JP6729600B2 - Nε−アシル−L−リジンの製造方法 - Google Patents
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Description
〔1〕以下(A)〜(C)のいずれかのタンパク質の存在下において、カルボン酸もしくはその塩およびL−リジンもしくはその塩を反応させて、Nε−アシル−L−リジンを生成することを含む、Nε−アシル−L−リジンの製造方法:
(A)配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号1のアミノ酸配列と70%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
〔2〕前記タンパク質がロドサーマス(Rhodothermus)属に属する細菌に由来する、〔1〕の方法。
〔3〕前記タンパク質が精製酵素である、〔1〕または〔2〕の方法。
〔4〕反応が前記タンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行われる、〔1〕または〔2〕の方法。
〔5〕前記微生物がコリネバクテリウム属に属する細菌である、〔4〕の方法。
〔6〕前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、〔5〕の方法。
〔7〕カルボン酸が、炭素原子数5以上のカルボン酸である、〔1〕〜〔6〕のいずれかの方法。
〔8〕カルボン酸が、オクタン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、リノール酸、オレイン酸、安息香酸、メトキシメチル安息香酸、フェニルプロピオン酸、シンナモイル酸、またはメトキシシンナモイル酸である、〔1〕〜〔7〕のいずれかの方法。
〔9〕カルボン酸がオクタン酸またはドデカン酸であり、Nε−アシル−L−リジンがΝε−オクタノイル−L−リジンまたはΝε−ドデカノイル−L−リジンである、〔1〕〜〔8〕のいずれかの方法。
〔10〕反応が水溶性溶媒中で行われることを特徴とする、〔1〕〜〔9〕のいずれかの方法。
〔11〕処理液が殺微生物処理液である、〔4〕〜〔10〕のいずれかの方法。
〔12〕反応が40℃以上で行われる、〔1〕〜〔11〕のいずれかの方法。
〔13〕反応がカルボン酸もしくはその塩の非乳化条件下で行われる、〔1〕〜〔12〕のいずれかの方法。
〔14〕反応がカルボン酸もしくはその塩またはL−リジンもしくはその塩を500mmol/L以上の濃度で含む溶液中で行われる、〔1〕〜〔13〕のいずれかの方法。
本発明で用いられるタンパク質はまた、熱処理に対する耐性に優れ得る。したがって、このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、タンパク質を産生する微生物を熱処理により死滅させた後であっても微生物により産生された熱処理液中のタンパク質が失活しないことから、熱処理液を反応に良好に用いることができるという利点を有し得る。本利点は、滅菌を可能にしつつ、反応に用いられる酵素液を併せて容易に調製できるという点で、環境安全面および工程の簡便化の観点からも望ましいものである。
本発明で用いられるタンパク質はさらに、弱酸性条件下で高い活性を示すという特性を有し得る。したがって、このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、後に詳述するように、製造されるNε−アシル−L−リジンの結晶の性状を改善できるという利点を有し得る。
本発明で用いられるタンパク質はまた、高濃度の基質による阻害を受け難いという特性を有し得る。このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、高濃度の基質を利用可能であるため、大量のNε−アシル−L−リジンを製造することができるという利点を有し得る。
(A)配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号1のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
(1)作用及び基質特異性:Nε−アシル−L−リジンの分解及び/または合成反応を触媒する。
(2)至適温度範囲:約75℃。
(3)至適pHの範囲:約pH5。
(4)温度安定性:80℃、60分処理において失活しない。
(a)配列番号2もしくは3の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号2もしくは3の塩基配列と70%以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつNε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号2もしくは3の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつNε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(d)(a)〜(c)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
i)Argをコードする4種のコドン(AGG、AGA、CGG、およびCGA)からなる群より選ばれる少なくとも1種のコドンの、Argをコードする別のコドン(CGU、またはCGC)への変更;
ii)Glyをコードする1種のコドン(GGA)の、別のコドン(GGG、GGU、またはGGC)への変更;
iii)Ileをコードする1種のコドン(AUA)の、別のコドン(AUU、またはAUC)への変更;
