JP2024514138A - Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたｌ－アルギニン生産方法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化された、Ｌ－アルギニン生産微生物及びそれを用いた、Ｌ－アルギニン製造方法に関する。【選択図】なし

Description

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された、Ｌ－アルギニン生産微生物；及びＬ－アルギニンの製造方法に関する。
Ｌ－アルギニン（Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ）は、肝機能促進剤、脳機能促進剤、総合アミノ酸製剤などの医薬用として用いられており、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用などの食品用としても最近脚光を浴びている物質である。産業的に利用可能な高濃度のアルギニンを生産するために、微生物を利用しようとする研究が持続的に行われており、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）生産菌株であるプレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物から誘導された変異株を利用する方法、細胞融合で生育改善されたアミノ酸生産菌株を利用する方法などが報告された。一方、コリネバクテリウム属微生物は、Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ排出能を有するｌｙｓＥが同一の塩基性アミノ酸であるＬ－アルギニンも排出することが報告されており（Ｂｅｌｌｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４７：１７６５－１７７４， ２００１）、前記遺伝子の強化を通じてＬ－アルギニン生産菌株の生産能を向上させる方法が知られている（米国公開特許番号ＵＳ ２００３－０１１３８９９ Ａ１）。
ＵＳ ２００３－０１１３８９９ Ａ１ 米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２ 米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２ 米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２ 大韓民国特許登録番号第０７９１６５９号 大韓民国特許登録番号第１０－０９２４０６５号
Ｂｅｌｌｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １４７：１７６５－１７７４， ２００１ Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８） ［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４ Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７ （１９８４） Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０） Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４ ［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３ Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８（１９７９） Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５ Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９ Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８ ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９ Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６ Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０，Ｖｏｌ． ２． １－１６ "Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ"ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１） Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｈｃｅｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１－５４５ Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｗ． Ｈ．，Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９４８，１７６，３６７－３８８ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
本発明者らは、Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びこれを用いたＬ－アルギニン生産方法を開発し、本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された、Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）組換え微生物を提供することにある。
本出願の他の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－アルギニン製造方法を提供することにある。
本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化されたコリネバクテリウム属微生物は、高収率でＬ－アルギニンを生産でき、産業的生産に有用に利用され得る。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。即ち、本出願で開示された多様な要素のすべての組み合せが本出願の範疇に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が記載されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照により挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）組換え微生物を提供することである。
本出願のタンパク質は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列を有したり、含んだり、前記アミノ酸配列からなったり必須的に構成され（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）てもよい。
本出願において、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、本出願微生物の内在的タンパク質であってもよいが、これに制限されない。
前記配列番号１のアミノ酸配列は、公知のデータベースである米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）から得ることができる。本出願において、前記配列番号１のアミノ酸配列は、前記配列番号１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。また、このような相同性又は同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。
例えば、前記アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端そして／又は内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加又は欠失、自然に発生し得る突然変異、潜在性突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は保存的置換を有する場合である。
本出願において用語「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸を類似した構造的及び／又は化学的性質を有するもう一つのアミノ酸で置換させることを意味する。前記変異体は、一つ以上の生物学的活性を依然として保有しながら、例えば、一つ以上の保存的置換を有することができる。このようなアミノ酸の置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、電荷を帯びる側鎖（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を有するアミノ酸中、正で荷電された（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リシン、及びヒスチジンを、負で荷電された（酸性）アミノ酸はグルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；電荷を帯びない側鎖（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）を有するアミノ酸中、非極性アミノ酸（ｎｏｎｐｏｌａｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンを含み、極性（ｐｏｌａｒ）又は親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）アミノ酸はセリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み、前記アミノ酸中、芳香族アミノ酸はフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを含む。
本出願において用語、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」又は「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、二つの与えられたアミノ酸配列又は核酸塩基配列相互間の類似の程度を意味し、百分率で表すことができる。用語相同性及び同一性は、しばしば互換的に使用することができる。
