BR112020000525A2 - micro-organismo que expressa d-prolina redutase ativa, métodos para produzir d-prolina redutase ativa e um ou mais ácidos, proteína prdh, e, método para produzir um micro-organismo que expressa d-prolina redutase ativa. - Google Patents

micro-organismo que expressa d-prolina redutase ativa, métodos para produzir d-prolina redutase ativa e um ou mais ácidos, proteína prdh, e, método para produzir um micro-organismo que expressa d-prolina redutase ativa. Download PDF

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Abstract

A presente revelação se refere a um micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa.

Description

MICRO-ORGANISMO QUE EXPRESSA D-PROLINA REDUTASE ATIVA, MÉTODOS PARA PRODUZIR D-PROLINA REDUTASE ATIVA E UM OU MAIS ÁCIDOS, PROTEÍNA PRDH, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM MICRO-ORGANISMO QUE EXPRESSA D-PROLINA REDUTASE ATIVA [CAMPO DA TÉCNICA]
[001] A presente revelação refere-se a um micro-organismo que expressa D-prolina redutase, em que as atividades de proteína PrdA, proteína PrdB e proteína PrdH são intensificadas; e um método para produzir a D-prolina redutase ativa correspondente. Sobre esta base, a presente revelação também se refere a um método para reduzir D-prolina e um análogo de D-prolina; e proteína PrdH que tem atividade para converter D-prolina redutase inativa em D-prolina redutase ativa enquanto é coexpressa com a proteína PrdA e a proteína PrdB. [ANTECEDENTES DA TÉCNICA]
[002] Devido às tendências de desenvolvimento de produtos ecologicamente corretos, bem como à crise de depleção de óleo e suprimento de petróleo instável, foram realizadas pesquisas e desenvolvimento de produtos derivados de biomassa, como bioplásticos, bioenergia, etc. Em particular, muitos estudos estão sendo feitos para aplicar vários monômeros derivados de biomassa ao náilon. Por exemplo, está sendo estudado o desenvolvimento do náilon 4,6 através da aplicação de putrescina derivada de biomassa e do náilon 5,6 como uma alternativa para hexametileno diamina (HMDA) do náilon 6,6 através da aplicação de cadaverina derivada de biomassa. O desenvolvimento de produtos de náilon 4 com o uso de ácido 4-aminobutírico (ou ácido gama-aminobutírico (GABA)) como um monômero que pode ser produzido a partir do ácido glutâmico como uma matéria-prima através de glutamato descarboxilase também está em andamento.
[003] É de conhecimento que o ácido 5-aminovalérico que é um monômero de náilon 5 seja convertido a partir de prolina pela D-prolina redutase. Entretanto, a ativação da D-prolina redutase exige uma autoclivagem precisa da proteína PrdA e a introdução de um grupo piruvoíla ao mesmo tempo. Entretanto, isso é considerado como uma limitação da técnica e, dessa forma, há uma demanda crescente por um método com capacidade para preparar a D- prolina redutase ativa. [REVELAÇÃO] [PROBLEMA DA TÉCNICA]
[004] Os presentes inventores continuaram a estudar um sistema de expressão recombinante e uma cepa de micro-organismo que podem produzir D- prolina redutase em uma forma ativa, e também a estudar sua aplicabilidade a vários substratos análogos de D-prolina. Como resultado, identificaram pela primeira vez a proteína PrdH que converte D-prolina redutase inativa em D- prolina redutase ativa enquanto é coexpressa com a proteína PrdA e a proteína PrdB. Adicionalmente, demonstraram com sucesso um micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa e a atividade da D-prolina redutase produzida a partir da mesma. [SOLUÇÃO DA TÉCNICA]
[005] Um objetivo da presente revelação é fornecer um micro- organismo que expressa Dr-prolina redutase ativa, em que as atividades de proteína PrdA, proteína PrdB e proteína PrdH são intensificadas.
[006] Um outro objetivo da presente divulgação é fornecer um método para produzir D-prolina redutase ativa, sendo que o método inclui as etapas de cultivar o micro-organismo em um meio e recuperar a D-prolina redutase ativa a partir do micro-organismo ou do meio.
[007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir um ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido aminovalérico (ácido 5-aminovalérico, 5-AVA), ácido y-aminobutírico (GABA)
e ácido 5-amino-4-hidroxipentanoico com o uso do micro-organismo ou da D- prolina redutase ativa produzida pelo micro-organismo.
[008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer a proteína PrdH que converte D-prolina redutase inativa em D-prolina redutase ativa enquanto é coexpressa com a proteína PrdA e a proteína PrdB.
[009] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir o micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, sendo que o método inclui as etapas de transformar uma célula hospedeira com um cassete de expressão que inclui o gene prdA ou os genes prdA e prdH e transformar a célula hospedeira com um cassete de expressão que inclui o gene prdB ou genes prdB e prdH. [EFEITOS VANTAJOSOS]
[0010] Na presente revelação, um polipeptídeo com capacidade para converter D-prolina redutase inativa em D-prolina redutase ativa foi sugerido recentemente, e a atividade da D-prolina redutase ativa é intensificada quando expressa mediante a interação com um complexo de PrdA e PrdB que constituem a D-prolina redutase existente ou quando expressa em conjunto com operon Prd, fornecendo, assim, uma forma ativa inovadora de D-prolina redutase e um método para converter D-prolina ou análogos da mesma. [DESCRIÇÃO DE DESENHOS]
[0011] A Figura 1 é um diagrama esquemático que ilustra um método para produzir D-prolina redutase ativa; A Figura 2 mostra os resultados de análise SDS-PAGE de acordo com as condições de expressão da proteína PrdA; A Figura 3 mostra resultados de análise SDS-PAGE da expressão de proteína PrdA com ou sem agitação; A Figura 4 mostra resultados de análise Western blot de acordo com a expressão de proteína PrdB;
A Figura 5 mostra resultados de análise Western blot para autoclivagem da proteína PrdA através da proteína PrdH; A Figura 6 mostra resultados de análise de TLC para atividades da D-prolina redutase recombinante e proteína PrdDEE,; A Figura 7 mostra resultados de análise Western blot para aplicação universal de proteína PrdH; A Figura 8 mostra resultados de análise de TLC para o efeito da proteína PrdC na atividade de D-prolina redutase; A Figura 9 mostra resultados da análise de TLC para o efeito da proteína PrdG na atividade de D-prolina redutase (A) e caracterização de proteína PrdG (B); A Figura 10 mostra resultados de análise de TLC para a produção de ácido 5-aminovalérico a partir de uma fonte de açúcar por meio da coexpressão da D-prolina redutase ativa recombinante e proteína adicional; e A Figura 11 mostra resultados de análise de TLC para a capacidade de conversão de análogo de D-prolina da D-prolina redutase ativa. [MELHOR MODO]
[0012] A presente revelação será descrita em detalhes conforme exposto a seguir. Entretanto, cada descrição e modalidade revelada nesta revelação também pode ser aplicada a outras descrições e modalidades. A saber, todas as combinações de diversos elementos revelados nesta revelação são abrangidas pelo escopo da presente revelação. Adicionalmente, o escopo da presente revelação não é limitado pela descrição específica descrita abaixo.
[0013] Para alcançar os objetivos da presente revelação, um aspecto da presente revelação fornece um micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, na qual as atividades da proteína PrdA, proteína PrdB e proteína PrdH são intensificadas.
[0014] Como usado aqui, o termo “D-prolina redutase” se refere a um complexo de proteínas que consiste em proteína PrdA e proteína PrdB. Sua principal função é conhecida como estando envolvida em um processo de conversão da redução de D-Prolina em ácido 5-aminovalérico (5-AVA). Essa reação é conhecida por corresponder à última etapa da reação de Stickland que é usada para o suprimento de fonte de energia (ATP) de cepas anaeróbicas (Bouillaut et al., J. Bacteriol., 2013, 195 (4), 844 a 854).
[0015] A reação de Stickland, também chamada fermentação de Stickland, se refere a uma reação que envolve a redução e oxidação acoplada de aminoácidos em ácidos orgânicos. Em detalhes, o aminoácido doador de elétrons é oxidado em um ácido carboxílico volátil, um átomo de carbono mais curto que o aminoácido original. Por exemplo, a alanina com uma cadeia de três carbonos é convertida em acetato com dois carbonos. Os aminoácidos podem agir como aceitador de Stickland e doador de Stickland.
[0016] As cepas representativas que têm a reação de Stickland podem incluir Peptoclostridium —difficile 630, Clostridium difficile 630, Peptoclostridium *stiklandil, Clostridium stiklandil ou Eubacterium acidaminophilum. Sabe-se que algumas cepas de Lactobacillus, como Lactobacillus salivarius, também estão incluídas. Portanto, essas cepas podem ser usadas para produzir o micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa da presente revelação, a proteína PrdH que tem atividade para converter a D-prolina redutase inativa na D-prolina redutase ativa, e a D-prolina ativa redutase.
[0017] Uma função principal da D-prolina redutase é conhecida como estando envolvida no processo de conversão de D-prolina em ácido 5- aminovalérico (5-AVA). Entretanto, nenhum mecanismo de reação claro para D-prolina redutase foi conhecido até agora, mas o mecanismo de reação a seguir foi sugerido. Primeiramente, entre as proteínas constitutivas da D-prolina redutase que consistem em um complexo de proteínas alfa-PrdA, beta-PrdA e
PrdB, a proteína alfa-PrdA tem um grupo piruvoíla no terminal amino, que interage com um grupo amina de D- prolina como um substrato e, como resultado, a energia de ativação do substrato é reduzida. Na próxima etapa, uma ligação C-N entre o carbono alfa e o grupo amina de D-prolina é quebrada por selenocisteína situada na proteína PrdB e, como resultado, ocorre uma reação de conversão de D-prolina em ácido 5-aminovalérico (Kabisch et al. J. Biol. Chem., 1999, 274(13), 8.445 a 8.454). Como usado aqui, o termo “D-prolina redutase ativa” se refere a um complexo de proteína que consiste em proteínas alfa-PrdA, beta-PrdA e PrdB, em que, da proteína PrdA e da proteína PrdB que constituem a D-prolina redutase, a proteína PrdA é separada em alfa-PrdA e beta-PrdA devido à autoclivagem precisa por PrdH, que é uma proteína auxiliar da presente revelação, e um grupo piruvoíla se liga ao terminal amino de alfa- PrdA. A D-prolina redutase ativa, conforme descrito acima, se refere a uma forma ativa da enzima, que tem capacidade para reduzir substratos de análogo de D-prolina ou D-prolina através da ligação do grupo piruvoíla de alfa-PrdA ao substrato. Por exemplo, a D-prolina redutase ativa tem capacidade para converter o substrato D-prolina em ácido 5-aminovalérico (5-aminovalerato).
[0018] Como usado aqui, o termo “D-prolina” é um isômero óptico de L-prolina que é um a-aminoácido. Em particular, a L-prolina, que é um aminoácido não essencial, pode ser sintetizada a partir de L-glutamato e convertida em D-prolina por racemase.
