JP6582997B2 - 変異型グルタミン酸−システインリガーゼ、及び、γ−グルタミルバリルグリシンの製造法 - Google Patents
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Description
[1]
野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる1またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する、変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
[2]
前記変異が、下記より選ばれる1またはそれ以上の変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135(I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T)、
Q144(F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I)、
Y241(A)、
N243(I, W, K, R, H)、
Y300(A, H, R, K)。
[3]
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
[4]
前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135(I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T)、
Q144(F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I)、
N243(R, H)、
Y300(R, K)、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
[5]
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記(a)、(b)、又は(c)に記載のタンパク質である、前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
[6]
γ−グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性の比率が0.7以上である、前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼ。
[7]
γ−グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性の比率が0.7以上である、変異型グルタミン酸−システインリガーゼ。
[8]
下記工程(A)を含む、γ-Glu-Valおよび/またはその塩の製造法:
(A)前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程。
[9]
下記工程(A)および(B)を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび/またはその塩の製造法:
(A)前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程;および
(B)グルタチオン合成酵素を工程(A)で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
[10]
下記工程(C)を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび/またはその塩の製造法:
(C)前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
[11]
前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼが、精製酵素である、前記方法。
[12]
前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼが、固定化酵素である、前記方法。
[13]
前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼが、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
[14]
前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
[15]
前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
[16]
前記微生物が、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、前記方法。
[17]
前記微生物が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
[18]
前記工程がATPの存在下で実施される、前記方法。
[19]
前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼをコードする遺伝子。
[20]
前記遺伝子を搭載するベクター。
[21]
前記遺伝子または前記ベクターを有する微生物。
[22]
γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、前記微生物。
[23]
グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、前記微生物。
[24]
エシェリヒア・コリである、前記微生物。
「グルタミン酸−システインリガーゼ(glutamate-cysteine ligase)」は、通常、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素(EC 6.3.2.2)として知られている。本発明において、同活性を、「γ−グルタミルシステイン合成酵素(gamma-glutamylcysteine synthetase)活性」ともいう。本発明において、グルタミン酸−システインリガーゼを、「GSHA」ともいう。
L135、Q144、Y241、N243、Y300。
上記表記において、数字は配列番号2に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における位置を、数字の左側の文字は配列番号2に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における当該位置のアミノ酸残基(すなわち、変異前のアミノ酸残基;一文字表記)を、各々示す。すなわち、例えば、「L135」は、配列番号2に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基を示す。
L135(I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T)、
Q144(F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I)、
Y241(A)、
N243(I, W, K, R, H)、
Y300(A, H, R, K)。
