合成的基因包括，实施例，二氢二皮考啉酸还原酶基因(日本专利申请特许公开No.7-75578)、参与L-赖氨酸生物合成的克隆二氨庚二酸脱氢酶基因(Ishino，S.等人，NucleicAcids Res.，15，3917(1987))、以及磷烯醇丙酮酸羧化酶基因(日本专利申请特许公开No.60-87788)、二氢二皮考啉酸合成酶基因(日本专利公开No.6-55149)、二氨庚二酸脱羧酶基因(日本专利申请特许公开No.60-62994)；这些基因的扩增影响L-赖氨酸的生产力。
如上所述，借助于L-赖氨酸生物合成基因的扩增已经得到改善L-赖氨酸生产力的某些成功结果。然而，虽然基因的扩增能够改善L-赖氨酸的生产力，但是某些基因的扩增却降低了细菌生长速度，导致降低L-赖氨酸的生产速度。
还没有一个报告说明以增强L-赖氨酸生物合成基因来改善细菌的生长。目前，还不知道谁能成功地用结合各种L-赖氨酸生物合成基因的方法在棒杆菌中不抑制菌的生长从而明显提高L-赖氨酸产量。
本发明的目的是，用增强棒杆菌内组合的多种L-赖氨酸生物合成基因方法，改善L-赖氨酸生产力但不降低菌的生长速度。
当产品是由微生物发酵得到时，与引进的原料有关的生产速度及产品的产量是极其重要的因素。增加单位发酵设备生产速度可以明显降低生产成本。发酵速度与发酵产量彼此相融是在工业生产中极其重要的。本发明提出了解决棒杆菌发酵生产L-赖氨酸中存在的上述问题。
本发明的原理是基于这样一个事实：通过增强二氨庚二酸脱羧酶的DNA编码顺序(必要时，下文二氨庚二酸脱羧酶称作“DDC”，DDC蛋白的编码基因称作“ LysA”)和二氨庚二酸脱氢酶的DNA编码顺序(必要时，二氨庚二酸脱氢酶”称作“DDH”，DDH蛋白的编码基因称作“ ddh”)两者与每一个单独增强DNA顺序比较，可以改善棒杆菌的生长，也改善了L-赖氨酸的生产速度。
换句话说，本发明是基于包括二氨庚二酸脱氢酶的DNA编码顺序和二氨庚二酸脱羧酶的DNA编码顺序在内的重组DNA在棒杆菌中的自主复制。
另一方面，本发明提供了载有增强了的二氨庚二酸脱氢酶的和二氨庚二酸脱羧酶的DNA编码顺序的棒杆菌。
还有，本发明提供了生产L-赖氨酸的方法，包括上述棒杆菌在培养基中培养以产生和积累L-赖氨酸、并从培养物中收集L-赖氨酸的步骤。
本发明提到的棒杆菌是在Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology，8th ed.，页599(1974)手册中定义的一组微生物，它们是不能形成芽孢、非耐酸的好氧革兰氏阳性杆菌。棒杆菌包括属于棒杆菌属的细菌、已经归类于短杆菌属的细菌但目前合并到棒杆菌属中的细菌，以及与棒杆菌属细菌有着密切的亲缘关系的属于短杆菌属的细菌。
根据本发明，可以改善棒杆菌的生长速度和生产L-赖氨酸的能力。本发明可以应用到普通的L-赖氨酸产生菌，也可用于具有高产L-赖氨酸的能力的菌株。
图1.描述构建携带 lysA的质粒p299LYSA的方法。
图2.描述构建携带 lysA和Brevi.-ori的质粒pLYSAB的方法。
图3.描述构建携带 ddh和Brevi.-ori的质粒pPK4D的方法。
图4.描述构建携带 ddh和 lysA的质粒p399DL的方法。
图5.描述构建携带 ddh、 lysA和Brevi.-ori的质粒pDL的方法。
图6.描述构建携带 lysC的质粒p399AKYB和p399AK9B的方法。
图7.描述构建携带 dapB和Brevi.-ori的质粒pDPRB的方法。
图8.描述构建携带 dapA和Brevi.-ori的质粒pDPSB的方法。
图9.描述构建携带 lysC、 dapB和Brevi.-ori的质粒pCRCAB的方法。
图10.描述构建携带突变型 lysC、 dapB和Brevi.-ori的质粒pCB的方法。
图11.描述构建携带 dapA、 dapB和Brevi.-ori的质粒pAB的方法。
图12.描述构建携带突变型 lysC、 dapA、 dapB和Brevi.-ori的质粒pCAB的方法。
图13.描述构建携带突变型 lysC、 dapA、 dapB、Brevi.-ori和lysA的质粒pCABL的方法。
图14.描述构建携带突变型 lysC、 dapA、 dapB、 ddh、 lysA和Brevi.-ori的质粒pCABDL的方法。
本发明详细说明如下：
<1>用于本发明的L-赖氨酸生物合成基因的制备
用于本发明的L-赖氨酸生物合成基因可以分别地由下列步骤得到：从细菌作为DNA供体制备染色体DNA、用载体质粒或类似物构建染色体DNA文库、从文库中筛选载有所需基因的菌株、从筛选的菌株回收基因插入的重组DNA。用于本发明的L-赖氨酸生物合成基因的DNA供体没有特殊的限制，只要所需的L-赖氨酸生物合成基因能够表达在棒杆菌细胞的 功能酶蛋白。但是，DNA的供体最好是棒杆菌。
已经知道来源棒杆菌的 lysA和 ddh两种基因的顺序。因此，可以根据聚合酶链反应方法经过扩增得到这些基因(PCR；参见White，T.J.等人， Trends Genet.，5，185(1989))。
用于本发明的每一种L-赖氨酸生物合成基因可以采用下面例举的某些方法得到。
(1)突变型 lysA的制备
根据例如Saito和Miura的方法(H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963))，制备染色体DNA，并根据聚合酶链反应方法(PCR；参见White，T.J.等人， Trends Genet.，5，185(1989))扩增lysA，可以从棒杆菌的染色体中分离出 lysA。DNA的供体没有特殊的限制，然而用 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株来举例说明。
在棒杆菌中， lysA和 argS一起形成一个操纵子(精氨酰-tRNA合成酶基因)并且 lysA处于 argS的下游。 lysA的表达由处于 argS上游的启动子调节(参见Journal of Bacteriology，Nov.，7356-7362(1993))。谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的这些基因的DNA顺序是已知的(参见MolecularMicrobiology，4(11)，1819-1830(1990)；Molecular and General Genetics，212，112-119(1988))，在该基础上，可以制备PCR的DNA引物。这样的DNA引物，特以23-mers of DNA为例，它们的核苷酸顺序分别显示在顺序表SEQ ID NO：1(相当于Molecular Microbiology，4(11)，1819-1830(1990)描述的核苷酸顺序中的核苷酸数11-33)和SEQ ID NO：2(相当于Molecular and General Genetics，212，112-119(1988)描述的核苷酸顺序中的核苷酸数1370-1392)。
下文描述的实例中，为了增强 lysA，采用含有启动子、 argS和lysA的DNA片断。然而， argS对本发明来说是不必要的。因为容许用 lysA刚好连接在启动子的下游的DNA片断。
在SEQ ID NO：3中举例，含有 argS和 lysA的DNA片断的核苷酸顺序和按核苷酸顺序推导的氨基酸编码顺序。由 argS编码的氨基酸顺序实施例显示在SEQ ID NO：4中，由 lysA编码的氨基酸顺序实例显示在SEQ ID NO：5中。除了编码这些氨基酸顺序的DNA片断以外，本发明也可同样使用实质上与在SEQ ID NO：5中氨基酸顺序相同的其他DNA片断，即具有由于例如取代、缺失或插入一个或多个对DDC活性没有实质性影响的氨基酸而产生变异的氨基酸顺序。
可根据普通方法使用应用生物系统公司生产的380B型DNA合成仪和磷酸酰胺酯方法(参见Tetrahedron Letters(1981)，22 1859)合成DNA。根据厂家提供的方法用Taq DNA聚合酶和Takara Shuzo公司生产的PJ2000型DNA扩增仪可以实行PCR。
最好是将经PCR扩增的 lysA与在大肠杆菌和/或棒杆菌细胞中自主复制的载体DNA相连，以制备重组DNA，而且预先将制备好的重组DNA引入大肠杆菌细胞中。这样的准备工作使下列操作容易进行。在大肠杆菌细胞中自主复制的载体最好是能在宿主细胞中自主复制的质粒载体，包括例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398和RSF1010。
当具备能使质粒在棒杆菌中自主复制的DNA片断插入这些载体时，它们可用作在大肠杆菌和/或棒状两种细菌中都可以自主复制的所谓穿梭载体。
这样的穿梭载体如下所示。在国际储存文库权威机构中
藏有每一种载体的微生物和它们的在园括号中的登记号码。
pHC4：大肠杆菌AJ12617(FERM BP-3532)
pAJ655：大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)
          谷氨酸棒杆菌SR8201(ATCC 39135)
PAJ 1844：大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)
          谷氨酸棒杆菌SR8202(ATCC 39136)
PAJ611：大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)
PAJ3148：谷氨酸棒杆菌SR8203(ATCC 39137)
PAJ440：枯草杆菌AJ11901(FERM BP-140)
可用如下方法从储存的微生物得到这些载体。在对数生长期收集的细胞用溶菌酶和SDS裂解，溶菌产物在30,000×g下离心分离得到上清液。将聚乙二醇加入上清液中，借助氯化铯-溴化乙锭平衡密度梯度离心进行分部分离和纯化。
根据例如D.M.Morrison的方法( Methods in Enzymology， 68，326(1979)或用氯化钙处理受体细胞以增加DNA的透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))引入质粒转化大肠杆菌。
(2) ddh的制备
用PCR方法从棒杆菌的染色体中制备含有 ddh的DNA片断。DNA的供体没有专门的限制，然而，例举的菌株是 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株。
已知谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的DDH基因(Ishino、S.等人，Nucleic Acids Res.，15，3917(1987))，在此基础上可以制备PCR的引物。这样的DNA引物以分别具有顺序表的SEQ ID NO：6和NO：7中所示核苷酸顺序的20-mers DNA为具体的实例。DNA的合成、PCR以及携带 ddh的质粒的制备都可以用与上述用于 lysA的同样方法进行。
含有 ddh的DNA片断的核苷酸顺序以及由核苷酸顺序推导出来的氨基酸顺序在SEQ ID NO：8中说明。SEQ ID NO：9只显示氨基酸顺序。除了编码该氨基酸顺序的DNA片断外，本发明也可以同样使用编码与SEQ ID NO：9中所示的基本相同的氨基酸顺序(即具有基于例如取代、缺失或插入一个或多个对DDH活性没有实质性影响的氨基酸的变异体的氨基酸顺序)的DNA片断。
<2>本发明的棒杆菌和重组DNA
本发明的棒杆菌含有用增强的编码二氨庚二酸脱羧酶( lysA)的DNA顺序和编码二氨庚二酸脱氢酶( ddh)的DNA顺序。术语“增强DNA顺序””含义例如是用增加基因的拷贝数、使用强启动子、使用具有高比活性酶的编码基因或混合这些方法等提高细胞内由DNA顺序编码的酶活性。
上面描述过DNA顺序的棒杆菌是产生L-赖氨酸的棒杆菌，其实例包括产生L-赖氨酸的野生菌株、人工突变菌株和用基因工程增强了L-赖氨酸生产力的棒杆菌。即使细菌L-赖氨酸的生产力很低，也可以通过增强 lysA和 ddh提高L-赖氨酸的生产力。如果细菌的L-赖氨酸生产力高，通过增强 lysA和 ddh可能会使其L-赖氨酸生产效率有更大的提高。
(1)属于棒杆菌的L-赖氨酸产生菌株
用于引进 lysA和 ddh的棒杆菌包括例如下列L-赖氨酸产生菌株：
嗜乙酰乙酸棒杆菌 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870；
嗜乙酰谷氨酸棒杆菌 Corynebacterium ATCC15806；
美棒杆菌( Corynebacterium callunae)ATCC 15991；
谷氨酸棒杆菌( Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032；
叉开短杆菌( Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020；
( Brevibacterium lactofermentum)ATCC 13869；
( Corynebacterium lilium)ATCC 15990；
黄色短杆菌( Brevibacterium flavum)ATCC 14067；
Corynebacterium melassecola ATCC 17965；
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066；
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068；
Brevibacterium roseum ATCC 13825；
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240；
嗜氨微杆菌 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354；
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340(FERM BP-1539)。
除了上述的菌株外，那些可用作增强 lysA和 ddh的宿主菌株，包括例如由上述菌株衍生来的有L-赖氨酸生产力的突变株。这样的人工突变株包括下列菌株：S-(2-氨乙基)半胱氨酸(下文缩写为“AEC”)抗性突变株( Brevibacterium lactofermentum AJ11082(NRRL B-11470)，日本专利公告No.56-1914、56-1915、57-14157、57-14158、57-30474、58-10075、59-4993、61-35840、62-24074、62-36673、5-11958、7-112437、和7-112438)；其生长需要一种氨基酸(诸如L-高丝氨酸)的突变株(日本专利公告No.48-28078和No.56-6499)；表现AEC抗性并需要一种氨基酸(诸如L-亮氨酸、L-高丝氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸和L-缬氨酸)的突变株(美国专利No.3,708,395和No.3,825,472)；对DL-α-氨基-ε-己内酰胺、α-氨基-月桂内酰胺、天门冬氨酸-类似物、磺胺药物、醌类(quinoid)、和N-月桂亮氨酸有抗性的L-赖氨酸产生突变株；对oxyaloacetate脱羧酶或呼吸系统的酶的抑制剂有抗性的L-赖氨酸产生突变株；(日本专利申请特许公开No.50-53588、50-31093、52-102498、53-9394、53-86089、55-9783、55-9759、56-32995、和56-39778，和日本专利公告No.53-43591和53-1833)；需要肌醇或乙酸的L-赖氨酸产生突变株(日本专利申请特许公开No.55-9784和56-8692)；对氟丙酮酸或不低于34℃的温度敏感的L-赖氨酸产生突变株；(日本专利申请特许公开No.55-9783和53-86090)；和对乙二醇有抗性并生产L-赖氨酸、属于短杆菌属和棒杆菌属的生产突变株(美国专利No.4,411,997)。
(2)通过基因重组增强L-赖氨酸生产力的L-赖氨酸产生棒杆菌
如果用基因工程方法，例如引入具有突变的酶(使其对反馈抑制不敏感，在参与L-赖氨酸生物合成的酶中，野生型的该酶受反馈抑制)的编码基因，或增强除 lysA和 ddh外的L-赖氨酸的生物合成的基因来增强了棒杆菌的L-赖氨酸生产，那么通过增强 lysA和 ddh可以进一步提高L-赖氨酸的生产速度。
L-赖氨酸生产力增强的棒杆菌包括含有编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制不敏感的天门冬氨酸激酶的DNA顺序(天门冬氨酸激酶下文称为“AK”、编码AK蛋白的基因下文称为“ lysC”，必要时对编码L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制不敏感的AK蛋白的基因)和编码二氢二皮考啉酸还原酶的增强的DNA顺序(二氢二皮考啉酸还原酶下文称为“DDPR”、必要时编码DDPR蛋白的基因下文称为“ dapB”)的棒杆菌，以及还含有编码二氢二皮考啉酸合成酶的增强的DNA顺序(二氢二皮考啉酸合成酶下文称“DDPS”、必要时编码DDPS蛋白的基因下文称为“ dapA”)的棒杆菌。用于本发明的每一个L-赖氨酸的生物合成基因可按照下面例举的某些方法得到。
(i)突变型 lysC的制备
含有突变型 lysC的DNA片断可以由L-赖氨酸和L-苏氨酸对AK活性的协同反馈抑制作用实质上不敏感的突变菌株制备(InternationalPublication No.WO 94/25605)。例如用常用的突变处理(诸如紫外线照射)和突变剂(诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)处理，由一组源于经过诱变处理的棒杆菌的野生型细胞，能够得到这样的突变型。AK的活性可用Miyajima(Miyajima，R.等人， The Journal of Biochemistry(1968)，63(2)，139-148)的方法测定。这样的突变株的最优选的代表是由Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869(现更名为 Corynebacterium glutamicum)的野生型菌株经过突变处理得到L-赖氨酸产生菌AJ3445(FERM P-1944)。
另一种方法，体外诱变处理含有野生型 lysC的质粒DNA也能够得到突变型 lysC。另一方面，具体突变得到L-赖氨酸和L-苏氨酸对AK的协同反馈抑制不敏感的资料已为人知(国际专利No.WO94/25605)。因此，根据这些资料突变型 lysC也可以由野生型的 lysC通过例如位点诱变方法得到。
含有 lysC的DNA片断可用PCR方法由棒杆菌的染色体制备。根据已知的谷氨酸棒杆菌的顺序(参见Moleculal Microbiology(1991)，5(5)，1197-1204；Mol.Gen.Genet.(1990)，224，317-324)，为了扩增例如大约1,643bp的 lysC编码区域，例举具有在顺序表SEQ ID NO：10和NO：11中所示核苷酸顺序的23-mer和21-mer的单链DNA作为DNA引物。合成DNA、PCR、制备携带得到的 lysC的质粒都能够用上述制备 lysA的相同方法进行。
按照上述方法，从AK野生型菌株分离 lysA时，可得到野生型lysC，而从AK突变菌株分离 lysA时，可得到突变型 lysC。
含有野生型 lysC的DNA片断的核苷酸顺序的实例是显示在顺序表SEQ ID NO：12上。由核苷酸顺序推导出野生型AK蛋白的α-亚基的氨基酸顺序，与DNA顺序一起显示在顺序表SEQ ID NO：13上。SEQ ID NO：14只显示氨基酸顺序。由核苷酸顺序推导出的野生型AK蛋白β-亚基的氨基酸顺序，与DNA顺序一起显示在顺序表SEQ IDNO：15上。SEQ ID NO：16只显示氨基酸顺序。在每一个亚基中，GTG用作起始密码子，而相应的氨基酸用蛋氨酸表示。然而，该代表不仅仅是蛋氨酸，还有缬氨酸或甲酰蛋氨酸。
用于本发明的突变型 lysC没有特别的限制，只是它编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制作用不敏感的AK。然而，突变型 lysC的实例是具有突变的突变型 lysC，其中从N-端算起第279个丙氨酸残基换成除了丙氨酸和α-亚基中的酸性氨基酸外的氨基酸残基，而且在野生型AK的氨基酸顺序中第30个丙氨酸残基换成除了丙氨酸和β-亚基中的酸性氨基酸外的氨基酸残基。野生型AK的氨基酸顺序具体包括作为α-亚基显示在顺序表SEQ ID NO：14中的氨基酸顺序、作为β-亚基显示在顺序表SEQ ID NO：16中的氨基酸顺序。
除了丙氨酸和酸性氨基酸以外，作为优选的氨基酸残基有苏氨酸、精氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基。
与待替换的氨基酸残基相应的密码子对其类型没有特别的限制，只要它编码氨基酸残基。假定野生型AK的氨基酸顺序可能由于细菌的种间和菌株间的差异而有轻微的不同。具有突变(由例如在一个或多个上述与活性否关的位点上替换、缺失、或插入一个或多个氨基酸残基而引起的)的AK也可用于本发明中。具有突变(由例如替换、缺失、或插入一个或多个氨基酸残基而引起的)的其它AK，只要对AK的活性和对L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制作用不敏感基本上没影响，也可以用于本发明。
由引入一个突变型 lysC质粒p399AK9B到Brevibacteriumlactofermentum野生型菌株AJ12036(FERM BP-734)中得到AJ12691菌株；AJ12691菌株已经于1992年4月10日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM P-12918；AJ12961菌株按照布达佩斯条约于1995年2月10日转移到国际保藏中心，登记号为FERM BP-4999。
(ii) dapB的制备
含有 dapB的DNA片断可借助PCR由棒杆菌的染色体制备。DNA供体没有特别的限制，然而，最好是Brevibacterium lactofermentumATCC 13869菌株。
对于Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株已经知道DDPR的DNA编码顺序(Journal of Bacteriology，175(9)，2743-2749(1993))，在此基础上可以制备PCR的DNA引物。这样的DNA引物具体以23-mers的DNA为例，它们的核苷酸顺序分别显示在顺序表SEQID NO：21和22中。合成DNA、PCR、制备携带得到的 dapB的质粒都能够用上述制备 lysC相同的方法进行。
含有 dapB的DNA片断的核苷酸顺序和由核苷酸顺序推导出的氨基酸顺序显示在SEQ ID NO：23中。SEQ ID NO：24只显示氨基酸顺序。除了编码该氨基酸顺序的DNA片断外，本发明也可以同样采用编码氨基酸顺序与显示在SEQ ID NO：24中基本相同的氨基酸顺序的DNA片断，即具有突变(由例如替换、缺失、或插入一个或多个氨基酸残基而引起的)的氨基酸顺序，只要对DDPR活性没有实质性影响。
将携带 dapB(下文实例得到)的pCRDAPB质粒引入到大肠杆菌JM109菌株中得到转化菌株AJ13107，按照布达佩斯条约，此菌株进行国际保藏，已经于1995年5月26日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM BP-5114。
(iii) dapA的制备
含有 dapA的DNA片断可借助PCR由棒杆菌的染色体制备。DNA供体没有特别的限制，然而，以Brevibacterium lactofermentumATCC 13869菌株为例。
