KR20230045989A - 신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 - Google Patents

신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 l-이소류신 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 L-이소류신 생산능을 향상시키는 신규한 아세토하이드록시산 신테아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS) 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-이소류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 아세토하이드록시산 신테아제 변이체 및 이를 이용한 L-이소류신 생산방법{Novel Acetohydroxy acid synthase variant and method of producing L-isoleucine using the same}
본 출원은 L-이소류신 생산능을 향상시키는 신규한 아세토하이드록시산 신테아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS) 변이체, 이를 포함하는 미생물, 및 상기 미생물을 이용하여 L-이소류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
L-이소류신은 총 20가지의 아미노산 중 분지쇄 아미노산(branched-chain amino acid)의 한 종류로서, 필수아미노산으로 분류되어 동물 사료, 식품 첨가물 및 의약 분야에 사용된다. L-이소류신은 대사 후 에너지 생성, 헤모글로빈 생성, 혈당 조절, 근육 생성 및 보수 등의 기능을 하기 때문에 수액제, 영양제, 스포츠 영양제뿐만 아니라 동물 사료 분야에서도 사용이 증가되고 있다.
이러한 경향에 기반하여, L-아미노산 생산을 위해 다양한 미생물 및 이의 변이체가 사용되는데(미국 등록특허 제10113190호), 이런 경우에도 L-이소류신을 제외한 부산물이 다수 생성되며, 이는 정제 단계에서 L-이소류신의 순도에 영향을 많이 미치는 물질이므로, 부산물을 제거할 수 있는 방법이 필요하다. 관련하여, L-이소류신의 순도를 높이기 위해 개발된 L-이소류신 정제방법 등은 별도의 추가적인 정제 과정 요구되는 단점이 있어(미국 등록특허 제6072083호), L-이소류신의 순도를 증가시키는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 17번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아세토하이드록시산 신타아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS) 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는, 코리네박테리움 속 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 출원이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 출원의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 17번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아세토하이드록시산 신타아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS) 변이체를 제공한다.
일 구현예로, 상기 다른 아미노산은 알라닌일 수 있다.
본 출원의 변이체는 상기 모서열인 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 기준으로 17번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 알라닌으로 치환되고, 상기 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.7% 이상 및 100% 미만의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서, “모서열(parent sequence)”이란 변형(modification)를 도입하여 변이형 폴리펩티드가 되는 기준 서열을 의미한다. 즉, 모서열은 시작 서열(starting sequence)로서 치환, 삽입 및/또는 결실 등의 변이를 도입하는 대상일 수 있다. 상기 모서열은 천연형(naturally occurring) 혹은 야생형(wild type)일 수 있고, 또는 상기 천연형 또는 야생형에 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실이 발생한 변이체(variant)이거나, 또는 인위적으로 합성된 서열일 수 있다.
본 출원에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원의 변이체는 아세토하이드록시산 신타아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS) 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 아세토하이드록시산 신타아제 활성을 갖는 야생형 폴리펩티드에 비해 L-이소류신 생산능이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "아세토하이드록시산 신타아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS)"는 L-발린 생합성에서 첫 번째 효소로서, 아세토락테이트 산타아제로도 명명된다. 아세토하이드록시산 신타아제는 피루브산(pyruvate)의 디카르복실화(decarboyxlation)와 다른 피루브산 분자와의 축합 반응을 촉매하여 발린의 전구체인 아세토락테이트를 생산하거나 피루브산의 디카르복실화와 2-케토부티레이트(2-ketobutyrate)와의 축합 반응을 촉매하여 이소류신의 전구체인 아세토히드록시부티레이트를 생산할 수 있다.
