JP2024517013A - ３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物、およびその用途 - Google Patents
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Abstract
３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物、前記微生物を含むパントテン酸および／またはパントイン酸生産用組成物、および前記微生物を培養する段階を含むパントテン酸および／またはパントイン酸の製造方法が提供される。
Description
関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年５月１０日付の大韓民国特許出願第１０－２０２１－００６０００９号に基づく優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０２１年５月１０日付の大韓民国特許出願第１０－２０２１－００６０００９号に基づく優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物、前記微生物を含むパントテン酸および／またはパントイン酸生産用組成物、および前記微生物を培養する段階を含むパントテン酸および／またはパントイン酸の製造方法が提供される。
パントテン酸（ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ）は、ビタミンＢ複合体に属する物質でビタミンＢ５とも呼ばれ、化粧品、医薬、ヒト栄養物、動物栄養物などに多様に応用されている商業的に重要な物質の一つである。パントテン酸は、パントイン酸（ｐａｎｔｏｎｉｃ ａｃｉｄ）にベータ－アラニンがアミド結合で連結された構造である。
パントテン酸またはパントイン酸は、化学的に合成して製造したり、好適な培地で好適な微生物を発酵させることによって生物工学的に製造することができる。微生物を用いる生物工学的製造方法の利点は、目的とする立体異性体型Ｄ－形態のパントテン酸またはパントイン酸が形成されるということである。
そこで、生物工学的にパントテン酸および／またはパントイン酸を製造するのに有利な効果を有する微生物およびこれを用いてパントテン酸および／またはパントイン酸を高効率で製造する技術の開発が要求される。
本出願の一例は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（３－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性を有するポリペプチドを提供する。一具体例において、（１）前記ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。他の具体例において、（２）前記ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｎ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記のようにアミノ酸配列においてＮ－末端からアミノ酸を計数することは、開始コドンから翻訳されたメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）を１番目のアミノ酸として計数することを意味することができる。
他の例は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、発現ベクターであってもよい。
他の例は、前記ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上（１つ、２つ、またはすべて）を含み、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（３－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）の活性が強化された、パントテン酸またはパントイン酸を生産する微生物を提供する。
前記微生物は、
（１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上（１つ、２つ、またはすべて）；または、
（２）前記（１）、および配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上（１つ、２つ、またはすべて）を含むものであってもよい。
（１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上（１つ、２つ、またはすべて）；または、
（２）前記（１）、および配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上（１つ、２つ、またはすべて）を含むものであってもよい。
前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物またはエシェリキア属微生物であってもよい。前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよい。
他の例は、前記微生物を含む、パントテン酸またはパントイン酸生産用組成物を提供する。
他の例は、前記微生物をパントテン酸および／またはパントイン酸の生産に使用するための用途を提供する。
他の例は、前記微生物を培地で培養する段階を含む、パントテン酸またはパントイン酸の製造方法を提供する。前記製造方法は、前記培養する段階の後に、培養された微生物、培地、またはこれらのすべてからパントテン酸またはパントイン酸を回収する段階を追加的に含むことができる。
本明細書では、パントテン酸および／またはパントイン酸生産能を向上させることができる３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはその変異体を探索し、これを微生物に導入することによって、パントテン酸および／またはパントイン酸生産能に優れた組換え菌株を提供しようとする。
本明細書において、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼを発現する微生物がパントテン酸生産能に優れていることを確認し、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの特定位置にアミノ酸置換変異が導入される場合、パントテン酸生産能がより増加することを確認した。
一例は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを提供する。一具体例において、前記ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。他の具体例において、前記ポリペプチドは、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｎ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。前記のようにアミノ酸配列においてＮ－末端からアミノ酸を計数することは、開始コドンから翻訳されたメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）を１番目のアミノ酸として計数することを意味することができる。
他の例は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
他の例は、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。前記組換えベクターは、前記ポリペプチドの発現ベクターとして使用できる。
他の例は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物を提供する。前記微生物は、パントテン酸またはパントイン酸を生産する微生物であってもよい。
前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化されるのは、微生物内在の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼが変異したり、または外来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼまたはその変異体が導入されることによって強化されるものであってもよい。
一具体例において、前記活性が強化された３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。あるいは、前記活性が強化された３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｎ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むものであってもよい。
前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物は、
（１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上；または
（２）前記（１）、および配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上を含むものであってもよい。
（１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上；または
（２）前記（１）、および配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上を含むものであってもよい。
前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼが強化されていない（例えば、配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸および／または１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていない）同種微生物と比較して、高いパントテン酸および／またはパントイン酸の生産能を有することができる。
他の例は、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物を含むパントテン酸および／またはパントイン酸生産用組成物を提供する。
他の例は、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物を培養する段階を含むパントテン酸および／またはパントイン酸の生産方法を提供する。
以下、より詳しく説明する。
ポリペプチド