[0019] Como usado aqui, o termo “proteína PrdA” se refere a um componente que constitui o complexo de proteína de D-prolina redutase, e a proteína PrdA é separada em proteína alfa-PrdA (fragmento de terminal carboxila) e proteína beta-PrdA (fragmento de terminal amino) através de um processo de autoclivagem. Um processo geral de autoclivagem ocorre através da simples clivagem de ligações peptídicas, mas o processo de autoclivagem da proteína PrdA é caracterizado pelo fato de que o processo de clivagem de ligações peptídicas e a introdução de um grupo piruvoíla no terminal amino da proteína alfa-PrdA ocorrem ao mesmo tempo. Quando a proteína PrdA existe independentemente, os processos de clivagem/degradação não específicos estão envolvidos devido à imperfeição da própria proteína, e há um problema em que a proteína PrdA não é completamente separada em proteína alfa-PrdA e proteína beta-PrdA.
[0020] O grupo piruvoíla é conhecido como um resíduo essencial para a atividade de D-prolina redutase, devido ao fato de que desempenha um papel na redução da energia de ativação do substrato (Kabisch er al., J. Biol. Chem, 1999, 274(13), 8.445 a 8.454). Entretanto, no mecanismo de clivagem de proteína através de uma reação geral de hidrólise, o grupo piruvoíla não é introduzido e, dessa forma, foram conduzidos vários estudos para solucionar esse problema. Para impedir a degradação não específica de proteína causada pela instabilidade estrutural de proteína PrdA (proteína pró-PrdA), foi conduzido um estudo para induzir um processo de clivagem artificial mediante a adição de um agente redutor como NaBHL, etc. ao fragmento de proteína PrdA a partir do qual o terminal amino é removido. Como resultado, a clivagem específica de sítio desejada foi observada, mas a introdução do grupo piruvoíla não foi obtida (Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3.538 a 3.544).
[0021] Uma sequência da proteína PrdA pode estar disponível junto ao GenBank do NCBI, que é um banco de dados público, e qualquer sequência pode ser usada sem limitação, desde que codifique a proteína PrdA de uma cepa que tem a reação de Stickland. Um exemplo representativo do mesmo pode incluir a proteína PrdA derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) ou Lactobacillus salivarius, mas não se limita ao mesmo. Por exemplo, pode ser uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de SEQ ID NO: 19, mas não se limita ao mesmo. Especificamente, a proteína PrdA da presente revelação pode incluir um polipeptídeo que tem pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 19. Adicionalmente, é evidente que a proteína PrdA que tem uma sequência de aminoácidos, parte da qual é deletada, modificada, substituída, substituída de maneira conservativa ou adicionada, também pode ser abrangida pelo escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia ou identidade acima e exiba eficácia correspondente à proteína acima.
[0022] Como usado aqui, o termo “proteína PrdB” se refere a um componente que constitui o complexo de proteína de D-prolina redutase, e a proteína PrdB é uma proteína seleno que inclui a selenocisteína (Sec), que é um aminoácido não natural. A selenocisteína é um aminoácido não natural chamado de o 21º aminoácido e é caracterizada por não ser introduzida em uma proteína através de mecanismos normais de síntese de proteína (Itoh er al., Science, 340(6128), 2013, 75 a 78). Em particular, uma vez que sua introdução é realizada com o uso de códon UGA, isto é, códon de parada entre 64 códons, há um fenômeno em que a síntese de proteína para no códon de parada sem um sistema de inserção de selenocisteína. Além disso, para não reconhecer o códon de inserção de selenocisteína como um códon de parada geral, uma estrutura secundária de um mRNA específico de sequência/estrutura chamado SECIS (SElenoCysteine Incorporation Sequence) precisa estar situado a jusante do códon UGA e para a incorporação em uma proteína, é necessário um sistema Sel (SelABCD) (Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2.486 a 2.492).
[0023] Uma sequência da proteína PrdB pode estar disponível junto ao GenBank do NCBI, que é um banco de dados público, e qualquer sequência pode ser usada sem limitação, desde que codifique a proteína PrdB de uma cepa que tem a reação de Stickland. Um exemplo representativo do mesmo pode incluir a proteína PrdB derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) ou Lactobacillus salivarius, mas não se limita ao mesmo. Por exemplo, pode ser uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de polipeptídeos de SEQ ID NO: 21, mas não se limita ao mesmo. Especificamente, a proteína PrdB da presente revelação pode incluir um polipeptídeo que tem pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia ou identidade com a SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 21. Adicionalmente, é evidente que a proteína PrdB que tem uma sequência de aminoácidos, parte da qual é deletada, modificada, substituída, substituída de maneira conservativa ou adicionada, também pode ser abrangida pelo escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia ou identidade acima e exiba eficácia correspondente à proteína acima.
[0024] Como usado aqui, o termo “proteína PrdH” se refere a uma proteína inovadora codificada com o uso do gene ORF, que está presente entre genes que codificam a proteína PrdA e a proteína PrdB que constituem a D- prolina redutase. Na presente revelação, é chamado de PrdH. Adicionalmente, de acordo com as espécies ou características de cepas que têm atividade de D- prolina redutase, a proteína PrdH pode ser parcialmente sobreposta com PrdA ou PrdB, e o códon de parada de PrdH pode estar situado após o códon de partida de PrdB, porém sem limitação.
[0025] A proteína PrdH pode ser coexpressa com a proteína PrdA e a proteína PrdB para induzir a autoclivagem precisa da proteína PrdA e a introdução do grupo piruvoíla, permitindo assim a construção da D-prolina redutase ativa. Especificamente, qualquer sequência pode ser usada sem limitação, desde que codifique a proteína PrdH de uma cepa que tem a reação de Stickland. Em outras palavras, qualquer sequência pode ser usada sem limitação, desde que inclua o gene ORF presente entre os genes que codificam a proteína PrdA e a proteína PrdB de uma cepa que tem a reação de Stickland. Um exemplo representativo do mesmo pode incluir a proteína PrdH derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) ou Lactobacillus salivarius, mas não se limita ao mesmo. A proteína PrdH derivada de Peptoclostridium difficile 630 e a proteína PrdH derivada de Lactobacillus salivarius têm 40% de homologia ou identidade entre si, e têm em comum o gene ORF presente entre os genes que codificam a proteína PrdA e a proteína PrdB derivada de cada um dos dois micro-organismos. Mais especificamente, a proteína PrdH pode ser, por exemplo, uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de polipeptídeos composta por uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23, mas não é limitada a isso.
[0026] Adicionalmente, a proteína PrdH da presente revelação pode incluir um polipeptídeo que tem pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de homologia ou identidade com SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23. Adicionalmente, é evidente que a proteína PrdH que tem uma sequência de aminoácidos, parte da qual é deletada, modificada, substituída, substituída de maneira conservativa ou adicionada, também pode ser abrangida pelo escopo da presente revelação, desde que a sequência de aminoácidos tenha a homologia ou identidade acima e exiba eficácia correspondente à proteína acima.
[0027] Conforme usado aqui, o termo “homologia” ou “identidade” significa o grau de relevância entre duas determinadas sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos e pode ser expresso como uma porcentagem. Os termos “homologia” e “identidade” podem ser muitas vezes usados de forma intercambiável.
[0028] A homologia ou identidade de sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão e pode ser usada com penalidades de intervalo padrão estabelecidas pelo programa usado. Substancialmente, as sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar sob condições moderada ou altamente estringentes, de modo que o comprimento total da sequência ou pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais do comprimento total possa hibridizar. Também são contemplados polinucleotídeos que contêm códons degenerados no lugar de códons na hibridização.
[0029] Se duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos têm ou não homologia, similaridade ou identidade pode ser determinado com o uso de algoritmos de computador conhecidos, como o programa “FASTA”, com o uso, por exemplo, dos parâmetros padrão como em Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85]: 2444, ou determinadas com o uso do algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo pacote de programas GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.] Academic Press, San Diego, 1994, e [CARILLO ETA/.]J(1988) SIAM J Applied Math 48:
1.073). Por exemplo, o BLAST do banco de dados do National Center for Biotechnology Information, ou ClustalW, pode ser usado para determinar a homologia, similaridade ou identidade.
[0030] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada, por exemplo, mediante a comparação de informações de sequência com o uso de um programa de computador GAP, como Needleman et al. (1970), J] Mol Biol.48: 443, conforme revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Brevemente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos), que são similares, divididos pelo número total de símbolos na mais curta dentre as duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação binária (que contém um valor de 1 para identidades e O para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, conforme revelado em Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353 a 358 (1979) (ou matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUCA4.4)); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna (ou penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5); e (3) nenhuma penalidade por lacunas finais. Portanto, como usado aqui, o termo “homologia” ou “identidade” representa relevância entre as sequências.
[0031] Adicionalmente, mesmo que “uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de uma SEQ ID NO particular” seja descrita no presente documento, é evidente que uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos, parte da qual é deletada, modificada, substituída, substituída de maneira conservativa ou adicionada, pode ser usada na presente revelação, desde que tenha atividade idêntica ou correspondente àquela do polipeptídeo composto da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO correspondente. Especificamente, a adição de uma sequência que não altera a função da proteína antes e depois da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. correspondente, mutações de ocorrência natural, substituições conservativas ou mutações sinônimas das mesmas não são excluídas. É evidente que, apesar de o polipeptídeo ter tal adição ou mutação de sequência, o mesmo é abrangido pelo escopo da presente revelação.
[0032] Como usado aqui, o termo “substituição conservativa” significa substituição de um aminoácido por um outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares em uma sequência de aminoácidos. À variante pode ter, por exemplo, uma ou mais substituições conservativas enquanto retém uma ou mais atividades biológicas. Tais substituições de aminoácidos podem geralmente ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática de resíduos. Por exemplo, os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido glutâmico e ácido aspártico; aminoácidos aromáticos incluem fenilalanina, triptofano e tirosina; e aminoácidos hidrofóbicos incluem alanina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina e triptofano. Comumente, a substituição conservativa tem pouco ou nenhum efeito na atividade do polipeptídeo resultante. O polinucleotídeo que codifica a proteína PrdH que tem a sequência de aminoácidos composta por SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23 também é abrangido pelo escopo da presente revelação. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo composto de uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 24. No polinucleotídeo, diversas modificações podem ser feitas na região de codificação, desde que não alterem a sequência de aminoácidos da proteína, devido à degenerescência de códon ou à consideração dos códons preferenciais pelo organismo no qual a proteína deve ser expressa.
[0033] É evidente que, devido à degeneração de códon, um polinucleotídeo que pode ser traduzido na proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: | ou SEQ ID NO: 23 ou a proteína que tem homologia ou identidade com o mesmo também pode ser incluída. Adicionalmente, uma sonda que pode ser produzida a partir de uma sequência de nucleotídeos conhecida, por exemplo, uma sequência que hibridiza com uma sequência complementar para toda ou parte da sequência de nucleotídeos sob condições estringentes para codificar uma proteína que tem a atividade da proteína composta pela sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, também pode ser incluída sem limitação. O termo “condições estringentes” significa condições sob as quais é permitida a hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes em uma literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., supra). Por exemplo, as condições estringentes podem incluir, por exemplo, condições sob as quais genes que têm alta homologia ou identidade, 40% ou mais, 85% ou mais, especificamente 90% ou mais, mais especificamente 95% ou mais, muito mais especificamente 97% ou mais, de forma particularmente específica 99% ou mais de homologia ou identidade são hibridizados entre si e genes que têm homologia ou identidade menor que a homologia ou identidade acima não são hibridizados entre si, ou condições de lavagem comuns da hibridização Southern, isto é, lavagem uma vez, especificamente, duas ou três vezes em uma concentração de sal e uma temperatura que correspondem a 60 ºC, 1 x SSC, SDS a 0,1%, especificamente, 60 ºC, 0,1 x SSC, SDS a 0,1% e, mais especificamente, 68 ºC, 0,1 x SSC, SDS a 0,1%.