上記表記において、数字およびその左側の文字の意味は前記と同様である。数字の右側のカッコ内の文字は、変異後のアミノ酸残基(一文字表記)を示す。すなわち、例えば、「L135(I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T)」は、配列番号2に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle、Phe、Met、Val、Gly、Ala、Trp、Lys、His、Arg、Cys、Asn、Ser、およびThrのいずれかのアミノ酸残基に置換される変異を示す。なお、各変異後のアミノ酸をカッコなしで表記してもよい。すなわち、例えば、「L135I」は、配列番号2に示す野生型GSHAのアミノ酸配列における135位のLeu残基がIle残基に置換される変異を示す。
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
上記表記において、数字、数字の左側の文字、および数字の右側の文字の意味は前記と同様である。また、上記表記において、「/」で区切られた2又はそれ以上の変異の併記は、二重変異又はそれ以上の多重変異を示す。すなわち、例えば、「L135I/Q144R」は、L135IとQ144Rの二重変異を示す。
L135(I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T)、
Q144(F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I)、
N243(R, H)、
Y300(R, K)、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。
変異型GSHAは、変異型gshA遺伝子を有する宿主に変異型gshA遺伝子を発現させることにより製造できる。変異型gshA遺伝子を有する宿主は、変異型gshA遺伝子を適当な宿主に導入することにより取得できる。なお、「変異型gshA遺伝子を宿主に導入する」ことには、宿主の染色体上のgshA遺伝子を「特定の変異」を有するように改変することも含まれる。なお、変異型gshA遺伝子を有する宿主を、変異型GSHAを有する宿主ともいう。また、変異型GSHAは、変異型gshA遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
「グルタチオン合成酵素(glutathione synthase)」は、通常、γ-Glu-CysとGlyとATPを基質として、グルタチオン(γ-Glu-Cys-Gly)とADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素(EC 6.3.2.3)として知られている。本発明において、同活性を、「グルタチオン合成酵素活性」ともいう。本発明において、グルタチオン合成酵素を、「GSHB」ともいう。
本発明は、変異型GSHAを利用したγ-Glu-Valの製造法や変異型GSHAを利用したγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。これらの方法を総称して、「本発明の方法」ともいう。
本発明は、変異型GSHAを利用してγ-Glu-Val-Glyを酵素的に製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法(酵素法)」ともいう。
本発明は、変異型GSHAを利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法(発酵法)」ともいう。
(A1)変異型GSHAを有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程;
(A2)変異型GSHAを有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程;
(B1)GSHBを有する微生物を工程(A1)または(A2)で生成したγ-Glu-ValおよびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程;
(B2)GSHBを有し、且つ、Glyの生産能を有する微生物を工程(A1)または(A2)で生成したγ-Glu-Valを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
本実施例では、エシェリヒア・コリのgshA遺伝子及びエシェリヒア・コリのgshB遺伝子を搭載するプラスミドpSH1391(Suzuki, H., et al J. Bacteriol. 187: 5861-5867 (2005))を出発材料に、開始コドンがATGに置換されたエシェリヒア・コリの野生型gshA遺伝子の発現プラスミドpTO1を構築した。
pSH1391のプラスミド構築法は以下の通りである。エシェリヒア・コリのgshA遺伝子を取得する目的で、エシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076)のゲノムDNAを鋳型として、ストラタジーン社製のPfuポリメラーゼを使用して、配列番号7、8のプライマー(表1)を用いてPCRを実施した。PCR産物をPvuI/PstIで消化して得られたgshA遺伝子を含む約2.4kbの断片と、pBR322をPvuI/PstI消化して得られた約4.2kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、20μg/mLのテトラサイクリン塩酸塩(Tc)を含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpFK68と名付けた。
pET3-a(ノバジェン社製)をSphI消化し、末端をブラント処理後、PvuII消化し、得られた約3.1kbのDNA断片をセルフライゲーションしてプラスミドpSH1558を作製した。pSH1558をAatII/BglII消化して得られた約2.4kbのアンピシリン耐性遺伝子を含む断片とpSH1391をAatII/BglII消化して得られたエシェリヒア・コリの野生型gshA遺伝子の部分断片を含む約3.6kbの断片をライゲーションした。該反応液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、100μg/mLのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、37℃で18時間培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、目的の構造を持つプラスミドをpSH1559と名付けた。
本実施例では、pTO1を基に、各種変異型gshA遺伝子の発現プラスミドを構築した。
実施例2で取得した各菌株を30μg/mLのKanを含む10 mLのLB培地に接種し、37℃、120往復/分で一晩振とう培養することで前培養液を調製した。得られた前培養液の濁度(600nm)を測定し、初期濁度が0.1となるように、500 mL容三角フラスコに張り込んだ30μg/mLのKanを含むLB培地100 mLに前培養液を接種した。37℃、100往復/分で終夜振とう培養した後に、遠心分離(4℃、8,000 rpm、5分)によって集菌した。沈殿として得られた菌体を5mLのTris-HCl buffer (pH 8.0) に懸濁し、再度遠心分離(4℃、8,000 rpm、5分)することによって菌体を洗浄した。沈殿として得られた菌体を3mLのTris-HCl buffer (pH 8.0)に再度懸濁し、氷水で冷やしながら超音波破砕(190 W、5分間)を行った。破砕処理液を遠心分離(4℃、8,000 rpm、10分)し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