상기 아세토하이드록시산 신타아제는 ilvB 및 ilvN, 두 유전자에 의하여 코딩되며, ilvB 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제의 큰 소단위체(large subunit)를, ilvN 유전자는 아세토하이드록시산 신타아제의 작은 소단위체(small subunit)를 각각 코딩한다. 이 중 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 작은 소단위체가 피드백 저해에 중요하게 관여한다고 여겨진다. 상기 "피드백 저해"는 효소계의 종산물이 그 효소계의 초기 단계에 있는 반응을 저해하는 것을 의미한다. 본 출원의 목적상, 아세토하이드록시산 신타아제는 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 아세토하이드록시산 신타아제일 수 있다.
상기 ilvN 유전자에 의해 코딩되는 아세토하이드록시산 신타아제는 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있고, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원의 변이체는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 기준으로 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 47번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 또는 이들의 조합; 중 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 42번째 위치에 상응하는 아미노산은 발린으로 치환되는 것일 수 있다.
다른 일 구현예로, 상기 47번째 위치에 상응하는 아미노산은 류신으로 치환되는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
구체적으로, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 기준으로 하여, 상기 서열번호 3은 17번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 알라닌으로 치환된 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열번호 4는 17번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 알라닌으로 치환되고, 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환된 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열번호 5는 17번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 알라닌으로 치환되고, 47번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환된 아미노산 서열일 수 있고, 상기 서열번호 6은 17번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파라긴이 알라닌으로 치환되고, 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 발린으로 치환되고, 47번째 위치에 상응하는 아미노산이 류신으로 치환된 아미노산 서열일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23 또는 서열번호 24 또는 서열번호 25 또는 서열번호 26의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23 또는 서열번호 24 또는 서열번호 25 또는 서열번호 26의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 6% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1의 17번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 알라닌을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 42번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 발린을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 47번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 류산을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 6% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다. 상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네박테리움 속 균주(the genus Corynebacterium) 균주를 제공하는 것이다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 균주는 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 균주; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 균주; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 균주 (예컨대, 재조합 균주); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 균주 (예컨대, 재조합 균주)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 균주는 L-이소류신 생산능을 가진 균주일 수 있다.
본 출원의 균주는 자연적으로 아세토하이드록시산 신타아제 또는 L-이소류신 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 아세토하이드록시산 신타아제 또는 L-이소류신 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 L-이소류신 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 L-이소류신을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 L-이소류신을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 아세토하이드록시산 신타아제 변이체가 발현되어, L-이소류신 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 L-이소류신 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 아세토하이드록시산 신타아제 비변형 미생물 (즉, 야생형 아세토하이드록시산 신타아제(서열번호 1)를 발현하는 미생물 또는 변이형(서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 6) 단백질을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 L-이소류신 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 L-이소류신 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 아세토하이드록시산 신타아제 비변형 미생물은 hom(R407H) 및 ilvA(T381A, F383A) 변이를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주(CA10-3101, KCCM12739P) 또는 NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산 균주인 KCJI-38 균주(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 L-이소류신 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 32% 이상, 약 34% 이상, 약 35% 이상, 약 39% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 46% 이상, 약 47% 이상, 약 50% 이상, 약 53% 이상, 약 54% 이상, 약 55% 이상, 약 57% 이상, 약 59% 이상, 약 60% 이상, 약 62% 이상, 약 63% 이상, 약 64% 이상 또는 약 73% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 200% 이하, 약 150% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하 또는 약 15% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, L-이소류신 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.02배 이상, 약 1.05배 이상, 약 1.10배 이상, 약 1.15배 이상, 약 1.20배 이상, 약 1.25배 이상, 약 1.30배 이상, 약 1.32배 이상, 약 1.34배 이상, 약 1.35배 이상, 약 1.39배 이상, 약 1.40배 이상, 약 1.45배 이상, 약 1.46배 이상, 약 1.47배 이상, 약 1.50배 이상, 약 1.53배 이상, 약 1.54배 이상, 약 1.55배 이상, 약 1.57배 이상, 약 1.59배 이상, 약 1.60배 이상, 약 1.62배 이상, 약 1.63배 이상, 약 1.64배 이상 또는 약 1.73배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 아세토하이드록시산 신타아제 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 “내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역을 활성이 강력한 서열로 교체;
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 cj1 내지 cj7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드 및 L-이소류신 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산방법을 제공한다.