[0034] Embora possa ocorrer uma incompatibilidade entre nucleotídeos devido à estringência da hibridização, é necessário que os dois ácidos nucleicos tenham uma sequência complementar. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases de nucleotídeo que podem hibridizar entre si. Por exemplo, com relação ao DNA, adenosina é complementar à timina e citosina é complementa à guanina. Consequentemente, a presente revelação pode incluir não apenas as sequências de ácidos nucleicos substancialmente similares, mas também fragmentos de ácido nucleico isolados que são complementares a toda a sequência.
[0035] Especificamente, o polinucleotídeo que tem homologia ou identidade pode ser detectado com o uso de condições de hibridização, incluindo a etapa de hibridização em um valor de Tm de 55 ºC e as condições descritas acima. Adicionalmente, o valor de Tm pode ser 60 ºC, 63 ºC ou 65 ºC, porém sem limitação, e pode ser adequadamente controlado por um versado na técnica de acordo com os propósitos.
[0036] A estringência adequada para a hibridização de polinucleotídeos depende do comprimento e do grau de complementaridade dos polinucleotídeos, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al., Supra, 9,50 a 9,51, 11,7 a 11,8).
[0037] Conforme usado aqui, o termo “intensificação da atividade” significa introdução da atividade da proteína enzimática, ou aprimoramento da mesma, em comparação com a atividade intrínseca do micro-organismo ou a atividade antes da modificação. A “introdução” da atividade significa que a atividade de uma proteína específica que não é originalmente possuída por um micro-organismo aparece natural ou artificialmente. A “atividade intrínseca” se refere à atividade de uma proteína específica originalmente possuída por uma cepa parental antes da transformação, quando o traço do micro-organismo é alterado devido à variação genética causada por fatores naturais ou artificiais.
[0038] Por exemplo, a intensificação da atividade pode incluir toda a introdução de uma D-prolina redutase estranha em uma célula hospedeira ou intensificação por meio da introdução ou intensificação da atividade intrínseca de D-prolina redutase.
[0039] Especificamente, na presente revelação, a intensificação de atividade pode ser realizada por meio de: 1) aumento do número de cópias dos polinucleotídeos que codificam as enzimas, 2) modificação da sequência de controle de expressão para aumentar a expressão dos polinucleotídeos, 3) modificação da sequência de polinucleotídeos no cromossomo para intensificar as atividades das enzimas, ou 4) modificação para a intensificação por meio de uma combinação dos mesmos, porém sem limitação.
[0040] 1) O aumento do número de cópias do polinucleotídeo pode ser, mas não está particularmente limitado a, realizado de uma forma em que o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um vetor ou mediante a inserção do polinucleotídeo no cromossomo de uma célula hospedeira. Adicionalmente, o aumento do número de cópias pode ser realizado mediante a introdução de um polinucleotídeo estranho que exibe a atividade enzimática ou um polinucleotídeo variante otimizado por códon do polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Qualquer sequência de polinucleotídeos estranha pode ser usada sem limitação na origem ou sequência da mesma, desde que exiba a atividade idêntica/similar àquela da enzima acima. A introdução pode ser realizada por um método de transformação conhecido que é adequadamente selecionado pelos versados na técnica, e a enzima pode ser produzida por meio da expressão do polinucleotídeo introduzido na célula hospedeira e, como resultado, sua atividade pode ser aumentada.
[0041] Em seguida, 2) a modificação da sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo pode ser, mas não está particularmente limitada a, realizada por meio da indução de uma modificação na sequência através de deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de nucleotídeos, ou uma combinação dos mesmos para intensificar ainda mais a atividade da sequência de controle de expressão ou por meio da substituição da sequência de polinucleotídeos por uma sequência de nucleotídeos que tem uma atividade mais forte. À sequência de controle de expressão inclui, mas não está particularmente limitada a, um promotor, uma sequência de operador, uma sequência que codifica um sítio de ligação ao ribossoma e uma sequência que regula a terminação da transcrição e tradução. Especificamente, um promotor exógeno forte, em vez do promotor original, pode ser conectado à região a montante da unidade de expressão do polinucleotídeo. Os exemplos do promotor forte podem incluir promotor CJ7, promotor IlysCP1, promotor EF-Tu, promotor groEL, promotor aceAÃ ou aceB, etc. O promotor e o polinucleotídeo estão operacionalmente ligados um ao outro para aprimorar uma taxa de expressão do polinucleotídeo que codifica a enzima, porém sem limitação.
[0042] Adicionalmente, 3) a modificação da sequência de polinucleotídeos no cromossomo pode ser, mas não está particularmente limitada a, realizada por meio da indução de uma modificação na sequência de controle de expressão através de deleção, inserção, substituição não conservativa ou conservativa da sequência de polinucleotídeos, ou uma combinação dos mesmos para intensificar ainda mais a atividade da sequência de polinucleotídeos, ou por meio da substituição da sequência de polinucleotídeos por uma sequência de polinucleotídeos que é aprimorada para ter uma atividade mais forte.
[0043] Por fim, 4) o método de modificação para a intensificação por meio de uma combinação de 1) a 3) pode ser realizado mediante a aplicação de um ou mais dos métodos de aumentar o número de cópias do polinucleotídeo que codifica a proteína, modificar a sequência de controle de expressão para aumentar a expressão do polinucleotídeo, modificar a sequência de polinucleotídeos no cromossomo e introduzir um polinucleotídeo estranho que exibe a atividade da proteína ou de um polinucleotídeo variante no qual os códons do mesmo são otimizados por códons.
[0044] Como usado aqui, o termo “vetor” é um construto de DNA que inclui uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada operacionalmente ligado a uma sequência reguladora adequada para permitir a expressão da proteína desejada em uma célula hospedeira adequada. A sequência reguladora pode incluir um promotor com capacidade para iniciar a transcrição, qualquer sequência de operador para a regulação de tal transcrição, uma sequência que codifica um domínio de ligação ao ribossoma de mRNA adequado e uma sequência que regula a terminação da transcrição e tradução. Depois que o vetor é transformado na célula hospedeira adequada, o mesmo pode se replicar ou funcionar independentemente do genoma hospedeiro e pode ser integrado ao próprio genoma.
[0045] O vetor usado na presente revelação não é particularmente limitado, contanto que possa replicar na célula hospedeira, e qualquer vetor conhecido na técnica pode ser usado. Os exemplos de vetores comumente usados podem incluir um plasmídeo natural ou recombinante, cosmídeo, vírus e bacteriófago. Por exemplo, pWE15, M13, MBL3, MBLA, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados como um vetor de bacteriófago ou vetor de cosmídeo. Como um vetor de plasmídeo, pode ser usado o tipo pBR, tipo pUC, tipo pBluescriptII, tipo PpGEM, tipo pTZ, tipo pCL, tipo pET, etc. Especificamente, podem ser usados os vetores pDZ, pACYC177, pACYCI84, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, ptMWI118, pCCIBAC, etc., porém sem limitação.
[0046] O vetor aplicável na presente revelação não é particularmente limitado e um vetor de expressão conhecido pode ser usado. Adicionalmente, o polinucleotídeo que codifica a proteína desejada pode ser inserido no cromossomo com o uso de um vetor para inserção cromossômica intracelular. À inserção cromossômica do polinucleotídeo pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, recombinação homóloga, porém sem limitação. Um marcador de seleção para confirmar a inserção cromossômica pode ser adicionalmente incluído. O marcador de seleção é para selecionar células transformadas com o vetor, isto é, para confirmar a inserção do polinucleotídeo desejado, e o marcador de seleção pode incluir marcadores que fornecem fenótipos selecionáveis, como resistência a fármaco, auxotrofia, resistência a agentes citotóxicos ou expressão de proteínas de superfície. Uma vez que apenas as células que expressam o marcador de seleção têm capacidade para sobreviver ou mostrar fenótipos diferentes sob o ambiente tratado com um agente seletivo, as células transformadas podem ser selecionadas.
[0047] Conforme usado aqui, o termo “transformação” significa a introdução de um vetor que inclui um polinucleotídeo que codifica uma proteína desejada em uma célula hospedeira de tal maneira que a proteína codificada pelo polinucleotídeo seja expressa na célula hospedeira. Desde que o polinucleotídeo transformado seja expresso na célula hospedeira, o mesmo pode ser integrado e colocado no cromossomo da célula hospedeira, ou pode existir de maneira extracromossômica ou independentemente da mesma. Adicionalmente, o polinucleotídeo inclui DNA e RNA que codificam a proteína-alvo. O polinucleotídeo pode ser introduzido em qualquer forma, desde que possa ser introduzido na célula hospedeira e expresso na mesma. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser introduzido na célula hospedeira sob a forma de um cassete de expressão, que é um construto gênico que inclui todos os elementos necessários para sua expressão autônoma. Comumente, o cassete de expressão inclui um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, sinais de terminações transcricionais, sítios de ligação a ribossoma e sinais de terminação de tradução. Adicionalmente, diversos fatores para ajudar a produção eficaz de uma proteína-alvo podem ser incluídos dentro ou fora do cassete de expressão. O cassete de expressão pode ser na forma de um vetor de expressão autorreplicável. Além disso, o polinucleotídeo tal como é pode ser introduzido na célula hospedeira e ligado operacionalmente às sequências necessárias para expressão na célula hospedeira, porém sem limitação. Um método para realizar a transformação pode incluir qualquer método para introduzir ácidos nucleicos em uma célula, e a transformação pode ser realizada por meio da seleção de uma técnica padrão adequada conforme conhecido na técnica, de acordo com a célula hospedeira. Por exemplo, o método pode incluir eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio (CaPO;,), precipitação com cloreto de cálcio (CaCl,), microinjeção, um método de polietilenoglicol (PEG), um método DEAFE- dextrano, um método de lipossoma catiônico e um método de acetato de lítio- DMSO etc., porém sem limitação.
[0048] Como usado aqui, o termo “operacionalmente ligado” significa uma ligação funcional entre a sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína desejada da presente revelação e uma sequência promotora que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo. A ligação operacional pode ser preparada com o uso de uma tecnologia recombinante genética conhecida na técnica, e a clivagem e ligação de DNA específicas de sítio podem ser preparadas com o uso de enzimas de restrição e ligação, etc., na técnica, porém sem limitação.
[0049] Adicionalmente, uma modalidade específica da presente revelação fornece um micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, na qual as atividades de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em PrdD, PrdE e PrdE, são intensificadas, além do micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, na qual as atividades da proteína PrdA, proteína PrdB e proteína PrdH são intensificadas.
[0050] Adicionalmente, uma modalidade específica da presente revelação fornece um micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, na qual as atividades de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em PrdC, PrdG e PrdF são intensificadas, além do micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, na qual as atividades da proteína PrdA, proteína PrdB e proteína PrdH são intensificadas.
