ES2907694T3 - Nuevo promotor y uso del mismo - Google Patents

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Abstract

Una molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora que consiste en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevo promotor y uso del mismo
Campo técnico
La presente descripción se refiere a un promotor nuevo, un vector que comprende el promotor, un microorganismo que comprende el promotor o vector y un método para producir un producto diana mediante el uso del microorganismo.
Antecedentes de la técnica
Se han realizado esfuerzos continuos para la producción de productos diana, tales como aminoácidos o materiales útiles que pueden usarse para varios propósitos, que incluyen alimentos, medicamentos, comidas, etc., en títulos altos mediante el uso de microorganismos (Patente coreana núm. 10-0924065). Como uno de tales métodos, existe un método para inducir la sobreexpresión de un gen diana en un microorganismo, y para este fin es necesario un sistema de expresión génica de alta eficacia. Dado que los promotores son uno de los factores que están significativamente implicados en los sistemas de expresión génica, es esencial el desarrollo de un promotor útil. El promotor tac derivado de E. coli es ampliamente conocido como un promotor fuerte. En el caso del microorganismo de la forma Coryne, se han desarrollado promotores fuertes modificando los promotores de los genes propios (Gene, 102, 93 - 98, 1991; Microbiology, 142, 1297 - 1309, 1996). Por ejemplo, en los casos de los promotores derivados de Corynebacterium ammoniagenesis, se describe que hay una mejora de alrededor del 10 % en comparación con la del promotor tac informado en E. coli (Biotechnol. Lett. 25, 1311 - 1316, 2003). Adicionalmente, como promotores fuertes derivados de Corynebacterium ammoniagenesis, se desarrollaron promotores Pcj1 a Pcj7 con varias fortalezas y tienen actividades promotoras fuertes con al menos 10 veces más que la del promotor tac (Patente coreana núm 10-0620092). Adicionalmente, se desarrolló el promotor Po2, que se sintetizó a partir de Corynebacterium glutamicum para tener una fuerte actividad promotora (Patente coreana núm.
10-1632642). Sin embargo, todavía existe la necesidad de desarrollar un promotor, ya que se necesita un sistema que muestre una alta eficiencia de expresión en Corynebacterium en comparación con el sistema de expresión génica de E. coli.
Dadas las circunstancias, los presentes inventores han hecho muchos esfuerzos para descubrir promotores que puedan inducir fuertemente la expresión génica en un microorganismo del género Corynebacterium. Como resultado, desarrollaron un promotor nuevo sintetizado de la presente descripción y confirmaron que el promotor tiene una actividad de expresión más alta en comparación con los promotores conocidos, completando así la presente descripción.
Problema técnico
Un objeto de la presente descripción es proporcionar una molécula de ácido nucleico nueva que tenga actividad promotora; un casete de expresión génica que contiene la molécula de ácido nucleico y un gen diana; un vector recombinante que contiene la molécula de ácido nucleico o el casete de expresión génica; un microorganismo recombinante que contiene el promotor o el vector; y un método para producir un producto diana mediante el uso del microorganismo recombinante.
Solución técnica
Para lograr los objetivos de la presente descripción, un aspecto de la presente descripción proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora que consiste en cualquier secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3.
Como se usa en la presente descripción, el término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico no traducida ubicada aguas arriba de una región codificante, que incluye un sitio de unión a polimerasa y tiene la actividad de iniciar la transcripción al ARNm de un gen ubicado aguas abajo de un promotor, es decir, un dominio de ADN al que se une la polimerasa e inicia la transcripción de un gen. El promotor puede estar ubicado en el dominio 5' de la región de inicio de la transcripción del ARNm.
En la presente descripción, las moléculas de ácido nucleico, que tienen la actividad promotora que consiste en cualquier secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3 (es decir, una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, o SeQ ID NO: 3), se denominaron SPL1, SPL7y SPL13, respectivamente. Además, las moléculas de ácido nucleico que tiene una actividad promotora pueden denominarse promotores y todos los términos descritos anteriormente pueden usarse en la presente descripción.
El promotor de la presente descripción permite la expresión de un gen diana, que está unido operativamente a la molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora en un microorganismo diana, y puede usarse como promotor de uso general.
Adicionalmente, la secuencia del promotor de la presente descripción puede modificarse mediante mutagénesis convencionalmente conocida, por ejemplo, evolución directa, mutagénesis sitio dirigida, etc. En consecuencia, el promotor puede incluir, sin limitación, cualquier secuencia de nucleótidos que tenga una homología del 70 % o más, específicamente 80 % o más, más específicamente 90 % o más, incluso más específicamente 95 % o más, aún más específicamente 98 % o más y con la máxima especificidad 99 % o más, a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3, y que tiene una actividad promotora similar. Adicionalmente, cualquier secuencia de nucleótidos que tenga la homología anterior, en la que parte de la secuencia se elimine, modifique, sustituya o inserte, debe interpretarse como incluida en el alcance de la molécula de ácido nucleico de la presente descripción, siempre que la secuencia tenga una actividad promotora.
En particular, la expresión "que consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3" no excluye los casos de adición y/o eliminación y/o modificación, etc., de un nucleótido que puede ocurrir mientras se une a un gen diana junto con el uso de una enzima de restricción, cuando se usa el promotor correspondiente mediante la unión al gen diana.
Específicamente, además del promotor para realizar la transcripción génica, puede incluirse cualquier secuencia operadora para controlar la transcripción, una secuencia que codifica un sitio de unión al ribosoma de ARNm adecuado y una secuencia para controlar la transcripción y la traducción. Por ejemplo, la secuencia de control adecuada para procariotas puede incluir cualquier secuencia operadora o dominio de unión a ribosomas, pero sin limitarse a ellos. La molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora de la presente descripción puede consistir en una secuencia para controlar la expresión génica como se describe anteriormente, de acuerdo con la necesidad de un experto en la técnica.
La molécula de ácido nucleico, que consiste en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1 a 3, que tiene una actividad promotora puede incluir, sin limitación, una sonda que puede prepararse a partir de una secuencia génica conocida, por ejemplo, cualquier secuencia de nucleótidos que tenga la actividad promotora de la presente descripción por hibridación con una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos completa o parcial de las s Eq ID NO: 1 a 3 de la presente descripción en condiciones estrictas.
Como se usa en la presente descripción, el término "homología" se refiere a un porcentaje de identidad entre dos restos de polinucleótidos o de polipéptidos. La homología de secuencia de un resto con respecto a otro puede determinarse mediante una técnica conocida en la técnica. Por ejemplo, la homología puede confirmarse mediante el uso de un software estándar para calcular parámetros tales como puntuación, identidad y similitud (específicamente BLAST 2.0) o comparando las secuencias a través de experimentos de hibridación Southern en una condición estricta definida, y la condición de hibridación apropiada definida puede ser determinado por un método bien conocido por un experto en la técnica dentro del alcance de la tecnología correspondiente (por ejemplo, J. Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989; F.M. Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
La "condición estricta" se refiere a una condición que permite la hibridación específica entre polinucleótidos. Esta condición se describe en detalle en las referencias (Por ejemplo, Sambrook y otros, supra). Por ejemplo, puede incluirse una condición de hibridación, donde los genes con una homología alta (por ejemplo, genes con una homología del 80 % o más, específicamente 90 % o más, más específicamente 95 % o más, incluso más específicamente 97 % o más, e aún más específicamente 99 % o más) se hibridan, y los genes con una homología inferior a la anterior no se hibridan; o una condición de lavado, donde el lavado se realiza una vez, específicamente de 2 a 3 veces, en condiciones de concentraciones de sal y temperatura correspondientes a una condición de lavado convencional para hibridación Southern (es decir, 60 °C, 1*SSC y 0,1 % SDS), específicamente 60 °C, 0,1*SSC y 0,1 % de SDS, más específicamente 68 °C, 0,1* SSC y 0,1 % de SDS. Aunque puede producirse un desajuste entre los nucleótidos debido a la rigurosidad de la hibridación, se requiere que los dos ácidos nucleicos tengan una secuencia complementaria. El término "complementario" se usa para describir la relación entre las bases de nucleótidos que pueden hibridar entre sí. Por ejemplo, con respecto a las bases de nucleótidos, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. En consecuencia, la presente descripción puede incluir no solo secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares sino también fragmentos de ácidos nucleicos aislados que son complementarios a la secuencia completa. Específicamente, el polinucleótido que tiene una homología puede detectarse mediante el uso de una condición de hibridación que incluye la condición de hibridación a un valor de Tm de 55 °C y las condiciones descritas anteriormente. Adicionalmente, el valor de Tm puede ser de 60 °C, 63 °C o 65 °C, pero sin limitarse a ellos, y puede controlarse adecuadamente por un experto en la técnica de acuerdo con esos fines. Es bien conocido que la rigurosidad para la hibridación de los polinucleótidos depende de la longitud y el grado de complementariedad de los polinucleótidos y las variables se conocen bien en la técnica (véase Sambrook y otros, supra, 9,50 - 9,51, 11,7 - 11,8).
La molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora de la presente descripción puede aislarse o prepararse mediante el uso de las técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede prepararse mediante el uso de la tecnología de síntesis estándar que usa un sintetizador de ADN automatizado, pero la preparación no se limita a ello.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un casete de expresión génica que incluye la molécula de ácido nucleico y el gen diana de la presente descripción.
La molécula de ácido nucleico es la misma que se explicó anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el término "casete de expresión génica" se refiere a un casete unitario que incluye un promotor y un gen diana y, por lo tanto, puede expresar un gen diana unido operativamente a la cadena aguas abajo del promotor. Dicho casete de expresión génica puede incluir varios factores que pueden ayudar a la expresión eficaz del gen diana, dentro o fuera del casete. El casete de expresión génica puede incluir convencionalmente una señal de terminación de la transcripción, un dominio de unión al ribosoma y una señal de terminación de la traducción, además del promotor unido operativamente al gen diana.
Como se usa en la presente descripción, el término "gen diana" se refiere a un gen que codifica una proteína que se va a expresar en un microorganismo.
Por ejemplo, el gen diana puede ser un gen involucrado en la producción de un producto seleccionado del grupo que consiste en los sacáridos (por ejemplo, psicosa o tagatosa), L-aminoácidos (L-lisina, L-valina, etc.), ácidos orgánicos, enzimas y una combinación de los mismos, pero sin limitarse a ellos. Específicamente, el gen diana puede ser un gen que codifique una enzima convertidora de azúcar o una enzima asociada con la biosíntesis de aminoácidos, un gen que codifique una enzima asociada con el poder reductor, un gen que codifique una enzima asociada con la biosíntesis de ácidos orgánicos o un gen que codifique un enzima asociada con la liberación de un producto diana, pero sin limitarse a ello. Más específicamente, el gen diana puede ser un gen que codifique la psicosa epimerasa, un gen que codifique la tagatosa epimerasa o un gen que codifique la tagaturonato epimerasa, un gen que codifique la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADp o un gen que codifique una aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada, pero sin limitarse a ellos.
La psicosa epimerasa puede indicarse como ATPE y se refiere a la psicosa-3-epimerasa que tiene la actividad de convertir la fructosa en psicosa. Adicionalmente, la tagaturonato epimerasa o tagatosa epimerasa (ácido hexurónico C4-epimerasa; patente coreana núm. 10-1550796) puede indicarse como UxaE, y se refiere a una enzima que tiene la actividad de convertir el fructuronato en tagaturonato o convertir la fructosa en tagatosa. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NADP puede indicarse como GapN, y se refiere a una enzima que tiene la actividad de convertir en 3-fosfoglicerato mediante el uso de gliceraldehído 3 fosfato como sustrato. La aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada puede indicarse como IlvE y se refiere a la enzima de la última etapa en la vía biosintética de los aminoácidos de cadena ramificada. Las secuencias de los genes que codifican ATPE, UxaE, GapN e IlvE pueden obtenerse fácilmente a través de una base de datos conocida como GenBank del NIH (EE. UU.) por parte de un experto en la técnica. Los genes que codifican ATPE, UxaE, GapN e IlvE son genes diana ilustrativos que pueden unirse operativamente a una molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora de la presente descripción, y el promotor de la presente descripción puede usar, sin limitación, cualquier gen que pueda ser expresado en un microorganismo por un promotor de propósito general, tal como un gen diana. Como se usa en la presente descripción, el término "unido operativamente" significa que la secuencia de los genes anteriores y una secuencia promotora están unidas funcionalmente de modo que la secuencia de ácido nucleico que tiene la actividad promotora de la presente descripción puede iniciar y mediar en la transcripción del gen diana. La unión operativa puede prepararse mediante el uso de una tecnología genética recombinante bien conocida en la técnica, y la escisión y unión de ADN específico del sitio pueden prepararse mediante el uso de las enzimas de escisión y unión, etc., en la técnica, pero sin limitarse a ello.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un vector recombinante, que incluye la molécula de ácido nucleico de la presente descripción o el casete de expresión génica de la presente descripción.
La molécula de ácido nucleico y el casete de expresión génica son los mismos que se explicaron anteriormente. Como se usa en la presente descripción, el término "vector" es una molécula de ADN artificial que posee un material genético para permitir la expresión de un gen diana en una célula huésped adecuada y, específicamente, una construcción de ADN que incluye la secuencia de nucleótidos de un gen unido operativamente a una secuencia reguladora apropiada. La secuencia reguladora puede incluir, además del promotor capaz de iniciar la transcripción, cualquier secuencia operadora para la regulación de dicha transcripción, una secuencia que codifica un dominio de unión al ribosoma de ARNm apropiado y una secuencia para la regulación de la transcripción y la traducción, pero sin limitarse a ello.
El vector usado en la presente descripción puede no estar particularmente limitado siempre que el vector pueda expresarse en una célula huésped y la célula huésped pueda transformarse mediante el uso de cualquier vector conocido en la técnica. Los ejemplos de vectores usados convencionalmente pueden incluir plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos naturales o recombinantes. Por ejemplo, como vector de fago o vector de cósmido, pueden usarse pWE15, M13, ABL3, ABL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, Charon21A, etc.; y como vector de plásmido pueden usarse los basados en pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc.. El vector que puede usarse en la presente descripción no está particularmente limitado, sino que puede usarse cualquier vector de expresión conocido. Adicionalmente, el promotor endógeno dentro del cromosoma puede reemplazarse con una molécula de ácido nucleico que tenga la actividad promotora de la presente descripción mediante un vector para insertar el cromosoma en una célula huésped. La inserción de la molécula de ácido nucleico en el cromosoma puede realizarse mediante un método bien conocido en la técnica, por ejemplo, recombinación homóloga. Por ejemplo, pueden usarse los vectores pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCCIBAC, pCES208, pXMJ19, pero el vector no está limitado a ellos. Dado que el vector de la presente descripción puede insertarse en el cromosoma mediante recombinación homóloga, puede incluirse además un marcador de selección para confirmar la inserción en el cromosoma. El marcador de selección se usa para la selección de una célula transformada, es decir, pueden usarse para confirmar la inserción de la molécula de ácido nucleico diana y los marcadores capaces de proporcionar fenotipos seleccionables tales como resistencia a fármacos, requerimiento de nutrientes, resistencia a agentes citotóxicos y expresión de proteínas de superficie. En las circunstancias en las que se tratan agentes selectivos, solo las células capaces de expresar los marcadores de selección pueden sobrevivir o expresar otros rasgos fenotípicos y así pueden seleccionarse las células transformadas.
Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a un proceso de introducción de un vector que incluye un polinucleótido que codifica una proteína diana en una célula huésped, lo que permite, de esta manera, la expresión del polinucleótido codificado por la proteína en la célula huésped. Para el polinucleótido transformado, no importa si se inserta en el cromosoma de una célula huésped y se ubica allí, o si se ubica fuera del cromosoma, siempre que pueda expresarse en la célula huésped. Adicionalmente, los polinucleótidos incluyen ADN y ARN, que codifican la proteína diana. El polinucleótido puede insertarse en cualquier forma siempre que pueda introducirse en una célula huésped y expresarse en ella. Por ejemplo, el polinucleótido puede introducirse en una célula huésped en forma de un casete de expresión, que es una construcción génica que incluye todos los elementos esenciales necesarios para la autoexpresión, o en la forma de un vector que incluye el casete de expresión. El casete de expresión o el vector que incluye el polinucleótido pueden ser aquellos que incluyen, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos que consiste en SEQ ID NO: 1, s Eq ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 de la presente descripción, que tiene una actividad promotora, y puede ser un vector, al que un gen diana no está unido operativamente. Incluso en este caso, la molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora puede ser reemplazada por el promotor endógeno dentro de la célula huésped (por ejemplo, un microorganismo del género Corynebacterium) y por recombinación homóloga. Como tal, puede expresarse el gen endógeno dentro de la célula huésped.