본 출원의 L-이소류신 생산방법은 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 벡터를 포함하는 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 본 출원의 코리네박테리움 속 균주를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및/또는 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 코리네박테리움 속 균주를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 코리네박테리움 속 균주의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 코리네박테리움 속 균주를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 출원의 코리네박테리움 속 균주의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 L-이소류신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 L-이소류신 생산 방법은, 본 출원의 코리네박테리움 속 균주를 준비하는 단계, 상기 균주를 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 L-이소류신 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 코리네박테리움 속 균주로부터 L-이소류신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 L-이소류신을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-이소류신을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 L-이소류신 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 L-이소류신 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 균주 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 균주; 이를 배양한 배지; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 L-이소류신 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 아미노산 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, 변이체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 균주, 배지 및 L-이소류신 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원에서 아세토하이드록시산 신타아제 변이를 발현하는 미생물은 이를 발현하지 않는 균주에 비해 L-이소류신 셍산을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 이를 이용하여 L-이소류신을 효과적으로 생산할 수 있다. 이에 L-이소류신을 활용하는 식품, 사료, 및 의약 등 광범위한 산업적 활용을 기대할 수 있다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: L-이소류신 생산 균주 제작
야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 L-이소류신을 생산하는 능력은 있으나, 과량 생산하지는 않는다. 이에, L-이소류신 생산능을 증가시키는 유전 형질을 확인하기 위하여, L-이소류신 생산능이 야생형에 비해 증가된 균주를 제작하였다.
먼저, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 L-이소류신 생합성 경로에서 이소류신의 전구체인 쓰레오닌의 피드백 저해 해소를 위해, 호모세린 디하이드로게나제(homoserine dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 hom를 변이하여, 호모세린 디하이드로게나제의 407번째 아미노산인 아르기닌을 히스티딘으로 치환하였다(대한민국 등록특허 제10-1996769호).
구체적으로, hom(R407H) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머 쌍 또는 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
14 primer 1 TCGAGCTCGGTACCCCGCTTTTGCACTCATCGAGC
15 primer 2 CACGATCAGATGTGCATCATCAT
16 primer 3 ATGATGATGCACATCTGATCGTG
17 primer 4 CTCTAGAGGATCCCCGAGCATCTTCCAAAACCTTG
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 중합반응 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하여 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1000 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 1000 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 14 및 서열번호 17의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃ 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 407번째 아르기닌이 히스티딘으로 치환된 호모세린 디하이드로게나제 변이체를 코딩하는 hom 유전자의 변이를 포함하는 2 kb의 DNA 단편(서열번호 13)이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트(PCR Purification kit, QUIAGEN)를 사용하여 정제하고 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다.
정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터(한국공개특허 제10-2020-0136813호)와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 인퓨전 클로닝 키트(Infusion Cloning Kit, TaKaRa)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 hom(R407H) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-R407H를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 hom(R407H) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)로 명명하였다.
제작한 ATCC13032 hom(R407H) 균주에 L-이소류신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시키기 위해, L-쓰레오닌 디하이드라타아제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자인 ilvA를 변이하여, L-쓰레오닌 디하이드라타아제의 381번째 아미노산인 쓰레오닌을 알라닌으로 치환 및 383번째 아미노산인 페닐알라닌을 알라닌으로 치환하였다.