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチド又はタンパク質の配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に利用できる。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又は同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列全体又は一部分と中程度又は高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイゼーションすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドで一般のコドン又はコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
任意の二つのポリヌクレオチド又はタンパク質配列が相同性、類似性又は同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを利用して「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定することができる。又は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．、２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０又は以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）を使用して決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３ （１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、又はＣｌｕｓｔａｌＷを利用して相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
ポリヌクレオチド又はタンパク質の相同性、類似性又は同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ （１９８１） ２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ． （１９７０）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含む）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ． ３５３－３５８ （１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４：６７４５の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ （ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（又はギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
本出願において、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＮＣｇｌ２６０８遺伝子と命名することができる。
本出願において用語、「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で一定の長さ以上のＤＮＡ又はＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で記載されたアミノ酸配列をコードする核酸塩基配列を含むことができる。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは配列番号２の核酸塩基配列を有したり含むことができる。また、本出願のポリヌクレオチドは配列番号２の核酸塩基配列からなるか、必須的に構成されてもよい。
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）又は本出願の変異体を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われ得る。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸塩基配列と相同性又は同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の核酸塩基配列を有したり含んだり、又は配列番号２の配列と相同性又は同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である核酸塩基配列からなったり必須的に行われるが、これに制限されない。
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造できるプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下にハイブリダイゼーションできる配列であれば、制限なく含まれ得る。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９；Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性又は同一性が高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の相同性又は同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションし、それより相同性又は同一性が低いポリヌクレオチド同士ハイブリダイゼーションしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１ХＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で１回、具体的には２回～３回洗浄する条件を列挙することができる。
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、二つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願のポリヌクレオチドはまた、実質的に類似の核酸塩基配列だけでなく全体配列に相補的な単離された核酸断片を含むことができる。
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、前記Ｔｍ値は６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適切に調節することができる。
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性程度に依存し、変数は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、同上）。
本出願において用語、「微生物（又は、菌株）」とは、野生型微生物や天然又は人為的に遺伝的変形が生じた微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、又は内在的遺伝子の活性が強化されたり、不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化されたり強化された微生物であり、所望のタンパク質、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。
本出願の微生物は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドが欠損された微生物；又は本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドが欠損されるようにベクターを通じて遺伝的に変形された微生物（例えば、組換え微生物）であってもよいが、これらに制限されない。
本出願の微生物は、Ｌ－アルギニン生産能を有する微生物であってもよい。
本出願の微生物は、親菌株に比べてＬ－アルギニン生産能が増加した微生物であってもよい。
本出願の微生物は、親菌株（例えば、天然にＬ－アルギニン生産能を有したり、Ｌ－アルギニン生産能のない親菌株）に本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドが欠損されてＬ－アルギニン生産能が付与された微生物であってもよいが、これに制限されない。
一例として、本出願の組換え微生物は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドが欠損されるようにベクターを通じて形質転換され、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドが欠損された菌株又は微生物であり、天然の野生型微生物又はＬ－アルギニンを生産する微生物に本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドが欠損され、Ｌ－アルギニン生産能が天然の野生型微生物又は配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質又はこれをコードするポリヌクレオチドが非変形された微生物に比べて増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
その例として、前記Ｌ－アルギニン生産能の増加の有無を比較する対象菌株である非変形微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９でａｒｇＲ遺伝子が欠損された菌株（例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒ）であってもよいが、これに制限されない。
一例として、前記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親菌株又は非変形微生物のＬ－アルギニン生産能に比べて約１％以上、具体的には、約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１０．５％以上、約１１％以上、約１１．５％以上、約１２％以上、約１２．５％以上、約１３％以上、約１３．５％以上又は約１４％以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下又は約２５％以下であってもよい）増加されたものであってもよいが、変異前の親菌株又は非変形微生物の生産能に比べて＋値の増加量を有する限り、これに制限されない。他の例において、前記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親菌株又は非変形微生物に比べて、Ｌ－アルギニン生産能が約１．１倍以上、約１．１２倍以上、約１．１３倍以上又は１．１４倍以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下、又は約２倍以下であってもよい）増加されたものであってもよいが、これに制限されない。前記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などをすべて含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに制限されない。