本明細書において、パントテン酸（ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ；ｅ．ｇ．，Ｄ－パントテン酸）は、化１の構造を有する化合物であって、パントイン酸（ｐａｎｔｏｉｃ ａｃｉｄ）にβ－アラニンがアミド結合で連結されたビタミン（ビタミンＢ５）であり、補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、ＣｏＡ）とアシル基キャリアタンパク質（ａｃｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＣＰ）の構成成分であり、生物体の各種代謝作用に関与する。
本明細書において、パントテン酸（ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ ａｃｉｄ；ｅ．ｇ．，Ｄ－パントテン酸）は、化１の構造を有する化合物であって、パントイン酸（ｐａｎｔｏｉｃ ａｃｉｄ）にβ－アラニンがアミド結合で連結されたビタミン（ビタミンＢ５）であり、補酵素Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ、ＣｏＡ）とアシル基キャリアタンパク質（ａｃｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＣＰ）の構成成分であり、生物体の各種代謝作用に関与する。
パントイン酸（ｐａｎｔｏｉｃ ａｃｉｄ；ｅ．ｇ．，Ｄ－パントイン酸）は、化２の構造を有する化合物であって、多様な生物学的活性化合物の構成成分である。
本明細書において、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（３－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｏｘｏｂｕｔａｎｏａｔｅ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、５，１０－メチレンテトラヒドロフォレート、３－メチル－２－オキソブタノエート、および水からテトラヒドロフォレートおよび２－ジヒドロパントエートを生合成する過程を触媒する酵素である。
一具体例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、１つ以上のアミノ酸残基が置換、欠失、または挿入された変異が導入された変異体であってもよい。
一例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの変異体は、配列番号３７のアミノ酸配列において１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、およびグリシン（Ｇ）からなる群より選択され、元のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。一具体例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号３７のアミノ酸配列において１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）またはチロシン（Ｙ）に置換されたものであってもよい。前記変異体のうち、配列番号３７のアミノ酸配列において１５９番目のアミノ酸残基に相応するアミノ酸を除いた一部のアミノ酸配列が欠失、改変、置換または付加されても、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を示す限り、本出願の変異体に含まれることは自明である。
また、一例において、前記変異体は、配列番号３７で記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列において配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドを含むことができる。つまり、配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応する位置において他のアミノ酸への置換を含み、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上、１００％未満の配列相同性または同一性を有し、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドは、本出願の変異体に含まれる。
一具体例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１１０～配列番号１２５の中から選択されたアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。前記配列番号１１０～配列番号１２５の中から選択されたいずれか１つの配列からなる変異体において１５９番目の残基に相応するアミノ酸を除いた一部のアミノ酸配列が欠失、改変、置換または付加されても、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を示す限り、本出願の変異体に含まれることは自明である。また、一例において、前記変異体は、配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応するアミノ酸は固定され、配列番号１１０～配列番号１２５の中から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを含むことができる。つまり、配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応する位置において他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１１０～配列番号１２５の中から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上、１００％未満の配列相同性または同一性を有する３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドは、本出願の変異体に含まれる。
一例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの変異体は、
（１）配列番号３７のアミノ酸配列において３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基に相応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびチロシン（Ｙ）からなる群より選択され、元のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、および
（２）配列番号３７のアミノ酸配列において３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの１１６番目の残基に相応するアミノ酸残基に相応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より選択され、元のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。
（１）配列番号３７のアミノ酸配列において３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基に相応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびチロシン（Ｙ）からなる群より選択され、元のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換され、および
（２）配列番号３７のアミノ酸配列において３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの１１６番目の残基に相応するアミノ酸残基に相応するアミノ酸が、他のアミノ酸、つまり、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、システイン（Ｃ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より選択され、元のアミノ酸と異なるアミノ酸に置換されたものであってもよい。
前記変異体のうち、配列番号３７のアミノ酸配列において１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基、および１１６番目の残基に相応するアミノ酸残基に相応するアミノ酸を除いた一部のアミノ酸配列が欠失、改変、置換または付加されても、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を示す限り、本出願の変異体に含まれることは自明である。
また、一例において、前記変異体は、配列番号３７で記載されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列において、（１）配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応するアミノ酸、および（２）配列番号３７のアミノ酸配列の１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドを含むことができる。つまり、（１）配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応する位置、および（２）配列番号３７のアミノ酸配列の１１６番目の残基に相応する位置において他のアミノ酸への置換を含み、配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上、１００％未満の配列相同性または同一性を有し、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドは、本出願の変異体に含まれる。