[0051] A “proteína PrdD, proteína PrdE, proteína PrdE2, proteína PrdC, proteína PrdG e proteína PrdF” se referem a uma proteína que constitui o operon Prd da D-prolina redutase. Especificamente, as proteínas que constituem o operon Prd, além da proteína PrdA e PrdB que constitui a D-prolina redutase,
são conhecidas como PrdDEE,CGFR. O operon prd mais conhecido está presente em uma cepa de Clostridium sticklandii, e o nome da proteína tem por base a construção do operon (NCBI GenBank: FP565809.1) de C. sticklandii (Jackson et al., J. Bacteriol., 2006, 188, 8.487 a 8.495).
[0052] As funções das proteínas que constituem o operon Prd não foram esclarecidas e as proteínas PrdD, PrdE e PrdE, têm alta homologia ou identidade de sequência com a proteína PrdA. Entre as mesmas, a proteína PrdD possui alta homologia ou identidade de sequência com a proteína beta-PrdA, e as proteínas PrdE e PrdE, têm alta homologia ou identidade com a proteína alfa-PrdA. As sequências das proteínas PrdD, PrdE e PrdE, podem estar disponíveis junto ao GenBank de NCBI, que é um banco de dados público. Na presente revelação, as proteínas PrdD, PrdE e PrdE, podem ser proteínas PrdD, PrdE e PrdE, derivadas de Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630)) e, especificamente, podem ser proteínas que têm sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 7,9 e 11 ou sequências de aminoácidos codificadas por sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOS: 8, 10 e 12, respectivamente, porém sem limitação.
[0053] É relatado que a proteína PrdC está envolvida na transferência de elétrons para a D-prolina redutase com o uso de NADH (Fonknechten et al., BMC Genomics, 2010, 11, 555). A proteína PrdG é conhecida como uma proteína membrânica, mas sua função não foi relatada. Uma sequência da proteína PrdC pode estar disponível junto ao GenBank de NCBI, que é um banco de dados público. Na presente revelação, as proteínas PrdC e PrdG podem ser proteínas PrdC e PrdG derivadas de Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630)) e, especificamente, podem ser proteínas que têm sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 13 e 15 ou sequências de aminoácidos codificadas por sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOS: 14 e 16, respectivamente, porém sem limitação.
[0054] Adicionalmente, a proteína PrdF, que é uma prolina racemase, é conhecida como estando envolvida na formação de um isômero óptico de prolina, e a proteína PrdR é relatada como tendo funções associadas à ativação de operon prd (Bouillaut er al., J. Bacteriol., 2013, 195(4), 844 a 854). Uma sequência da proteína PrdF pode estar disponível junto ao GenBank de NCBI, que é um banco de dados público. Na presente revelação, a proteína PrdF pode ser uma proteína PrdF derivada de Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630)) e, especificamente, pode ser uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 18, porém sem limitação.
[0055] Como usado aqui, o termo “micro-organismo que expressa a D- prolina redutase ativa” se refere a um micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa que consiste em alfa-PrdA ligada ao grupo piruvoíla, obtida por autoclivagem precisa da proteína PrdA, beta-PrdA e PrdB. O “micro- organismo” pode incluir qualquer um dos micro-organismos procarióticos e micro-organismos eucarióticos, desde que tenha capacidade para produzir a D- prolina redutase ativa. Por exemplo, o micro-organismo pode incluir micro- organismos do gênero Escherichia, do gênero Erwinia, do gênero Serratia, do gênero Providencia, do gênero Corynebacterium e do gênero Brevibacterium. O exemplo do micro-organismo do gênero Escherichia pode ser E. coli, porém sem limitação.
[0056] O micro-organismo de produção de D-prolina redutase ativa do gênero Escherichia, que tem capacidade para expressar o polipeptídeo que tem a atividade de D-prolina redutase da presente revelação, pode incluir todos os micro-organismos com capacidade para expressar o polipeptídeo por meio de vários métodos conhecidos, além da introdução de vetor acima.
[0057] Um outro aspecto da presente revelação fornece um método para produzir a D-prolina redutase ativa, sendo que o método inclui as etapas de cultivar o micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa em um meio e recuperar a D-prolina redutase ativa a partir do micro-organismo ou do meio.
[0058] O “micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa” é o mesmo que descrito acima.
[0059] A “cultura” significa cultivar o micro-organismo sob condições ambientais moderadamente controladas. O processo de cultura da presente revelação pode ser realizado de acordo com um meio e condições de cultura adequados conhecidos na técnica. Esse processo de cultura pode ser facilmente ajustado e usado pelos versados na técnica de acordo com a cepa selecionada. À etapa de cultivar o micro-organismo pode ser, mas não está particularmente limitada a, realizada por cultura de batelada conhecida, cultura contínua, cultura de batelada alimentada, etc. Nesse sentido, as condições da cultura não são particularmente limitadas, mas um pH ideal (por exemplo, pH 5 a 9, especificamente pH 6 a 8, e mais especificamente pH 6,8) pode ser ajustado com o uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico) . Além disso, um agente antiespumígeno, como éster de poliglicol de ácido graxo, pode ser usado durante a cultura para suprimir a geração de espuma. Para manter a cultura em um estado aeróbico, oxigênio ou gás contendo oxigênio pode ser injetado na cultura. Para manter a cultura em um estado anaeróbico ou microaeróbico, nenhum gás pode ser injetado ou nitrogênio, hidrogênio ou gás dióxido de carbono podem ser injetados na cultura. À temperatura da cultura pode ser mantida a 20 ºC a 45 ºC, e especificamente a 25 ºC a 40 ºC, porém sem limitação. A cultura pode ser continuada até que seja obtida uma quantidade desejada do material desejado, e especificamente durante cerca de 10 horas a cerca de 160 horas, porém sem limitação. Adicionalmente, no meio de cultura a ser usado, fontes de carbono, como açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, amido e celulose), óleos e gorduras (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético), podem ser usados individualmente ou em uma mistura dos mesmos, porém sem limitação. As fontes de nitrogênio, como compostos orgânicos que contêm nitrogênio (por exemplo, peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato de malte, licor de milho, farinha de soja e ureia) ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio), podem ser usados individualmente ou em uma mistura dos mesmos, porém sem limitação. As fontes de potássio, como di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio ou sais que contêm sódio correspondentes aos mesmos, podem ser usadas individualmente ou em uma mistura dos mesmos, porém sem limitação. Adicionalmente, outras substâncias essenciais de estímulo de crescimento, incluindo sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro), aminoácidos e vitaminas podem ser incluídas no meio.
[0060] O método para produzir a D-prolina redutase ativa pode ser facilmente determinado pelos versados na técnica sob um meio e condições de cultura otimizadas conhecidas na técnica. A etapa de recuperar a D-prolina redutase ativa pode ser realizada com o uso de um método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, centrifugação, filtração, destilação, cromatografia de troca iônica, cristalização, HPLC, etc., podem ser usados, porém sem limitação.
[0061] Adicionalmente, a etapa de recuperação pode incluir um processo de purificação e pode ser realizada com o uso de um método adequado conhecido na técnica. Portanto, a D-prolina redutase ativa a ser coletada pode ser uma forma purificada ou um caldo de fermentação do micro-organismo, incluindo a D-prolina redutase ativa.
[0062] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para converter D-prolina ou um análogo da mesma por meio de um método de redução com o uso do micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa ou a D-prolina redutase ativa produzida a partir do mesmo.
[0063] Especificamente, o método pode ser um método para produzir um ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido 5-aminovalérico (5- AVA), ácido y-aminobutírico (GABA) e ácido 5-amino-4-hidroxipentanoico com o uso do micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa ou a D- prolina redutase ativa produzida a partir do mesmo.
[0064] O análogo de D-prolina é uma substância que tem uma estrutura similar à D-prolina e inclui todos os análogos, em que um grupo carboxila, carbono alfa e um grupo amino são sequencialmente conectados e uma estrutura de anel que inclui o carbono alfa e o grupo amino é formado, independentemente do tamanho do anel, e que pode ser reduzido pela D-prolina redutase ativa da presente revelação. Especificamente, o análogo de D-prolina pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácido D-azetidina-2- carboxílico, trans-4-hidroxi-D-prolina e cis-4-hidroxi-D-prolina, porém sem limitação.
[0065] Adicionalmente, a redução por meio da D-prolina redutase ativa significa que a ligação entre o carbono alfa e o grupo amino na estrutura de D- prolina ou do análogo da mesma é rompida e, como resultado, a estrutura de anel é liberada. Especificamente, a D-prolina pode ser convertida em ácido 5- aminovalérico (5-AVA) pela D-prolina redutase ativa. Adicionalmente, o ácido D-azetidina-2-carboxílico tem uma estrutura de anel de 4 membros devido à falta de um átomo de carbono, em comparação com a D-prolina, e quando convertido pela D-prolina redutase ativa, o ácido y-aminobutírico (GABA) pode ser produzido. Adicionalmente, quando cis-4-hidroxi-D-prolina ou trans-4- hidroxi-D-prolina, que é formada mediante a adição de um grupo hidroxila (-
OH) à estrutura de anel da D-prolina, é submetida a uma reação de conversão pelo D-prolina redutase ativa, o ácido 5-amino-4-hidroxipentanoico pode ser produzido, porém sem limitação.
[0066] Mais um outro aspecto fornece a proteína PrdH que tem atividade para converter D-prolina redutase inativa em D-prolina redutase ativa, enquanto é coexpressa com a proteína PrdA e a proteína PrdB.
[0067] A “proteína PrdA”, a “proteína PrdB”, a “proteína PrdH” e a “D- prolina redutase ativa” são iguais conforme descrito acima.
[0068] Como usado aqui, o termo “coexpressão” significa que a expressão de duas ou mais proteínas ou expressão de genes que codificam duas ou mais proteínas ocorre ao mesmo tempo. Um método para expressar o gene ou a proteína pode ser prontamente determinado a partir de métodos conhecidos na técnica por aqueles versados na técnica.
[0069] Como usado aqui, o termo “conversão de D-prolina redutase inativa em D-prolina redutase ativa” significa que a D-prolina redutase em um estado inativo é convertida para ter atividade de D-prolina redutase ativa. Isso significa que a D-prolina redutase inativa é convertida na D-prolina redutase ativa que consiste em alfa-PrdA ligada ao grupo piruvoíla obtida por autoclivagem precisa da proteína PrdA, beta-PrdA e PrdB. A “D-prolina redutase inativa” significa D-prolina redutase na qual não ocorre a autoclivagem da proteína PrdA ou mesmo que ocorra a autoclivagem da proteína PrdA, alfa- PrdA, a qual nenhum grupo piruvoíla está ligado, e beta -PrdA estão incluídas, ou a proteína de PrdA ou PrdB não é expressa, ou a proteína de PrdA ou PrdB não tem atividade, mesmo que expressa.
[0070] Mais um outro aspecto fornece um método para produzir o micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa, sendo que o método inclui as etapas de transformar uma célula hospedeira com um cassete de expressão que inclui o gene prdA ou os genes prdA e prdH e transformar a célula hospedeira com um cassete de expressão que inclui o gene prdB ou genes prdB e prdH.