구체적으로, 상기 ilvA(T381A, F383A) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터를 제작하기 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 19 및 서열번호 20의 프라이머 쌍 또는 서열번호 21 및 서열번호 22의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 각각 수행하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
19 primer 5 TCGAGCTCGGTACCCATGAGTGAAACATACGTGTC
20 primer 6 GCGCTTGAGGTACTCtgcCAGCGcGATGTCATCATCCGG
21 primer 7 CCGGATGATGACATCgCGCTGgcaGAGTACCTCAAGCGC
22 primer 8 CTCTAGAGGATCCCCCGTCACCGACACCTCCACA
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 변성; 및 72℃ 1분 중합반응이며, 이러한 조건의 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하여 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 1126 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 286 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 19 및 서열번호 22의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건으로 95℃에서 5분간 변성 이후, 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 2분 중합을 28회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
그 결과, 381번째 쓰레오닌이 알라닌으로 및 383번째 페닐알라닌이 알라닌으로 치환된 L-쓰레오닌 디하이드라타아제 변이체를 코딩하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1.4 kb의 DNA 단편(서열번호 18)이 증폭되었다. 증폭 산물을 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 다카라(TaKaRa)의 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 ilvA(T381A, F383A) 변이를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-ilvA(T381A, F383A)를 제작하였다.
제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 hom(R407H)에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 ilvA(T381A, F383A) 변이를 포함하는 균주를 얻었으며, 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101이라 명명하였다.
상기 균주 CA10-3101은 2020년 5월 27일자로 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 국제기탁하여 KCCM12739P로 기탁번호를 부여받았다.
다음으로, 상기 ilvA(T381A, F383A) 변이를 L-이소류신 생산 균주에 도입하는 경우 L-이소류신에 대한 피드백 해제와 활성을 증가시켜 실제로 L-이소류신 생산능을 증가시키는지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산 균주인 KCJI-38 균주(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호)에 상기 ilvA(T381A, F383A) 변이를 전기펄스법으로 도입하여 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 균주를 제작하였다. 그 다음, 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다.
이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 생산하였다. 상기 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10 ㎎/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도 및 L-쓰레오닌 농도를 측정한 후 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
균주명 L-이소류신(g/L) L-쓰레오닌(g/L)
KCCM11248P(모균주) 1.5 0.5
KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 4.0 0.0
상기 표 3에 나타난 바와 같이, ilvA(T381A, F383A) 변이를 도입한 KCCM11248P/pECCG117-ilvA(T381A, F383A) 균주는 모균주인 KCCM11248P에 비해 L-이소류신 생산능이 현저히 증가하고, L-쓰레오닌 분해율이 높은 것을 확인하였다. 이에 따라, 상기 ilvA(T381A, F383A) 변이를 균주에 도입시 L-이소류신에 대한 피드백 해제와 활성이 증가됨을 확인하였다.
실시예 2: 변이형 ilvN 라이브러리 벡터 제작
아세토하이드록시산 신타아제(Acetohydroxy acid synthase, AHAS)의 작은 소단위체를 코딩하는 ilvN 유전자의 변이 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리는 error-prone PCR kit(clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)를 이용하여 제작하였으며, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체를 주형으로 하고 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
7 primer 9 CGAGCTCGGTACCCATGGCTAATTCTGACG
8 primer 10 TAGAGGATCCCCTTAGATCTTGGCCGGAGC
구체적으로, 1000bl 당 0에서 3개의 변이가 발생하는 조건으로 94℃에서 30초 pre-heating 후, 94℃에서 30초, 68℃에서 1분 30초의 과정을 25회 반복 수행하였다. 이 때, 수득한 산물을 megaprimer(500~125ng)를 이용하여 95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 12분의 과정을 25회 반복 수행한 후 DpnI 처리하여, 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신(25mg/L)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 폴리뉴클레오티드 서열을 분석한 결과 2mutations/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pTOPO-ilvN-library로 명명하였다.
실시예 3: ilvN 라이브러리가 도입된 L-이소류신 생산 균주 제작
상기 실시예 2에서 제작된 pTOPO-ilvN-library를 상기 실시예 1에서 제작한 L-이소류신 생산 균주인 CA10-3101(KCCM12739P)에 전기천공법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 영양배지에 도말하여 변이 유전자가 삽입된 균주 5,000개의 콜로니를 확보하였으며, 각 콜로니를 CA10-3101/pTOPO-ilvNm1부터 CA10-3101/pTOPO-ilvNm5000까지로 명명하였다.