エシェリヒア・コリMG1655(ATCC 47076)のグルタミン酸−システインリガーゼをコードするgshA遺伝子の発現プラスミドpSF12-EcGshAを以下の手順で構築した。gshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGSHAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号1および配列番号2に示す。なお、同遺伝子の開始コドンはTTGであったため、pSF12-EcGshAの構築に際し、開始コドンをATGに置換した。また、pSF12-EcGshAによれば、GSHAはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
変異型gshA遺伝子を構築するため、Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit(ストラタジーン社)を使用し、製造元のプロトコールに従って、各種変異型gshA遺伝子に対応するプライマー(配列番号29〜76)を用いて、実施例4に記載したpSF12-EcGshAを鋳型として、PCRを実施した。各変異とプライマーの関係を表8に示す。表中、大文字表記の配列が変異の導入されるアミノ酸残基に対応する。
実施例4及び実施例5で取得した各菌株(各gshA遺伝子発現プラスミドを有するJM109株)を100μg/mLのAmpを含むLB培地(1.0%(w/v)ペプトン、0.5%(w/v)酵母エキス、1.0%(w/v)NaCl)3mLに接種し、30℃、120往復/分で20時間振とう培養することで前培養液を調製した。得られた前培養液150μlを、100μg/mLのAmpを含むTB培地(1.2%(w/v)トリプトン、2.4%(w/v)酵母エキス、0.4%(w/v)グリセロール、0.23%(w/v)KH2PO4、1.25%(w/v)K2HPO4)15mLを張り込んだ70mL容の試験管(φ25mm)に接種した。30℃、120往復/分で20時間振とう培養した後に、遠心分離(4℃、12,000×g、5分)によって集菌した。沈殿として得られた菌体を0.2 mLの緩衝液(20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM イミダゾール, 15 % グリセロール)に懸濁し、冷却しながら超音波破砕処理に供して菌体を破砕した。得られた菌体破砕液を遠心分離(4℃、29,100×g、10分)し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
エシェリヒア・コリW3110株(ATCC 27325)のグルタチオン合成酵素をコードするgshB遺伝子(配列番号3)の発現プラスミドpET-EcgshBを特開2012-85637に記載の方法で構築した。続いて、pET-EcgshBを用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3) (Life Technologies社製)を形質転換し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-EcgshBを得た。gshB遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるGSHBのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号3および配列番号4に示す。なお、pET-EcgshBによれば、GSHBはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
実施例6で取得した各精製GSHAについて、γ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性を測定した。
実施例6で取得した各精製GSHAおよび実施例7で取得した精製GSHBを用い、アミノ酸からのγ-Glu-Val-Gly(CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ぶ)の生成を検討した。γ-Glu-Val-Glyの構造式を下記式(I)に示す。
独立行政法人理化学研究所の無細胞タンパク質合成サービス(http://www.ynmr.riken.jp/fees/external_fee_2013.html)に委託して、エシェリヒア・コリMG1655(ATCC 47076)由来の野生型GSHAと変異型GSHAの精製酵素を取得し、以降の実験に用いた。なお、タンパク質合成後、Niに対するaffinity精製により得られた溶出画分を精製酵素とした。溶出には緩衝液(50mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0), 10% グリセロール, 300mM イミダゾール, 300mM NaCl, 1mM DTT)が用いられた。また、これらの遺伝子の開始コドンはTTGであったため、タンパク質合成に際し、開始コドンをATGに置換した。また、野生型GSHAおよび変異型GSHAはC末端に6個のHis残基が付加された形態で発現する。また、タンパク質合成に際し、無細胞タンパク質合成サービスの発現量向上オプションを利用した。
実施例10で取得した各精製GSHAについて、γ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性を測定した。
配列番号1:Escherichia coli MG1655株の野生型gshA遺伝子の塩基配列
配列番号2:Escherichia coli MG1655株の野生型GSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号3:Escherichia coli W3110株のgshB遺伝子の塩基配列
配列番号4:Escherichia coli W3110株のGSHBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:Escherichia coli MG1655株のggt遺伝子の塩基配列
配列番号6:Escherichia coli MG1655株のGGTタンパク質のアミノ酸配列
配列番号7〜106:プライマー
Claims (21)
- 野生型グルタミン酸−システインリガーゼにおいて下記より選ばれる1またはそれ以上のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基に変異を有し、且つ、γ−グルタミルバリン合成酵素活性を有する、変異型グルタミン酸−システインリガーゼであって:
L135、Q144、Y241、N243、Y300、
前記野生型グルタミン酸−システインリガーゼが、下記(a)、(b)、又は(c)に記載のタンパク質であり:
(a)配列番号2に示すアミノ酸配列を含むタンパク質;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質;
(c)配列番号2に示すアミノ酸配列に対し90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、