已经知道谷氨酸棒杆菌编码DDPS的DNA顺序(参见 Nucleic Acid Research， 18(21)，6421(1990)； EMBL登记号X53993)，在此基础上可以制备PCR的DNA引物。这样的DNA引物具体以23-mers的DNA为例，它们的核苷酸顺序分别显示在顺序表SEQ ID NO：17和18中。合成DNA、PCR、制备携带得到的 dapA的质粒都能够用上述制备lysC相同的方法进行。
含有 dapA的DNA片断的核苷酸顺序和由核苷酸顺序推导出的氨基酸顺序显示在SEQ ID NO：19中。SEQ ID NO：20只显示氨基酸顺序。除了编码该氨基酸顺序的DNA片断外，本发明也可以采用编码氨基酸顺序与显示在SEQ ID NO：20中基本相同的氨基酸顺序的DNA片断，即具有突变(由例如替换、缺失、或插入一个或多个氨基酸残基而引起的)的氨基酸顺序，只要对DDPR活性没有实质性影响。
将携带 dapA(由后面的实施例中得到)的pCRDAPA质粒引入到大肠杆菌JM109菌株中得到转化菌株AJ13106，按照布达佩斯条约，此菌株进行国际保藏，已经于1995年5月26日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM BP-5113。
在特定的实施方案中，为了增强如上述的L-赖氨酸产生棒杆菌的lysA和 ddh，基因是用质粒载体、转座子或噬菌体载体等引入到宿主中。在引入中，即使用低拷贝型载体，也预期能够达到某种程度的增强。然而，还是优选多拷贝型载体。这样的载体包括例如上述的质粒载体、pAJ655、pAJ1844、pAJ611、pAJ3148、和pAJ440。此外，由棒杆菌衍生的转座子记载在国际专利No.WO 92/02627 and WO93/18151；欧州专利公告No.445385；日本专利申请特许公开No.6-46867；Vertes，A.A.等人， Mol.Microbiol.， 11，739-746(1994)；Bonamy，C.，等人， Mol.Microbiol.， 14，571-581(1994)；Vertes，A.A.等人， Mol.Gen. Genet.， 245，397-405(1994)；Jagar，W.等人， FEMS Microbiology Letters，126，1-6(1995)；日本专利申请特许公开No.7-107976和7-327680等资料上。
例如用引进含有 lysA和 ddh的重组DNA到宿主棒杆菌中，并在宿主细胞中进行自主复制，能够得到根据本发明增强了 lysA和 ddh的棒杆菌。例如用插入 lysA和 ddh到载体(诸如上述的质粒载体、转座子或噬菌体载体之类)中，可以得到重组DNA。
lysA和 ddh基因的每一个都可以通过不同的载体分别连续引入宿主中。或者，两种基因可用一个载体一起引入宿主中。当使用不同的载体时，基因可以任何次序引入，可是，应优选具有能在宿主中稳定分配并停留的机制的载体，以及能够彼此共存的载体。
在采用质粒定为载体的情况下可以按照电子脉冲方法(Sugimoto等人，日本专利申请特许公开No.2-207791)将重组DNA引入宿主中。引入一个带转座子的质粒到宿主中并使转座子转位，可以利用转座子进行基因扩增。
并且，当突变型 lysC、 dapA和 dapB引进到棒杆菌中时，每一个 lysA和 ddh的基因都可以用不同的载体分别连续引入宿主中，或者，两种或多种基因可用一个载体一起引入宿主中。
<3>生产L-赖氨酸的方法
通过在合适的培养基中培养包含上述增强的L-赖氨酸生物合成基因的棒杆菌，能够在培养物中产生、积累和回收L-赖氨酸，从而有效地生产L-赖氨酸。
所用培养基的实例是普通的含有碳源、氮源、无机离子、和可选的其它有机成份的培养基。
作为碳源，可能用糖类(诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和淀粉水解物之类)、有机酸(诸如富马酸、柠檬酸和琥珀酸之类)。
作为氮源，可能用无机铵盐(诸如硫铵、氯化铵和磷酸铵之类)、有机氮(诸如大豆水解物之类)、氨气、氨水。
有机微量营养源，需要含有适量的所需物质诸如维生素B1和L-高丝氨酸或酵母浸汁等。此外，如果所需还可以加入少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等等。
最好在好氧条件下培养大约30-90小时。在培养期间，培养温度最好控制在25-37℃，pH值最好控制在5-8。无机或有机、酸或碱物质、或氨气等都可用来调节pH值。可以通过组合普通的离子交换树脂方法、沉淀方法或其他已知的方法从培养物中回收L-赖氨酸。
实施例
下面参考实施例更详细地解释本发明。
实施例1：从Brevibacterium lactofermentum中制备lysA
<1>制备 lysA和构建携带 lysA的质粒
Brevibacterium lactofermentumATCC 13869野生型菌株作为染色体DNA的供体。按照普通的方法从ATCC 13869菌株制备染色体DNA。按照PCR方法从染色体DNA上扩增含有 argS、 lysA和含有这些基因的操纵子的启动子DNA片断。关于用来扩增的DNA引物，根据Corynebacterium qlutamicum已知顺序，具有分别显示在顺序表SEQ ID NO：1和2的核苷酸顺序的20-mers合成DNA用来扩增编码精氨酸-tRNA合成酶和DDC的大约3.6kb的区间(参见 Molecular Microbiology， 4(11)，1819-1830(1990)； Molecular and General Genetics，212，112-119(1988))。
根据普通方法使用380B型DNA合成仪(应用生物系统公司生产)和磷酸酰胺酯方法(参见 Tetrahedron Letters(1981)， 22，1859)合成DNA。
根据厂家提供的方法用Taq DNA聚合酶和PJ2000型DNA扩增仪(Takara Shuzo公司生产)，通过PCR扩增基因。pHSG399用作扩增的3,579bp基因片断的克隆载体。用限制酶 SamI(Takara Shuzo生产)消化pHSG399，并与含有已扩增 lysA的DNA片断连接。如上述得到的含有来源于ATCC 13869菌株的 lysA的质粒定为p399LYSA。
用 KpnI和 BamHI(Takara Shuzo生产)消化p399LYSA来提取含有lysA的DNA片断。该DNA片断与用 KpnI和 BamHI消化的pHSG299连接。得到的质粒定为p299LYSA。构建p299LYSA的过程示于图1中。
将能够使质粒在棒杆菌中自主复制的DNA片断(下文称为“Brevi.-ori”)引入p299LYSA中，以制备可在棒杆菌中自主复制、携带 lysA的质粒。Brevi.-ori是从含Brevi.-ori的质粒载体pHK4制备的，而且可在大肠杆菌和棒杆菌的细胞中自主复制。pHK4是通过用KpnI和 BamHI(Takara Shuzo生产)消化pHC4、提取Brevi.-ori片断、并使其与用 KpnI和 BamHI消化过的pHSG298连接而构建的(日本专利申请特许公开No.5-7491)。pHK4使宿主对卡那霉素有抗性。含有pHK4的大肠杆菌HB101定为大肠杆菌AJ13136，已经于1995年8月1日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM BP-5186。
pHK4用限制酶 BamHI消化，并且使切开端成平端。用DNA平齐试剂盒(Takara Shuzo生产)按照设计的方法实现平端形成。平端形成后，连接磷酸化 KpnI接头以进行修饰，这样只有用 KpnI消化才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori部分的DNA片断。用 KpnI消化该质粒，将产生的Brevi.-ori DNA片断与也用 KpnI消化的p299LYSA连接，以制备在棒杆菌中自主复制、携带 lysA的质粒。制备的质粒定为pLYSAB。构建的pLYSAB方法示于图2上。
<2>测定来自Brevibacterium lactofermentum的 lysA的核苷酸顺序
制备p299LYSA的质粒DNA，按照Sanger等人的方法测定核苷酸顺序(例如F.Sanger等人， Proc.Natl.Acad.Sci.， 74，5463(1977))。测定的核苷酸顺序与由核苷酸顺序推导出编码的氨基酸顺序显示在SEQ ID NO：3中。关于核苷酸顺序，由 argS编码的氨基酸顺序和由 lysA编码的氨基酸顺序分别显示在SEQ ID NO：4和5中。
实施例2：从Brevibacterium lactofermentum制备ddh
ddh基因是用两个寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO：6和7，根据Brevibacterium lactofermentum已知的 ddh基因的核苷酸顺序制备的)，通过PCR方法扩增Brevibacterium lactofermentumATCC 13869的染色体DNA的 ddh基因而得到(Ishino，S.等人，Nucleic Acids Res.，15，3917(1987))。所得的扩增的DNA片断用 EcoT22I和AvaI消化并切成平端。然后，该片断插入pMW119的 SamI位点得到质粒pDDH。
接着，pDDH用 SalI和 EcoRI消化后，生成平端。然后，得到的片断与用 SamI消化的pUC18连接。这样得到的质粒定为pUC18DDH。
将Brevi.-ori引入pUC18DDH中以构建可在棒杆菌中自主复制、携带 ddh的质粒。pHK4用限制酶 KpnI和 BamHI消化，并且使切开端成平端。用DNA平齐试剂盒(Takara Shuzo生产)按照设计的方法形成平端。平端形成后，连接磷酸化PstI接头(Takara Shuzo生产)，这样它可插入pHSG299的PstI位点。按上述构建的质粒定为pPK4。接着，pUC18DDH用 XbaI和 KpnI消化，得到的片断与用 KpnI和 XbaI消化的pPK4连接。这样就构建了可在棒杆菌中自主复制、携带 ddh的质粒。该质粒定为pPK4D。构建pPK4D的过程示于图3中。
实施例3：携带ddh和lysA的质粒的构建
携带 ddh的质粒pUC18DDH用 EcoRI消化然后平端化，再用 XbaI消化以提取含 ddh的DNA片断。该 ddh片断与含有 lysA的的质粒p399LYSA(用 BamHI消化，然后平端化，再用 XbaI消化)连接。该质粒定为p399DL。构建p399DL的过程示于图4中。
将Brevi.-ori引入p399DL中。pHK4用限制酶 XbaI和 BamHI消化，并且使切开端成平端。平端形成后，连接磷酸化 XbaI接头以进行修饰，这样只有用 XbaI消化pHK4才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori部分的DNA片断。该质粒用 XbaI消化，产生的Brevi.-oriDNA片断与也用 XbaI消化的p399DL连接，构建了可在棒杆菌中自主复制含有 ddh和 lysA的质粒。该质粒定为pDL。构建pDL的过程示于图5中。
实施例4：由Brevibacterium lactofermentum制备突变型lysC、dapA和dapB
<1>由Brevibacterium lactofermentum菌株制备野生型 lysC基因和突变型 lysC基因
(1)制备野生型 lysC和突变型 lysC以及制备携带它们的质粒
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869菌株和由其经过诱变处理得到的L-赖氨酸产生突变型菌株AJ3445(FERM p-1944)作为染色体DNA的供体。由于AJ3445菌株已经经过诱变处理，所以 lysC产生了变化而对赖氨酸和苏氨酸的协同抑制作用基本上不敏感( Journal of Biochemistry， 68，701-710(1970))。
从染色体DNA按照PCR方法进行扩增含有 lysC的DNA片断(聚合酶链反应；参见White，T.J.等人， Trends Genet.， 5，185(1989))。关于扩增的DNA引物，为了扩增编码 lysC的大约1,643bp区域，根据已知的谷氨酸棒杆菌的顺序(参见 Molecular Microbiology(1991)， 5(5)，1197-1204；和 Mol.Gen.Genet.(1990)， 224，317-324)，合成具有显示在SEQ ID NO：10和11中核苷酸顺序的单链23-mer和21-mer DNA。
已扩增的1,643kb的基因片断用琼脂糖凝胶电泳确认。然后按照普通方法纯化从凝胶上切出的片断，再用限制酶 NruI和 EcoRI(TakaraShuzo公司生产)进行消化。
pHSG399(参见Takeshita，S.等人， Gene(1987)， 61，63-74)作为基因片断的克隆载体。用限制酶 SamI和 EcoRI(Takara Shuzo生产)消化pHSG399，并与已扩增 lysC的片断连接。DNA是用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo公司生产)及其方法连接的。这样，质粒制备成功，其中从谷氨酸棒杆菌染色体扩增的 lysC片断分别与PHSG399连接。携带来源于ATCC 13869(野生型菌株)的 lysC的质粒定为p399AKY。携带来源于AJ3463(L-赖氨酸产生菌)的 lysC的质粒定为p399AK9。
将Brevi.-ori引入制备的p399AKY和p399AK9中，分别构建了可在棒杆菌中自主复制、携带 lysC的质粒。pHK4用限制酶 KpnI和BamHI(Takara Shuzo公司生产)消化，并且使切开端成平端。平端形成使用DNA平齐试剂盒及其方法进行的(Takara Shuzo公司生产)。平端形成后，连接磷酸化 BamHI接头以进行修饰，这样只有用 BamHI消化才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori的DNA片断。用 BamHI消化该质粒，将产生的Brevi.-ori DNA片断与用 BamHI消化的p399AKY和p399AK9连接，制备可在棒杆菌中自主复制、携带 lysC的质粒。
来源于p399AKY的携带野生型 lysC质粒定为p399AKYB，来源于p399AK9的携带突变型 lysC的质粒定为p399AK9B。构建p399AKYB和p399AK9B的过程示于图6中。通过引进突变型 lysC的质粒p399AK9B到Brevibacterium lactofermentum野生型菌株(AJ12036菌株，FERM BP-734)得到的菌株AJ12691已经于1992年4月10日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM P-12918；按照布达佩斯条约，此菌株已经于1995年2月10日转入国际保藏中心，登记号为FERMBP-4999。
(2)来自Brevibacterium lactofermentum的野生型 lysC基因和突变型 lysC的核苷酸顺序的测定
为了测定野生型和突变型 lysC的核苷酸顺序，分别从各自的转化体制备携带野生型 lysC的质粒p399AKYB和携带突变型 lysC的质粒p399AK9B。核苷酸顺序的测定是按照Sanger等人的方法(例如F.sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，74，5463(1977))进行的。
由p399AKY编码的野生型 lysC的核苷酸顺序显示在顺序表SEQID NO：12上。另一方面，由p399AK9编码的突变型 lysC的核苷酸顺序与野生型 lysC比较，显示在顺序表SEQ ID NO：12上的只有一个核苷酸第1051个G变成A。已知谷氨酸菌株的lysC有两个亚基(α，β)，编码在同一DNA链的同一阅读框架内(参见Kalinowski，J.等人，Molecular Microbiology(1991) 5(5)，1197-1204)。从同源性判断，预期经顺序分析的基因也有编码在同一DNA链的同一阅读框架内的两个亚基(α，β)。
由核苷酸顺序推导出的野生型AK蛋白α-亚基的氨基酸顺序与DNA顺序一起显示在顺序表SEQ ID NO：13中。单独氨基酸顺序显示在顺序表SEQ ID NO：14中。由核苷酸顺序推导出的野生型AK蛋白β-亚基的氨基酸顺序与DNA顺序一起显示在顺序表SEQ ID NO：15中。SEQ ID NO：16只显示氨基酸顺序。在每一个亚基中，GTG都用作起始密码子，而相应的氨基酸用蛋氨酸表示。可是，这种表示是指蛋氨酸、缬氨酸或甲酰蛋氨酸。
另一方面，突变型 lysC顺序上的突变是指发生了氨基酸的替代，因此，α-亚基的第279个丙氨酸残基换成苏氨酸残基，而且在野生型AK蛋白的β-亚基氨基酸顺序中第30个丙氨酸残基换成苏氨酸残基(SEQ ID NO：14、16)。
<2>由Brevibacterium lactofermentum制备 dapB
(1)制备 dapB和构建携带 dapB的质粒
Brevibacterium lactofermentum的野生型菌株ATCC 13869作为染色体DNA的供体。根据普通方法由ATCC 13869菌株制备染色体DNA。按照PCR方法从染色体DNA中含扩增 dapB的DNA片断。关于扩增的DNA引物，为了经过扩增达到大约2.0kb编码DDPR，根据已知的谷氨酸棒杆菌的顺序(参见 Jounal of bacteriology， 157(9)，2743-2749(1993))，分别合成具有显示在核苷酸顺序表SEQ ID NO：21和22中核苷酸顺序的23-mer DNA。DNA的合成和pCR是用与实施例1中叙述的同样方法进行。pCR-Script(Invitrogen生产)作为已扩增的2,001bp基因片断的克隆载体，并与已扩增的 dapB片断连接。这样构建了由菌株染色体扩增的2,001bp的 dapB片断与pCR-Script连接的质粒。如上述得到的、含有来源于ATCC 13869的 dapB的质粒定为pCRDAPB。由引入pCRDAPB到大肠杆菌JM109中得到的转化体菌株AJ13107已经按照布达佩斯条约于1995年5月26日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所(邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM BP-5114。
含有DDPR结构基因的1,101bp片断是通过用 EcoRV和 SphI消化pCRDAPB提取得到的。该片断与用 HincII和 SphI消化的pHSG399连接制备成质粒。制备的质粒定为p399DPR。
Brevi.-ori引入制成的p399DPR中，构建可在棒杆菌中自主复制、携带 dapB的质粒。pHK4用限制酶 KpnI(Takara Shuzo公司生产)消化，并且使切开端成平端。平端形成使用DNA平齐试剂盒及其方法进行(Takara Shuzo公司生产)。平端形成后，连接磷酸化 BamHI接头(Takara Shuzo公司生产)以进行修饰，这样只有用 BamHI消化pHK4才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori的DNA片断。该质粒用 BamHI消化，产生的Brevi.-ori DNA片断与用 BamHI消化的p399DPR连接，构建了可在棒杆菌中自主复制、携带 dapB的质粒。制备的质粒定为pDPRB。构建pDPRB的过程示于图7中。
(2)测定来源于Brevibacterium lactofermentum的 dapB的核苷酸顺序
从含有pDPRB的AJ13107菌株制备质粒DNA，并以与实施例1中相同的方法测定它的核苷酸顺序。测定的核苷酸顺序和由其推导出的氨基酸顺序显示在SEQ ID NO：23中。SEQ ID NO：24只显示氨基酸顺序。
<3>从Brevibacterium lactofermentum制备 dapA
(1)制备 dapA并构建携带 dapA的质粒
Brevibacterium lactofermentum野生型菌株ATCC 13869用作染色体DNA的供体。用普通方法由ATCC 13869菌株制备染色体DNA。断用PCR方法从染色体DNA扩增含有 dapA的DNA片断。关于扩增的DNA引物，为了扩增编码DDPS的大约1.5kb区间，需根据已知的谷氨酸棒杆菌的顺序，分别合成具有显示在核苷酸顺序表SEQ IDNO：17和18上核苷酸顺序的23-mer DNA(参见 Nucleic Acid Research， 18(21)，6421(1990)；EMBL登记号No.X53993)。合成DNA和PCR是用与实施例1中叙述的同样方法进行。pCR-1000(Invitrogen生产，参见 Bio/Technology， 9，657-663(1991))作为已扩增的1,411bp基因片断的克隆载体，与已扩增的 dapA片断连接。DNA的连接是用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo公司生产)和其方法实行的。由Brevibacterium lactofermentum染色体扩增的1,411bp  dapA片断与pCR-1000连接，这样就构建了一个质粒。如上述得到的、含有来源于ATCC 13869菌株的 dapA的质粒定为pCRDAPA。由引入pCRDAPA到大肠杆菌JM109中得到的转化体菌株AJ13106已经按照布达佩斯条约于1995年5月26日保藏在国际贸易工业部的工业科学技术署国家生物科学和人类技术研究所邮政编码：305，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)，登记号为FERM BP-5113。
将Brevi.-ori引入制成的pCRDAPA中以构建可在棒杆菌中自主复制、携带 dapA的质粒。pHK4用限制酶 KpnI和 BamHI(Takara Shuzo公司生产)消化，并且使切开端成平端。平端形成使用DNA平齐试剂盒(Takara Shuzo公司生产)及其方法进行的。平端形成后，连接磷酸化 SmaI接头(Takara Shuzo公司生产)以进行修饰，这样只有用 SmaI消化pHK4才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori的DNA片断。该质粒用 SmaI消化，产生的Brevi.-ori DNA片断与也用 SmaI消化的pCRDAPA连接，制备了可在棒杆菌中自主复制、携带 dapA的质粒。该质粒定为pDPSB。构建pDPSB(Kmr)的过程示于图8中。
(2)测定来自Brevibacterium lactofermentum菌株的 dapA的核苷酸顺序
从含有pCRDAPA的菌株AJ13106制备质粒DNA并以与实施例1中相同的方法测定它的核苷酸顺序。测定的核苷酸顺序和由其推导出的氨基酸顺序显示在SEQ ID NO：19中。SEQ ID NO：20只显示氨基酸顺序。
<4>构建携带突变型 lysC和 dapA二者的质粒
携带突变型 lysC、 dapA和棒杆菌的复制起始区的质粒是由携带dapA的pCRDAPA质粒以及携带 lysC和Brevi.-ori的p399AK9B质粒构建。p399AK9B用 SalI完全消化，并且使切开端成平端。连接 EcoRI接头以此构建 SalI位点被修饰到 EcoRI位点的质粒。得到的质粒定为p399AK9BSE。突变型 lysC和Brevi.-ori是作为一个片断用 EcoRI部分消化p399AK9BSE而切出。该片断再与用 EcoRI消化的pCRDAPA质粒连接。得到的质粒定为pCRCAB。该质粒可在大肠杆菌和棒杆菌中自主复制，并使宿主具有对卡那霉素的抗性，此质粒携带突变型 lysC和 dapA二者。构建pCRCAB的过程示于图9中。