[0071] A “proteína PrdA”, a “proteína PrdB”, a “proteína PrdH”, o “cassete de expressão”, a “D-prolina redutase ativa” e o “micro-organismo que expressa a D-prolina redutase ativa” são iguais conforme descrito acima. [MODO PARA INVENÇÃO]
[0072] Doravante, a presente revelação será descrita em maiores detalhes com referência a Exemplos. Entretanto, esses Exemplos são apenas para ilustrar a presente revelação, e o escopo da presente revelação não se destina a ser limitado por esses Exemplos. EXEMPLO 1: EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS PrdA E PrdH 1-1: SELEÇÃO DE GENE PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdA
[0073] Para expressão da proteína PrdA, foi realizado um experimento para uma sequência de aminoácidos (Q17ZY9, UniProtKB, SEQ ID NO: 3) de proteína PrdA de D-prolina redutase derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) que é conhecida como uma cepa representativa que tem reação de Stickland. Uma sequência de nucleotídeos (CD630 32440, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 4) da D-prolina redutase proteína PrdA foi usada para construir um vetor de expressão. 1-2: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE EXPRESSA PrdA (pETDuet H6- prdA-H6)
[0074] Uma etiqueta de histidina 6X (H6) para análise Western blot foi incorporada em ambos os terminais da sequência de nucleotídeos, e um gene que tem sequências de enzima de restrição Ndel e Xhol nos terminais amino e carboxila, respectivamente, foi sintetizado. O gene sintetizado e um vetor pETDuet-l foram especificamente digeridos com enzimas de restrição Ndel/Xhol, respectivamente, e, então, cada fragmento de gene foi obtido através de separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase,
um vetor que expressa PrdA (pETDuet H6-prdA-H6) foi construído. 1-3: CONSTRUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO QUE TEM MUTAÇÃO SÍTIO-DIRIGIDA EM SÍTIO DE AUTOCLIVAGEM DE PROTEÍNA PrdA (pETDuet. H6-prdA(C421A)-H6)
[0075] Um método de varredura de alanina foi aplicado a um aminoácido na posição 421, que é conhecido como um sítio onde ocorre a autoclivagem de proteína PrdA. Para realizar a substituição (C421A) de alanina por cisteína, que é o aminoácido na posição 421, foi realizada a mutagênese sítio-dirigida. Para essa finalidade, o vetor pETDuet H6-prdA-H6 construído e os iniciadores de SEQ ID NOS: 25 e 26 (Tabela 1) projetados para a mutação C421A foram adicionados a uma pré-mistura de Pfu PCR para amplificar o gene. Nesse momento, a reação de PCR foi realizada para 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC durante 1 minuto, anelamento a 55 ºC durante 1 minuto e alongamento a 72 ºC durante 10 minutos. Esse produto de PCR foi tratado com DpnI (37 ºC, 3 horas) e transformado em E. coli (DH5a). A E. coli transformada foi cultivada para obter a cepa, e um vetor de plasmídeo foi isolado a partir da mesma. O sequenciamento foi realizado para obter um vetor pETDuet H6- prdA(C421A)-H6.
[TABELA 1] * sublinhado: sítio de mutação C421A 1-4: CONSTRUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO QUE COEXPRESSA PROTEÍNAS PrdA e PrdH (pETDuet prdH H6-prdA-H6)
[0076] Para induzir a autoclivagem da proteína PrdA, tentou-se coexpressar uma proteína inovadora (sequência de aminoácidos: Q1I7ZY5, UniProtKB, SEQ ID NO: 1 / sequência de nucleotídeos: CD630 32430, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 2; doravante, mencionada como proteína
PrdH) codificada com o uso do gene ORF presente entre genes que codificam PrdA e PrdB que são proteínas estruturais entre proteínas que constituem o operon prd derivado de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630). Para essa finalidade, sintetizou-se um gene que tem sequências enzimáticas de restrição da combinação Ncol/Notl, cada uma nos terminais amino e carboxila da sequência de nucleotídeos. O gene prdH sintetizado e o vetor pETDuet. H6- prdA-H6 previamente construído foram digeridos especificamente com enzimas de restrição Ncol/Notl, respectivamente e, então, cada fragmento de gene foi obtido através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática da T4 ligase, foi construído um vetor de expressão (pETDuet. prdH H6-prdA- H6) com capacidade para coexpressar as proteínas PrdA e PrdH. 1-5: IDENTIFICAÇÃO DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdA POR
TRÊS TIPOS CONSTRUÍDOS DE VETORES DE EXPRESSÃO E AUTOCLIVAGEM DE PrdA
[0077] Na próxima etapa, o vetor de expressão pETDuet. H6-prdA-H6, PpETDuet. H6-prdA(C421A)-H6 ou pETDuet. prdH H6-prdA-H6 construído foi transformado em E. coli BL21(DE3) e, então, semeado em meio LB (50 ml) que contém um antibiótico ampicilina (0,1 mg/ml), seguido de incubação sob condições de 37 ºC e 200 rpm.
[0078] Para induzir a superexpressão da proteína desejada, quando o valor de ODçsoo alcançou 0,5 - 0,6, adicionou-se isopropil B-D-l- tiogalactopiranosídeo 0,1 mM (doravante, mencionado como IPTG).
[0079] Adicionalmente, para o propósito de induzir a autoclivagem da proteína PrdA através da ligação de um substrato, E. coli transformada com o vetor pETDuet H6-prdA-H6 foi cultivada em um meio na presença ou ausência do substrato D-prolina (10 mM).
[0080] Posteriormente, a cultura foi adicionalmente realizada durante 16 horas a 30 ºC sob uma condição de agitação de 200 rpm ou a 30 ºC sob uma condição de cultura estacionária, respectivamente. A condição de cultura estacionária foi realizada omitindo um processo de agitação para reduzir a degradação não específica da proteína PrdA expressa.
[0081] Para examinar a expressão da proteína PrdA recombinante, a cepa obtida foi interrompida e a centrifugação (15.000 rpm, 4 ºC e 10 minutos) foi realizada para separar um sobrenadante, seguido da análise SDS-PAGE e análise Western blot. Como resultado da análise, foi confirmado que a proteína desejada que tem um peso molecular de 67,6 kDa igual a um peso molecular teórico da proteína PrdA foi expressa (Figura 2). Entretanto, a proteína foi expressa na forma de proteína pró-PrdA que não foi autoclivada, que é uma forma inativa da proteína PrdA. Por essa razão, não foi encontrada produção de proteína —adicional (alfa-PrdA, 21,9 kDa e beta-PrdA, 447 kDa). Adicionalmente, as bandas de proteínas clivadas não especificamente foram encontradas no resultado de Western blot, indicando que ocorreu muita degradação de proteína devido à instabilidade estrutural da proteína pró-PrdA que não foi autoclivada (Figura 2, faixa 2). Adicionalmente, os padrões de expressão da proteína variante PrdA(C421A) que foi preparada por meio da substituição de alanina por cisteína na posição 421 da proteína PrdA, que é conhecida como um sítio de autoclivagem, foram idênticos àqueles da PrdA do tipo selvagem, confirmando também que a autoclivagem não ocorreu por meio do mecanismo independente da proteína PrdA (Figura 2, faixa 3). Adicionalmente, quando D-prolina foi adicionada (Figura 2, faixa 4) para induzir a autoclivagem da proteína PrdA através da ligação de substrato ou a proteína PrdA foi coexpressa com a proteína PrdH, a autoclivagem da proteína PrdA não ocorreu (Figura 2, faixa 5).
[0082] Quando a proteína PrdA foi expressa sozinha, a cultura estacionária foi realizada sem um processo de agitação, a fim de reduzir a degradação não específica da proteína expressa, e os padrões de expressão da proteína PrdA foram analisados. Nesse caso, a degradação da própria proteína foi aprimorada devido a um nível de expressão relativamente baixo, mas a autoclivagem não ocorreu (Figura 3, faixas 3 e 4). Em detalhe, foi encontrada uma proteína clivada que tem um tamanho similar à proteína beta-PrdA, mas a proteína alfa-PrdA não foi encontrada, indicando que a proteína clivada é uma proteína produzida por clivagem não específica. Esses resultados foram consistentes com os resultados da técnica anterior (Publicação de Patente Coreana nº 2015-0029526; Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3.538 a 3.544). EXEMPLO 2: EXPRESSÃO DA PROTEÍNA PrdB 2-1: SELEÇÃO DE GENE PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdB
[0083] Para a expressão de proteína PrdB, foi realizado um experimento para uma sequência de aminoácidos (Q17ZY6, UniProtKB, SEQ ID NO: 5) de proteína PrdB de D-prolina redutase derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) que é conhecida como uma cepa representativa que tem reação de Stickland. Uma sequência de nucleotídeos (CD630 32410, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 6) da proteína foi usada para construir um vetor de expressão. 2-2: CONSTRUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO DE PrdB (pCDFDuet prdB-H6)
[0084] Um gene foi sintetizado mediante a incorporação da etiqueta de histidina 6X (H6) para análise Western blot no terminal carboxila da sequência de nucleotídeos e mediante a inclusão de sequências de enzima de restrição Ndel e Xhol nos terminais amino e carboxila, respectivamente. O gene sintetizado e um vetor pCDFDuet-l foram especificamente digeridos com enzimas de restrição Ndel/Xhol, respectivamente, e, então, cada fragmento de gene foi obtido através de separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, um vetor que expressa PrdB (pCDFDuet. prdB-H6) foi construído.
2-3: CONSTRUÇÃO DE VETOR PARA INTRODUZIR SELENOCISTEÍNA NA PROTEÍNA PrdB
[0085] A proteína PrdB é conhecida como uma selenoproteína. Por outras palavras, uma vez que a selenocisteína está incluída na sequência de aminoácidos da proteína PrdB e a selenocisteína é um aminoácido não natural, existe uma limitação técnica pelo fato de que a introdução através de um processo de síntese de proteína geral é difícil. Portanto, na presente revelação, a introdução de selenocisteína da proteína PrdB foi tentada através da introdução de um sistema de operon sel (sel ABC) que é uma técnica conhecida (Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2.486 a 2.492). 2-3-1: VETOR INTRODUZIDO POR selAB (pACYCDuet selB/pACYCDuet selA selB)
[0086] Para essa finalidade, a proteína SelA (sequência de aminoácidos: Q18212, UniProtKB / sequência de nucleotídeos: CD630 24950, NCBI GenBank AM180355.1) e proteína SelB (sequência de aminoácidos: Q18210, UniProtKB / sequência de nucleotídeos: CD630 24930, NCBI GenBank AMI180355.1) derivado de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) foram usadas, e um gene foi sintetizado de modo que tivesse sequências de enzima de restrição da combinação NcolI/NotI e Ndel/Xhol nos terminais amino e carboxila, respectivamente.
[0087] Em seguida, um vetor de plasmídeo pACYCDuet-l comercialmente disponível (Novagene) e o gene selB foram tratados com uma combinação de enzimas de restrição Ndel/Xhol, respectivamente, e separados em um gel de agarose. Então, através da reação de T4 ligase, um vetor pACYCDuet selB foi construído. O gene selA foi inserido no vetor (pACYCDuet selB) através da reação enzimática de restrição adicional da combinação Ndel/Xhol. Finalmente, um vetor pACYCDuet selA selB foi construído.