iv)Leuをコードする1種のコドン(CUA)の、別のコドン(UUG、UUA、CUG、CUU、またはCUC)への変更;ならびに
v)Proをコードする1種のコドン(CCC)の、別のコドン(CCG、CCA、またはCCU)への変更。
本発明の縮重変異体がRNAの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「U」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がDNAの場合、ヌクレオチド残基「U」の代わりに「T」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜200個、または1〜100個である。
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム、
コリネバクテリウム・カルナエ、
コリネバクテリウム・グルタミカム、
コリネバクテリウム・リリウム、
コリネバクテリウム・メラセコーラ、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、
コリネバクテリウム・ハーキュリス、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム、
ブレビバクテリウム・フラバム、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、
ブレビバクテリウム・ロゼウム、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、
ブレビバクテリウム・アルバム、
ブレビバクテリウム・セリヌム、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511、
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991、
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020,ATCC13032,ATCC13060,ATCC13869,FERM BP−734、
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990、
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965、
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP−1539)、
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020、
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826,ATCC14067,AJ12418(FERM BP−2205)、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869、
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872、
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111、
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス ATCC15354。
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された目的タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、AJ12036の細胞表層タンパク質(PS2)破壊株であるC.グルタミカムYDK010株が挙げられる(WO01/23491参照)。
1−1)pPK4ベクター中のNaeI認識サイトを改変したベクター(pPK5)の構築
特開平9−322774号公報に記載のpPK4の中には、制限酵素Nae Iの認識配列が一ヵ所存在する。この配列を改変するため、NaeI認識配列gccggcをgcaggcに改変した配列とpPK4におけるその周辺配列を含む配列番号4及び配列番号5に記載のプライマーを合成した。次に、pPK4を鋳型として、配列番号4及び配列番号5のプライマーを用いて、約5.6kbpのプラスミド全長をPCR法によって増幅した。PCRにはPyrobest(登録商標) DNA polymerase(Takara Bio)を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
5’−cgattttcccgcctgcctggtggctcg−3’(配列番号5)
次に、WO2005/103278に記載のTat系分泌装置の増幅プラスミドであるpVtatABCを鋳型にして、配列番号6と配列番号7のプライマーを用いて、tatABC遺伝子をコードする配列を含む約3.7kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。配列番号7のプライマーはpVtatABCと相補的な塩基配列の5’末端側に制限酵素KpnIとApaIの認識配列を付加したデザインにしてある。
5’−aatgggccctttggtacccctaaataatatcggtcc−3’(配列番号7)
1−2)で構築したpPK5−tatABCベクター中のtatABC遺伝子領域の中には、制限酵素KpnIおよびXbaIの認識配列が1ヵ所ずつ存在する。これらの配列を改変するため、KpnI認識配列ggtaccをggaaccに改変した配列とpPK5−tatABCにおけるその周辺配列を含む配列番号8および配列番号9に記載のプライマーと、XbaI認識配列tctagaをtgtagaに改変した配列とpPK5−tatABCにおけるその周辺配列を含む配列番号10および配列番号11に記載のプライマーを合成した。