확보된 5,000개의 콜로니 중 L-이소류신 생산능이 증가된 콜로니를 확인하기 위해 각각의 콜로니에 대해 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다. 구체적으로, 이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 생산하였다. 상기 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10㎎/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도를 측정한 후 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) L-이소류신 농도 증가율(%)
CA10-3101(모균주) 2.32 -
CA10-3101/pTOPO-ilvNm2991 3.23 39
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 변이 균주 CA10-3101/pTOPO-ilvNm2991는 ilvN WT을 갖는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 비해 L-이소류신 생산능이 증가됨을 확인하였다. 상기 변이 균주에 대한 시퀀싱을 진행하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 ilvN 유전자와 비교한 결과, 변이 균주는 ilvN의 아미노산 서열에서 17번째 아스파라긴이 알라닌으로 치환(D17A)된 변이를 포함하고 있음을 확인하였다.
상기 결과를 바탕으로, 상기 ilvN(D17A) 변이 균주가 모균주에 비해 고수율로 L-이소류신을 생산할 수 있음을 확인하였으며, 이의 L-이소류신 농도 증가율은 모균주 대비 약 39%임을 확인하였다.
실시예 4: 변이형 ilvN이 도입된 L-이소류신 생산 균주 제작
상기 실시예 3에서 확인한 ilvN(D17A) 변이를 상기 실시예 1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101 균주에 도입하였다.
구체적으로, 상기 변이형 ilvN 유전자(D17A)를 염색체상에 도입하기 위한 벡터를 제작하기 위해, CA10-3101/pTOPO-ilvNm2991(D17A)의 염색체를 주형으로 하고 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR를 수행하였다. PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 어닐링 55℃ 30초 변성; 및 중합반응 72℃ 1분이며, 이러한 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하여, 변이형 ilvN 유전자(D17A)를 각각 포함하는 3종의 545bp DNA 단편을 수득하였다. 증폭산물을 QUIAGEN사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 SmaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 타카라(TaKaRa)의 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 변이형 ilvN 유전자를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-ilvN(D17A)을 제작하였다.
상기에서 제작된 벡터를 전기천공법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 변이형 ilvN으로 치환된 균주를 얻었으며, CA10-3101::ilvN(D17A)를 CA10-3128로 명명하였다.
모균주(CA10-3101) 및 본 실시예에서 제작한 변이주 CA10-3128에 대하여 L-이소류신 생산능 증가 효과를 확인하기 위해, 각각의 균주를 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 수행하였다.
이소류신 생산배지를 25㎖ 함유하는 250㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 생산하였다. 상기 생산배지의 조성은 하기에 나타내었다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10㎎/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도를 측정한 후 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) L-이소류신 농도 증가율(%)
CA10-3101 2.12 -
CA10-3128(D17A 도입 균주) 3.25 53
상기 표 6에 나타난 바와 같이, ilvN WT을 갖는 L-이소류신 생산 균주인 모균주(CA10-3101)에 비해 ilvN(D17A)가 도입된 CA10-3128 균주에서 L-이소류신의 농도가 증가함을 확인하였으며, ilvN(D17A)이 도입된 균주의 L-이소류신 농도 증가율은 모균주 대비 약 53%임을 확인하였다.
실시예 5: 조합 변이형 ilvN 플라스미드 제작
상기 실시예 3에서 확인된 ilvN 변이형을 포함하는 조합 변이를 L-이소류신 균주에 도입하기 위해, 조합 변이형 ilvN를 염색체상에 도입하기 위한 벡터를 제작하였다.