El método de transformación puede incluir cualquier método que pueda introducir ácidos nucleicos en una célula, y la transformación puede realizarse mediante la selección de una técnica estándar apropiada conocida en la técnica de acuerdo con la célula huésped. Por ejemplo, el método puede incluir electroporación, precipitación con fosfato cálcico (CaPO4), precipitación con cloruro de calcio (CaCh), microinyección, un método con polietilenglicol (PEG), un método con DEAE-dextrano, un método con liposomas catiónicos y un método con acetato de litio/DMSO, etc., pero sin limitarse a ellos.
Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un microorganismo recombinante que incluye una molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora de la presente descripción, el casete de expresión génica o un vector recombinante que incluye el casete de expresión génica.
La molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora, el casete de expresión génica y el vector recombinante son los mismos que se explicaron anteriormente.
El casete de expresión génica y el vector recombinante pueden introducirse en un microorganismo mediante transformación.
Adicionalmente, la transformación es la misma que se explicó anteriormente.
Como se usa en la presente descripción, el término "microorganismo" es un concepto que incluye tanto un microorganismo de tipo salvaje como un microorganismo modificado genéticamente de forma natural o artificial, y puede ser un microorganismo que tiene un mecanismo particular debilitado o mejorado debido a la inserción de un gen extraño o una mejora o debilitamiento de la actividad de un gen endógeno. Como se usa en la presente descripción, el microorganismo puede incluir, sin limitación, cualquier microorganismo en el que se introduzca la molécula de ácido nucleico que tiene la actividad promotora de la presente descripción y sea capaz de funcionar como promotor.
Específicamente, el microorganismo puede ser un microorganismo del género Corynebacterium, y más específicamente, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc. Incluso más específicamente, el microorganismo puede ser Corynebacterium glutamicum, pero sin limitarse a ellos.
En aún otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir un producto diana, que incluye (a) cultivar el microorganismo recombinante de la presente descripción en un medio; y (b) recuperar un producto diana del microorganismo o del medio donde se cultivó el microorganismo.
Como se usa en la presente descripción, el término "producto diana" puede seleccionarse del grupo que consiste en los sacáridos (por ejemplo, psicosa o tagatosa), L-aminoácidos (por ejemplo, L-lisina, L-valina), ácidos orgánicos, enzimas y un combinación de los mismos. El "sacárido" se refiere a un carbohidrato que tiene un sabor dulce y puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, glucosa, fructosa, galactosa, alulosa, tagatosa, xilosa, lactosa, sacarosa y una combinación de los mismos, pero sin limitarse a ellos.
El "aminoácido" o "L-aminoácido" generalmente se refiere a una unidad básica constitutiva de una proteína en la que un grupo amino y un grupo carboxilo están unidos al mismo átomo de carbono. El aminoácido puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, treonina, serina, cisteína, glutamina, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, fenilalanina, tirosina, triptófano, prolina y una combinación de los mismos, pero sin limitarse a ellos. Los ácidos orgánicos pueden ser compuestos orgánicos que tengan una propiedad ácida, por ejemplo, aquellos compuestos en los que se incluyen un grupo carboxi y un grupo sulfónico. Los ejemplos específicos de ácidos orgánicos pueden incluir ácido láctico, ácido acético, ácido succínico, ácido butírico, ácido palmítico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido propiónico, ácido hexenoico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido valérico o ácido cítrico, pero no se limitan a ellos. Las "enzimas" se refieren a los catalizadores de proteínas que median en las reacciones químicas que ocurren en los organismos vivos y, específicamente, las enzimas desempeñan el papel de catalizadores que reducen la energía de activación requerida para una reacción al formar un complejo enzima-sustrato al unirse a los sustratos. Por ejemplo, algunas enzimas pueden estar involucradas en la producción de sacáridos (por ejemplo, psicosa o tagatosa), y más específicamente, estas enzimas pueden ser psicosa epimerasa, tagatosa epimerasa o tagaturonato epimerasa, pero no se limitan a ellas. Los productos diana pueden incluir cualquier producto diana que pueda producirse mediante la expresión de un gen diana, que está unido operativamente al promotor de la presente descripción, pero los productos diana no se limitan a ellos.
Como se usa en la presente descripción, el término “cultivo” se refiere al crecimiento de un microorganismo en condiciones ambientales apropiadas y controladas artificialmente. En la presente descripción, el proceso de cultivo puede realizarse en base a los medios de cultivo apropiados y condiciones de cultivo ampliamente conocidas en la técnica. Específicamente, el proceso de cultivo puede realizarse de forma continua en un proceso por lotes, un proceso por lotes alimentados o por lotes alimentados repetido, pero sin limitarse a ellos.
Los medios usados en el cultivo deben satisfacer adecuadamente los requisitos de las cepas específicas. Se describen medios de cultivo para los microorganismos del género Corynebacterium y el género Escherichia (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., EE. UU., 1981). Como fuente de carbono a usar en los medios, pueden incluirse azúcares y carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites y grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido glucónico, ácido acético y ácido pirúvico, pero no se limitan a ellos. Estos materiales se pueden usar individualmente o como una mezcla. Como fuente de nitrógeno a usar, pueden usarse peptona, extracto de levadura, extracto de carne de res, extracto de malta, licor de maceración de maíz, polvo de harina de soja y urea o compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio pueden incluirse, pero la fuente de nitrógeno no se limita a ellos. Las fuentes de nitrógeno también pueden usarse individualmente o como una mezcla. Como fuente de fósforo, pueden usarse fosfato de dihidrógeno de potasio o fosfato de hidrógeno de dipotasio o sales que contienen los sodio correspondientes, pero la fuente de fósforo no se limita a ellos. Además, los medios de cultivo pueden incluir una sal metálica tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro que es esencial para el crecimiento. Además, pueden usarse materiales esenciales para el crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas además de los materiales mencionados anteriormente. Adicionalmente, pueden adicionarse los precursores apropiados a los medios de cultivo. Específicamente, cuando se produce una enzima como producto diana, el sustrato de la enzima puede estar contenido en el medio. Por ejemplo, puede incluirse en los medios fructosa, que puede servir como sustrato para psicosa epimerasa, tagatosa epimerasa o tagaturonato epimerasa. Los materiales de origen anterior pueden alimentarse adecuadamente al cultivo por lotes o de manera continua durante el proceso de cultivo. Estos diversos procesos de cultivo se describen, por ejemplo, en la referencia ("Biochemical Engineering" por James M. Lee, ediciones Prentice-Hall International, páginas 138 - 176).
El pH del cultivo puede ajustarse con un compuesto básico apropiado tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoníaco o un compuesto ácido tal como ácido fosfórico y ácido sulfúrico. Adicionalmente, la formación de espuma puede ajustarse mediante un agente antiespumante tal como un éster de poliglicol de ácido graso. Para mantener la condición aeróbica del cultivo, pueden introducirse oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno (por ejemplo, aire). La temperatura de cultivo puede estar generalmente en el intervalo de 20 °C a 45 °C, específicamente de 25 °C a 40 °C, pero la temperatura no se limita a ello y puede cambiar de acuerdo con las condiciones de cultivo.
El método para producir un producto diana de la presente descripción puede incluir una etapa de recuperación del producto diana del microorganismo de la presente descripción o del medio donde se cultivó el microorganismo. El método para producir un producto diana a partir del microorganismo o del medio en el que se cultivó el microorganismo consiste en aislar o recuperar el producto diana mediante el uso de una reacción apropiada descrita en la técnica. Por ejemplo, los métodos pueden incluir un tratamiento con un precipitante de proteínas (un método de salinización), centrifugación, extracción, ultrasonicación, ultrafiltración, diálisis, varios métodos de cromatografía tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc., y una combinación de los mismos, pero sin limitarse a ellos. La etapa de recuperación puede incluir un proceso de purificación, y un experto en la técnica puede seleccionar el proceso de varios procesos de purificación y utilizarlo según sea necesario.