<5>构建携带突变型 lysC和 dapB二者的质粒
携带突变型 lysC和 dapB的质粒是由携带突变型 lysC的p399AK9质粒和携带 dapB的p399DPR质粒构建的。含有DDPR结构基因的1,101bp片断是用用 EcoRV和 SphI消化p399DPR提取的。该片断与用 SalI消化的p399AK9连接并使切开端成平端，再用 SphI消化，构建成的携带突变型 lysC和 dapB二者的质粒，该质粒定为p399AKDDPR。
下一步，Brevi.-ori引入制成的p399AKDDPR。含有Brevi.-ori的pHK4质粒用限制酶 KpnI(Takara Shuzo公司生产)消化，并且使切开端成平端。平端形成使用DNA平齐试剂盒(Takara Shuzo公司生产)及其方法进行的。平端形成后，连接磷酸化 BamHI接头(Takara Shuzo公司生产)以进行修饰，这样只有用 BamHI消化pHK4才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori的DNA片断。该质粒用 BamHI消化，产生的Brevi.-ori DNA片断与也用 BamHI消化的p399AKDDPR连接，制备了可在棒杆菌中自主复制、携带突变型 lysC和 dapB的质粒。制备的质粒定为pCB。构建pCB的过程示于图10中。
<6>构建携带 dapA和 dapB二者的质粒
携带 dapA的pCRDAPA质粒可用 KpnI和 EcoRI消化以提取含有dapA的DNA片断，并且该片段与用 KpnI和 EcoRI消化的载体质粒pHSG399连接。得到的质粒定为p399DPS。
另一方面，携带 dapB的pCRDAPB质粒用 SacII和 EcoRI消化以提取含有DDPR编码区的2,0bp DNA片断，并且该片段与用 SacII和EcoRI消化的载体质粒p399DPS连接，构建了携带 dapA和 dapB二者的质粒。得到的质粒定为p399AB。
下一步，Brevi.-ori引入制成的p399AB。携带Brevi.-ori的pHK4质粒用限制酶 BamHI(Takara Shuzo公司生产)消化，并且使切开端成平端。平端形成使用DNA平齐试剂盒(Takara Shuzo公司生产)及其方法进行的。平端形成后，连接磷酸化 KpnI接头(Takara Shuzo公司生产)以进行修饰，这样只有用 KpnI消化pHK4才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori的DNA片断。该质粒用 KpnI消化，产生的Brevi.-oriDNA片断与用 KpnI消化的p399AB连接，构建了可在棒杆菌中自主复制、携带 dapA和 dapB的质粒。制备的质粒定为pAB。构建pAB的过程示于图11中。
<7>构建同时携带突变型 lysC、 dapA和 dapB的质粒
为了提取 dapA基因片断，p399DPS用 EcoRI和 SphI消化并形成平端。该片断与用SpnI消化的p399AK9质粒连接并平端以构建突变型 lysC和 dapA共存的质粒p399CA。
为了提取包括 dapB的2.0kb的DNA基因片断，载体质粒pCRDAPB用 EcoRI消化、形成平端、接着用 SacI消化。携带突变型lysC和 dapA的质粒p399CA用 SpeI消化并平端，然后再用 SacI消化并与提取的 dapB片断连接，得到了一个同时携带突变型 lysC、 dapA和 dapB的质粒。该质粒定为p399CAB。
下一步，Brevi.-ori引入制成的p399CAB。含有Brevi.-ori的pHK4质粒用限制酶 BamHI(Takara Shuzo公司生产)消化，并且使切开端成平端。平端形成使用DNA平齐试剂盒(Takara Shuzo公司生产)及其方法进行的。平端形成后，连接磷酸化 KpnI接头(Takara Shuzo公司生产)以进行修饰，这样只有用 KpnI消化pHK4才可能从pHK4中切出相应于Brevi.-ori的DNA片断。该质粒用 KpnI消化，产生的Brevi.-oriDNA片断与也用 KpnI消化的p399CAB连接，构建了可在棒杆菌中自主复制、携带突变型 lysC、 dapA和 dapB的质粒。制备的质粒定为pCAB。构建pCAB的过程示于图12中。
<8>构建同时携带突变型 lysC、 dapA、 dapB和 lysA的质粒
携带 lysA的p299LYSA质粒用 KpnI和 BamHI消化和形成平端，然后提取 lysA基因片断。该片断与用 HpaI(Takara Shuzo公司生产)消化的pCAB连接并形成平端以构建可在棒杆菌细胞内自主复制、携带突变型 lysC、 dapA、 dapB和 lysA的质粒。构建的质粒定为pCABL。构建pCABL的过程示于图13中。请注意， lysA片断插入pCABL含有 dapB的DNA片断的 HpaI位点，然而， HpaI位点处于 dapB基因启动子的上游(在SEQ ID NO：23中的核苷酸酸序号为611-616)， dapB基因并未分割。
<9>构建同时携带突变型lysC、dapA、dapB、ddh和lysA的质粒
pHSG299用 XbaI和 KpnI消化，并与用 XbaI和 KpnI消化的携带ddh和 lysA的p399DL质粒连接，构建的质粒定为p299DL。p299DL用 XbaI和 KpnI消化并形成平端。平端形成后，提取携带 ddh和 lysA的DNA片断。该DNA片断与同时携带 lysC、 dapA和 dapB并用 HpaI消化和形成平端的pCAB质粒连接以构建同时携带突变型 lysC、dapA、 dapB、 ddh和 lysA、可棒杆菌细胞内自主复制的质粒。构建的质粒定为pCABDL。构建pCABDL的过程示于图14上。
实施例5：将携带L-赖氨酸的生物合成基因的质粒引入Brevibacterium lactofermentum的L-赖氨酸产生菌中
如上述构建的携带L-赖氨酸的生物合成基因的质粒，即pLYSAB(Cmr)、pPK4D(Cmr)、p399AK9B(Cmr)、pDPSB(Kmr)pDPRB(Cmr)、pCRCAB(Kmr)、pAB(Cmr)、pDL(Cmr)、pCB(Cmr)pCAB(Cmr)、pCABL(Cmr)和pCABDL(Cmr)分别引入Brevibacteriumlactofermentum的L-赖氨酸产生菌AJ11082(NRRL B-11470)中。AJ11082菌株对AEC有抗性。采用电脉冲方法引入质粒(Sugimoto等人，日本专利特许公开No.2-207791)。转化体是根据各自质粒具有的抗药标记选择。当引进携带氯霉素抗性基因的质粒时，转化体可在含有5ug/ml氯霉素的完全培养基上选择，当引进携带卡那霉素抗性基因的质粒时，转化体可在含有25ug/ml卡那霉素的完全培养基上选择。
实施例6：L-赖氨酸的生产
从实施例5中得到的每种转化体培养在L-赖氨酸产生培养基中以估计它的生产力。L-赖氨酸产生培养基含有下列成份。
[L-赖氨酸产生培养基]
溶解除碳酸钙外的下列组分(每升)，以能够用KOH调至pH8.0。培养基在115℃下灭菌15分钟，碳酸钙(50g)在干燥热空气中单独灭菌后加入灭菌的培养基中。
葡萄糖                    100g
(NH4)2SO4             55g
KH2PO                   1g
MgSO4·7H2O            1g
生物素                    500ug
维生素B1                 2000ug
FeSO4·7H2O            0.01g
MnSO4·7H2O            0.01g
尼克酰胺                  5mg
蛋白水解物(Mamenou)       30ml
碳酸钙                    50g
各种类型转化体和原始菌种中的每种在含有上述成份的培养基中在31.5℃往返式摇床上培养。培养48或72小时后的L-赖氨酸的产量和72小时后的增长(OD562)示于表1中。表中 lysC *代表突变型 lysC。增长是定量测定101倍稀释后在560nm处的OD值。
                          表1
           培养40小时或72小时后L-赖氨酸的积累
  菌株/质粒    引入的基因     L-赖氨酸产量(g/L)  增长(OD 562 /101)
  40hrs后   72hr后
  AJ11082AJ11082/pLYSABAJ11082/pPK4DAJ11082/p399AK9BAJ11082/pDPSBAJ11082/pDPRBAJ11082/pCRCABAJ11082/pABAJ11082/pDLAJ11082/pCBAJ11082/pCABAJ11082/pCABLAJ11082/pCABDL lysA ddhlysC* dapA dapB lysC *， dapA dapA， dapB lysA， ddh lysC *， dapB lysC *， dapA， dapB lysC *， dapA， dapB， lysA lysC *， dapA， dapB， lysA， ddh   22.019.819.016.818.719.919.719.023.323.323.026.226.5   29.832.533.434.533.829.936.534.831.635.045.046.547.0  0.4500.3560.3300.3980.4100.4450.3600.3900.4400.4400.4250.3790.409
正如上表所示，当单独增强 lysA、 ddh、突变型 lysC、 dapA或 dapB时，培养72小时后L-赖氨酸产量高于或等于原始菌株的产量，但是培养40小时后产量却低于原始菌株的。这就是说，在短期培养中L-赖氨酸的生产速度降低了。同样地，当使用突变型 lysC和 dapA结合或 dapA和 dapB结合增强时，培养72小时后L-赖氨酸产量高于或等于原始菌株的产量，但是培养40小时后产量却低于原始菌株的。因此，在短期培养中L-赖氨酸的生产速度降低了。
另一方面，只有当 lysA和 ddh结合增强时，生长得到了改善，在短期培养中L-赖氨酸的生产速度也成功地得到了恢复，并且在长期培养中L-赖氨酸的积累量也得到提高。
而且，在 dapB和突变型 lysC一起在菌株中增强的情况下，以及dapA和它们同时在菌株中增强时，与原始菌株比较生长得到了改善，而且L-赖氨酸的生产速度也增加了。在这三个基因同时在菌株中增强时，通过进一步增强 lysA和 ddh时，L-赖氨酸的生产速度和L-赖氨酸积累量都进一步得到提高。
顺序表
(1)一般资料
(i)申请者：AJINOMOTO CO.，有限公司
(ii)发明的题目：生产L-赖氨酸的方法
(iii)顺序数目：24
(iv)通讯地址
(A)地址：
(B)街道：
(C)城市：
(E)国家：
(F)邮政编码：
(v)计算机可读形式
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30
(vi)流通的申请资料
(A)申请号：
(B)存档日期：
(C)分类：
(vii)前申请资料
(A)申请号码：JP 8-142812
(B)存档日期：1996年6月5日
(viii)委托/代理资料
(A)名称：
(B)登记号码：
(ix)电讯资料
(A)电话：
(B)传真：
(2)SEQ ID NO：1的资料
(i)顺序特性
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：否
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：1：
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG                    23
(2)SEQ ID NO：2的资料
(i)顺序特性
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：是
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：2：
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA                    23
(2)SEQ ID NO：3的资料
(i)顺序特性
(A)长度：3579个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：533..2182
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：2182..3522
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：3：
GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGGCTGCACT GCAACGAGGT CGTAGTTTTG GTACATGGCT  60
TCTGGCCAGT TCATGGATTG GCTGCCGAAG AAGCTATAGG CATCGCACCA GGGCCACCGA  120
GTTACCGAAG ATGGTGCCGT GCTTTTCGCC TTGGGCAGGG ACCTTGACAA AGCCCACGCT  180
GATATCGCCA AGTGAGGGAT CAGAATAGTG CATGGGCACG TCGATGCTGC CACATTGAGC  240
GGAGGCAATA TCTACCTGAG GTGGGCATTC TTCCCAGCGG ATGTTTTCTT GCGCTGCTGC  300
AGTGGGCATT GATACCAAAA AGGGGCTAAG CGCAGTCGAG GCGGCAAGAA CTGCTACTAC  360
CCTTTTTATT GTCGAACGGG GCATTACGGC TCCAAGGACG TTTGTTTTCT GGGTCAGTTA  420
CCCCAAAAAG CATATACAGA GACCAATGAT TTTTCATTAA AAAGGCAGGG ATTTGTTATA  480
AGTATGGGTC GTATTCTGTG CGACGGGTGT ACCTCGGCTA GAATTTCTCC CC ATG      535
                                                          Met
                                                            1
ACA CCA GCT GAT CTC GCA ACA TTG ATT AAA GAG ACC GCG GTA GAG GTT    583
Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu Val
              5                  10                  15
TTG ACC TCC CGC GAG CTC GAT ACT TCT GTT CTT CCG GAG CAG GTA GTT    631
Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val Val
         20                  25                  30
GTG GAG CGT CCG CGT AAC CCA GAG CAC GGC GAT TAC GCC ACC AAC ATT    679
Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn Ile
     35                  40                  45
GCA TTG CAG GTG GCT AAA AAG GTC GGT CAG AAC CCT CGG GAT TTG GCT    727
Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu Ala
 50                  55                  60                  65
ACC TGG CTG GCA GAG GCA TTG GCT GCA GAT GAC GCC ATT GAT TCT GCT    775
Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser Ala
                 70                  75                  80
GAA ATT GCT GGC CCA GGC TTT TTG AAC ATT CGC CTT GCT GCA GCA GCA    823
Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala Ala
             85                  90                  95
CAG GGT GAA ATT GTG GCC AAG ATT CTG GCA CAG GGC GAG ACT TTC GGA    871
Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe Gly
        100                 105                 110
AAC TCC GAT CAC CTT TCC CAC TTG GAC GTG AAC CTC GAG TTC GTT TCT    919
Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val Ser
    115                 120                 125
GCA AAC CCA ACC GGA CCT ATT CAC CTT GGC GGA ACC CGC TGG GCT GCC    967
Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala Ala
130                 135                 140                 145
GTG GGT GAC TCT TTG GGT CGT GTG CTG GAG GCT TCC GGC GCG AAA GTG    1015
Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys Val
                150                 155                 160
ACC CGC GAA TAC TAC TTC AAC GAT CAC GGT CGC CAG ATC GAT CGT TTC    1063
Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg Phe
            165                 170                 175
GCT TTG TCC CTT CTT GCA GCG GCG AAG GGC GAG CCA ACG CCA GAA GAC    1111
Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu Asp
        180                 185                 190
GGT TAT GGC GGC GAA TAC ATT AAG GAA ATT GCG GAG GCA ATC GTC GAA    1159
Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val Glu
    195                 200                 205
AAG CAT CCT GAA GCG TTG GCT TTG GAG CCT GCC GCA ACC CAG GAG CTT    1207
Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu Leu
210                 215                 220                 225
TTC CGC GCT GAA GGC GTG GAG ATG ATG TTC GAG CAC ATC AAA TCT TCC    1255
Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser Ser
                230                 235                 240
CTG CAT GAG TTC GGC ACC GAT TTC GAT GTC TAC TAC CAC GAG AAC TCC    1303
Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn Ser
            245                 250                 255
CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC    1351
Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys Asp
        260                 265                 270
AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC    1399
Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr
    275                 280                 285
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC    1447
Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly Asp
290                 295                 300                 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC    1495
Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser
                310                 315                 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT    1543
Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly
            325                 330                 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA    1591
Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro
        340                 345                 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC    1639
Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg Asp
    355                 360                 365
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA    1687
Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu
370                 375                 380                 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG    1735
Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu
                390                 395                 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTG TGG    1783
Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu Trp
            405                 410                 415
GAA TCC CAG TCC TCC GAC AAC CCT GTG TAC TAC GTG CAG TAC GGA CAC    1831
Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly His
        420                 425                 430
GCT CGT CTG TGC TCC ATC GCG CGC AAG GCA GAG ACC TTG GGT GTC ACC    1879
Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr
    435                 440                 445
GAG GAA GGC GCA GAC CTA TCT CTA CTG ACC CAC GAC CGC GAA GGC GAT    1927
Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly Asp
450                 455                 460                 465
CTC ATC CGC ACA CTC GGA GAG TTC CCA GCA GTG GTG AAG GCT GCC GCT    1975
Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala Ala
                470                 475                 480
GAC CTA CGT GAA CCA CAC CGC ATT GCC CGC TAT GCT GAG GAA TTA GCT    2023
Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu Ala
            485                 490                 495
GGA ACT TTC CAC CGC TTC TAC GAT TCC TGC CAC ATC CTT CCA AAG GTT    2071
Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys Val
        500                 505                 510
GAT GAG GAT ACG GCA CCA ATC CAC ACA GCA CGT CTG GCA CTT GCA GCA    2119
Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala Ala
    515                 520                 525
GCA ACC CGC CAG ACC CTC GCT AAC GCC CTG CAC CTG GTT GGC GTT TCC    2167
Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val Ser
530                 535                 540                 545
GCA CCG GAG AAG ATG TAACA ATG GCT ACA GTT GAA AAT TTC AAT GAA      2214
Ala Pro Glu Lys Met       Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu
                550         1               5
CTT CCC GCA CAC GTA TGG CCA CGC AAT GCC GTG CGC CAA GAA GAC GGC    2262
Leu Pro Ala His Val Trp Pro Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly
 10                  15                  20                  25
GTT GTC ACC GTC GCT GGT GTG CCT CTG CCT GAC CTC GCT GAA GAA TAC    2310
Val Val Thr Val Ala Gly Val Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr
                 30                  35                  40
GGA ACC CCA CTG TTC GTA GTC GAC GAG GAC GAT TTC CGT TCC CGC TGT    2358
Gly Thr Pro Leu Phe Val Val Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys
             45                  50                  55
CGC GAC ATG GCT ACC GCA TTC GGT GGA CCA GGC AAT GTG CAC TAC GCA    2406
Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala
         60                  65                  70
TCT AAA GCG TTC CTG ACC AAG ACC ATT GCA CGT TGG GTT GAT GAA GAG    2454
Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu
     75                  80                  85
GGG CTG GCA CTG GAC ATT GCA TCC ATC AAC GAA CTG GGC ATT GCC CTG    2502
Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu
 90                  95                 100                 105
GCC GCT GGT TTC CCC GCC AGC CGT ATC ACC GCG CAC GGC AAC AAC AAA    2550
Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys
                110                 115                 120
GGC GTA GAG TTC CTG CGC GCG TTG GTT CAA AAC GGT GTG GGA CAC GTG    2598
Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val
            125                 130                 135
GTG CTG GAC TCC GCA CAG GAA CTA GAA CTG TTG GAT TAC GTT GCC GCT    2646
Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala
        140                 145                 150
GGT GAA GGC AAG ATT CAG GAC GTG TTG ATC CGC GTA AAG CCA GGC ATC    2694
Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile
    155                 160                 165
GAA GCA CAC ACC CAC GAG TTC ATC GCC ACT AGC CAC GAA GAC CAG AAG    2742
Glu Ala His Thr His Glu Phe Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys
170                 175                 180                 185
TTC GGA TTC TCC CTG GCA TCC GGT TCC GCA TTC GAA GCA GCA AAA GCC    2790
Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala
                190                 195                 200
GCC AAC AAC GCA GAA AAC CTG AAC CTG GTT GGC CTG CAC TGC CAC GTT    2838
Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val
            205                 210                 215
GGT TCC CAG GTG TTC GAC GCC GAA GGC TTC AAG CTG GCA GCA GAA CGC    2886
Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg
        220                 225                 230
GTG TTG GGC CTG TAC TCA CAG ATC CAC AGC GAA CTG GGC GTT GCC CTT    2934
Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu
    235                 240                 245
CCT GAA CTG GAT CTC GGT GGC GGA TAC GGC ATT GCC TAT ACC GCA GCT    2982
Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala
250                 255                 260                 265
GAA GAA CCA CTC AAC GTC GCA GAA GTT GCC TCC GAC CTG CTC ACC GCA    3030
Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala
                270                 275                 280
GTC GGA AAA ATG GCA GCG GAA CTA GGC ATC GAC GCA CCA ACC GTG CTT    3078
Val Gly Lys Met Ala Ala Glu Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu
            285                 290                 295
GTT GAG CCC GGC CGC GCT ATC GCA GGC CCC TCC ACC GTG ACC ATC TAC    3126
Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr
        300                 305                 310
GAA GTC GGC ACC ACC AAA GAC GTC CAC GTA GAC GAC GAC AAA ACC CGC    3174
Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg
    315                 320                 325
CGT TAC ATC GCC GTG GAC GGA GGC ATG TCC GAC AAC ATC CGC CCA GCA    3222
Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala
330                 335                 340                 345
CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA    3270
Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu
                350                 355                 360
GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC    3318
Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly
            365                 370                 375
GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC    3366
Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly
        380                 385                 390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC    3414
Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser
    395                 400                 405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT    3462
Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala
410                 415                 420                 425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC    3510
Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu
                430                 435                 440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC        3562
Ser Leu Glu Ala
            445
GTGGAGGGCG GTTTTGG                                                 3579
(2)SEQ ID NO：4的资料
(i)顺序特性
(A)长度：550个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：4：
Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu Ile Lys Glu Thr Ala Val Glu
  1               5                  10                  15
Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gln Val
             20                  25                  30
Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn
         35                  40                  45
Ile Ala Leu Gln Val Ala Lys Lys Val Gly Gln Asn Pro Arg Asp Leu
     50                  55                  60
Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala Ile Asp Ser
 65                  70                  75                  80
Ala Glu Ile Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn Ile Arg Leu Ala Ala Ala
                 85                  90                  95
Ala Gln Gly Glu Ile Val Ala Lys Ile Leu Ala Gln Gly Glu Thr Phe
            100                 105                 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val
        115                 120                 125
Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro Ile His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala
    130                 135                 140
Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gln Ile Asp Arg
                165                 170                 175
Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu
            180                 185                 190
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr Ile Lys Glu Ile Ala Glu Ala Ile Val
        195                 200                 205
Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gln Glu
    210                 215                 220
Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His Ile Lys Ser
225                 230                 235                 240
Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn
                245                 250                 255
Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gln Val Leu Lys
            260                 265                 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser
        275                 280                 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val Ile Lys Ser Asp Gly
    290                 295                 300
Asp Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Asp Ile Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe
305                 310                 315                 320
Ser Arg Gly His Asn Leu Asn Ile Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His
                325                 330                 335
Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys
            340                 345                 350
Pro Glu Gly Val Glu Val Leu Ile Gly Gln Met Val Asn Leu Leu Arg
        355                 360                 365
Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr
    370                 375                 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala Ile Gly Ile Asp Ala Ala Arg Tyr Ser
385                 390                 395                 400
Leu Ile Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp Ile Asp Leu Gly Leu
                405                 410                 415
Trp Glu Ser Gln Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gln Tyr Gly
            420                 425                 430
His Ala Arg Leu Cys Ser Ile Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val
        435                 440                 445
Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly
    450                 455                 460
Asp Leu Ile Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala
465                 470                 475                 480
Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg Ile Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu
                485                 490                 495
Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His Ile Leu Pro Lys
            500                 505                 510
Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro Ile His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala
        515                 520                 525
Ala Ala Thr Arg Gln Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val
    530                 535                 540
Ser Ala Pro Glu Lys Met
545                 550
(2)SEQ ID NO：5的资料
(i)顺序特性
(A)长度：445个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：5：
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
  1               5                  10                  15
Arg Asn Ala Val Arg Gln Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
             20                  25                  30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
         35                  40                  45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
     50                  55                  60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys
 65                  70                  75                  80
Thr Ile Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp Ile Ala
                 85                  90                  95
Ser Ile Asn Glu Leu Gly Ile Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
            100                 105                 110
Arg Ile Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
        115                 120                 125
Leu Val Gln Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gln Glu
    130                 135                 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys Ile Gln Asp
145                 150                 155                 160
Val Leu Ile Arg Val Lys Pro Gly Ile Glu Ala His Thr His Glu Phe
                165                 170                 175
Ile Ala Thr Ser His Glu Asp Gln Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
            180                 185                 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
        195                 200                 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gln Val Phe Asp Ala
    210                 215                 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gln
225                 230                 235                 240
Ile His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Tyr Gly Ile Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
            260                 265                 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
        275                 280                 285
Leu Gly Ile Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala Ile
    290                 295                 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr Ile Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp
305                 310                 315                 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr Ile Ala Val Asp Gly
                325                 330                 335
Gly Met Ser Asp Asn Ile Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
            340                 345                 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
        355                 360                 365
Ile Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp Ile Leu Ile Asn Asp Glu
    370                 375                 380
Ile Tyr Pro Ser Asp Ile Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385                 390                 395                 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
                405                 410                 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
            420                 425                 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp Ile Leu Ser Leu Glu Ala
        435                 440                 445
(2)SEQ ID NO：6的资料
(i)顺序特性
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：否
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：6：
CATCTAAGTA TGCATCTCGG                           20
(2)SEQ ID NO：7的资料
(i)顺序特性
(A)长度：20个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其它核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：是
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：7：
TGCCCCTCGA GCTAAATTAG                           20
(2)SEQ ID NO：8的资料
(i)顺序特性
(A)长度：1034个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：61..1020
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：8：
ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC  60
ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC    108
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
  1               5                  10                  15
AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA    156
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
             20                  25                  30
ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT    204
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
         35                  40                  45
GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG    252
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
     50                  55                  60
TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG    300
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
 65                  70                  75                  80
CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA    348
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
                 85                  90                  95
CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT    396
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
            100                 105                 110
GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC    444
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
        115                 120                 125
GTC TAC GCA GCG GCA GTC TTA GCC GAG CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG    492
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
    130                 135                 140
GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT    540
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145                 150                 155                 160
GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC GCC CTG    588
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
                165                 170                 175
GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC    636
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
            180                 185                 190
CAC AAG CGC CAA TGC TTC GTG GTT GCC GAC GCG GCC GAT CAC GAG CGC    684
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
        195                 200                 205
ATC GAA AAC GAC ATC CGC ACC ATG CCT GAT TAC TTC GTT GGC TAC GAA    732
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
    210                 215                 220
GTC GAA GTC AAC TTC ATC GAC GAA GCA ACC TTC GAC TCC GAG CAC ACC    780
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225                 230                 235                 240
GGC ATG CCA CAC GGT GGC CAC GTG ATT ACC ACC GGC GAC ACC GGT GGC    828
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
                245                 250                 255
TTC AAC CAC ACC GTG GAA TAC ATC CTC AAG CTG GAC CGA AAC CCA GAT    876
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
            260                 265                 270
TTC ACC GCT TCC TCA CAG ATC GCT TTC GGT CGC GCA GCT CAC CGC ATG    924
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
        275                 280                 285
AAG CAG CAG GGC CAA AGC GGA GCT TTC ACC GTC CTC GAA GTT GCT CCA    972
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
    290                 295                 300
TAC CTG CTC TCC CCA GAG AAC TTG GAC GAT CTG ATC GCA CGC GAC GTC    1020
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305                 310                 315                 320
TAATTTAGCT CGAG                                                    1034
(2)SEQ ID NO：9的资料
(i)顺序特性
(A)长度：320个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：9：
Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
             20                  25                  30
Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
         35                  40                  45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
     50                  55                  60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala
 65                  70                  75                  80
Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro
                 85                  90                  95
Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
            100                 105                 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg
        115                 120                 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp
    130                 135                 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro
145                 150                 155                 160
Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
                165                 170                 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr
            180                 185                 190
His Lys Arg Gln Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
        195                 200                 205
Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu
    210                 215                 220
Val Glu Val Asn Phe Ile Asp Glu Ala Thr Phe Asp Ser Glu His Thr
225                 230                 235                 240
Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly
                245                 250                 255
Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp
            260                 265                 270
Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met
        275                 280                 285
Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro
    290                 295                 300
Tyr Leu Leu Ser Pro Glu Asn Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val
305                 310                 315                 320
(2)SEQ ID NO：10的资料
(i)顺序特性
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：否
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：10：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT                    23
(2)SEQ ID NO：11的资料
(i)顺序特性
(A)长度：21个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：是
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：11：
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C                      21
(2)SEQ ID NO：12的资料
(i)顺序特性
(A)长度：1643个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：12：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC  60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT  120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG  180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT  240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC  300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT  360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG  420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT  480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC  540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC  600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG  660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT  720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT  780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC  840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC  900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT  960
CCTGTGGAAG AAGCAGTCCT TACCGGTGTC GCAACCGACA AGTCCGAAGC CAAAGTAACC  1020
GTTCTGGGTA TTTCCGATAA GCCAGGCGAG GCTGCCAAGG TTTTCCGTGC GTTGGCTGAT  1080
GCAGAAATCA ACATTGACAT GGTTCTGCAG AACGTCTCCT CTGTGGAAGA CGGCACCACC  1140
GACATCACGT TCACCTGCCC TCGCGCTGAC GGACGCCGTG CGATGGAGAT CTTGAAGAAG  1200
CTTCAGGTTC AGGGCAACTG GACCAATGTG CTTTACGACG ACCAGGTCGG CAAAGTCTCC  1260
CTCGTGGGTG CTGGCATGAA GTCTCACCCA GGTGTTACCG CAGAGTTCAT GGAAGCTCTG  1320
CGCGATGTCA ACGTGAACAT CGAATTGATT TCCACCTCTG AGATCCGCAT TTCCGTGCTG  1380
ATCCGTGAAG ATGATCTGGA TGCTGCTGCA CGTGCATTGC ATGAGCAGTT CCAGCTGGGC  1440
GGCGAAGACG AAGCCGTCGT TTATGCAGGC ACCGGACGCT AAAGTTTTAA AGGAGTAGTT  1500
TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG GTTATGCGCA  1560
CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT TCCCCGCGTT  1620
CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC                                          1643
(2)SEQ ID NO：13的资料
(i)顺序特性
(A)长度：1643个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum ermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：217..1482
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：13：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC  60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT  120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG  180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG    234
                                        Met Ala Leu Val Val Gln
                                          1               5
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC    282
Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg Ile Arg Asn Val
             10                  15                  20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT    330
Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val
         25                  30                  35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA    378
Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
     40                  45                  50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG    426
Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
 55                  60                  65                  70
ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG    474
Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala Ile Glu
                 75                  80                  85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG    522
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr Gly Ser Gln Ala Gly Val
             90                  95                 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG    570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg Ile Val Asp Val Thr Pro
        105                 110                 115
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT    618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys Ile Cys Ile Val Ala
    120                 125                 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT    666
Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135                 140                 145                 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC    714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
                155                 160                 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT    762
Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
            170                 175                 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC    810
Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
        185                 190                 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG    858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys Ile Leu Val Leu
    200                 205                 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC    906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215                 220                 225                 230
TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG    954
Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu Ile Ala Gly Ser Met Glu
                235                 240                 245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG    1002
Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
            250                 255                 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG    1050
Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu
        265                 270                 275
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC    1098
Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp
    280                 285                 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC    1146
Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile
295                 300                 305                 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG    1194
Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu
                315                 320                 325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC    1242
Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
            330                 335                 340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA    1290
Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
        345                 350                 355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC    1338
Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
    360                 365                 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT    1386
Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg
375                 380                 385                 390
GAA GAT GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG    1434
Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln
                395                 400                 405
CTG GGC GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAA    1482
Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
            410                 415                 420
AGTTTTAAAG GAGTAGTTTT ACAATGACCA CCATCGCAGT TGTTGGTGCA ACCGGCCAGG  1542
TCGGCCAGGT TATGCGCACC CTTTTGGAAG AGCGCAATTT CCCAGCTGAC ACTGTTCGTT  1602
TCTTTGCTTC CCCGCGTTCC GCAGGCCGTA AGATTGAATT C                      1643
(2)SEQ ID NO：14的资料
(i)顺序特性
(A)长度：421个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：14：
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
  1               5                  10                  15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
             20                  25                  30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
         35                  40                  45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
     50                  55                  60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
                 85                  90                  95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
            100                 105                 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
        115                 120                 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
    130                 135                 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
                165                 170                 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
            180                 185                 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