γ−グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ−グルタミルバリン合成酵素活性の比率が0.7以上である、変異型グルタミン酸−システインリガーゼ。 - 前記変異が、下記より選ばれる1またはそれ以上の変異に相当する変異を含む、請求項1に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135(I, F, M, V, G, A, W, K, H, R, C, N, S, T)、
Q144(F, A, N, S, D, T, R, H, G, K, Y, W, C, M, P, V, L, I)、
Y241(A)、
N243(I, W, K, R, H)、
Y300(A, H, R, K)。 - 前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項1又は2に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135F/N243W、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/N243F、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243Y、L135M/N243R、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144R/N243F、Q144D/N243W、Q144D/N243F、Q144A/N243W
、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144I、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135K/Q144L、L135H/Q144L、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135Q/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。 - 前記変異が、下記のいずれかの変異に相当する変異を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼ:
L135(I, M, V, G, A, K, H, C, N, S, T)、
Q144(F, A, S, D, T, R, H, K, Y, W, C, M, P, V, L, I)、
N243(R, H)、
Y300(R, K)、
L135I/Q144R、L135I/Q144D、L135I/Q144A、L135I/Q144L、L135I/N243W、L135I/N243F、L135F/Q144A、L135M/Q144R、L135M/Q144A、L135M/Q144L、L135M/N243W、L135M/Q144H、L135M/Q144N、L135M/N243C、L135V/Q144R、L135V/Q144D、L135V/Q144A、L135V/Q144L、L135V/Q144V、L135V/Q144K、L135V/Q144C、L135V/Q144T、L135H/Q144R、L135G/Q144L、L135A/Q144L、L135V/N243W、L135V/N243F、L135V/N243P、Q144R/N243W、Q144D/N243W、Q144A/N243W、Q144A/N243F、Q144L/N243W、Q144L/N243F、L135M/Q144F、L135M/N243A、L135V/N243G
、L135V/N243A、L135V/N243L、L135V/N243Y、L135V/N243K、L135V/N243R、L135V/N243H、L135V/N243D、L135V/N243E、L135V/N243C、L135V/N243Q、L135V/N243S、L135V/N243T、L135V/Q144P、L135V/Q144W、L135V/Q144H、L135V/Q144E、L135V/Q144N、L135V/Q144S、L135D/Q144L、L135C/Q144L、L135N/Q144L、L135S/Q144L、L135T/Q144L。 - 下記工程(A)を含む、γ-Glu-Valおよび/またはその塩の製造法:
(A)請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程。 - 下記工程(A)および(B)を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび/またはその塩の製造法:(A)請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼをGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程;および
(B)グルタチオン合成酵素を工程(A)で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させる
ことによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。 - 下記工程(C)を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび/またはその塩の製造法:
(C)請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。 - 前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼが、精製酵素である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼが、固定化酵素である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼが、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌
体の処理物に含有されるものである、請求項6〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記変異型グルタミン酸−システインリガーゼおよびグルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項6または7に記載の方法。
- 前記微生物が、γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、請求項10〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項10〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記工程がATPの存在下で実施される、請求項5〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の変異型グルタミン酸−システインリガーゼをコードする遺伝子。
- 請求項16に記載の遺伝子を搭載するベクター。
- 請求項16に記載の遺伝子または請求項17に記載のベクターを有する微生物。
- γ−グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、請求項18に記載の微生物。
- グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項18または19に記載の微生物。
- エシェリヒア・コリである、請求項18〜20のいずれか1項に記載の微生物。
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