Efectos ventajosos de la invención
El promotor nuevo de la presente descripción puede tener diversas actividades de acuerdo con los microorganismos que inducen la expresión de un gen diana. En consecuencia, cuando es necesario controlar la actividad del gen diana según sea necesario durante la producción del producto diana, el producto diana puede producirse de forma eficiente mediante el uso del promotor nuevo de la presente descripción.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados del ensayo de GFP que ilustran la fuerza medida de los promotores nuevos. La figura 1(A) muestra los resultados del ensayo de GFP de los promotores nuevos basados en Corynebacterium glutamicum ATCC13032, y la figura 1 (B) muestra los resultados del ensayo de GFP de los promotores nuevos basados en Corynebacterium glutamicum ATCC13869.
La figura 2 muestra los resultados de HPLC que confirman la producción de psicosa. La figura 2(A) muestra el resultado de la reacción con fructosa como sustrato mediante el uso de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 /CJ4 -ATPE-2, la figura 2(B) muestra el resultado de la reacción con fructosa como sustrato mediante el uso de Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL1-ATPE-2 y la figura 2(C) muestra el resultado de la reacción con fructosa como sustrato mediante el uso de Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL7-ATPE-2.
La figura 3 muestra los resultados de HPLC que confirman la producción de tagatosa. La figura 3(A) muestra el resultado de la reacción con fructosa como sustrato mediante el uso de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 /CJ4 -TN(m) y la figura 3(B) muestra el resultado de la reacción con fructosa como sustrato mediante el uso de ATCC13032/SPL13-TN(m).
Descripción detallada de la invención
En lo adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos, etc., para ayudar a la comprensión de la presente descripción. Sin embargo, estos ejemplos pueden modificarse en otras formas diversas y el alcance de la presente descripción no debe interpretarse como limitado por estos ejemplos. Los ejemplos de la presente descripción se proporcionan con el propósito de una explicación más completa para aquellos que tienen un conocimiento promedio en la técnica.
Ejemplo 1: confirmación de la expresión del gen diana inducida por un promotor nuevo
1-1. Preparación de los vectores recombinantes que contienen las secuencias promotoras nuevas
Para la síntesis de un promotor nuevo capaz de inducir la expresión de un gen diana, se analizaron diversas secuencias promotoras derivadas de un microorganismo del género Corynebacterium y un microorganismo del género Escherichia. Los promotores que tenían las secuencias de nucleótidos representadas por las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 se sintetizaron y nombraron como SPL1, SPL7 y SPL13, respectivamente.
Basado en los promotores SPL1, SPL7 y SPL13 preparados por síntesis como moldes, la PCR se realizó mediante el uso de los cebadores de SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5 que incluyen los sitios de restricción KpnIlEcoRV [Sambrook y otros, Molecular Cloning, a laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. La PCR se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 30 s; y extensión a 72 °C durante 7 min. Como resultado, se obtuvieron SPL1, SPL7 y SPL13 con un tamaño de aproximadamente 300 pb.
El marco abierto de lectura (ORF) del gen GFP se obtuvo mediante PCR mediante el uso del vector pGFPuv (Clontech, EE. UU.) como molde junto con los cebadores de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 que incluyen los sitios de restricción PstI/EcoRV. La PCR se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y extensión a 72 °C durante 1 min; y extensión a 72 °C durante 7 mindoya. Como resultado, se obtuvo el fragmento génico de GFP (SEQ ID NO: 14) de aproximadamente 716 pb.
En los sitios de restricción PstI y KpnI de un vector lanzadera pECCG117 (Biotechnology letters, vol 13, núm. 10, p.721 - 726 (1991), (Patente coreana núm. 10-1992-0007401)) que puede expresarse en E. coli y microorganismos en forma de Coryne, cada uno de SPL1, SPL7 y SPL13, que se trataron con las enzimas de restricción Kpn I y EcoRV, y el ORF del gen GFP que se trató con PstI y EcoRV se unieron operativamente entre sí mediante el uso de una ADN ligasa y, por lo tanto, se prepararon vectores recombinantes, en los que cada uno de SPL1, SPL7 y SPL13 está unido a Gf P, y se denominaron pSPL1-GFP, pSPL7-GFP y pSPL13-GFP, respectivamente.
1-2. Preparación de las cepas transformadas
El vector pECCG117, los vectores recombinantes (pSPL1-GFP, pSPL7-GFP y pSPL13-GFP) preparados anteriormente, y p117-CJ4-GFP, que incluye un promotor pcj4 descrito anteriormente (Patente coreana núm. 10­ 0620092), se transformaron en Corynebacterium glutamicum ATCC13032 y Corynebacterium glutamicum ATCC13869 por el método de pulso eléctrico (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541 - 545), respectivamente, y las cepas transformadas se obtuvieron en placa de agar Luria-Bertani (LB) que contenía kanamicina (25 mg/l). Las cepas obtenidas en base a ATCC13032 se denominaron como Corynebacterium glutamicum ATcC13032/pECCG117, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL1-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL7-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL13-GFP y respectivamente. Adicionalmente, las cepas obtenidas en base a ATCC13869 se denominaron como Corynebacterium glutamicum ATCC13869/pECCG117, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/SPL1-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/SPL7-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/SPL13-GFP y Corynebacterium glutamicum ATCC13869/CJ4-GFPrespectivamente.
Los 6 tipos de cepas obtenidas mediante la transformación anterior, es decir, ATCC13032/SPL7-GFP, ATCC13032/SPL13-GFP, ATCC13032/SPL1-GFP, ATCC13869/SPL7-GFP, ATCC13869/SPL13-GFP y ATCC13869/SPL1-GFP, se denominaron como CA01-2301, CA01-2302, CA01-2303, CA01-2304, CA01-2305 y CA01-2306, respectivamente, y luego se depositaron en el Centro cultural coreano de microorganismos (KCCM), una autoridad depositaria internacional bajo la Tratado de Budapest, el 2.17.2017, con los números de acceso KCCM11971P, KCCM11972P, KCCM11973P, KCCM11974P, KCCM11975P y KCCM11976P.
1-3. Confirmación de las actividades de los promotores nuevos
Para la confirmación de las actividades de los promotores SPL1, SPL7 y SPL13, las cepas transformadas obtenidas en el ejemplo 1-2 (es decir, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pECCG117, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/CJ4-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL1-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL7-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL13-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/pECCG117, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/CJ4-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/SPL1-GFP, Corynebacterium glutamicum ATCC13869/SPL7-GFP y Corynebacterium glutamicum ATCC13869/SPL13-GFP) se cultivaron mediante el método descrito más abajo y se midieron sus actividades de GFP.
Las cepas transformadas se inocularon en cada matraz que contenía 25 ml de un medio de cultivo (glucosa (20 g), sulfato de amonio ((NH4)2SO4) (5 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4'7H2O (0,5 g), biotina (150 |jg), sal de tiamina HCl (1,5 mg), ácido calcio-pantoténico (3 mg) y nicotinamida (3 mg) (basado en 1 l de agua destilada), pH 7,2) y se cultivaron en una incubadora con agitación a 30 °C durante 20 horas. Las células bacterianas se recuperaron por centrifugación (5000 rpm, 15 min), se lavaron dos veces con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y se suspendieron en el mismo tampón. Se adicionaron perlas de vidrio a la suspensión (1,25 g/1,5 ml) y las células bacterianas se rompieron mediante el uso de un batidor de perlas durante 6 minutos. Luego, el resultante se sometió a centrifugación (15 000 rpm, 20 minutos), se recuperó el sobrenadante y se cuantificaron las concentraciones de proteínas por el método de Bradford. Para una cantidad igual de extractos de células bacterianas, la luz excitada se irradió a 488 nm de acuerdo con un método introducido por Laure Gory y otros. (FEMS Microbiology Letters, 194, 127 - 133, 2001), y la luz emitida a 511 nm se midió mediante el uso del espectrofotómetro LS-50B (Perkin-Elmer), y de ese modo se midió el nivel de expresión del gen GFP (Tabla 1).