本出願において用語、「非変形微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株又は天然型菌株自体であるか、自然的又は人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非変形微生物は、本明細書に記載の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の弱化又はこれをコードするポリヌクレオチドの欠損される前の微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変形前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用され得る。
本出願のまた他の一例として、本出願のコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。
具体的には、本出願の組換え微生物は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド全体又は一部が欠損された微生物であってもよい。
また、本出願の微生物は、アルギニン転写抑制因子（ＡｒｇＲ，ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）の活性がさらに弱化された微生物であってもよい。具体的には、本出願の微生物は、ａｒｇＲ遺伝子の全体又は一部がさらに欠損された微生物であってもよい。
前記ＡｒｇＲは、配列番号１３のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドを含むものであってもよい。また、前記ａｒｇＲ遺伝子は、配列番号１４の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドを含むものであってもよいが、これに制限されない。
さらに、本出願の微生物は、追加的にカルバモイルリン酸シンターゼ小サブユニット（ＣａｒＡ：ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）及び／又は大サブユニット（ＣａｒＢ：ｃａｒｂａｍｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ）の活性が強化されたり、正常のカルバモイルトランスフェラーゼＦ（ＡｒｇＦ：ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ ｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｆ）を発現したり、又はこれらの組み合わせを含む微生物であってもよい。
一例として、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）においてＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損された菌株又はコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１ＲにおいてＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損された菌株にさらにｃａｒＡ及び／又はｃａｒＢタンパク質活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム微生物であってもよい。
また、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１ＰにおいてＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損された菌株又はコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒにおいてさらに正常のａｒｇＦを発現する微生物であってもよく、前記正常のａｒｇＦを発現する微生物は、さらにｃａｒＡ及び／又はｃａｒＢタンパク質活性が強化されたコリネバクテリウム・グルタミカム微生物であってもよい。
前記ａｒｇＦタンパク質は、配列番号１５のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドを含むものであってもよく、前記ａｒｇＦ遺伝子は配列番号１６の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチド含むものであってもよいが、これに制限されない。また、前記ｃａｒＡタンパク質は配列番号１７のアミノ酸配列で記載されたポリペプチド、前記ｃａｒＢタンパク質は配列番号１９で記載されたポリペプチドを含むものであってもよく、前記ｃａｒＡ遺伝子は配列番号１８の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチド、前記ｃａｒＢ遺伝子は配列番号２０の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。
本出願において用語、タンパク質の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少又は活性がないことを全て含む概念である。前記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方制御（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。
前記弱化は、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変異などにより、タンパク質自体の活性が本来微生物が有しているタンパク質の活性に比べて減少又は除去された場合、これをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害又はタンパク質への翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的なタンパク質活性程度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、前記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、タンパク質の活性がない場合も含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然又は人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質転換前の親菌株、野生型又は非変形微生物が本来有していた特定のタンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。タンパク質の活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方制御、低下、減衰」するということは、形質転換前の親菌株又は非変形微生物が本来有していた特定のタンパク質の活性に比べて低下したことを意味する。
このようなタンパク質の活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに制限されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成することができる（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ． ２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
具体的には、本出願のタンパク質の弱化は、
１）タンパク質をコードする遺伝子の全体又は一部の欠損；
２）タンパク質をコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（又は発現調節配列）の変形；
３）タンパク質の活性が除去又は弱化されるように、前記タンパク質を構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）タンパク質の活性が除去又は弱化されるように、前記タンパク質をコードする遺伝子配列の変形（例えば、タンパク質の活性が除去又は弱化されるように変形されたタンパク質をコードするように、前記タンパク質遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’－ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列の変形；
６）タンパク質をコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるためにタンパク質をコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）タンパク質をコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’の末端に反対方向に転写するプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；又は
９）前記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。
例えば、
前記１）タンパク質をコードする前記遺伝子の一部又は全体の欠損は、染色体内の内在的目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、又はマーカー遺伝子への交換であってもよい。
また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はこれらの組み合わせで発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異が発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これに限定されるものではない。
また、前記３）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’－ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてタンパク質の発現率がより低い他の開始コドンをコードする核酸塩基配列で置換するものであってもよいが、これらに制限されない。
また、前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列の変形は、タンパク質の活性を弱化するように前記タンパク質のアミノ酸配列又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はこれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、又はより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列若しくは活性がないように改良されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害又は弱化させることができるが、これに制限されない。