        195                 200                 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
    210                 215                 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225                 230                 235                 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
                245                 250                 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
            260                 265                 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
        275                 280                 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
    290                 295                 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg
305                 310                 315                 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
                325                 330                 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
            340                 345                 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
        355                 360                 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
    370                 375                 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385                 390                 395                 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Gly Arg
            420
(2)SEQ ID NO：15的资料
(i)顺序特性
(A)长度：1643个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：964..1482
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：15：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC  60
TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT  120
GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG  180
GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT  240
GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC  300
ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT  360
GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG  420
CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT  480
GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC  540
GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC  600
AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG  660
TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT  720
GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT  780
AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC  840
TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC  900
GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT  960
CCT  GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA   1008
    Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
      1               5                  10                  15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC    1056
Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
                 20                  25                  30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT    1104
Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val
             35                  40                  45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC    1152
Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe
         50                  55                  60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG    1200
Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys
     65                  70                  75
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC    1248
Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val
 80                  85                  90                  95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT    1296
Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
                100                 105                 110
ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA    1344
Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu
            115                 120                 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT    1392
Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp
        130                 135                 140
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC    1440
Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly
    145                 150                 155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA    1490
Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160                 165                 170
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG  1550
GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT  1610
TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC                               1643
(2)SEQ ID NO：16的资料
(i)顺序特性
(A)长度：172个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：16：D NO：16：
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
  1               5                  10                  15
Lys Val Thr Val Leu Gly Ile Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
             20                  25                  30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu
         35                  40                  45
Gln Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr
     50                  55                  60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu
 65                  70                  75                  80
Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly
                 85                  90                  95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
            100                 105                 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu
        115                 120                 125
Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp
    130                 135                 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
                165                 170
(2)SEQ ID NO：17的资料
(i)顺序特性
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：否
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：17：
GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC
(2)SEQ ID NO：18的资料
(i)顺序特性                                  23
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：是
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：18：
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG
(2)SEQ ID NO：19的资料
(i)顺序特性
(A)长度：1411个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：311..1213
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：19：
CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT  60
TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC  120
ACACCCACGA GCTAAAAATT CATATAGTTA AGACAACATT TTTGGCTGTA AAAGACAGCC  180
GTAAAAACCT CTTGCTCATG TCAATTGTTC TTATCGGAAT GTGGCTTGGG CGATTGTTAT  240
GCAAAAGTTG TTAGGTTTTT TGCGGGGTTG TTTAACCCCC AAATGAGGGA AGAAGGTAAC  300
CTTGAACTCT ATG AGC ACA GGT TTA ACA GCT AAG ACC GGA GTA GAG CAC     349
           Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His
             1               5                  10
TTC GGC ACC GTT GGA GTA GCA ATG GTT ACT CCA TTC ACG GAA TCC GGA    397
Phe Gly Thr Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly
     15                  20                  25
GAC ATC GAT ATC GCT GCT GGC CGC GAA GTC GCG GCT TAT TTG GTT GAT    445
Asp Ile Asp Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp
 30                  35                  40                  45
AAG GGC TTG GAT TCT TTG GTT CTC GCG GGC ACC ACT GGT GAA TCC CCA    493
Lys Gly Leu Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro
                 50                  55                  60
ACG ACA ACC GCC GCT GAA AAA CTA GAA CTG CTC AAG GCC GTT CGT GAG    541
Thr Thr Thr Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu
             65                  70                  75
GAA GTT GGG GAT CGG GCG AAC GTC ATC GCC GGT GTC GGA ACC AAC AAC    589
Glu Val Gly Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn
         80                  85                  90
ACG CGG ACA TCT GTG GAA CTT GCG GAA GCT GCT GCT TCT GCT GGC GCA    637
Thr Arg Thr Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala
     95                 100                 105
GAC GGC CTT TTA GTT GTA ACT CCT TAT TAC TCC AAG CCG AGC CAA GAG    685
Asp Gly Leu Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu
110                 115                 120                 125
GGA TTG CTG GCG CAC TTC GGT GCA ATT GCT GCA GCA ACA GAG GTT CCA    733
Gly Leu Leu Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro
                130                 135                 140
ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT    781
Ile Cys Leu Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser
            145                 150                 155
GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG    829
Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys
        160                 165                 170
GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG    877
Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr
    175                 180                 185
GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT    925
Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu
190                 195                 200                 205
GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC    973
Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro
                210                 215                 220
ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC    1021
Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val
            225                 230                 235
CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCG CTG GTA GCT GCC CAA    1069
Arg Ala Arg Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln
        240                 245                 250
GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG    1117
Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln
    255                 260                 265
GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG    1165
Gly Ile Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu
270                 275                 280                 285
CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA    1213
Gln Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
                290                 295                 300
TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA  1273
AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA  1333
CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC  1393
TCAAGGATCC CAACATTC                                                1411
(2)SEQ ID NO：20的资料
(i)顺序特性
(A)长度：301个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：20：
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
  1               5                  10                  15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp
             20                  25                  30
Ile Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
         35                  40                  45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
     50                  55                  60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
 65                  70                  75                  80
Asp Arg Ala Asn Val Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
                 85                  90                  95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu
        115                 120                 125
Ala His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu
    130                 135                 140
Tyr Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met
145                 150                 155                 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
                165                 170                 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala
            180                 185                 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
        195                 200                 205
Gly Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
    210                 215                 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg
225                 230                 235                 240
Glu Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu
                245                 250                 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gln Gly Ile Asn
            260                 265                 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu
        275                 280                 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
    290                 295                 300
(2)SEQ ID NO：21的资料
(i)顺序特性
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：否
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：21：
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA                    23
(2)SEQ ID NO：22的资料
(i)顺序特性
(A)长度：23个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：其他核酸
(A)说明：/desc＝“合成DNA”
(iv)反向：是
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：22：
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT                    23
(2)SEQ ID NO：23的资料
(i)顺序特性
(A)长度：2001个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：双链
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：基因组DNA
(vi)初始来源：
(A)有机体：Brevibacterium lactofermentum
(B)菌株：ATCC 13869
(ix)特点：
(A)名称/关键：CDS
(B)位置：730..1473
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：23：
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAACGACAAC CTGATCAGGA TATCCAATGC CTTGAATATT  60
GACGTTGAGG AAGGAATCAC CAGCCATCTC AACTGGAAGA CCTGACGCCT GCTGAATTGG  120
ATCAGTGGCC CAATCGACCC ACCAACCAGG TTGGCTATTA CCGGCGATAT CAAAAACAAC  180
TCGCGTGAAC GTTTCGTGCT CGGCAACGCG GATGCCAGCG ATCGACATAT CGGAGTCACC  240
AACTTGAGCC TGCTGCTTCT GATCCATCGA CGGGGAACCC AACGGCGGCA AAGCAGTGGG  300
GGAAGGGGAG TTGGTGGACT CTGAATCAGT GGGCTCTGAA GTGGTAGGCG ACGGGGCAGC  360
ATCTGAAGGC GTGCGAGTTG TGGTGACCGG GTTAGCGGTT TCAGTTTCTG TCACAACTGG  420
AGCAGGACTA GCAGAGGTTG TAGGCGTTGA GCCGCTTCCA TCACAAGCAC TTAAAAGTAA  480
AGAGGCGGAA ACCACAAGCG CCAAGGAACT ACCTGCGGAA CGGGCGGTGA AGGGCAACTT  540
AAGTCTCATA TTTCAAACAT AGTTCCACCT GTGTGATTAA TCTCCAGAAC GGAACAAACT  600
GATGAACAAT CGTTAACAAC ACAGACCAAA ACGGTCAGTT AGGTATGGAT ATCAGCACCT  660
TCTGAATGGG TACGTCTAGA CTGGTGGGCG TTTGAAAAAC TCTTCGCCCC ACGAAAATGA  720
AGGAGCATA ATG GGA ATC AAG GTT GGC GTT CTC GGA GCC AAA GGC CGT      768
          Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg
            1               5                  10
GTT GGT CAA ACT ATT GTG GCA GCA GTC AAT GAG TCC GAC GAT CTG GAG    816
Val Gly Gln Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu
     15                  20                  25
CTT GTT GCA GAG ATC GGC GTC GAC GAT GAT TTG AGC CTT CTG GTA GAC    864
Leu Val Ala Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp
 30                  35                  40                  45
AAC GGC GCT GAA GTT GTC GTT GAC TTC ACC ACT CCT AAC GCT GTG ATG    912
Asn Gly Ala Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met
                 50                  55                  60
GGC AAC CTG GAG TTC TGC ATC AAC AAC GGC ATT TCT GCG GTT GTT GGA    960
Gly Asn Leu Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly
             65                  70                  75
ACC ACG GGC TTC GAT GAT GCT CGT TTG GAG CAG GTT CGC GCC TGG CTT    1008
Thr Thr Gly Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu
         80                  85                  90
GAA GGA AAA GAC AAT GTC GGT GTT CTG ATC GCA CCT AAC TTT GCT ATC    1056
Glu Gly Lys Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile
     95                 100                 105
TCT GCG GTG TTG ACC ATG GTC TTT TCC AAG CAG GCT GCC CGC TTC TTC    1104
Ser Ala Val Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe
110                 115                 120                 125
GAA TCA GCT GAA GTT ATT GAG CTG CAC CAC CCC AAC AAG CTG GAT GCA    1152
Glu Ser Ala Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala
                130                 135                 140
CCT TCA GGC ACC GCG ATC CAC ACT GCT CAG GGC ATT GCT GCG GCA CGC    1200
Pro Ser Gly Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg
            145                 150                 155
AAA GAA GCA GGC ATG GAC GCA CAG CCA GAT GCG ACC GAG CAG GCA CTT    1248
Lys Glu Ala Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu
        160                 165                 170
GAG GGT TCC CGT GGC GCA AGC GTA GAT GGA ATC CCA GTT CAC GCA GTC    1296
Glu Gly Ser Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val
    175                 180                 185
CGC ATG TCC GGC ATG GTT GCT CAC GAG CAA GTT ATC TTT GGC ACC CAG    1344
Arg Met Ser Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln
190                 195                 200                 205
GGT CAG ACC TTG ACC ATC AAG CAG GAC TCC TAT GAT CGC AAC TCA TTT    1392
Gly Gln Thr Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe
                210                 215                 220
GCA CCA GGT GTC TTG GTG GGT GTG CGC AAC ATT GCA CAG CAC CCA GGC    1440
Ala Pro Gly Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly
            225                 230                 235
CTA GTC GTA GGA CTT GAG CAT TAC CTA GGC CTG TAAAGGCTCA TTTCAGCAGC  1493
Leu Val Val Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
        240                 245
GGGTGGAATT TTTTAAAAGG AGCGTTTAAA GGCTGTGGCC GAACAAGTTA AATTGAGCGT  1553
GGAGTTGATA GCGTGCAGTT CTTTTACTCC ACCCGCTGAT GTTGAGTGGT CAACTGATGT  1613
TGAGGGCGCG GAAGCACTCG TCGAGTTTGC GGGTCGTGCC TGCTACGAAA CTTTTGATAA  1673
GCCGAACCCT CGAACTGCTT CCAATGCTGC GTATCTGCGC CACATCATGG AAGTGGGGCA  1733
CACTGCTTTG CTTGAGCATG CCAATGCCAC GATGTATATC CGAGGCATTT CTCGGTCCGC  1793
GACCCATGAA TTGGTCCGAC ACCGCCATTT TTCCTTCTCT CAACTGTCTC AGCGTTTCGT  1853
GCACAGCGGA GAATCGGAAG TAGTGGTGCC CACTCTCATC GATGAAGATC CGCAGTTGCG  1913
TGAACTTTTC ATGCACGCCA TGGATGAGTC TCGGTTCGCT TTCAATGAGC TGCTTAATGC  1973
GCTGGAAGAA AAACTTGGCG ATGAACCG                                     2001
(2)SEQ ID NO：24的资料
(i)顺序特性
(A)长度：248个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线形
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)顺序说明：SEQ ID NO：24：
Met Gly Ile Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gln
  1               5                  10                  15
Thr Ile Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
             20                  25                  30
Glu Ile Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
         35                  40                  45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
     50                  55                  60
Glu Phe Cys Ile Asn Asn Gly Ile Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
 65                  70                  75                  80
Phe Asp Asp Ala Arg Leu Glu Gln Val Arg Ala Trp Leu Glu Gly Lys
                 85                  90                  95
Asp Asn Val Gly Val Leu Ile Ala Pro Asn Phe Ala Ile Ser Ala Val
            100                 105                 110
Leu Thr Met Val Phe Ser Lys Gln Ala Ala Arg Phe Phe Glu Ser Ala
        115                 120                 125
Glu Val Ile Glu Leu His His Pro Asn Lys Leu Asp Ala Pro Ser Gly
    130                 135                 140
Thr Ala Ile His Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ala
145                 150                 155                 160
Gly Met Asp Ala Gln Pro Asp Ala Thr Glu Gln Ala Leu Glu Gly Ser
                165                 170                 175
Arg Gly Ala Ser Val Asp Gly Ile Pro Val His Ala Val Arg Met Ser
            180                 185                 190
Gly Met Val Ala His Glu Gln Val Ile Phe Gly Thr Gln Gly Gln Thr
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Lys Gln Asp Ser Tyr Asp Arg Asn Ser Phe Ala Pro Gly
    210                 215                 220
Val Leu Val Gly Val Arg Asn Ile Ala Gln His Pro Gly Leu Val Val
225                 230                 235                 240
Gly Leu Glu His Tyr Leu Gly Leu
                245

Claims (8)

1.能够在棒杆菌细胞中自主复制的重组DNA，包括编码二氨庚二酸脱羧酶的DNA顺序和编码二氨庚二酸脱氢酶的DNA顺序。
2.根据权利要求1的重组DNA，其中表明了编码二氨庚二酸脱羧酶的所述DNA顺序编码显示在序列表的SEQ ID NO：5中的氨基酸顺序，或编码显示在SEQ ID NO：5的氨基酸顺序，其中有一个或多个的氨基酸经取代、缺失或插入。
3.根据权利要求1的重组DNA，其中表明了编码二氨庚二酸脱氢酶的所述DNA顺序编码显示在序列表的SEQ ID NO：9中的氨基酸顺序，或编码显示在SEQ ID NO：9的氨基酸顺序，其中有一个或多个的氨基酸的取代、缺失或插入。
4.棒杆菌，其中增强了编码二氨庚二酸脱羧酶的所述DNA顺序和编码二氨庚二酸脱氢酶的所述DNA顺序。
5.根据权利要求4的棒杆菌，它是通过引入权利要求1中定义的重组DNA转化的。
6.生产L-赖氨酸的方法，包括在培养基上培养权利要求4定义的所述棒杆菌，在培养物中生产和积累L-赖氨酸以及从培养物中收集L-赖氨酸的步骤。
7.生产L-赖氨酸的方法，包括在培养基上培养权利要求5定义的所述棒杆菌，在培善物中生产和积累L-赖氨酸以及从培善养物中收集L-赖氨酸的步骤。
8.一种棒杆菌，其中的一道编码二氨庚二酸脱羧酶的DNA顺序以及一道编码二氨庚二酸脱氢酶的DNA顺序是通过增加所述两道DNA顺序的拷贝数、通过使用强促进子，或其组合，而得到增强。
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