Tabla 1:
Figure imgf000009_0001
Como se muestra en la tabla 1 anterior, todos los SPL1, SPL7 y SPL13 mostraron sus actividades promotoras en dos tipos diferentes de Corynebacterium glutamicum y también mostraron una mayor sensibilidad a la fluorescencia que el promotor pcj4, que se sabe que es un promotor fuerte. A partir de estos resultados, se encontró que SPL1, SPL7 y SPL13 son promotores muy potentes que pueden expresar genes diana en Corynebacterium glutamicum. Ejemplo 2. Evaluación de la capacidad de producir productos diana
2-1. Evaluación de la capacidad de producir psicosa
(1) Preparación de los vectores y cepas transformadas para la expresión de ATPE, que incluyen las secuencias de los promotores SPL1 y SPL7
Se prepararon los vectores para las cepas de Corynebacterium con expresión mejorada de ATPE (psicosa epimerasa derivada de Agrobacterium tumefaciens) mediante el uso de SPL1 y SPL7. El marco abierto de lectura (ORF) del gen ATPE se amplificó mediante PCR (30 ciclos de reacciones de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C) mediante el uso del vector pET24-ATPE-2 (SEQ ID NO: 8) como molde junto con los cebadores de SEQ ID NO: 9 y 10. El gen ATPE amplificado y los vectores pSPL1-GFP y pSPL7-GFP para las cepas de Corynebacterium preparadas en el ejemplo 1 se trataron con las enzimas de restricción EcoRVy PstI, y el ATPE-2 obtenido por la PCR se unió operativamente a los mismos mediante el uso del kit de BD In-Fusion y, por tanto, finalmente se prepararon los vectores pSPL1-ATPE-2 y pSPL7-ATPE-2 para las cepas de Corynebacterium.
Los vectores pSPL1-ATPE-2 y pSPL7-ATPE-2 así preparados se introdujeron en la cepa ATCC13032 mediante electroporación y, de este modo, se prepararon las cepas SPL1-ATPE-2 y SPL7-ATPE-2.
(2) Evaluación de la capacidad de producir psicosa por las cepas transformadas
Las cepas preparadas por el procedimiento anterior se cultivaron mediante el uso de medios con la misma composición que en el ejemplo 1 y se midieron sus actividades ATPE. Las cepas ATCC13032/pECCG117 y ATCC13032/CJ4 -ATPE-2 se usaron como grupos de control.
Las cepas se cultivaron durante la noche en un medio LB sólido colocado en una incubadora a 30 °C y el cultivo nocturno de cada cepa se inoculó en 25 ml de medio y se cultivó en una incubadora con agitación a 30 °C durante 24 horas. El cultivo se centrifugó y se eliminó el sobrenadante. Los cuerpos bacterianos recuperados se lavaron con solución de EPPS (pH 8,0), y el sedimento así obtenido se disolvió en solución de EPPS (pH 8,0). Se le adicionó POESA (1 mg/ml), se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora y se centrifugó. Luego, el sedimento resultante obtenido por centrifugación se disolvió en solución de EPPS (pH 8,0) y se le adicionó una solución de fructosa (350 g/l) como sustrato y se hizo reaccionar a 50 °C durante 3 horas, y la reacción se detuvo por tratamiento térmico. Después, se recuperó el sobrenadante por centrifugación y se midió la cantidad de producción de psicosa mediante análisis de HPLC (Figura 1(A), 1(B) y 1(C)). La cantidad de producción de psicosa después de la reacción se indicó en la tabla 2 más abajo.
Tabla 2:
Figure imgf000010_0002
Como se muestra en la tabla 2, se confirmó que las producibilidades de psicosa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL1-ATPE-2 y ATCC13032/SPL7-ATPE- 2 mejoraron en un 321 % y un 258 %, en comparación con Corynebacterium glutamicum ATCC13032/CJ4- ATPE-2, respectivamente. A partir de lo anterior, se confirmó que cuando se usaron los promotores SPL1 y SPL7 de la presente descripción, aumentó la cantidad de expresión del gen que codifica ATPE, lo que confirma que la actividad de ATPE aumentó significativamente.
2-2. Evaluación de la capacidad de producir tagatosa
(1) Preparación de los vectores y cepas transformadas para la expresión de UxaE, que incluye una secuencia promotora de SPL13
Los vectores para las cepas de Corynebacterium se prepararon al clonar el gen de la tagatosa epimerasa (UxaE) derivado de Thermotoga neapolitana mediante el uso de CJ4-GFP, en el que se insertó el GFP y el SPL13-GFP preparado en el ejemplo 1. El marco abierto de lectura abierto (ORF) del gen TN(m) se amplificó mediante PCR (30 ciclos de reacción de 30 segundo a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C) mediante el uso del vector pET28a-TN(m) vector (SEQ ID NO: 11) como molde junto con los cebadores de SEQ iD NO: 12 y 13. El gen TN(m) amplificado y los vectores CJ4-GFP y SPL13-GFP para las cepas de Corynebacterium se trataron con las enzimas de restricción EcoRV y PstI y luego se ligaron y, por lo tanto, finalmente se prepararon los vectores pCJ4-TN(m) y pSPL13-TN(m) para las cepas de Corynebacterium.
Los vectores pCJ4-TN(m) y pSPL13-TN(m) así preparados se introdujeron en la cepa ATCC13032 mediante electroporación y, de este modo, se prepararon las cepas ATCC13032/CJ4-TN(m) y SPL13-TN(m).
(2) Evaluación de la capacidad de producir tagatosa por las cepas transformadas
Las cepas preparadas por el procedimiento anterior se cultivaron y trataron previamente en los mismos medios y condiciones de cultivo descritos en el ejemplo 1 y se adquirieron las cepas para activar UxaE. La evaluación de la actividad se realizó al cambiar solo la cantidad de sustrato, la temperatura de reacción y el tiempo de la misma manera que en el ejemplo 2-1 (haciendo reaccionar a 60 °C durante 2 horas después de adicionar una solución de fructosa (100 g/l)). Después, se recuperó el sobrenadante por centrifugación y se midió la cantidad de producción de tagatosa mediante análisis de HPLC (Figuras 2(A) y 2(B)). La cantidad de producción de tagatosa después de la reacción se indicó en la tabla 3 más abajo.
Tabla 3:
Figure imgf000010_0001
Como se muestra en la tabla 3, la producibilidad de tagatosa de Corynebacterium glutamicum ATCC13032/SPL13-TN(m) mejoró en un 143 % en comparación con Corynebacterium glutamicum ATCC13032/CJ4-TN(m). A partir de lo anterior, se confirmó que cuando se usó el promotor SPL13 de la presente descripción, aumentó la cantidad de expresión del gen que codifica UxaE, lo que confirma que la actividad de UxaE aumentó significativamente.
2-3. Evaluación de la capacidad de producir valina
(1) Preparación del vector pECCG117-SPL7-ilvE y las cepas transformadas que incluyen una secuencia promotora de SPL7
Para confirmar la capacidad de producción de L-valina como ejemplo de L-aminoácidos, se prepararon los vectores pECCG777-CJ7-ilvE y pECCG117-SPL7-ilvE de la siguiente manera, para potenciar la actividad enzimática de ilvE (NCgl2123), que codifica un aminoácido aminotransferasa de cadena ramificada, que es un gen importante para la biosíntesis de valina. Específicamente, como resultado de realizar PCR (30 ciclos de reacción de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C) mediante el uso del cromosoma ATCC14067 como molde junto con los cebadores de SEQ ID NO: 14 y 15, se amplificó un fragmento de PCR con un tamaño de aproximadamente 1104 pb, que tiene un sitio de restricción EcoRV en el extremo 5' y un sitio de restricción PstI en el extremo 3' del gen NCgl2123. El fragmento de PCR así obtenido se purificó y se mezcló con pECCG117-CJ7-GFP (patente coreana núm. 10-0620092) y pECCG117-SPL7-GFP, que se trataron con las enzimas de restricción EcoRV y PstI, respectivamente, y los vectores se prepararon con el kit de clonación In-fusion. Los vectores así preparados se denominaron pECCG117-CJ7-ilvE y pECcG117-SPL7-ilvE, respectivamente.