前記６）タンパク質をコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ － Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ． １（１） １９８６］を参照することができる。
前記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、タンパク質をコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前端にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、又は速度を低下させるものであってもよい。
前記８）タンパク質をコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、前記タンパク質をコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。
本出願において用語、タンパク質の活性の「強化」とは、タンパク質の活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方制御（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方制御、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、又は内在的活性又は変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然又は人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親菌株又は非変形微生物が本来有していた特定のタンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。タンパク質の活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方制御」、「過剰発現」又は「増加」するとは、形質転換前の親菌株又は非変形微生物が本来有していた特定のタンパク質の活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
前記強化は、外来のタンパク質を導入するか、又は内在的なタンパク質の活性強化及び／又は濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記タンパク質の活性の強化有無は、当該タンパク質の活性度、発現量又は当該タンパク質から排出される産物の量の増加から確認することができる。
前記タンパク質の活性の強化は、当該分野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のタンパク質の活性を変形前の微生物より強化させることができる限り、制限されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業界の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに制限されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１０，Ｖｏｌ． ２． １－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
具体的には、本出願のタンパク質の強化は、
１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’－ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列の変形；
４）タンパク質活性が強化されるように、前記タンパク質のアミノ酸配列の変形；
５）タンパク質活性が強化されるように前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、タンパク質の活性が強化されるように変形されたタンパク質をコードするように前記タンパク質遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）タンパク質の活性を示す外来タンパク質又はこれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）タンパク質の三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、又は化学的に修飾；又は
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に制限されるものではない。
より具体的には、
前記１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。又は、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピー又は２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに制限されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（又は発現調節配列）を活性の強力な配列への交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はそれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、又はより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含み得る。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに制限されない。
公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国登録特許ＵＳ ７６６２９４３ Ｂ２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０５８４３３８ Ｂ２）、Ｏ２プロモーター（米国登録特許ＵＳ １０２７３４９１ Ｂ２）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに制限されない。
前記３）タンパク質をコードする遺伝子転写体の開始コドン又は５’－ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてタンパク質発現率がより高い他の開始コドンをコードする核酸塩基配列で置換することであってもよいが、これらに制限されない。
前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列の変形は、タンパク質の活性を強化するように、前記タンパク質のアミノ酸配列又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換又はこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、又はより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列又は活性が増加するように改良されたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに制限されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、前述の通りである。
前記６）タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりタンパク質が生成し、その活性が増加されてもよい。
前記７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、又は外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
前記８）タンパク質の三次構造を分析し、露出部位を選択して変形又は化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするタンパク質の配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形又は化学的に修飾する露出部位を選択して変形又は修飾することであってもよい。
このようなタンパク質活性の強化は、対応するタンパク質の活性又は濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたタンパク質の活性又は濃度を基準にして増加するか、又は当該タンパク質から生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに制限されるものではない。
本出願において用語、「ベクター」は、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を制御する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと無関係に複製又は機能することができ、ゲノム自体に統合することができる。
本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げることができる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われ得るが、これらに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性又は表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーを使用することができる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、又は他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞あるいは微生物内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、又は染色体外に位置するかに関係なく、それらの全部を含み得る。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入することができる。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含み得る。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部又は全体の変形は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換え又は遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／又は（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／又は化学物質処理により誘導され得るが、これらに制限されない。前記遺伝子の一部又は全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部又は全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列又はベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これらに制限されるものではない。