2-3-2: VETOR INTRODUZIDO POR selC (pCDFDuet prdB-H6 Psac- selC)
[0088] O gene selC codifica tRNA específico de selenocisteína e foi sintetizado mediante a inclusão do gene selC (sequência de nucleotídeos: CDIF630 02727, NCBI GenBank CP010905.1) derivado de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) e 150 nucleotídeos adicionais do terminal amino e 250 nucleotídeos do terminal carboxila, de modo que o terminador e promotor intrínseco de selC fossem incluídos, e, finalmente, a sequência de enzima de restrição Xbal em ambas as extremidades. O gene selC assim obtido e o vetor pCDFDuet. prdB-H6 previamente construído foram tratados com a enzima de restrição Xbal e, então, separados em um gel de agarose. Através da reação de T4 ligase, um vetor pPCDFDuet. prdB-H6 Psuc-selC foi finalmente construído. 2-4: IDENTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdB POR
TRÊS TIPOS CONSTRUÍDOS DE VETORES DE EXPRESSÃO 1) EXPRESSÃO ÚNICA DE PROTEÍNA PrdB
[0089] O vetor pCDFDuet, prdB-H6 preparado no Exemplo 2-2 foi transformado em E. coli BL21(DE3) e cultivado em um meio LB (50 ml) que contém um antibiótico (50 ug/ml de espectinomicina) (37 ºC, 200 rpm ) 2) COEXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdB E selC
[0090] O vetor pCDFDuet. prdB-H6-Psuc. selC preparado no Exemplo 2-3 foi transformado em E. coli BL21(DE3) e cultivado da mesma maneira que em 1]l). 3) COEXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdB E PROTEÍNA selAB
[0091] Uma combinação do pCDFDuet prdB-H6 preparado no Exemplo 2-2 e do vetor pACYCDuet selA selB preparado no Exemplo 2-3 foi transformada em E. coli BL21(DE3) e cultivada da mesma maneira que em 1). 4) COEXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdB E selABC
[0092] Uma combinação dos vetores pCDFDuet. prdB-H6-P;suc. selC e pACYCDuet selA selB preparados no Exemplo 2-3 foi transformada em E. coli BL21(DE3) e cultivada da mesma maneira que em 1).
[0093] Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçsoo alcançou 0,5 - 0,6, foi adicionado IPTG 0,1 mM. Adicionalmente, para suprir selênio necessário para a biossíntese e introdução de selenocisteína, selenito de sódio 10 uM foi suprido ou não e, então, cultivado por 16 horas. Cada uma das cepas de E. coli obtidas foi interrompida e a centrifugação foi realizada para isolar cada sobrenadante, seguido da análise Western blot.
[0094] Como resultado da análise, quando a proteína PrdB foi expressa individualmente, a proteína PrdB foi expressa em um nível muito baixo devido à baixa eficiência de introdução de selenocisteína (Figura 4, faixas 1 e 2) e quando a proteína PrdB e selC foram coexpressos (Figura 4, faixas 3 e 4) ou quando as proteínas PrdB e SelAB foram coexpressas (Figura 4, faixas 5 e 6), os mesmos resultados foram observados (Figura 4). Entretanto, quando a proteína PrdB e o gene selABC foram coexpressos, o nível de expressão da proteína PrdB aumentou notavelmente (Figura 4, faixa 7), indicando que um aminoácido não natural selenocisteína foi incorporado de modo eficaz na proteína PrdB devido aos efeitos das proteínas SelA e SelB que constituem operon sel e SelC que é o tRNA específico de selenocisteína. Adicionalmente, a adição de selenito de sódio (Figura 4, faixa 8; concentração final: 10 uM) aumentaram adicionalmente o nível de expressão da proteína PrdB, em comparação com a não adição (faixa 7), indicando que a construção do sistema para a incorporação eficaz de selenocisteína é um fator importante para aumentar o nível de expressão da proteína PrdB. EXEMPLO 3: VERIFICAÇÃO DA FUNÇÃO DE PROTEÍNA PrdH E AVALIAÇÃO DA ATIVIDAIDE DE D-PROLINA REDUTASE
INCLUINDO EXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdH 3-1: EXPRESSÃO DE PROTEÍNA DE D-PROLINA REDUTASE PARA VERIFICAÇÃO DA FUNÇÃO DE PrdH
[0095] Com base nas informações conforme confirmado acima, tentou- se a expressão de D-prolina redutase e, para essa finalidade, foram avaliadas as seguintes combinações dos vetores. 1) COEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS PrdA E PrdB
[0096] Foi realizada a coexpressão do vetor que expressa proteína PrdA construído anteriormente (pETDuet H6-prdA-H6) e do vetor que expressa proteína PrdB (combinação dos vetores pCDFDuet prdB-H6-P;suc selC e pACYCDuet selA selB). Os três tipos dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB (50 ml) que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). 2) COEXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdA, PrdB E PROTEÍNA PrdH
[0097] Foi realizada a coexpressão do vetor que coexpressa PrdA e PrdH construído anteriormente (pETDuet prdH H6-prdA-H6) e do vetor que expressa proteína PrdB (combinação dos vetores pCDFDuet prdB-H6- Psi selC e pACYCDuet, selA selB). Um método de cultura foi realizado da mesma maneira que em 1). 3) COEXPRESSÃO DE PROTEÍNA PrdA(C421A), PrdB E PROTEÍNA PrdH
[0098] Foi realizada a coexpressão do vetor que coexpressa proteína PrdA(C421A) e PrdH construído anteriormente (pETDuet prdH H6- prdA(C421A)-H6) e do vetor que expressa proteína PrdB (combinação dos vetores pCDFDuet. prdB-H6-Ps«c. selC e pACYCDuet selA selB). Um método de cultura foi realizado da mesma maneira que em 1) e 2).
[0099] Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODç«oo do meio de cultura alcançou 0,5 -— 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado a cada meio de cultura. Selenito de sódio 10 uM foi suprido e, então, cultivado por 16 horas. 3-2: IDENTIFICAÇÃO DA AUTOCLIVAGEM DE PROTEÍNA PrdA POR MEIO DA INTRODUÇÃO DE PROTEÍNA PrdH - ANÁLISE
WESTERN BLOT
[00100] As células de E. coli de cada meio de cultura obtido no Exemplo 3-1 foram rompidas e a centrifugação foi realizada para isolar um sobrenadante, seguido da análise Western blot.
[00101] Como resultado da análise, quando apenas a proteína PrdA e a proteína PrdB foram coexpressas, nenhum fenômeno de autoclivagem da proteína PrdA foi observado (Figura 5, faixa 1). Entretanto, quando a proteína PrdH e as proteínas PrdA e PrdB foram coexpressas, a forma inativa da proteína PrdA (proteína Pró-PrdA) desapareceu enquanto uma banda de proteína adicional foi formada (Figura 5, faixa 2).
[00102] Para confirmar se o resultado experimental acima foi ou não atribuído ao mecanismo intrínseco de autoclivagem da proteína PrdA, a cisteína na posição 421, que é conhecida como o sítio de autoclivagem da proteína PrdA, foi substituída por alanina (C421A) e coexpressão das proteínas PrdB e PrdH foi realizada. Como resultado, a proteína Pro-PrdA foi mantida enquanto nenhuma proteína clivada foi observada (Figura 5, faixa 3), indicando que as proteínas que apareceram adicionalmente são aquelas que resultam da clivagem específica de cisteína na posição 421 da proteína PrdA.
[00103] Portanto, foi confirmado que a proteína PrdH é uma proteína essencial para a autoclivagem da proteína PrdA e é uma proteína auxiliar que desempenha um papel importante para assegurar a atividade da proteína PrdA.
[00104] Além disso, com base nos resultados dos Exemplos anteriores, em que não ocorreu autoclivagem da proteína PrdA, embora a proteína PrdA e a proteína PrdH tenham sido coexpressas (Exemplo 1; Figura 2, faixa 5), foi confirmado que a proteína PrdH e a proteína PrdB precisam existir ao mesmo tempo para induzir a autoclivagem da proteína PrdA, indicando que a proteína PrdA e a proteína PrdB formam preferencialmente um complexo em um nível predeterminado ou maior e, então, ocorre o processo de clivagem pela proteína PrdH. 3-3: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE D-PROLINA REDUTASE COEXPRESSA COM PROTEÍNA PrdH - ANÁLISE DE TLC
[00105] As células de E. coli obtidas em 3-1 foram ajustadas para uma OD final de 50, seguido de centrifugação. Após a lavagem primária, as células de E. coli foram diluídas com 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0). Em seguida, cada 200 ul das amostras diluídas foram dispensados e DTT (concentração final de 25 mM) e D-prolina (concentração final de 10 mM) foram adicionados e deixados reagir por 6 horas, seguido da análise de TLC.
[00106] A cepa que coexpressa proteínas PrdA, PrdB e PrdH mostraram formação de um ponto que corresponde ao ácido 5-aminovalérico (5-AVA) na TLC (Figura 6, faixa 1). Na ausência da proteína PrdHáH, nenhuma atividade foi observada (Figura 6, faixa 2), indicando que nenhuma autoclivagem da proteína PrdA ocorreu devido à ausência de proteína PrdH, e como resultado, a atividade de D-prolina redutase não foi observada.