구체적으로, pDCM2-ilvN(D17A)를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 9의 프라이머 쌍 또는 서열번호 10 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였으며, pDCM2-ilvN(H47L)를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 11의 프라이머 쌍 또는 서열번호 12 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하며 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
서열번호 명칭 서열
9 primer 11 TTCGGTCTTAACAGACACGAGGGACACGAG
10 primer 12 GTGTCCCTCGTGTCTGTTAAGACCGAAACA
11 primer 13 CGGTTGATGCCgagTGTTTCGGTCTTTGCA
12 primer 14 AAGACCGAAACActcGGCATCAACCGCATC
PCR 반응을 위한 중합효소로는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 95℃ 30초 변성; 55℃ 30초 어닐링; 및 72℃ 1분 중합반응을 조건으로 하여, 이러한 변성, 어닐링, 및 중합반응을 28회 반복하여 149bp, 423bp DNA 단편과 166bp, 405bp DNA 단편을 각각 수득하였다. 증폭 산물을 QUIAGEN사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 벡터 제작을 위한 삽입 DNA 단편으로 사용하였다. 정제한 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2와 상기 증폭 산물인 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 다카라(TaKaRa)의 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 변이형 ilvN를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-ilvN(D17A, A42V), pDCM2-ilvN(D17A, H47L)를 제작하였다.
추가로, pDCM2-ilvN(D17A, H47L)를 주형으로 하여 서열번호 7 및 서열번호 9의 프라이머 쌍, 서열번호 10 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하여, 149bp, 423bp DNA 단편을 수득하였다. 증폭 산물을 QUIAGEN사의 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하여 벡터 제작을 위한 삽입 DNA단편으로 사용하였다. 정제된 증폭 산물을 제한효소 smaI으로 처리한 후, 65℃에서 20분간 열처리한 pDCM2 벡터와 상기 PCR을 통하여 증폭한 삽입 DNA 단편의 몰농도(M) 비율이 1:2가 되도록 하고, 다카라(TaKaRa)의 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 클로닝함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰의 변이형 ilvN를 염색체상에 도입하기 위한 벡터 pDCM2-ilvN(D17A, A42V, H47L)을 제작하였다.
실시예 6: 조합 변이형 ilvN이 도입된 L-이소류신 생산 균주 제작
상기 실시예 5에서 제작된 벡터를 전기천공법으로 상기 실시예 1에서 제작한 코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-3101 균주에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 조합 변이형 ilvN으로 치환된 균주를 얻었다. CA10-3101::ilvN(D17A, A42V)를 CA10-3131, CA10-3101::ilvN(D17A, H47L)를 CA10-3133, CA10-3101::ilvN(D17A, A42V, H47L)를 CA10-3134로 명명하였다.
제작된 3종 균주의 L-이소류신 생산성 증가 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다.
이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 생산하였다. 상기 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10㎎/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2
배양 종료 후, 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도를 측정한 후 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) L-이소류신 농도 증가율(%)
CA10-3101(모균주) 2.03 -
CA10-3128(D17A) 3.22 59
CA10-3131(D17A, A42V) 3.51 73
CA10-3133(D17A, H47L) 3.33 64
CA10-3134(D17A, A42V, H47L) 3.18 57
상기 표 8에 나타난 바와 같이, ilvN WT을 갖는 L-이소류신 생산 균주인 모균주(CA10-3101)에 비해 ilvN 단독 변이(ilvN(D17A)) 또는 ilvN 조합 변이(ilvN(D17A, A42V), ilvN(D17A, H47L), ilvN(D17A, A42V, H47L))가 도입된 변이주에서 L-이소류신 농도가 증가함을 확인하였다.
상기의 결과로부터, ilvN 단독 또는 조합 변이가 균주의 L-이소류신 생산능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: L-이소류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 균주에서 변이형 ilvN 치환 균주의 제작
상기 실시예 6에서 L-이소류신 생산능 증가에 효과적인 것으로 확인된 ilvN 단독 변이 1종 및 조합 변이 3종을 NTG(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) 처리된 L-이소류신 생산균주인 KCJI-38(KCCM11248P, 대한민국 등록특허 제10-1335789호) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25㎎m/L를 함유한 선별배지에 도말하여 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 치환된 변이형 ilvN 및 조합 변이형 ilvN 치환주를 획득하였다. 그 다음, 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다.