5’−gggaacgcacggttcccctagagcacg−3’(配列番号9)
5’−cgacgctgaagttgtagagatcatccg−3’(配列番号10)
5’−cggatgatctctacaacttcagcgtcg−3’(配列番号11)
KpnI認識配列(ggtacc)、C.glutamicum ATCC13869由来cspB遺伝子のプロモーター領域、E.coli W3110由来TorAシグナル配列、Rhodothermus marinus由来amidohydrolase(NCBI;WP_012844854.1、配列番号1)をコードする遺伝子(配列番号2)、及びApaI認識部位(gggccc)を、記載順に連結したDNAを化学合成によって取得した(配列番号3)。RmELAをコードする遺伝子は、「コドン使用データベース」に開示されている情報を基に、C.glutamicumのコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように設計した(http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res.,28,292(2000))。
1−4)で構築したpPK6−RmELAを用いて、C.glutamicum ATCC13869由来の変異株より取得したWDK010株(WO2010/067871)を形質転換して、カナマイシンを25mg/l含むCM2G寒天培地(酵母エキストラクト 10g、ポリペプトン 10g、グルコース 5g、塩化ナトリウム 5g、DL−メチオニン 0.2g、寒天 15g、pH7.2、水で1Lにする)で形質転換体を選択した。得られた形質転換体を、WDK010/pPK6−RmELA株と命名した。
カナマイシン25mg/lを含むシード液体培地(酵母エキストラクト 10g、ポリペプトン 10g、グルコース 5g、大豆加水分解物 窒素量として0.1g、DL−メチオニン 0.02g、pH7.2、水で1Lにする)50mlを入れた全容500ml坂口フラスコ試験管にWDK010/pPK6−RmELA株を1白金耳分接種し、30℃で8時間振とう培養した。このようにして得られた培養液0.9mlを、カナマイシン 25mg/lを含むメイン液体培地(グルコース 120g、硫酸アンモニウム 3g、リン酸二水素カリウム 1.5g、大豆加水分解物 窒素量として0.2g、硫酸マグネシウム七水和物 3g、DL−メチオニン 0.15g、硫酸鉄(II)七水和物 0.03g、硫酸マンガン(II)五水和物 0.03g、硫酸亜鉛七水和物 0.04g、塩化カルシウム 0.25g、チアミン塩酸塩 0.45mg、ビオチン 0.45mg、ディスホームGD−113K(日本油脂株式会社製)0.1ml、pH6.2、水で1Lにする)300mlを入れた1000ml容ジャーファーメンターに添加し、メイン培養を開始した。メイン培養は30℃、通気1/1vvm、アンモニアでpHを6.6に制御し、グルコースが消費されるまで行った。溶存酸素濃度が5%以上になるよう攪拌を500rpm以上で制御した。
2−1)RmELA E.coli発現株の作製
pPK6−RmELAを鋳型として、配列番号12と配列番号13のプライマーを用いてRmELA遺伝子をコードする配列を含む約1.7kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。配列番号12及び配列番号13のプライマーは、RmELA遺伝子と相補的な塩基配列の5’末端側に、それぞれ制限酵素NdeI及びXhoIの認識配列を付加したデザインにしてある。
5’−aaaaCTCGAGTGGGGAGGCCGGACACAGACCTGCTGC−3’(配列番号13)
アンピシリンを100mg/l含むOvernight Express Instant TB培地(Novagen) 50mlを入れた500ml溶坂口フラスコに試験管にE.coli BL21(DE3)/pET21a−RmELA株1白金耳分接種し、37℃で24時間振とう培養した。
アンピシリンを100mg/l含むOvernight Express Instant TB培地(Novagen)50mlを入れた500ml溶坂口フラスコにBL21(DE3)/pET21a−RmELA株1白金耳分接種し、37℃で24時間振とう培養した。
4−1)アシルリジン加水分解
本酵素のアシルリジン加水分解の基質特異性を見るために、各種アシルリジンに対する、本発明の酵素の反応性を調べた。結果の一覧を以下の表2に示す。酵素は実施例3で取得した精製酵素を用いて評価した。活性測定は、各種アシルリジン4mM、Tris−HCl 100mM(pH7.0)、37℃で行い、アシルリジンの分解に伴い生成するリジンの濃度を測定することで算出した。L−リジンの測定にはBF−5及びリジン電極(王子計測機器(株)製)を、D−リジンの測定にアミノ酸アナライザー分析((株)日立製作所製)は用いた。1Uは、1分あたり1μmolのリジンをアシルリジンより遊離させる酵素量と定義した。
本酵素のアシルリジン脱水縮合の基質特異性を見るために、L−リジンと各種カルボン酸を基質として本酵素によるアシルリジン合成能を調べた。酵素は実施例3で取得した精製酵素を用いて評価した。合成反応は、L−リジン塩酸塩45mM、各種カルボン酸45mM、Tris−HCl 100mM(pH8.0)、メタノール10%(v/v)、45℃で行い、反応液を質量分析(DART−MS:日本電子(株)製)することでアシルリジンの分子量の検出を確認した。
5−1)温度に対する影響
実施例3記載の方法で取得した精製酵素を用いて、Nε−アセチル−L−リジンを基質とした場合の酵素の反応至適温度及び温度安定性を調べた。