[00107] A cepa que coexpressa as proteínas PrdA, PrdB e PrdH foi projetada como CC04-9007 e, então, depositada no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) que é a autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste em 2 de fevereiro de 2017 com o número de acesso KCCM11963P. EXEMPLO 4. VERIFICAÇÃO DA APLICAÇÃO UNIVERSAL DE PROTEÍNA PrdH 4-1: SELEÇÃO DE CEPA PARA VERIFICAÇÃO DA APLICAÇÃO
UNIVERSAL DE PROTEÍNA PrdH
[00108] Para verificar que a proteína PrdH é uma proteína acessória essencial aplicada universalmente à autoclivagem da proteína PrdA, foi examinado se a proteína PrdH (doravante, mencionada como LsPrdH) estava ou não envolvida na autoclivagem da proteína PrdA (doravante, mencionada como LsPrdA) derivada de Lactobacillus salivarius, que é uma cepa conhecida por ter a reação de Stickland, além de Peptoclostridium difficile 630. 4-2: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE EXPRESSA LsPrdA (pETDuet H6-LsprdA-H6)
[00109] Um gene foi sintetizado mediante a incorporação de uma etiqueta de histidina 6X (H6) para análise Western blot em ambos os terminais da sequência de nucleotídeos da proteína LsPrdA (sequência de aminoácidos: EIJLY6, UniProtKB, SEQ ID NO: 19 / sequência de nucleotídeos: HMPREF9269 1797, NCBI GenBank AEBAO01000066.1, SEQ ID NO: 20), e mediante a inclusão de sequências de enzimas de restrição Ndel e Xhol nos terminais amino e carboxila, respectivamente. Um vetor pETDuet-l e o gene sintetizado foram digeridos com uma combinação de enzimas de restrição Ndel/Xhol e, então, cada fragmento de gene foi obtido através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, um vetor que expressa pETDuet. H6-LsprdA-H6 foi construído. 4-3: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE COEXPRESSA PROTEÍNAS LsPrdA e LsPrdH (pETDuet LsprdH H6-LsprdA-H6)
[00110] Adicionalmente, as sequências de enzimas de restrição da combinação Ncol/NotI foram adicionadas em ambos os terminais de uma sequência de nucleotídeos da proteína LsPrdH (sequência de aminoácidos: EIJLY7, UniProtKB, SEQ ID NO: 23 / sequência de nucleotídeos: HMPREF9269 1798, NCBI GenBank AEBAO01000066.1, SEQ ID NO: 24) e, então, a síntese foi realizada. O vetor que expressa pETDuet H6-LsPrdA-H6 construído foi digerido com uma combinação de enzimas de restrição Ncol/Notl, e os fragmentos de gene foram obtidos através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, um vetor que expressa pETDuet LsprdH H6-LsprdA-H6 foi construído. 4-4: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE EXPRESSA LsPrdB (pCDFDuet LsprdB(U1I51C)-H6)
[00111] Uma etiqueta de histidina 6X (H6) para análise Western blot foi incorporada ao terminal carboxila do gene correspondente da proteína PrdB derivada de Lactobacillus salivarius (doravante mencionada como LsPrdB) (sequência de aminoácidos: EILJLY8 e E1JLY9, UniProtKB, SEQ ID NO: 21 / sequência de nucleotídeos: HMPREF9269 1799 e HMPREF9269 1800, NCBI GenBank AEBAO01000066.1, SEQ ID NO: 22; no banco de dados de sequências, uma sequência de códon de parada (UAG) presente na proteína LsPrdB foi reconhecida não como uma sequência para introdução de selenocisteína, mas como um códon de parada para expressão de proteína e, dessa forma, a sequência foi expressa como duas sequências de proteínas ou nucleotídeos. Portanto, o vetor de expressão foi construído mediante a estimação de todas dentre as duas sequências de nucleotídeos e a sequência entre as duas sequências de nucleotídeos como uma sequência de nucleotídeos da proteína LsPrdB. Adicionalmente, para não reconhecer o códon (UGA) da selenocisteína introduzido para expressão eficaz da proteína PrdB como o códon de parada, o códon foi substituído pelo códon de cisteína (UGT) e as sequências das enzimas de restrição Ndel e Xhol foram adicionadas nos terminais amino e carboxila, respectivamente.
[00112] Com base nisso, o vetor pPCDFDuet-1 e o gene sintetizado foram digeridos com uma combinação de enzimas de restrição Ndel/Xhol, respectivamente e, então, cada fragmento de gene foi obtido através da separação em gel de agarose e através da reação enzimática de T4 ligase, foi construído um vetor que expressa pPCDFDuet. LsprdB(U151C)-H6. 4-5: IDENTIFICAÇÃO DA AUTOCLIVAGEM DE PROTEÍNA LsPrdA POR MEIO DA INTRODUÇÃO DE PROTEÍNA LsPrdH - ANÁLISE
WESTERN BLOT
[00113] A coexpressão de uma combinação do vetor que expressa proteína LsPrdA construído (pETDuet H6-LsprdA-H6) e o vetor que expressa proteína LsPrdB (pCDFDuet LsprdB(UI51C)-H6) ou o vetor que expressa proteína LsPrdA e LsPrdH (pETDuet -H6) e o vetor que expressa proteína LsPrdB (pCDFDuet LsprdB(U151C)-H6) foi realizada. As duas combinações dos vetores de expressão foram transformadas em £E. coli BL21(DE3), respectivamente e cultivadas em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODrçoo alcançou 0,5 - 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e, então, cultivado por 16 horas. Cada uma das cepas de £. coli obtidas foi interrompida e a centrifugação foi realizada para isolar cada sobrenadante, seguido da análise Western blot.
[00114] Como resultado do experimento, quando a proteína LsPrdA e a proteína LsPrdB(U151C) foram coexpressas, uma forma não clivada da proteína LsPrdA (proteína Pro-LsPrdA) e da proteína LsPrdB foi expressa e a degradação não específica da proteína LsPrdA foi observada (Figura 7, faixa 1). Em contrapartida, quando coexpressa com a proteína LsPrdH, a proteína Pro- LsPrdA foi reduzida enquanto uma banda de proteína adicional foi observada, indicando o fenômeno de autoclivagem da proteína LsPrdA (Figura 7, faixa 2). A proteína LsPrdH tem cerca de 55% de homologia de sequência de aminoácidos com a proteína PrdH obtida anteriormente, mas tem a mesma característica pelo fato de que são codificadas pelo gene ORF situado entre o gene prdA e o gene prdB no genoma.
[00115] Consequentemente, foi confirmado que as duas proteínas
(proteína PrdH e LsPrdH) presentes na posição similar no genoma têm a mesma função, embora tenham um nível relativamente baixo de homologia de sequência, e também se confirmou que, independentemente do tipo da cepa e da homologia de sequência, a proteína PrdH tem a função universal de induzir a autoclivagem de proteína PrdA, que é uma etapa essencial para a produção da D-prolina redutase ativa. EXEMPLO 5: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE PROTEÍNA EXPRESSA COMPLETAMENTE POR OPERON DE D-PROLINA REDUTASE - COEXPRESSÃO COM PROTEÍNA PrdDEE;
[00116] Para avaliar os efeitos de proteínas em outros operons prd na D- prolina redutase cuja atividade foi confirmada, a coexpressão adicional foi realizada. Como uma primeira etapa, a coexpressão de proteínas PrdDEE, foi realizada. 5-1: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE COEXPRESSA PROTEÍNAS PrdA, PrdH E PrdDEE> (pETDuet prdH prdADEE>)
[00117] Para coexpressar cada um dos genes da proteína PrdD derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) (sequência de aminoácidos: Q17ZY7, UniProtKB, SEQ ID NO: 7 / sequência de nucleotídeos: CD630 32400, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 8), a proteína PrdE (sequência de aminoácidos: Q17ZY2, UniProtKB, SEQ ID NO:9 / sequência de nucleotídeos: CD630 32390, NCBI GenBank AM180355.1, SEQID NO:10) e a proteína PrdE, (sequência de aminoácidos: Q17ZY3, UniProtKB, SEQ ID NO: 11 / sequência de nucleotídeos: CD630 32380, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 12) com a proteína PrdA, um sítio de ligação de ribossoma foi adicionado entre os respectivos genes, e as sequências de enzima de restrição da combinação Ndel/XholI foram adicionadas a ambos os terminais para realizar a síntese (prdADEE,). Em detalhes, o vetor que expressa pETDuet prdH H6- prdA-H6 construído anteriormente no Exemplo 1-4 e o gene prdDEE,
sintetizado foram digeridos com a combinação de enzimas de restrição Ndel/Xhol e, então, os fragmentos de gene foram obtidos através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, foi construído um vetor que expressa pETDuet prdH prdADEE,. 5-2: COEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS PrdA, PrdB, PrdH E PrdDEE; E VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE D-PROLINA REDUTASE INTENSIFICADA - ANÁLISE DE TLC
[00118] Foi realizada a coexpressão do vetor que expressa proteínas PrdADEE, e PrdH (pETDuet prdH prdADEE;) e do vetor que expressa proteína PrdB (combinação dos vetores pCDFDuet prdB-Psuc selC e pACYCDuet selA selB).
[00119] Os três tipos dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçoo alcançou 0,5 — 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e 10 uM de selenito de sódio foram supridos e, então, cultivados por 16 horas. As células de E. coli obtidas foram ajustadas para uma OD final de 50, seguido de centrifugação. Após a lavagem primária, as células de E. coli foram diluídas com | ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0).
[00120] Em seguida, cada 200 ul das amostras diluídas foram dispensados e DTT (concentração final de 25 mM) e D-prolina (concentração final de 10 mM) foram adicionados e deixados reagir por 6 horas, seguido da análise de TLC.
[00121] Como resultado, a combinação com PrdAHBDEE, mostrou um ponto relativamente grande de ácido 5-aminovalérico na TLC, em comparação com a combinação com a proteína PrdAHB, e uma taxa de reação inicial da D- prolina redutase também foi rápida (Figura 6, faixa 3). Esses resultados indicam que a proteína PrdDEE, induziu a intensificação da atividade de D-prolina redutase. EXEMPLO 6: EXPRESSÃO ADICIONAL DE PROTEÍNA PrdC E VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE D-PROLINA REDUTASE
INTENSIFICADA
[00122] A seguir, foi realizada a coexpressão da proteína PrdC. Sabe-se que a D-prolina redutase realiza a reação de conversão consumindo NADH, e PrdC está envolvida na transferência de elétrons dependente de NADH. Portanto, a proteína PrdC pode contribuir para a transferência de elétrons da D- prolina redutase. Para examinar o efeito da proteína PrdC, foram realizados experimentos na presença ou ausência de um agente redutor DTT. 6-1: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE EXPRESSA PROTEÍNA PrdC (pACYCDuet selA-prdC selB)
[00123] Para adicionar um gene da proteína PrdC derivada de Peptoclostridium difficitle 630 (clostridium difficile 630) (sequência de aminoácidos: Q177Z72, UniProtKB, SEQ ID NO: 13 / sequência de nucleotídeos: CD630 32470, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 14) ao sistema de expressão de D-prolina redutase existente, foi construído um vetor com capacidade para coexpressar proteínas SelA e SelB. Um sítio de ligação ao ribossoma foi inserido entre os genes selA e prdC e as sequências de enzimas de restrição da combinação Ncol/NotI foram adicionadas em ambos os terminais para realizar àa síntese (selA-prdCc). O vetor que expressa pACYCDuet selA selB construído anteriormente e o gene selA-prdC sintetizado foram digeridos com a combinação de enzimas de restrição Ncol/Notl, respectivamente, e cada fragmento de gene foi obtido através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, foi construído um vetor que expressa pACYCDuet selA-prdC selB. 6-2: COEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS PrdA, PrdB, PrdH, E PrdC E
VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE D-PROLINA REDUTASE INTENSIFICADA - ANÁLISE DE TLC
[00124] Foi realizada a coexpressão do vetor que expressa proteínas PrdADEE, e PrdH (pETDuet prdH prdADEE;) e do vetor que expressa proteínas PrdB e PrdC (combinação dos vetores pCDFDuet. prdB-P;suc selC e pACYCDuet selA-prdC selB).
[00125] Os três tipos dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçoo alcançou 0,5 — 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e 10 uM de selenito de sódio foram supridos e, então, cultivados por 16 horas. As células de E. coli obtidas foram ajustadas para uma OD final de 50, seguido de centrifugação. Após a lavagem primária, as células de E. coli foram diluídas com | ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0). Como um grupo controle do mesmo, foi usada E. coli em que o vetor que expressa proteínas PrdADEFE, e PrdH (pETDuet prdH prdADEE;,) e o vetor que expressa proteína PrdB (combinação dos vetores pCDFDuet. prdB-P;sac. selC e pACYCDuet selA selB) do Exemplo 5 foram coexpressos. Em seguida, cada 200 ul das amostras diluídas foi dispensado e D-prolina (concentração final de mM) foi adicionada e deixada reagir na presença ou ausência de DTT (concentração final de 25 mM) por 6 horas, seguido da análise de TLC.