SEC ID NO: 145' GAGATCAAAACAGATATCATGACGTCATTAGAGTTC 3'
SEC ID NO: 155' ATCCCCCGGGCTGCAGTTAGCCAACCAGTGGGTA 3'
Los vectores recombinantes de pECCG117-CJ7-ilvE y pECCG117-SPL7-ilvE, así preparados, y el vector pECCG117 se transformaron en una cepa productora de valina, Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (Patente coreana núm. 10-1117022), por un método de pulso eléctrico, y las cepas transformadas se obtuvieron en una placa de LB agar que contenía kanamicina (25 mg/l). Las cepas así obtenidas se denominaron KCCM11201P/pECCG117, KCCM11201PCJ7-ilvE y KCCM11201P/SPL7-ilvE, respectivamente.
(2) Evaluación de la capacidad de producir valina por las cepas transformadas
La capacidad de producir L-valina por los 3 tipos diferentes de cepas transformadas se analizó mediante cultivo como se describe más abajo.
Cada una de las cepas en una cantidad de un bucle de platino se inoculó en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 25 ml de un medio de producción y se cultivó en una incubadora con agitación (200 rpm) a 30 °C durante 72 horas. Al finalizar el cultivo, se analizó la concentración de L-valina en cada cultivo mediante HPLC (SHIMADZU LC-20AD).
<Medio de producción (pH 7,2)>
Glucosa (50 g), (NH4)2SO4 (20 g), sólidos macerados de maíz (20 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (200 |jg) (basado en 1 l de agua destilada)
El cultivo y el análisis anterior se realizaron repetidamente, y las concentraciones de L-valina analizadas se muestran en la tabla 4 más abajo.
Tabla 4:
Figure imgf000011_0001
Como se muestra en la tabla 4, se confirmó que la capacidad de producir valina por la cepa KCCM11201P/SPL7-ilvE, donde se introduce el promotor de la presente descripción, mejoró en un 21,8 % en comparación con la de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P/CJ7-ilvE, donde se introduce un promotor conocido, y adicionalmente, se mejoró en un 39,2 % respecto al del grupo control, KCCM11201P /pECCG117. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que el promotor SPL7 aumentó la expresión del gen ilvE incrementando así significativamente la actividad de la enzima codificada por el gen correspondiente.
2-4. Evaluación de la capacidad de producir lisina
(1) Preparación del vector pDZTn-SPL13-gapN1 y las cepas transformadas que incluyen una secuencia promotora de SPL13
Para confirmar la capacidad de producción de L-lisina como ejemplo representativo de L-aminoácidos, se prepararon los vectores de la siguiente manera para mejorar la actividad enzimática de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GapN) dependiente de NADP, que se deriva de los mutantes conocidos de Streptococcus.
Para la inserción en un gen transponible NCgl2392 en un microorganismo del género Corynebacterium, se realizó PCR (30 ciclos de reacción de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C) mediante el uso del cromosoma de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 de tipo salvaje como molde, junto con los siguientes cebadores de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 y SEQ ID NO: 19, basados en el NIH Genbank del NIH (EE. UU.), y como resultado se amplificaron fragmentos que incluyen el extremo 5' y el extremo 3' del gen NCgl2392. Como resultado de realizar PCR (30 ciclos de reacción de 30 segundos a 94 °C, 30 s a 55 °C y 2 minutos a 72 °C) mediante el uso del vector pEcCG122-Pcj7-gapN1 (Patente coreana núm. 10-1182033) junto con los siguientes cebadores de SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, se amplificó Pcj7-gapN1. Como resultado de realizar PCR (30 ciclos de reacción de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C) mediante el uso del vector pECCG122-Pcj7-gapN1 y el vector SPL13-GFP preparados en el ejemplo 1, junto con los siguientes cebadores de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 y SEQ ID NO: 21, se amplificaron los genes SPL13 y gapN, respectivamente, y estos genes se clonaron en el vector pDZ (Patente coreana núm. 0924065), que no es replicable en Corynebacterium glutamicum, junto con los fragmentos del gen NCgl2392 preparados anteriormente y, por lo tanto, se prepararon los vectores pDZTn-Pcj7-gapN1 y pDZTn-SPL13-gapN1.
SEQ ID NO: 165' ATCCTCTAGAGTCGACCAAATGCTCCAACCGTCCGT 3'
SEQ ID NO: 175' CTCGAGGAACTCATTCCTTCTGCTCG 3'
SEQ ID NO: 185' TCTAGAACTAGTGGGCCCGACATCTAATAACCGGGCAG 3'
SEQ ID NO: 195' ATGCCTGCAGGTCGACGCAGACGCACTCGACTACAC 3'
SEQ ID NO: 205' GAATGAGTTCCTCGAGAGAAACATCCCAGCGCTACT 3'
SEQ ID NO: 21 5' GCCCACTAGTTCTAGATTATTTGATATCAAATACGA 3'
SEQ ID NO: 225' GAATGAGTTCCTCGAGGGCGCTTCATGTCAACAATC 3'
SEQ ID NO: 235' ATTGTTTTGTCATATGTGTTTTGATCTCCTCCAATA 3'
SEQ ID NO: 245' CATATGACAAAACAATATAAAAA 3'
Cada uno de los vectores anteriores (pDZTn-Pcj7-gapN1 y pDZTn-SPL13-gapN1) se transformó mediante el uso de la cepa KCCM11016P con mayor capacidad para producir lisina (el microorganismo se describió como KFCC10881, se volvió a depositar en una autoridad de depósito internacional en virtud del tratado de Budapest, y se le asignó un número de acceso de KCCM11016P, Patente coreana núm. 10-0159812) como cepa parental, por el método de pulso eléctrico (Appl. Microbiol. Biotecnología. (1999) 52: 541 - 545), y las cepas transformadas se obtuvieron en un medio selectivo que contenía 25 mg/l de kanamicina. Para seleccionar las colonias en las que se insertó el gen gapN1 en el genoma mediante un proceso de recombinación secundaria (crossover), aquellas colonias en las que se insertaron los genes Pcj7-gapN1 y SPL13-gapN1, respectivamente, se obtuvieron mediante el uso de los pares de cebadores de SEQ ID NO: 20 y 21 y SeQ ID nO: 21 y 22. Las colonias así obtenidas se denominaron KCCM11016P/CJ7-gapN1 y KCCM11016P/SPL13-gapN1, respectivamente.
(2) Evaluación de la capacidad de producir lisina por las cepas transformadas
La capacidad de producir L-lisina por los 3 tipos diferentes de cepas transformadas se analizó mediante cultivo como se describe más abajo.
Cada una de las cepas se inoculó en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 25 ml de un medio de cultivo y se cultivó en una incubadora con agitación (200 rpm) a 30 °C durante 20 horas. A continuación, se inoculó 1 ml del cultivo para siembra en un matraz con deflector de esquina de 250 ml que contenía 24 ml del medio de producción y se cultivó en una incubadora con agitación (200 rpm), a 30 °C durante 72 horas. La concentración de L-lisina en cada cultivo se analizó por HPLC (SHIMADZU, LC-20AD).
<Medio de siembra (pH 7,0)>
Glucosa (20 g), peptona (10 g), extracto de levadura (5 g), urea (1,5 g), KH2PO4 (4 g), K2HPO4 (8 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (100 |jg), tiamina HCl (1000 |jg), ácido calcio-pantoténico (2000 |jg), nicotinamida (2000 |jg) (basado en 1 l de agua destilada) < Medio de producción (pH 7,0)>
Glucosa (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos macerados de maíz (5 g), urea (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4-7H2O (0,5 g), biotina (100 jg), sal de tiamina HCl (1000 jg), ácido calcio-pantoténico (2000 jg), nicotinamida (3000 jig y CaCO3 (30 g) (basado en 1 l de agua destilada)
El cultivo y el análisis anteriores se realizaron repetidamente, y las concentraciones de L-lisina analizadas se muestran en la tabla 5 más abajo.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ácido nucleico que tiene una actividad promotora que consiste en cualquier secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1 a 3.
2. Un casete de expresión génica que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 y un gen diana.
3. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o el casete de expresión génica de la reivindicación 2.
4. Un microorganismo recombinante del género Corynebacterium que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o el vector de la reivindicación 3.