本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－アルギニン製造方法を提供する。
前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化及び微生物などは、前記他の様態で記載した通りである。
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。
前記微生物は、アルギニン転写抑制因子（ＡｒｇＲ）活性がさらに弱化されたり、ａｒｇＲ遺伝子がさらに欠損されたものであってもよいが、これらに限定されるものではなく、これについては、他の様態で記載した通りである。
本出願において、用語「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／又は流加式であってもよいが、これらに制限されるものではない。
本出願において、用語、「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特に制限なくいずれも使用できるが、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。
具体的には、コリネバクテリウム属微生物に対する培養培地は、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ、１９８１）］で見ることができる。
本出願において前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（即ち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を用いることができ、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などのような有機窒素源が使用され得る。これらの窒素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
前記リン源としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、又はこれに対応するナトリウム含有塩などが含まれ得る。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／又は適切な前駆体などが含まれ得る。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加され得る。しかし、これに限定されるものではない。
また、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方式で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素又は酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。
本出願の培養により製造されたＬ－アルギニンは、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
本出願のＬ－アルギニン製造方法は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を準備する段階、前記微生物を培養するための培地を準備する段階、又はこれらの組み合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。
本出願のＬ－アルギニン生産方法は、前記培養による培地（培養が行われた培地）又は培養による培地コリネバクテリウム属微生物からＬ－アルギニンを回収する段階をさらに含むことができる。前記回収する段階は、前記培養する段階その後にさらに含むことができる。
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式又は流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のＬ－アルギニンを収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該分野において公知となった適切な方法を用いて培地又は微生物から所望のＬ－アルギニンを回収することができる。
また、本出願のＬ－アルギニン生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＬ－アルギニン生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、前記回収段階と精製段階は、順序に関係なく連続的又は非連続的に行われるか、もしくは同時に又は一つの段階に統合されて行うことができるが、これに制限されるものではない。
本出願のもう一つの態様は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物；これを培養した培地；あるいは、それらの組み合わせを含むＬ－アルギニン製造用組成物を提供することである。
本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤又は等張化剤などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願の組成物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物、培養及び培地などは、前記他の様態で記載した通りである。
本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化する段階を含む、コリネバクテリウム属微生物の製造方法を提供する。
本出願のもう一つの態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された、コリネバクテリウム属微生物のＬ－アルギニン生産用途を提供する。
前記コリネバクテリウム属微生物の製造方法及びコリネバクテリウム属微生物のＬ－アルギニン生産用途において、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化及び微生物などは、前記他の様態で記載した通りである。
以下、本出願を実施例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施形態に過ぎず、したがって、本出願の権利範囲をこれに限定するとは意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野で熟練した通常の技術者であれば、十分に理解し、容易に実施することができる。
実施例１． トランスポゾンを利用したランダム突然変異ライブラリー製作及びスクリーニング
Ｌ－アルギニン生産能が増加した菌株を得るために、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭ ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して得たプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（大韓民国特許登録番号第０７９１６５９号）を親菌株にして電気パルス法（Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｈｃｅｎｏｌ．（１９９９）５２：５４１－５４５）で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹して約２０，０００個のコロニーを確保した。
＜複合平板培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、牛肉抽出物５ｇ、酵母抽出物５ｇ、脳心臓浸出液（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ） １８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素２ｇ、ソルビトール９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸留水１リットルを基準）
ニンヒドリン法（Ｍｏｏｒｅ，Ｓ．，Ｓｔｅｉｎ，Ｗ． Ｈ．，Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９４８，１７６，３６７－３８８）を用いて親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株に比べてＬ－アルギニン生産能の向上された上位１０種の突然変異株を選別した。
実施例２：選別されたランダム突然変異株のＬ－アルギニン生産能の分析
前記実施例１で選抜した１０種の突然変異株を対象に、Ｌ－アルギニン生産能が再現性よく増加された菌株を最終選別するために、下記の培地を用いたフラスコ培養を行った。培養が完了した後、ＨＰＬＣを用いて培養液内のＬ－アルギニン濃度を分析し、各突然変異株のＬ－アルギニン生産濃度を下記表１に示した。
＜生産培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖６％、硫酸アンモニウム３％、第一リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．２％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ１％、酵母抽出物０．５％、ビオチン１００ｍｇ／ｌ、ＣａＣＯ３３％、（蒸溜水１リットル基準）。
選別した１０種の変異株の中でＬ－アルギニン生産能が有意に向上した菌株としてＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－５を最終選別した。
実施例３：最終選別株でのＬ－アルギニン生産能増加の原因究明
前記実施例２のＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－５でトランスポゾンのランダムな挿入により不活性化された遺伝子を同定した。