이소류신 생산배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주 및 상기 변이주를 접종한 후, 32℃에서 60시간동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 L-이소류신을 생산하였다. 상기 생산배지의 조성은 하기와 같다.
<생산배지>
포도당 10%, 효모추출물 0.2%, 황산암모늄 1.6%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.1%, 황산철7수염 10㎎/ℓ, 황산망간1수염 10㎎/ℓ, 비오틴 200 ㎍/ℓ, pH 7.2
배양 종료 후, 액체고속크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도를 측정한 후 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 농도(g/L) L-이소류신 농도 증가율(%)
KCCM11248P(모균주) 1.3 -
KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A) 2.1 62
KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A, A42V) 2.0 54
KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A, H47L) 1.9 46
KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A, A42V, H47L) 1.8 38
상기 표 9에 나타난 바와 같이, ilvN WT을 갖는 L-이소류신 생산 균주인 모균주(KCCM11248P)에 비해 ilvN 단독 변이(ilvN(D17A)) 또는 ilvN 조합 변이(ilvN(D17A, A42V), ilvN(D17A, H47L), ilvN(D17A, A42V, H47L))가 도입된 변이주에서 L-이소류신 농도가 증가함을 확인하였다. 특히 KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A) 균주가 모균주 대비 L-이소류신 농도 증가율이 높았으며, KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A, A42V), KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A, H47L), KCCM11248P△ilvN::ilvN(D17A, A42V, H47L) 균주들도 모두 모균주 대비 L-이소류신 생산능이 증가됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12739P 20200527
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel Acetohydroxy acid synthase variant and method of producing L-isoleucine using the same <130> KPA211307-KR <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> ilvN <400> 1 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Asp Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 2 <211> 519 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ilvN <400> 2 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcagga cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgcaaaga ccgaaacaca cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420 cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A) <400> 3 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr His Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 4 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A, A42V) <400> 4 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr His Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 5 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A, H47L) <400> 5 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Ala Lys Thr Glu Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 6 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A, A42V, H47L) <400> 6 Met Ala Asn Ser Asp Val Thr Arg His Ile Leu Ser Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Ala Val Asp Gly Ile Ile Ser Arg Val Ser Gly Met Phe Thr Arg Arg 20 25 30 Ala Phe Asn Leu Val Ser Leu Val Ser Val Lys Thr Glu Thr Leu Gly 35 40 45 Ile Asn Arg Ile Thr Val Val Val Asp Ala Asp Glu Leu Asn Ile Glu 50 55 60 Gln Ile Thr Lys Gln Leu Asn Lys Leu Ile Pro Val Leu Lys Val Val 65 70 75 80 Arg Leu Asp Glu Glu Thr Thr Ile Ala Arg Ala Ile Met Leu Val Lys 85 90 95 Val Ser Ala Asp Ser Thr Asn Arg Pro Gln Ile Val Asp Ala Ala Asn 100 105 110 Ile Phe Arg Ala Arg Val Val Asp Val Ala Pro Asp Ser Val Val Ile 115 120 125 Glu Ser Thr Gly Thr Pro Gly Lys Leu Arg Ala Leu Leu Asp Val Met 130 135 140 Glu Pro Phe Gly Ile Arg Glu Leu Ile Gln Ser Gly Gln Ile Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Gly Pro Lys Thr Met Ala Pro Ala Lys Ile 165 170 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 7 cgagctcggt acccatggct aattctgacg 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 8 tagaggatcc ccttagatct tggccggagc 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 9 ttcggtctta acagacacga gggacacgag 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 10 gtgtccctcg tgtctgttaa gaccgaaaca 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 11 cggttgatgc cgagtgtttc ggtctttgca 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 12 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<223> primer 3 <400> 16 atgatgatgc acatctgatc gtg 23 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 17 ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg 35 <210> 18 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvA(T381A, F383A) <400> 18 atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga tggctagcgg agcggagctg 60 attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt cctccgtcat tgcaccaact 120 ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag cggaaatcta ccttaagcgt 180 gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg cgctgaactc tggagcgcag 240 ctcactcagg agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat ctgcaggtaa ccatgcccag 300 ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac gcatctatgt tcctgtgcag 360 actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg gagagtttgt ctccttggtg 420 gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc atgaagatgc agagcgcacc 480 ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg tcatcggtca gggtacagtg 540 gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga gtgcagatca cgtgatggtt 600 ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct acatggctga tatggcacct 660 cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat ccatgcaggc tgcattgcac 720 aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg tggacggcgc agcagtcaaa 780 cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc agggtcgcgt gcacatgatg 840 agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc tttaccaaaa cgaaggcatc 900 atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga aggaaatgtc ctttgcacct 960 ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg atgtgctgcg ttatgcggaa 1020 atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact acttcttggt gaacttcccg 1080 caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc tgggaccgga tgatgacatc 1140 gcgctggcag agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg gtactgcgtt ggtgggtatt 1200 cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac gtatggagga atcggcaatt 1260 gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat acttgaccta a 1311 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 19 tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 35 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 20 gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 21 ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 39 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 22 ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca 34 <210> 23 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A) <400> 23 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcaggc cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgcaaaga ccgaaacaca cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420 cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519 <210> 24 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A, A42V) <400> 24 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcaggc cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgttaaga ccgaaacaca cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420 cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519 <210> 25 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A, H47L) <400> 25 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcaggc cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgcaaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420 cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519 <210> 26 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ilvN(D17A, A42V, H47L) <400> 26 atggctaatt ctgacgtcac ccgccacatc ctgtccgtac tcgttcaggc cgtagacgga 60 atcatttccc gcgtatcagg tatgttcacc cgacgcgcat tcaacctcgt gtccctcgtg 120 tctgttaaga ccgaaacact cggcatcaac cgcatcacgg ttgttgtcga cgccgacgag 180 ctcaacattg agcagatcac caagcagctc aacaagctga tccccgtgct caaagtcgtg 240 cgacttgatg aagagaccac tatcgcccgc gcaatcatgc tggttaaggt ctctgcggac 300 agcaccaacc gtccgcagat cgtcgacgcc gcgaacatct tccgcgcccg agtcgtcgac 360 gtggctccag actctgtggt tattgaatcc acaggcaccc caggcaagct ccgcgcactg 420 cttgacgtga tggaaccatt cggaatccgc gaactgatcc aatccggaca gattgcactc 480 aaccgcggtc cgaagaccat ggctccggcc aagatctaa 519

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 17번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 아세토하이드록시산 신타아제(Acetohydroxy acid synthase) 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 17번째 위치에 상응하는 아미노산은 알라닌으로 치환되는 것인, 변이체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 17번째 위치에 상응하는 아미노산은 아스파라긴인 것인, 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 42번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 47번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환; 또는 이들의 조합; 중 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 것인, 변이체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 42번째 위치에 상응하는 아미노산은 발린으로 치환되는 것인, 변이체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 47번째 위치에 상응하는 아미노산은 류신으로 치환되는 것인, 변이체.
  7. 제4항에 있어서, 상기 42번째 위치에 상응하는 아미노산은 알라닌인 것인, 변이체.
  8. 제4항에 있어서, 상기 47번째 위치에 상응하는 아미노산은 히스티딘인 것인, 변이체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는, 코리네박테리움 속 균주.
  11. 제10항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 야생형 아세토하이드록시산 신타아제 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코리네박테리움 속 균주와 비교하여 L-이소류신 생산능이 증가된, 균주.
  12. 제10항에 있어서, 상기 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것인, 균주.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이체; 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하는 코리네박테리움 속 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-이소류신 생산 방법.
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