5. El microorganismo recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum o Corynebacterium ammoniagenes.
6. Un método para producir un producto diana, que comprende:
(a) cultivar el microorganismo recombinante de la reivindicación 4 en un medio; y
(b) recuperar un producto diana del microorganismo o del medio.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el producto diana es psicosa, tagatosa o un aminoácido.
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Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101968317B1 (ko) 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
KR102003911B1 (ko) 2018-02-23 2019-07-25 씨제이제일제당 주식회사 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법
KR102035844B1 (ko) * 2018-02-23 2019-10-23 씨제이제일제당 주식회사 L-트립토판을 생산하는 재조합 코리네형 미생물 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
KR102016050B1 (ko) * 2018-03-20 2019-08-29 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 이의 용도
KR101947959B1 (ko) 2018-05-28 2019-02-13 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
CN109097361B (zh) * 2018-08-28 2020-02-14 江南大学 启动子、其载体及其应用
KR102112240B1 (ko) 2018-09-28 2020-05-18 씨제이제일제당 주식회사 알파-글루코시다제의 활성이 강화된 l-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법
KR101996769B1 (ko) 2018-12-21 2019-10-01 씨제이제일제당 (주) 변이형 호모세린 디하이드로게나제 및 이를 이용한 호모세린 또는 호모세린 유래 l-아미노산의 생산 방법
KR102204917B1 (ko) 2019-04-22 2021-01-20 씨제이제일제당 주식회사 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법
KR102221040B1 (ko) 2019-05-09 2021-03-03 씨제이제일제당 주식회사 L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법
KR102472558B1 (ko) 2019-06-28 2022-12-01 씨제이제일제당 주식회사 황 함유 아미노산 또는 그 유도체 제조방법
KR102472559B1 (ko) 2019-06-28 2022-12-01 씨제이제일제당 주식회사 황 함유 아미노산 또는 그 유도체의 제조방법
KR102153534B1 (ko) * 2019-09-02 2020-09-09 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 이를 이용한 아미노산 생산 방법
KR102183209B1 (ko) 2019-09-09 2020-11-26 씨제이제일제당 주식회사 L-쓰레오닌 배출 단백질의 변이체 및 이를 이용한 l-쓰레오닌 생산 방법
KR102377500B1 (ko) 2019-10-28 2022-03-23 씨제이제일제당 주식회사 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 도입된 L-메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산방법
KR102147381B1 (ko) 2019-11-22 2020-08-24 씨제이제일제당 주식회사 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물
KR102316445B1 (ko) 2019-11-29 2021-10-26 씨제이제일제당 주식회사 신규 세린 프로테아제 변이체
KR102143964B1 (ko) 2019-12-06 2020-08-12 씨제이제일제당 주식회사 신규한 분지쇄 아미노산 아미노트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 류신 생산방법
KR102182497B1 (ko) 2019-12-20 2020-11-24 씨제이제일제당 주식회사 내막 단백질의 변이체 및 이를 이용한 목적 산물 생산 방법
KR102399441B1 (ko) 2020-01-20 2022-05-18 씨제이제일제당 주식회사 타가토스 생산용 조성물 및 이를 이용한 타가토스 제조 방법
KR102207867B1 (ko) * 2020-01-21 2021-01-26 씨제이제일제당 주식회사 Nadp 의존적 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제를 포함하는 미생물을 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR102198072B1 (ko) 2020-03-04 2021-01-04 씨제이제일제당 주식회사 글루타민 신테타아제 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-글루타민 생산 방법
KR102311391B1 (ko) 2020-05-21 2021-10-12 씨제이제일제당 주식회사 L- 분지쇄 아미노산 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용하여 l-분지쇄 아미노산을 생산하는 방법
KR102647745B1 (ko) 2020-05-27 2024-03-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법
KR102246288B1 (ko) 2020-08-13 2021-04-29 씨제이제일제당 주식회사 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR102344689B1 (ko) 2020-09-01 2021-12-29 씨제이제일제당 주식회사 L-발린 생산 미생물 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102414743B1 (ko) 2020-09-09 2022-06-29 씨제이제일제당 주식회사 신규 o-포스포세린 배출 단백질 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산 방법
CA3191344A1 (en) 2020-09-09 2022-03-17 Nara Kwon A recombinant microorganism for producing l-glutamic acid and a method for producing l-glutamic acid using the same
AU2021384593A1 (en) 2020-11-20 2023-06-08 Cj Cheiljedang Corporation Microorganism having enhanced l-glutamine producing ability, and l-glutamine producing method using same
KR102464883B1 (ko) 2020-12-11 2022-11-09 씨제이제일제당 주식회사 신규한 감마-아미노부티르산 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
KR102470602B1 (ko) 2020-12-11 2022-11-25 씨제이제일제당 주식회사 신규한 분지 연쇄 아미노산 아미노트렌스퍼라아제 변이체 및 이를 이용한 이소류신 생산 방법
KR102261851B1 (ko) 2021-01-15 2021-06-04 씨제이제일제당 (주) 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102254209B1 (ko) 2021-01-15 2021-05-18 씨제이제일제당 (주) 신규한 dna 중합효소 ⅲ 감마 및 타우 서브유닛 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102259337B1 (ko) 2021-01-15 2021-06-01 씨제이제일제당 주식회사 신규한 포스포노아세테이트 하이드롤라제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102254631B1 (ko) 2021-01-15 2021-05-21 씨제이제일제당 주식회사 신규한 펩타이드 메티오닌 설폭사이드 환원효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
KR102257841B1 (ko) 2021-01-15 2021-05-28 씨제이제일제당 주식회사 신규한 피토엔 신타제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102284728B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 H(+)/Cl(-) 익스체인지 트랜스포터 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
KR102287112B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-06 씨제이제일제당 주식회사 신규한 쿠퍼익스포팅 P-type 에이티피에이즈 A 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
KR102284725B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 페로체라테이즈 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
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KR102287114B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-06 씨제이제일제당 주식회사 신규한 사이토신 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102287111B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-06 씨제이제일제당 주식회사 신규한 데옥시구아노신트리포스페이트 트리포스포하이드로레이즈 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102284727B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 단백질 HtrL 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
KR102284726B1 (ko) 2021-01-25 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 타우토머레이즈 pptA 변이체 및 이를 이용한 L-트립토판 생산 방법
KR102281364B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 우레아제 부속 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281366B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 테트라하이드로디피콜리네이트 n-숙시닐트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102495918B1 (ko) 2021-01-26 2023-02-06 씨제이제일제당 주식회사 aroG 알돌라아제 (Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
KR102281365B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 프롤린 탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281362B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 스퍼미딘 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281363B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 시스테인 설피네이트 디설피나제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281360B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 atp 포스포리보실트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281359B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281361B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 아스파라긴 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281367B1 (ko) 2021-01-26 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102277404B1 (ko) 2021-01-27 2021-07-14 씨제이제일제당 주식회사 신규한 갈락토사이드 o-아세틸트랜스퍼라제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102277403B1 (ko) 2021-01-27 2021-07-14 씨제이제일제당 주식회사 신규한 리보뉴클레아제 p 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102254635B1 (ko) 2021-01-27 2021-05-21 씨제이제일제당 주식회사 신규한 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
KR102281368B1 (ko) 2021-01-28 2021-07-23 씨제이제일제당 (주) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102291553B1 (ko) 2021-01-29 2021-08-18 씨제이제일제당 (주) 신규한 프리모솜 조립 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102314883B1 (ko) 2021-01-29 2021-10-19 씨제이제일제당 (주) 신규한 Co/Zn/Cd 유출 시스템 컴포넌트 변이체 및 이를 이용한 L-라이신 생산 방법