具体的には、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－５のＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して切断した後に連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーの２０種を選別した後、未知の遺伝子の一部が含まれたプラスミドを獲得し、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭ ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞ Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔのプライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いて核酸塩基配列を分析した結果、米国国立衛生研究所のジェンバンク（ＮＩＨ Ｇｅｎｂａｎｋ）に報告された核酸塩基配列に基づいて配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が不活性化されていることが分かった。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９で配列番号２をｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈした結果、ＮＣｇｌ２６０８遺伝子であることを確認した。
実施例４：ＮＣｇｌ２６０８遺伝子欠損のための組換えベクターの製作
配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子の不活性化がＬ－アルギニンの生産に及ぼす影響を再確認するために、コリネバクテリウム属菌株の染色体上でＮＣｇｌ２６０８遺伝子を欠損させるための組換えベクターを製作した。
まず、前記遺伝子の欠損のための断片を製作するために、プライマー３～６を合成し、これを表３に示した。
配列番号２に基づいてＯＲＦ部位を欠損するために、５’末端にＢａｍＨＩと３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有するようにプライマー３（配列番号５）、プライマー４（配列番号６）、プライマー５（配列番号７）、プライマー６（配列番号８）（表２）を合成し、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ １３８６９の染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ［Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ］を行った。これからＮＣｇｌ２６０８のヌクレオチド配列でコードされるタンパク質をコードする部分の上端６００ｂｐと下端６００ｂｐが連結されたＤＮＡ断片を獲得した。この時、ＰＣＲ条件は、変性９５℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；及び重合反応７２℃、１分を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応させて行った。コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（大韓民国特許登録番号第１０－０９２４０６５号）とＰＣＲで増幅された前記断片を染色体導入用制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
ＰＣＲを通じて前記目的の遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドをｐＤＺ－△ＮＣｇｌ２６０８と命名した。
実施例５：コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ由来のＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損した菌株の製作及びＬ－アルギニン生産能の評価
ｐＤＺ－△ＮＣｇｌ２６０８を染色体上における相同組換えによりＬ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐに形質転換させた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。
その後、４％のスクロースを含む固体平板培地で２次組換えを行った。２次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー３とプライマー６を用いてＰＣＲ法により染色体上で配列番号２の遺伝子が欠損した菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－△ＮＣｇｌ２６０８と命名した。
前記製作されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－△ＮＣｇｌ２６０８菌株のＬ－アルギニン生産能を分析するために、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株と共に以下の方法で培養した。
下記の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐと実施例６で製作された菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－△ＮＣｇｌ２６０８を接種し、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成は、それぞれ下記の通りである。
＜種培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（蒸留水１リットルを基準）
＜生産培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖６％、硫酸アンモニウム３％、第一リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水塩０．２％、ＣＳＬ（トウモロコシ浸漬液）１．５％、ＮａＣｌ １％、酵母抽出物０．５％、ビオチン１００ｍｇ／ｌ
培養終了後、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）によりＬ－アルギニンの生産量を測定し、分析したＬ－アルギニンの濃度を下記表４に示した。
前記結果のように、Ｌ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐから配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させた場合、親菌株に比べてＬ－アルギニン生産能が平均２０．０％増加することを確認した。
したがって、コリネバクテリウム属微生物で配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることにより、Ｌ－アルギニン生産能を向上させることを確認した。
実施例６：コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒ由来のＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損された菌株の製作及びＬ－アルギニン生産能の評価
Ｌ－アルギニンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株でも前記と同様な効果があるかを確認するために、野生株（ＡＴＣＣ１３８６９）に１種の変異（△ａｒｇＲ）を導入しようとした。
前記遺伝子ａｒｇＲの欠損のための組換えベクターは、前記実施例４と同様の方法で製作され、ベクターの製作に用いられたプライマーは表５の通りである。
ＰＣＲを通じて前記目的の遺伝子が挿入されたプラスミドで選別した後、このプラスミドをｐＤＺ－△ａｒｇＲと命名した。ｐＤＺ－△ａｒｇＲを用いてコリネバクテリウム・グルタミカム野生株を前記実施例６と同様な方法で形質転換させ、形質転換株を対象にプライマー７とプライマー１０を用いてＰＣＲ法を通じて染色体上でａｒｇＲが欠損された菌株を確認した。前記組換え菌株をＣＪ１Ｒと命名し、これによりアルギニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒを対象に前記実施例６と同様な方法でＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損された菌株を製作し、ＣＪ１Ｒ－△ＮＣｇｌ２６０８と命名した。
ＮＣｇｌ２６０８遺伝子が欠損されたＣＪ１Ｒ－△ＮＣｇｌ２６０８を前記実施例５と同様の方法で培養し、培養終了後、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ ２４７８）によりＬ－アルギニンの生産量を測定し、分析したＬ－アルギニンの濃度を下記表６に示した。
前記結果のように、Ｌ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒを対象にＮＣｇｌ２６０８遺伝子を欠損させた場合、Ｌ－アルギニン生産能が平均１７．３％増加することを確認した。
したがって、実施例５の結果と同様に、コリネバクテリウム属微生物でＮＣｇｌ２６０８遺伝子を欠損させることにより、Ｌ－アルギニン生産能を向上させることを確認した。
前記菌株ＣＪ１Ｒ－△ＮＣｇｌ２６０８をＣＡ０６－７２０４と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０２１年２月２３日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２９６１Ｐの付与を受けた。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更又は変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
Figure 2024514138000007

Claims (9)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が弱化された、Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）組換え微生物。
  2. 前記微生物は、親菌株に比べてＬ－アルギニン生産能が増加した、請求項１に記載の微生物。
  3. 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１に記載の微生物。
  4. 前記微生物は、さらにアルギニン転写抑制因子（ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）の活性が弱化された、請求項１に記載の微生物。
  5. 前記微生物は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが欠損された、請求項１に記載の微生物。
  6. 配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－アルギニン製造方法。
  7. 前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記コリネバクテリウム属微生物は、さらにアルギニン転写抑制因子が弱化されたものである、請求項６に記載の方法。
  9. 前記微生物は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸塩基配列が欠損されたものである、請求項６に記載の方法。
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