一具体例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１２８のアミノ酸配列を含むものであってもよいが、これに制限されるわけではない。前記配列番号１２８のアミノ酸配列からなる変異体において、（１）１５９番目の残基に相応するアミノ酸、および（２）１１６番目の残基に相応するアミノ酸を除いた一部のアミノ酸配列が欠失、改変、置換または付加されても、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を示す限り、本出願の変異体に含まれることは自明である。また、一例において、前記変異体は、（１）配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応するアミノ酸、および（２）配列番号３７のアミノ酸配列の１１６番目の残基に相応するアミノ酸は固定され、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを含むことができる。つまり、（１）配列番号３７のアミノ酸配列の１５９番目の残基に相応する位置、および（２）配列番号３７のアミノ酸配列の１１６番目の残基に相応する位置において他のアミノ酸への置換を含み、配列番号１２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上、１００％未満の配列相同性または同一性を有する３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドは、本出願の変異体に含まれる。
微生物
本明細書において、
（１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上；または
（２）前記（１）、および配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上を含む、
パントテン酸またはパントイン酸を生産する微生物を提供する。
本明細書において、
（１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上；または
（２）前記（１）、および配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上を含む、
パントテン酸またはパントイン酸を生産する微生物を提供する。
本明細書において、用語「３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物」は、先に説明した３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを発現するように操作（変異）されることによって、パントテン酸および／またはパントイン酸生産能がなかった微生物がパントテン酸および／またはパントイン酸生産能を有するか、元のパントテン酸および／またはパントイン酸生産能より高いパントテン酸および／またはパントイン酸生産能を有するものであってもよい。本明細書において、「微生物」は、単細胞のバクテリアを包括するもので、「細胞」と相互交換的に使用されてもよい。本明細書において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドが発現するように変異する前の微生物を前記変異した微生物と区別するために、「親菌株（ｐａｒｅｎｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｏｒ ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）または宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」で表現される。
一例において、前記微生物は、コリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）微生物などからなる群より選択された１種以上であってもよい。前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）などを含むことができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。さらにより具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよい。前記エシェリキア属菌株は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であってもよい。
本明細書において、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が導入されたものであってもよい。
本明細書において、「３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物」は、親菌株が３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを発現するようにする変異（操作）が導入された、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを発現する微生物であってもよい。前記微生物は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上を含むものであってもよい。一例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを発現するようにする変異は、先に説明した３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはこれを含む組換えベクターを親菌株に導入することによって行われるものであってもよい。このように親菌株に導入される３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、親菌株内在の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を代替したり、これに加えて追加的に含まれるものであってもよい。
一具体例において、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを発現する微生物は、寄託番号ＫＣＣＭ１２９７３Ｐ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＶ０３－５００２と名付ける）である。
本明細書において、ポリヌクレオチド（「遺伝子」と相互交換的に使用されてもよい）またはポリペプチド（「タンパク質」と相互交換的に使用されてもよい）が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる、または特定の核酸配列またはアミノ酸配列で表現される」いうのは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須として含むことを意味することができ、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等の配列」を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈される。
一例において、本明細書で提供される核酸配列またはアミノ酸配列は、これらの本来の機能または目的とする機能を維持する範囲で通常の突然変異誘発法、例えば、指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）および／または部位特異的突然変異法（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などによって改変されたものを含むことができる。一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む、または特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる」というのは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を必須として含むか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるか、これを必須として含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味することができる。本明細書において、前記目的とする機能は、微生物のパントテン酸および／またはパントイン酸生産能を増加させたり付与した機能を意味することができる。
本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって前記タンパク質（リジン排出タンパク質）を発現させようとする微生物で好まれるコドンを考慮して、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコード領域に多様な改変が行われる。
本明細書において、用語「相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、与えられた核酸配列またはアミノ酸配列と一致する程度を意味し、百分率（％）で表示される。核酸配列に対する相同性の場合、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）や、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
一例において、本明細書で提供される特定の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、前記特定の核酸配列またはこれと実質的に同等の核酸配列だけでなく、前記特定の核酸配列に相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を含むものと解釈される。具体的には、前記相補性を有するポリヌクレオチドは、目的に応じて当業者によって適切に調節可能なＴｍ値、例えば、５５℃、６０℃、６３℃または６５℃のＴｍ値でハイブリダイズし、後述する条件で分析することができる：このような条件は公知の文献に具体的に記載されている。例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の高い相補性を有する遺伝子同士でハイブリダイズし、それより低い相補性を有する遺伝子同士はハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）、および０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）；６０℃、０．１ｘＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ；または６８℃、０．１×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件などが挙げられるが、これに制限されるわけではない。ハイブリダイゼーションには２つのヌクレオチドが相補的配列を有することが要求されたり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が許容される。前記用語「相補的」は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用できる。例えば、ＤＮＡの場合、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さおよび相補性の程度に依存し、これは関連技術分野にてよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）。