KR102258159B1 (ko) 2021-01-29 2021-05-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 말레이트 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102344057B1 (ko) 2021-01-29 2021-12-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102284729B1 (ko) 2021-01-29 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 시아네이트 트랜스포터 패밀리 단백질변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102527096B1 (ko) 2021-02-01 2023-04-28 씨제이제일제당 주식회사 프리페네이트 탈수 효소 (Prephenate dehydratase) 변이체 및 이를 이용한 분지쇄 아미노산 생산 방법
KR102527102B1 (ko) 2021-03-05 2023-04-28 씨제이제일제당 주식회사 이소프로필말레이트 신타제 변이체 및 이를 이용한 l-류신의 생산 방법
KR102649245B1 (ko) 2021-03-08 2024-03-21 씨제이제일제당 주식회사 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산방법
KR102525074B1 (ko) 2021-03-10 2023-04-24 씨제이제일제당 주식회사 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 o-아세틸-l-호모세린 또는 l-메티오닌 생산 방법
KR102613549B1 (ko) 2021-03-12 2023-12-13 씨제이제일제당 주식회사 신규 세린 프로테아제 변이체
KR102306008B1 (ko) 2021-04-07 2021-09-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 전사 조절자 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102306010B1 (ko) 2021-04-07 2021-09-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 분지쇄아미노산 투과효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281369B1 (ko) 2021-04-07 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 디히드로리포일 아세틸기전이효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102281371B1 (ko) 2021-04-07 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102306007B1 (ko) 2021-04-07 2021-09-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 슈가 포터 계열 mfs 트랜스포터 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR102306009B1 (ko) 2021-04-07 2021-09-27 씨제이제일제당 (주) 신규한 WhiB 계열 전사 조절자 WhcA 변이체 및 이를 이용한 L-발린 생산 방법
KR102281370B1 (ko) 2021-04-07 2021-07-22 씨제이제일제당 (주) 신규한 2-이소프로필말레이트합성효소 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR20220139085A (ko) 2021-04-07 2022-10-14 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
KR102314885B1 (ko) 2021-04-12 2021-10-18 씨제이제일제당 (주) 신규한 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102314884B1 (ko) 2021-04-12 2021-10-18 씨제이제일제당 (주) 신규한 세포분해 막단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102303747B1 (ko) 2021-04-12 2021-09-16 씨제이제일제당 (주) 신규한 주요 촉진제 수퍼패밀리 퍼미에이즈 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102338875B1 (ko) 2021-04-12 2021-12-10 씨제이제일제당 (주) 신규한 당 인산염 이성질화효소/에피머레이즈 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
KR102273639B1 (ko) 2021-04-20 2021-07-06 씨제이제일제당 주식회사 신규한 이중기능성 메틸렌테트라히드로폴레이트 탈수소효소/메테닐테트라하이드로폴레이트 사이클로하이드롤라아제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
KR102284730B1 (ko) 2021-04-28 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 수용성 피리딘 뉴클레오티드 트랜스수소효소 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102284731B1 (ko) 2021-04-28 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아이소시트르산 디하이드로게네이즈 키나아제/포스파타제 효소 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판 생산 방법
KR102277410B1 (ko) 2021-04-29 2021-07-14 씨제이제일제당 주식회사 신규한 이중기능성 pyr 오페론 전사조절자/우라실 포스포리보실 전달 효소 변이체 및 이를 이용한 IMP 생산 방법
KR102279137B1 (ko) 2021-04-29 2021-07-19 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아데닌 포스포리보실기 전이효소 변이체 및 이를 이용한 imp 생산 방법
EP4105332A4 (en) * 2021-05-07 2022-12-28 CJ Cheiljedang Corporation NOVEL PROMOTER AND USE THEREOF
KR20220157144A (ko) 2021-05-20 2022-11-29 씨제이제일제당 (주) 신규 프로모터 및 이의 용도
KR102634303B1 (ko) 2021-05-21 2024-02-06 씨제이제일제당 주식회사 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
KR20220168151A (ko) 2021-06-14 2022-12-22 연세대학교 산학협력단 활성이 증가된 변이체 선별을 위한 방법
KR20220163754A (ko) 2021-06-03 2022-12-12 씨제이제일제당 (주) 신규한 YhhS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
KR102600520B1 (ko) 2021-06-09 2023-11-09 씨제이제일제당 주식회사 제라닐제라닐 피로포스페이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 테트라테르펜, 이의 전구체, 및 테트라테르펜을 전구체로 하는 물질의 생산방법
KR20220166947A (ko) 2021-06-11 2022-12-20 씨제이제일제당 (주) 신규한 MdtH 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
WO2022270991A1 (ko) 2021-06-25 2022-12-29 씨제이제일제당 (주) 신규한 폴리-4-하이드록시부티레이트 및 1,4-부탄다이올 생산방법
WO2023277307A1 (ko) 2021-06-30 2023-01-05 씨제이제일제당 (주) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
KR102611977B1 (ko) 2021-07-15 2023-12-08 씨제이제일제당 주식회사 신규한 베타-카로틴 15,15 -옥시게네이즈 변이체 및 이를 이용한 레티노이드 생산방법
KR20230016505A (ko) 2021-07-26 2023-02-02 씨제이제일제당 (주) LacI 계열 DNA 결합 전사 조절자의 활성이 약화된 미생물 및 이를 이용한 L-글루탐산의 생산방법
KR102619598B1 (ko) 2021-08-23 2023-12-29 씨제이제일제당 주식회사 신규한 아세토하이드록시산 신타아제 소단위체 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
KR20230031624A (ko) 2021-08-27 2023-03-07 씨제이제일제당 (주) 신규한 초산 대사 조절자 a 변이체 및 이를 이용한 l-분지쇄 아미노산 생산 방법
KR102419166B1 (ko) 2021-09-23 2022-07-08 씨제이제일제당 주식회사 신규한 글루타민 가수분해 gmp 합성효소 변이체 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
KR20230042953A (ko) 2021-09-23 2023-03-30 씨제이제일제당 (주) 고농도 l-글루탐산을 생산하기 위한 균주 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산방법
KR20230045990A (ko) 2021-09-29 2023-04-05 씨제이제일제당 (주) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
KR20230045989A (ko) 2021-09-29 2023-04-05 씨제이제일제당 (주) 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법
KR20230054183A (ko) 2021-10-15 2023-04-24 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
KR20230059451A (ko) 2021-10-26 2023-05-03 씨제이제일제당 (주) LysE 변이체 및 이를 이용한 L-아르기닌 생산방법
JP2024505616A (ja) * 2021-12-29 2024-02-07 テサン・コーポレイション 常時発現用新規プロモーター変異体およびその用途

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR920007401B1 (ko) 1990-06-21 1992-08-31 제일제당 주식회사 다발성 절단부위를 지닌 대장균과 코리네형 세균에서 발현 가능한 신규 셔틀벡터
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
DE19548222A1 (de) * 1995-12-22 1997-06-26 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
EP3170889A1 (en) 2006-09-15 2017-05-24 CJ Cheiljedang Corporation A corynebacteria having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
KR100930203B1 (ko) * 2008-01-28 2009-12-07 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR100987281B1 (ko) * 2008-01-31 2010-10-12 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
CN101698844B (zh) * 2009-06-29 2012-01-04 中国科学院微生物研究所 一种来源于谷氨酸棒杆菌的启动子及其应用
KR101182033B1 (ko) 2009-07-08 2012-09-11 씨제이제일제당 (주) 외래종 유래의 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로지나제의 활성을 획득한 코리네박테리움 속의 ｌ-라이신 생산방법
KR101226384B1 (ko) * 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR101117022B1 (ko) 2011-08-16 2012-03-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ-발린 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-발린 제조방법
KR101335853B1 (ko) * 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
KR20140066553A (ko) * 2012-11-23 2014-06-02 삼성전자주식회사 코리네박테리움 속 균주의 신규 프로모터
KR101481142B1 (ko) * 2013-03-04 2015-01-15 한국과학기술원 코리네박테리아 발현용 합성프로모터
KR20140140215A (ko) * 2013-05-28 2014-12-09 경상대학교산학협력단 사이코스 3-에피머라제 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 및 이를 이용한 사이코스의 생산 방법
MX2015016535A (es) 2013-06-05 2016-04-13 Cj Cheiljedang Corp Metodo de produccion para tagatosa.
KR101504900B1 (ko) * 2013-06-27 2015-03-23 백광산업 주식회사 트랜스케톨라아제 유전자 프로모터 변이체 및 이의 용도
US10266862B2 (en) * 2014-11-06 2019-04-23 Industry-Academic Cooperation Foundation Gyeongsang National University Method for preparing psicose
CN104611249B (zh) * 2014-11-17 2019-06-11 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种利用醛缩酶全细胞合成d-阿洛酮糖的方法
KR101632642B1 (ko) 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도

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