実施例3記載の方法で取得した精製酵素を用いて、Nε−アセチル−L−リジンを基質とした場合の酵素の至適pH及びpH安定性を調べた。
RmELAのC.glutamicum発現株を、酵素活性を維持した状態で加熱殺菌することが可能か調べた。実施例1、1−6)記載の方法で取得した培養液150μlをPCRチューブに分注し、ブロックヒーターを用いて75℃で30分間熱処理を行ったものを熱処理培養液とした。熱処理培養液及び、熱処理培養液を生理食塩水(0.85% NaCl)で段階希釈(〜希釈倍率x102)したものを、カナマイシンを25mg/l含むCM2G寒天培地(酵母エキストラクト 10g、ポリペプトン 10g、グルコース 5g、塩化ナトリウム 5g、DL−メチオニン 0.2g、寒天 15g、pH7.2、水で1Lにする)に塗布して、形成したコロニーをカウントすることでRmELA発現株の生菌数を調査した。その結果、コロニー形成は認められず、75℃、30分間の熱処理で培養液が殺菌されていることが分かった。熱処理していない培養液を同様の方法で調査をした場合、生菌数は7.0x1010cfu/mlであった。
実施例1、1−6)記載の方法で取得したRmELAのC.glutamicum発現株の培養液を、遠心分離して上清を回収した後に、0.45μmのフィルターで膜除菌したものをRmELA酵素液とした。また、Streptomyces mobarensis由来ELA(SmELA)のC.glutamicum発現株であるWDK010/pPKT−tatABC株(WO2010067871)を同様の手順で培養及び除菌したものをSmELA酵素液とした。
実施例7記載の方法で調整したRmELA酵素液を用いて、Nε−ドデカノイル−L−リジンの合成反応を実施した。終濃度が、ドデカン酸 300mmol/L、L−リジン塩酸塩 300mmol/L、ZnSO4 0.1mmol/L、メタノール 10%、RmELA酵素液 3U/mlとなるように反応液200mlを調製し、500ml溶ジャーファーメンターを用いて300rpmにて攪拌した。pHは7.0となるように1N NaOHで調製し、反応温度は55℃となるように調整した。
実施例7記載の方法で調整したRmELA酵素液を用いて、Nε−オクタノイル−L−リジンの合成反応を実施した。終濃度が、オクタン酸300mmol/L、L−リジン塩酸塩 300mmol/L、ZnSO4 0.1mmol/L、RmELA酵素液 2.1U/mlとなるように反応液100mlを調製し、200ml溶ジャーファーメンターを用いて300rpmにて攪拌した。pHは7.0となるように1N NaOHで調製し、反応温度は50℃となるように調整した。
Claims (14)
- 以下(A)〜(C)のいずれかのタンパク質の存在下において、カルボン酸もしくはその塩およびL−リジンもしくはその塩を反応させて、Nε−アシル−L−リジンを生成することを含む、Nε−アシル−L−リジンの製造方法:
(A)配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号1のアミノ酸配列において、1〜50個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nε−アシル−L−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記タンパク質がロドサーマス(Rhodothermus)属に属する細菌に由来する、請求項1記載の方法。
- 前記タンパク質が精製酵素である、請求項1または2記載の方法。
- 反応が前記タンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行われる、請求項1または2記載の方法。
- 前記微生物がコリネバクテリウム属に属する細菌である、請求項4記載の方法。
- 前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項5記載の方法。
- カルボン酸が、炭素原子数5以上のカルボン酸である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- カルボン酸が、オクタン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、リノール酸、オレイン酸、安息香酸、メトキシメチル安息香酸、フェニルプロピオン酸、シンナモイル酸、またはメトキシシンナモイル酸である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- カルボン酸がオクタン酸またはドデカン酸であり、Nε−アシル−L−リジンがΝε−オクタノイル−L−リジンまたはΝε−ドデカノイル−L−リジンである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 反応が水溶性溶媒中で行われることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 処理液が殺微生物処理液である、請求項4〜10のいずれか一項記載の方法。
- 反応が40℃以上で行われる、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- 反応がカルボン酸もしくはその塩の非乳化条件下で行われる、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 反応がカルボン酸もしくはその塩またはL−リジンもしくはその塩を500mmol/L以上の濃度で含む溶液中で行われる、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
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