前記ポリヌクレオチドまたはベクターの導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行われる。本明細書において、用語「形質転換」は、特定のポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターを宿主細胞内に導入する過程で、形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で染色体内に挿入されて位置したり、染色体外に位置することができる。一例として、形質転換は、標的タンパク質（外来タンパク質）をコードするポリヌクレオチドやこれを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにするものであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態は制限がない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入される。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位および／または翻訳終結シグナルなどの発現調節要素を含むことができる。前記発現カセットは、自ら複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。前記用語「作動可能に連結」とは、発現調節要素が目的タンパク質（外来タンパク質）をコードするポリヌクレオチドの転写調節（例、転写開始）を行えるように発現調節要素（例、プロモーター）とポリヌクレオチドとが機能的に連結されていることを意味することができる。作動可能な連結は、当業界における公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位－特異的ＤＮＡ切断および連結によって行われるが、これに制限されない。
前記ポリヌクレオチドを宿主細胞に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入するいかなる方法でも行うことが可能であり、宿主細胞により当分野にて公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法として、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿法、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが例示されるが、これに制限されるわけではない。
前記ポリヌクレオチドの宿主細胞遺伝体（染色体）内導入（挿入）は、公知の方法を当業者が適切に選択して行われ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍまたはＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質など）、それをコードする遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、それをコードするＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼタンパク質とガイドＲＮＡとの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合タンパク質（ＲＮＰ）、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ－コード遺伝子およびガイドＲＮＡ－コードＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群より選択された１つ以上）を用いて行われるが、これに制限されるわけではない。
本明細書において、用語「ベクター」は、好適な宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように好適な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主細胞のゲノム（遺伝体）と無関係に発現したり、宿主細胞のゲノム内に統合される。
本明細書において使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用されるすべてのベクターの中から選択されてもよい。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを例示することができるが、これに制限されない。
本明細書において使用可能なベクターは、公知の発現ベクターおよび／またはポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入用ベクターであってもよい。前記ポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入は、当業界にて知られた任意の方法、例えば、相同組換えまたはＣＲＩＳＰＲシステムによって行われるが、これに限定されない。前記ベクターは、前記染色体内挿入の有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入の有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与する遺伝子の中から選択されて使用可能である。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選別することができる。
他の例は、前記微生物を含む、パントテン酸またはパントイン酸生産用組成物を提供する。
他の例は、前記微生物を培地で培養する段階を含む、パントテン酸またはパントイン酸の製造方法を提供する。
他の例は、微生物の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を強化させる段階を含む、前記微生物のパントテン酸および／またはパントイン酸生産能を増加させる方法、または前記微生物にパントテン酸生産能を付与する方法を提供する。
前記微生物の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を強化させる段階は、前記微生物に３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドを発現するようにする変異を導入する段階を含むことができる。
前記変異を導入する段階は、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを微生物に導入（形質転換）させる段階を含むものであってもよい。
他の例は、前記３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性が強化された微生物を培地で培養する段階を含む、パントテン酸および／またはパントイン酸の生産方法を提供する。前記方法は、前記培養する段階の後に、前記培養された微生物、培地、またはこれらのすべてからパントテン酸および／またはパントイン酸を回収する段階を追加的に含むことができる。
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行われる。この時、培養条件は、特にこれに制限されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０～４５℃、または２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに制限されるわけではない。前記培養によって生産されたパントテン酸および／またはパントイン酸は、培地中に分泌されたり細胞内に残留しうる。
前記培養に使用可能な培地は、炭素供給源として糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜（ｍｏｌａｓｓｅ）、デンプンおよびセルロース）、乳脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、有機酸（例：酢酸）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用するか、または２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粉および尿素）、無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用するか、または２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。リン供給源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用するか、または２種以上を混合して使用することができるが、これに制限されない。また、前記培地は、その他の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸、および／またはビタミンなどのような必須成長－促進物質を含むことができる。
前記パントテン酸および／またはパントイン酸を回収する段階は、培養方法により当該分野にて公知の好適な方法を用いて培地、培養液、または微生物から目的とするアミノ酸を収集するものであってもよい。例えば、前記回収する段階は、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどから選択された１つ以上の方法で行われる。前記パントテン酸および／またはパントイン酸を回収する方法は、その前、同時、またはその後に、精製段階を追加的に含むことができる。
本明細書では、３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの変異体を提供し、これを用いて微生物のパントテン酸および／またはパントイン酸の生産能を増加させる技術が提供される。前記３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体を発現するようにする変異を微生物に導入することによって、パントテン酸および／またはパントイン酸の生産性を向上させたり、パントテン酸および／またはパントイン酸生産能を付与できる技術が提供される。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示に過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。下記記載の実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で変形できることは当業者にとって自明である。
実施例１．３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の探索および選別
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐａｎＢ）をクエリに設定してＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ探索の結果、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の活性を有すると推定される候補遺伝子とこれらを保有した微生物を選別した。そのうち、バイオセーフティーレベル（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ）が１等級の微生物由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を選別し、これを表１にまとめた。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐａｎＢ）をクエリに設定してＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ探索の結果、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の活性を有すると推定される候補遺伝子とこれらを保有した微生物を選別した。そのうち、バイオセーフティーレベル（ｂｉｏｓａｆｅｔｙ ｌｅｖｅｌ）が１等級の微生物由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を選別し、これを表１にまとめた。
実施例２．外来微生物由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼが導入されたコリネバクテリウム属微生物の作製
前記実施例１で確保された微生物のゲノムを抽出した後、これを鋳型として表１のプライマー配列を用いてＰＣＲを行って、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片を増幅した。前記ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高－信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行い、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を３０回繰り返す条件で行った。その結果、それぞれの３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片（ｐａｎＢ）を取得した。
前記実施例１で確保された微生物のゲノムを抽出した後、これを鋳型として表１のプライマー配列を用いてＰＣＲを行って、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片を増幅した。前記ＰＣＲはＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高－信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行い、変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を３０回繰り返す条件で行った。その結果、それぞれの３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ断片（ｐａｎＢ）を取得した。
コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＰＬＭ１プロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号２７と２８のプライマーを用いて前記記載されたものと同一にＰＣＲを行って、プロモーターＤＮＡ断片を取得した。
制限酵素ＢａｍＨＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＥＣＣＧ１１７（大韓民国登録特許第１０－００５７６８４号）ベクターと得られたＤＮＡ断片（各ｐａｎＢ、ＰＬＭ１プロモーター）をモル濃度（Ｍ）２：１：１（ｐＥＣＣＧ１１７ベクター：ｐａｎＢ：ＰＬＭ１）となるようにして、タカラ（ＴａＫａＲａ）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることによってプラスミドを取得し、前記取得されたプラスミドの名前と導入された遺伝子情報を前記表１に表記した。
作製された１３種のベクターをエレクトロポレーション法によってコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換して、外来ＰａｎＢ（３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）を発現する菌株を作製した。
実施例３．外来微生物由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼが発現するコリネバクテリウム属微生物のパントテン酸生産能調査
前記実施例２で得られた多様な外来微生物由来のｐａｎＢ発現菌株のパントテン酸の生産性を確認するために、下記のような組成からなる生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに親菌株（非形質転換菌株）および前記菌株をそれぞれ接種した後、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振盪培養してパントテン酸を製造した。
前記実施例２で得られた多様な外来微生物由来のｐａｎＢ発現菌株のパントテン酸の生産性を確認するために、下記のような組成からなる生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに親菌株（非形質転換菌株）および前記菌株をそれぞれ接種した後、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振盪培養してパントテン酸を製造した。
＜生産培地＞
ブドウ糖１０％、ベータ－アラニン０．５％、酵母抽出物０．４％、硫酸アンモニウム１．５％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水和物６．７ｍｇ／ｌ、ビオチン５０μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ１００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
ブドウ糖１０％、ベータ－アラニン０．５％、酵母抽出物０．４％、硫酸アンモニウム１．５％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水和物６．７ｍｇ／ｌ、ビオチン５０μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ１００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
前記得られた培養液を２０，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離後、上澄液をＴＤＷ（ｔｒｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で１／１０希釈した後、ＨＰＬＣ分析を行ってパントテン酸およびＬ－バリンの濃度を測定し、その結果を下記の表２に示した。
表２に示されているように、親菌株のコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２はパントテン酸を生産しないのに対し、試験されたすべての外来微生物由来のｐａｎＢ発現コリネバクテリウム・グルタミカム菌株は平均的に約０．６ｇ／Ｌのパントテン酸を生産した。特に、外来微生物由来のＰａｎＢの発現菌株のうち、大腸菌由来のｐａｎＢ発現菌株のＡＴＣＣ１３０３２ ｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＥＣ）が最も高いパントテン酸生産性（１．２ｇ／Ｌ）を示した。
上記の結果は、実施例１で選別された１３種の微生物由来の酵素（３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）がすべてパントテン酸生産能を示し、この中でも大腸菌由来の酵素が特に高いパントテン酸生産能を有することを示す。
実施例４．大腸菌由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子が導入されたコリネバクテリウム属微生物の作製
前記実施例３において、特に優れたパントテン酸生産能を有することが確認された大腸菌由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ－コード遺伝子（ｐａｎＢ）をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入するためのプラスミドを作製した。
前記実施例３において、特に優れたパントテン酸生産能を有することが確認された大腸菌由来の３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ－コード遺伝子（ｐａｎＢ）をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入するためのプラスミドを作製した。
まず、親菌株に存在するｐａｎＢを欠損させるためのベクターを作製した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号２９と３０および配列番号３１と３２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２５回繰り返す条件で行った。その結果、ｐａｎＢ遺伝子の上流領域１０００ｂｐとｐａｎＢ遺伝子の下流領域１０００ｂｐの遺伝子断片をそれぞれ取得し、ＱＩＡＧＥＮ社のＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて各増幅産物を精製して、ベクター作製のための挿入ＤＮＡ断片として用いた。
制限酵素ｓｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺ（大韓民国登録特許番号第０９２４０６５号）ベクターとＤＮＡ断片（ｐａｎＢ遺伝子の上流領域１０００ｂｐの遺伝子断片およびｐａｎＢ遺伝子の下流領域１０００ｂｐの遺伝子断片）をモル濃度（Ｍ）２：１：１となるようにして、タカラ（ＴａＫａＲａ）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることによって、ｐａｎＢ遺伝子を染色体上に欠損するためのベクターｐＤＺ＿ΔｐａｎＢを作製した。
大腸菌由来のｐａｎＢ遺伝子を用意するために、実施例２で作製されたプラスミドｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＥＣ）を鋳型として配列番号３３と３４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは変性９５℃、３０秒；アニーリング５５℃、３０秒；および重合反応７２℃、１分を２５回繰り返し行い、その結果、１０７７ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。制限酵素ｓｍａＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺ＿ΔｐａｎＢベクターと前記得られたＤＮＡ断片をモル濃度（Ｍ）１：２となるようにして、タカラ（ＴａＫａＲａ）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることによって、大腸菌由来のｐａｎＢ遺伝子を染色体上に導入するためのベクターｐＤＺ＿ΔｐａｎＢ：：ＰＬＭ１－ｐａｎＢ（ＥＣ）を作製した。
作製されたベクターｐＤＺ＿ΔｐａｎＢとｐＤＺ＿ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）をエレクトロポレーション法によりそれぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でｐａｎＢが欠損した菌株（ΔｐａｎＢ菌株）と大腸菌由来のｐａｎＢが導入された菌株（ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ））をそれぞれ得た。大腸菌由来のｐａｎＢの適切な置換の有無は、下記のプライマーの組み合わせを用いてＭＡＳＡ（Ｍｕｔａｎｔ Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ＰＣＲ手法（Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ，２，１１２－１１７（１９９３））を用いて確認した。つまり、大腸菌ｐａｎＢに符合するプライマーの組み合わせ（配列番号３５と２８および配列番号３６と１）では増幅される菌株を選別することによって１次決定し、選別された菌株のｐａｎＢ配列は配列番号３５および配列番号３６のプライマーの組み合わせを用いて分析することによって２次確認した。
前記のように得られた変異株のパントテン酸の生産性を確認するために、生産培地（実施例３参照）２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の野生型菌株、ΔｐａｎＢ菌株、およびΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）変異株を接種した後、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振盪培養してパントテン酸を製造した。
前記得られた培養液を２０，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離後、上澄液をＴＤＷ（ｔｒｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で１／１０希釈した後、ＨＰＬＣ分析を行ってパントテン酸およびＬ－バリンの濃度を測定し、その結果を下記の表３に示した。
表３に示されているように、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の野生型およびｐａｎＢ欠損（ΔｐａｎＢ）菌株は、パントテン酸を全く生産できなかったりほとんど生産できないのに対し、外来のｐａｎＢを発現する変異株コリネバクテリウム・グルタミカム（ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ））は０．４ｇ／ｌの濃度でパントテン酸を生産した。
実施例５．人工変異法（ＮＴＧに基づく変異）によるランダム突然変異株の作製およびｐａｎＢ生産菌株の選別
本実施例では、パントテン酸の生産能がより向上した微生物変異株を得るために、下記のような方法を用いて、実施例４により作製した大腸菌由来のｐａｎＢを発現する変異株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）菌株を親菌株として微生物の変異を誘導した。
本実施例では、パントテン酸の生産能がより向上した微生物変異株を得るために、下記のような方法を用いて、実施例４により作製した大腸菌由来のｐａｎＢを発現する変異株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）菌株を親菌株として微生物の変異を誘導した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）菌株を活性化培地で１６時間培養して活性化させ、１２１℃で１５分間滅菌した種培地に接種して１４時間培養した後、培養液５ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍＭクエン酸緩衝溶液（ｃｉｔｒｉｃ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した後、ＮＴＧ（Ｎ－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ’－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）を最終濃度２００ｍｇ／ｌとなるように添加して２０分間処理し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）で洗浄した。ＮＴＧが処理された菌株を最小培地に塗抹して死滅率を測定した結果、死滅率は８５％となった。生存した細胞を生産培地に接種および培養し、最終的に優れたパントテン酸生産能を示す変異株を２種選別して、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＶＢ５－０１（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、ＣＪＶＢ５－０１）およびＣＪＶＢ５－０２（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、ＣＪＶＢ５－０２）と名付けた。
本実施例で使用した培地の組成は下記の通りである。
＜活性化培地＞
牛肉抽出物１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母抽出物１％、寒天２％、ｐＨ７．２
牛肉抽出物１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母抽出物１％、寒天２％、ｐＨ７．２
＜生産培地＞
ブドウ糖１０％、ベータ－アラニン０．５％、酵母抽出物０．４％、硫酸アンモニウム１．５％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水和物６．７ｍｇ／ｌ、ビオチン５０μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
ブドウ糖１０％、ベータ－アラニン０．５％、酵母抽出物０．４％、硫酸アンモニウム１．５％、第１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム７水和物０．０５％、硫酸鉄７水和物１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１水和物６．７ｍｇ／ｌ、ビオチン５０μｇ／ｌ、チアミン・ＨＣｌ １００μｇ／ｌ、ｐＨ７．２
＜最小培地＞
ブドウ糖１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、第１リン酸カリウム０．１％、尿素０．１％、チアミン０．００１％、ビオチン２００μｇ／ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２
ブドウ糖１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、第１リン酸カリウム０．１％、尿素０．１％、チアミン０．００１％、ビオチン２００μｇ／ｌ、寒天２％、ｐＨ７．２
前記得られた変異株コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＶＢ５－０１およびＣＪＶＢ５－０２のパントテン酸生産能を確認するために、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）菌株、ＣＪＶＢ５－０１変異株およびＣＪＶＢ５－０２変異株をそれぞれ接種した後、３２℃で４８時間、２００ｒｐｍで振盪培養してパントテン酸を製造した。
前記得られた培養液を２０，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離後、上澄液をＴＤＷ（ｔｒｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で１／１０希釈した後、ＨＰＬＣ分析を行ってパントテン酸およびＬ－バリンの濃度を測定し、その結果を下記の表４および表５に示した。
前記表４および表５に示されているように、コリネバクテリウム・グルタミカムΔｐａｎＢ菌株はパントテン酸を生産しておらず、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＶＢ５－０１変異株およびＣＪＶＢ５－０２変異株は外来ｐａｎＢが挿入されたコリネバクテリウム・グルタミカムΔｐａｎＢ：：ｐａｎＢ（ＥＣ）と比較して、より優れたパントテン酸生産能を示すことを確認した。また、３－メチル－２－オキソブタノエートを基質とする物質であるバリンの濃度が減少したことから、ＣＪＶＢ５－１変異株およびＣＪＶＢ５－０２変異株のパントテン酸生産能が野生型よりはるかに強くなったことを確認することができた。
コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＶＢ５－０１変異株のゲノムシーケンシングの結果、挿入された大腸菌ｐａｎＢ遺伝子が、野生型大腸菌３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（配列番号３７）にＧ１１６Ａ変異（配列番号３７のアミノ酸配列のうち１１６番目のアミノ酸残基のＧ（Ｇｌｙ）がＡ（Ａｌａ）に置換）が導入された変異体をコードするように変異したことを確認した。以下、「Ｇ１１６Ａ」のようにアミノ酸位置を用いたアミノ酸変異表示は、アミノ酸変異および／またはこのようなアミノ酸変異を誘導する遺伝子変異を意味するものと理解される。前記Ｇ１１６Ａ変異が導入された大腸菌３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号６２に示した。
コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪＶＢ５－０２変異株のゲノムシーケンシングの結果、挿入された大腸菌ｐａｎＢ遺伝子が、野生型大腸菌３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（配列番号３７）にＡ１５９Ｌ変異（配列番号３７のアミノ酸配列のうち１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基のＡ（Ａｌａ、アラニン）がＬ（Ｌｅｕ、ロイシン）に置換）が導入された変異体をコードするように変異したことを確認した。以下、「Ａ１５９Ｌ」のようにアミノ酸位置を用いたアミノ酸変異表示は、アミノ酸変異および／またはこのようなアミノ酸変異を誘導する遺伝子変異を意味するものと理解される。前記Ａ１５９Ｌ変異が導入された大腸菌３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号１１０に示した。
上記の結果により、ランダム突然変異法により得られたＣＪＶＢ５－０１変異株およびＣＪＶＢ５－０２変異株がピルビン酸からパントテン酸の合成される経路が阻害されず、パントテン酸を高効率および高収率で生産できることを確認した。
実施例６．３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの活性を有する変異型ｐａｎＢプラスミドの作製
前記実施例５によりパントテン酸生産能に影響を与えることが確認された大腸菌ＰａｎＢ（３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）の変異位置である１１６番目および／または１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基がパントテン酸生産能の増加に重要な位置であることを確認するために、この位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型を作製して、その効果を確認した。
前記実施例５によりパントテン酸生産能に影響を与えることが確認された大腸菌ＰａｎＢ（３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ）の変異位置である１１６番目および／または１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基がパントテン酸生産能の増加に重要な位置であることを確認するために、この位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型を作製して、その効果を確認した。
実施例２で作製されたｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＥＣ）（表１参照）を鋳型とし、下記の表６に記載のプライマーを用いて、大腸菌ＰａｎＢ（配列番号３７）の１１６番目位置のアミノ酸のＧ（Ｇｌｙ）が他のアミノ酸に置換されたランダム突然変異（飽和突然変異誘発：Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が導入された（つまり、前記ランダム突然変異が導入された大腸菌ＰａｎＢをコードするように変異したｐａｎＢ遺伝子が導入された）変異体を作製した。また、下記の表７に記載のプライマーを用いて、大腸菌ＰａｎＢ（配列番号３７）の１５９番目位置のアミノ酸のＡ（Ａｌａ）が他のアミノ酸に置換されたランダム突然変異が導入された変異体を作製した。実施例１で作製されたｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＥＣ）を鋳型として使用した。それぞれの飽和突然変異誘発（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が導入された変異株の変異型による置換されたアミノ酸および各変異型に使用されたプライマーを下記の表６および表７にまとめた。
具体的には、前記表６および表７で提示したプライマーを用いて、実施例２で作製されたｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＥＣ）（表１参照）を鋳型としてＰＣＲを行った。重合酵素はＳｏｌｇＴＭ Ｐｆｕ－Ｘ ＤＮＡポリメラーゼ（ＳｏｌＧｅｎｔ ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を使用し、ＰＣＲは９５℃で１０分間変性後、９５℃３０秒変性、５５℃３０秒アニーリング、７２℃１分重合を２５回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行って進行させた。その結果、３－メチル－２－オキソブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺伝子の変異（１１６番目の残基）を中心に５’上流部位の６１０ｂｐのＤＮＡ断片と３’下流部位の４７０ｂｐのＤＮＡ断片を得、１５９番目の残基を中心に５’上流部位の４７７ｂｐのＤＮＡ断片と３’下流部位の３１８ｂｐのＤＮＡ断片を得ており、制限酵素ＢａｍＨＩで処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＥＣＣＧ１１７（大韓民国登録特許第１０－００５７６８４号）ベクターと前記得られたそれぞれのＤＮＡ断片（１１６番目の残基：５’上流部位の６１０ｂｐのＤＮＡ断片および３’下流部位の４７０ｂｐのＤＮＡ断片、１５９番目の残基：５’上流部位の４７７ｂｐのＤＮＡ断片および３’下流部位の３１８ｂｐのＤＮＡ断片）をモル濃度（Ｍ）２：１：１となるようにして、タカラ（ＴａＫａＲａ）のＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて提供されたマニュアルによりクローニングすることによって、変異ｐａｎＢ導入のためのプラスミドを取得した。コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＰＬＭ１プロモーターを確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２）ゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１０８と１０９のプライマーを用いて前記記載されたものと同一にＰＣＲを行って、プロモーターＤＮＡ断片を取得した。
前記得られた変異プラスミドの情報を下記の表８および表９にまとめた。
実施例７．変異型３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼのパントテン酸生産能評価
実施例６で作製された変異プラスミド（表８および表９）とｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＷＴ－ＥＣ）（表１）を、それぞれ実施例４で作製されたＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有する選別培地で塗抹して、それぞれのランダム突然変異（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が導入された計１９種の形質転換変異株を取得した。その後、実施例３と同様の方法でフラスコ評価を進行させて、得られたパントテン酸生産能を測定した。前記得られた結果を表１０および表１１に示した：
実施例６で作製された変異プラスミド（表８および表９）とｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＷＴ－ＥＣ）（表１）を、それぞれ実施例４で作製されたＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含有する選別培地で塗抹して、それぞれのランダム突然変異（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が導入された計１９種の形質転換変異株を取得した。その後、実施例３と同様の方法でフラスコ評価を進行させて、得られたパントテン酸生産能を測定した。前記得られた結果を表１０および表１１に示した：
上記の表１０から分かるように、ＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ菌株はパントテン酸を生産しないのに対し、大腸菌ＰａｎＢ（野生型）またはその変異型が導入された変異株はすべてパントテン酸生産能を示した。また、Ｇ１１６Ｓ、Ｇ１１６Ｃ、Ｇ１１６Ｌ、Ｇ１１６Ｉ、Ｇ１１６Ｔ、Ｇ１１６Ｖ、Ｇ１１６Ｄ、Ｇ１１６Ｅ、Ｇ１１６Ｎ、Ｇ１１６Ａ、Ｇ１１６Ｍ、またはＧ１１６Ｑ変異が導入された変異株は大腸菌ＰａｎＢ（野生型）を含む変異株のＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ ｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＷＴ）と比較して、より高い水準でパントテン酸を生産した。このような結果により、大腸菌ＰａｎＢの野生型および変異型ともパントテン酸の生産増加効果を有し、特にＰａｎＢ（配列番号３７）の１１６番目のアミノ酸残基がパントテン酸の生産に重要な位置であり、この位置のアミノ酸を元と異なる多様なアミノ酸に置換する場合、パントテン酸の生産能がより増加することを確認することができた。
本実施例において、パントテン酸の生産能に最も優れていることが確認されたＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ ｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（Ｇ１１６Ａ）菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＶ０３－５００１と名付ける）を、２０２０年６月８日付で大韓民国ソウル特別市西大門区（ソデムング）弘済洞（ホンジェドン）所在の韓国微生物保存センターに寄託して、ＫＣＣＭ１２７４４Ｐの寄託番号が与えられた。
また、前記表１１から確認できるように、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株はパントテン酸を生産しないのに対し、前記作製された１９種の変異株はすべてパントテン酸生産能を示し、このうち、野生型ｐａｎＢ（配列番号３７）の１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）に変異した変異株は、野生型ｐａｎＢを含むＡＴＣＣ１３０３２ ｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＷＴ）菌株と比較して、高い水準でパントテン酸を生産した。このような結果により、ｐａｎＢ（配列番号３７）の１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基がパントテン酸の生産に重要な位置であることを確認することができ、この位置のアミノ酸を元と異なる多様なアミノ酸に置換する場合、パントテン酸の生産能がより増加することを確認することができた。
本実施例において、パントテン酸の生産能に最も優れていることが確認されたＡＴＣＣ１３０３２ΔｐａｎＢ ｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（Ａ１５９Ｌ）菌株をＣＶ０３－５００２と名付け、２０２１年４月１３日付で大韓民国ソウル特別市西大門区（ソデムング）弘済洞（ホンジェドン）所在の韓国微生物保存センターに寄託して、ＫＣＣＭ１２９７３Ｐの寄託番号が与えられた。
実施例８．パントテン酸生産能が向上した変異型３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼの作製および評価
実施例７で効果を確認した３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧ１１６Ａ変異体と、３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼＡ１５９Ｌ変異体とを組み合わせて、追加的な活性の向上があるか否かを確認した。
実施例７で効果を確認した３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧ１１６Ａ変異体と、３－メチル－２ケトブタノエートヒドロキシメチルトランスフェラーゼＡ１５９Ｌ変異体とを組み合わせて、追加的な活性の向上があるか否かを確認した。
Ｇ１１６ＡとＡ１５９Ｌ変異体を含むベクターを作製するために、実施例２で作製されたｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（Ａ１５９Ｌ）を鋳型として配列番号７４、１２６および配列番号７７、１２７のプライマーを用いて、実施例２に記載されたものと同一にＧ１１６ＡとＡ１５９Ｌがすべて含まれているベクターを作製した。作製された変異プラスミドｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（Ｇ１１６Ａ、Ａ１５９Ｌ）を野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法で導入した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する選別培地で塗抹して、それぞれの形質転換株を取得した。その後、実施例２と同様の方法でフラスコ評価を進行させて、得られたパントテン酸生産能を測定した。前記得られた結果を下記の表１２に示した。
前記表１２から確認できるように、ＡＴＣＣ１３０３２菌株はパントテン酸を生産しないのに対し、ｐａｎＢの１１６番目の残基に相応するアミノ酸変異と１５９番目の残基に相応するアミノ酸変異とをすべて含む変異株は野生型ｐａｎＢを含むＡＴＣＣ１３０３２ ｐＥＣＣＧ１１７－ｐａｎＢ（ＷＴ）菌株と比較して高い水準でパントテン酸を生産し、Ａ１５９ＬまたはＧ１１６Ａ変異を含む変異株よりも高い水準でパントテン酸を生産した。このような結果により、ｐａｎＢの１１６番目と１５９番目の残基に相応するアミノ酸残基がパントテン酸の生産に重要な位置であることを確認することができ、この位置のアミノ酸を元と異なるアミノ酸に置換する場合、パントテン酸の生産能がより増加することを確認することができた。
以上の説明から、本出願の属する技術分野における当業者は本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連し、以上に述べた実施例はあらゆる面で例示的であり、限定的ではないと理解しなければならない。本出願の範囲は、上記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれると解釈されなければならない。
（受託番号）
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２７４４Ｐ
受託日付：２０２００６０８
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２９７３Ｐ
受託日付：２０２１０４１３
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２７４４Ｐ
受託日付：２０２００６０８
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２９７３Ｐ
受託日付：２０２１０４１３
Claims (18)
- 配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、ポリペプチド。
- 前記１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）に置換された、請求項１に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、配列番号１１０～配列番号１２５のアミノ酸配列からなる群より選択されたいずれか１つの配列番号のアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載のポリペプチド。
- 配列番号３７のアミノ酸配列において、
（１）Ｎ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され；および
（２）Ｎ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、ポリペプチド。 - （１）前記１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）に置換され；および
（２）前記１１６番目の残基に相応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、またはメチオニン（Ｍ）に置換された、請求項４に記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドは、配列番号１２８のアミノ酸配列からなるものである、請求項４に記載のポリペプチド。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- （１）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上；または
（２）配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｎ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターからなる群より選択された１つ以上を含む、
パントテン酸またはパントイン酸を生産する微生物。 - 前記１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）に置換された、請求項９に記載の微生物。
- 前記配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドは、
配列番号１１０～配列番号１２５のアミノ酸配列からなる群より選択されたいずれか１つの配列番号のアミノ酸配列からなるものである、請求項９に記載の微生物。 - （１）前記１５９番目の残基に相応するアミノ酸が、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ）、プロリン（Ｐ）、ヒスチジン（Ｈ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、トレオニン（Ｔ）、リジン（Ｋ）、バリン（Ｖ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、またはグルタミン（Ｑ）に置換され；および
（２）前記１１６番目の残基に相応するアミノ酸が、アラニン（Ａ）、アスパラギン（Ｎ）、トレオニン（Ｔ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン酸（Ｄ）、システイン（Ｃ）、グルタミン（Ｑ）、またはメチオニン（Ｍ）に置換された、請求項９に記載の微生物。 - 前記配列番号３７のアミノ酸配列においてＮ－末端から１５９番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、Ｎ－末端から１１６番目の残基に相応するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドは、
配列番号１２８のアミノ酸配列からなるものである、請求項９に記載の微生物。 - 前記微生物は、コリネバクテリウム属微生物またはエシェリキア属微生物である、請求項９に記載の微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１４に記載の微生物。
- 請求項９～１５のいずれか１項に記載の微生物を含む、パントテン酸またはパントイン酸生産用組成物。
- 請求項９～１５のいずれか１項に記載の微生物を培地で培養する段階を含む、パントテン酸またはパントイン酸の製造方法。
- 前記培養する段階の後に、培養された微生物、培地、またはこれらのすべてからパントテン酸またはパントイン酸を回収する段階を追加的に含む、請求項１７に記載のパントテン酸またはパントイン酸の製造方法。
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