[00126] Como resultado da reação, uma taxa de reação relativamente baixa foi observada, em comparação com a adição de DTT. Entretanto, quando apenas a proteína PrdC estava presente, a D-prolina foi convertida em ácido 5- aminovalérico, mesmo na ausência de DTT (Figura 8, faixa 2). Esses resultados indicam que a proteína PrdC contribui para a transferência de elétrons de D- prolina redutase, e a reação de conversão foi possível com o uso de uma potência de redução de NADH intracelular sem adição do agente redutor (DTT). EXEMPLO 7: EXPRESSÃO ADICIONAL DE PROTEÍNA prdG E VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE D-PROLINA REDUTASE
INTENSIFICADA
[00127] Estima-se que a proteína PrdG seja uma proteína membrânica, mas não há relatos da função exata da mesma até agora. 7-1: CONSTRUÇÃO DE VETOR QUE COEXPRESSA PROTEÍNAS PrdG e PrdB (pCDFDuet prdG prdB-Psac selC)
[00128] Um gene foi sintetizado mediante a inclusão de sequências de enzimas de restrição da combinação Ncol/Notl nos terminais amino e carboxila de uma sequência de nucleotídeos da proteína PrdG derivada de Peptoclostridium difficitle 630 (clostridium difficile 630) (sequência de aminoácidos: Q1I7ZY0, UniProtKB, SEQ ID NO: 15 / sequência de nucleotídeos: CD630 32360, NCBI GenBank AM180355.1; não foi nomeado proteína PrdG no banco de dados de sequência, mas nomeado proteína PrdG no presente documento, com base na homologia com a proteína PrdG de C. sticklandir,, SEQ ID NO: 16) O gene prdG sintetizado e o vetor pPCDFDuet. prdB-Psuc. selC construído anteriormente foram digeridos com as enzimas de restrição Ncol/Notl e, então, cada fragmento de gene foi obtido através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, foi construído um vetor que coexpressa a proteína PrdG e a proteína PrdB (pCDFDuet. prdG prdB-Psac. selC). 7-2: COEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS PrdA, PrdB, PrdH E PrdCG E VERIFICAÇÃO DE ATIVIDADE DE D-PROLINA REDUTASE INTENSIFICADA - ANÁLISE DE TLC
[00129] Foi realizada a coexpressão de uma combinação do vetor que expressa proteína PrdA e PrdH (pETDuet prdH prdA) e do vetor que expressa proteína PrdB (pCDFDuet. prdB-Psuc. selC e pACYCDuet selA selB) ou uma combinação do vetor que expressa proteína PrdA e PrdH (pETDuet prdH prdA) e do vetor que coexpressa proteína PrdB e PrdCG (pCDFDuet, prdG. prdB-Psuc. selC e pACYCDuet selA-prdC selB).
[00130] Os três tipos dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçoo alcançou 0,5 — 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e 10 uM de selenito de sódio foram supridos e, então, cultivados por 16 horas. As células de E. coli obtidas foram ajustadas para uma OD final de 50, seguido de centrifugação. Após a lavagem primária, as células de E. coli foram diluídas com | ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0).
[00131] Considerando que a proteína PrdG é uma proteína membrânica, cada 200 ul das amostras diluídas da combinação PrdAHB e da combinação PrdAHBCG foi dispensado e D-prolina (concentração final de 10 mM) foi adicionada, e as células inteiras, lisatos celulares sob a mesma condição OD e os sobrenadantes dos mesmos obtidos por centrifugação foram deixados reagir na presença ou ausência de DTT (concentração final de 25 mM) e na presença ou ausência de glicose a 1% por 6 horas, seguido da análise de TLC.
[00132] Como resultado do experimento, quando a combinação PrdAHBCG, incluindo adicionalmente a proteína PrdC, exibiu atividade com ou sem DTT (Figura 9, sem, pistas 4 a 6) e, em particular, quando DTT foi adicionado ao sobrenadante do lisato celular e deixado reagir, a combinação PrdAHBCG mostrou um nível de atividade relativamente baixo, em comparação com a combinação PrdAHB (Figura 9, DTT, faixa 6).
[00133] Esses resultados indicam que uma porção significativa da D- prolina redutase expressa foi removida por centrifugação e, devido à ligação com a proteína PrdG que tem a característica de proteína membrânica, a D-
prolina redutase expressa foi removida após a precipitação por centrifugação. Adicionalmente, na reação de conversão à base de DTT, tanto a combinação PrdAHB como PrdAHBCG mostraram níveis similares de atividade nas células inteiras e nos lisatos celulares. Quando foi adicionada glicose a 1% para aumentar o suprimento de NADH sem DTT, apenas a combinação PrdAHBCG mostrou atividade (Figura 9, glicose a 1%). Com base nos resultados experimentais do Exemplo 6, que mostram que a proteína PrdC está relacionada com a disponibilidade de NADH, pode ser visto que, através da associação com a proteína PrdC, a proteína PrdG induz a formação do complexo de D-prolina redutase que usa prontamente NADH intracelular. Em outras palavras, quando um agente redutor como o DTT é usado, é possível transferir elétrons diretamente para a D-prolina redutase com ou sem uma proteína mediadora. Entretanto, quando o NADH intracelular é usado sem a adição externa do agente redutor, é necessária a proteína mediadora (proteína PrdC) com capacidade para ajudar na transferência de elétrons e, para a construção de um sistema de transferência de elétrons eficaz, a proteína PrdG funciona para aumentar a integração de D-prolina redutase, induzindo assim o efeito de aprimoramento da atividade. EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DA CEPA QUE PRODUZ ÁCIDO 5- AMINOVALÉRICO A PARTIR DE D-PROLINA COM O USO DA PROTEÍNA AUXILIAR PrdH 8-1: PREPARAÇÃO DA CEPA QUE PRODUZ ÁCIDO 5-
AMINOVALÉRICO
[00134] Para produzir ácido 5-aminovalérico a partir de uma fonte de açúcar por meio de um micro-organismo, é necessário suprir D-prolina, que é um substrato da D-prolina redutase. Entretanto, uma vez que E. coli não tem via de biossíntese de d-prolina, uma via metabólica de uso de d-prolina que é convertida a partir de L-prolina foi projetada. Em detalhe, a prolina racemase que tem uma capacidade de formar isômero de prolina precisa existir ao mesmo tempo. Portanto, na presente revelação, foi realizado um experimento através da introdução de prolina racemase, que é a técnica conhecida (Rudnick et al., Biochemistry, 1975, 14(20), 4.515 a 4.522).
[00135] Para essa finalidade, para inserir o gene prdF da proteína prolina racemase derivada de Peptoclostridium difficile 630 (clostridium difficile 630) (sequência de aminoácidos: QI17ZY4, UniProtKB, SEQ ID NO: 17 / sequência de nucleotídeos: CD630 32370, NCBI GenBank AM180355.1, SEQ ID NO: 18) no sistema de expressão de D-prolina redutase existente, um sítio de ligação ao ribossoma foi adicionado entre os respectivos genes para a coexpressão com a proteína PrdG e, então, as sequências de enzimas de restrição da combinação Ncol/NotIl foram adicionadas a ambos os terminais para realizar a síntese (prdGF).
[00136] O vetor de expressão pCDFDuet prdG prdB-Ps«c selC construído anteriormente e o gene prdGF sintetizado foram digeridos com a combinação de enzimas de restrição Ncol/Notl, e cada fragmento de gene foi obtido através da separação em um gel de agarose. Através da reação enzimática de T4 ligase, foi construído um vetor que expressa pCDFDuet. prdGF prdB- Pseic selC. 8-2: VERIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE ÁCIDO 5-AMINOVALÉRICO POR MEIO DA D-PROLINA REDUTASE ATIVA - ANÁLISE DE LC/MS
ETLC
[00137] Uma combinação de vetor que expressa proteínas PrdA e PrdH (PETDuet. prdH prdA) e PrdBCG (vetores pPCDFDuet. prdG. prdB-Psuc. selC e pACYCDuet selA-prdC selB) e uma combinação de vetor que expressa proteínas PrdA e PrdH (pETDuet. prdH prdA) e vetor que expressa proteína PrdBCGF (vetores pCDFDuet. prdGF prdB-Ps«c selC e pACYCDuet selA- prdC selB) foram expressas. As duas combinações dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçoo alcançou 0,5 — 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e 10 uM de selenito de sódio e glicose a 196 (NADH intensificado) foram supridos e, então, cultivados a 30 ºC, 200 rpm por 24 horas. O meio de cultura obtido por centrifugação foi submetido a análises de LC/MS e TLC.
[00138] Como resultado do experimento, cerca de 67,7 ppm de ácido 5- aminovalérico foram produzidos na presença de prolina racemase (Figura 10, faixa 3) e o ácido 5-aminovalérico não foi produzido na ausência de prolina racemase (Figura 10, faixas 1 a 2). Em outras palavras, foi confirmado que a L- prolina foi produzida a partir da fonte de açúcar adicionada através de um metabolismo em E. coli e, então, convertida em D-prolina por meio de prolina racemase e, finalmente, o ácido 5-aminovalérico foi produzido pela D-prolina redutase ativa produzida. 8-3: PRODUÇÃO DE ÁCIDO 5-AMINOVALÉRICO A PARTIR DE D-
PROLINA ADICIONADA AO MEIO DE CULTURA
[00139] Além de um processo para produzir ácido 5-aminovalérico a partir de uma fonte de açúcar por fermentação direta, foi realizado um experimento para converter o ácido 5-aminovalérico a partir de D-prolina que foi adicionada externamente durante a cultura do micro-organismo, incluindo a D-prolina redutase ativa.
[00140] Em detalhe, foi realizado um experimento para examinar se o ácido 5-aminovalérico pode ou não ser biossintetizado a partir de D-prolina adicionada a um meio de cultura. Para essa finalidade, o vetor que expressa proteínas PrdA e PrdH construído anteriormente (pETDuet prdH prdA) e o vetor que expressa proteína PrdBCG (combinação do vetor
PpCDFDuet. prdG prdB-Psac selC e pACYCDuet selA-prdC selB) foram coexpressos. Os três tipos dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ug/ml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçoo alcançou 0,5 — 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e 10 uM de selenito de sódio e glicose a 1% foram supridos e, então, cultivados adicionalmente a 30 ºC, 200 rpm por 24 horas na presença ou ausência de D- prolina 5 mM. O meio de cultura obtido por centrifugação foi submetido à análise de LC/MS.
[00141] Como resultado da análise, confirmou-se que o ácido 5- aminovalérico não foi observado na ausência de D-prolina, enquanto que, em média, 196,7 ppm (1,68 mM) de ácido 5-aminovalérico foram produzidos na presença de 5 mM de D -prolina, o que foi confirmado pela análise de HPLC (Shimadzu). EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO DE SUBSTRATO ANÁLOGO DE D- PROLINA COM BASE NA D-PROLINA REDUTASE
[00142] Para confirmar adicionalmente a atividade de D-prolina redutase ativa construída, vários substratos diferentes de prolina foram submetidos à reação de conversão. Nesse Exemplo, o ácido D-azetidina-2-carboxílico (D- Aze) que tem uma estrutura similar à D-prolina, cis-4-hidroxi-D-prolina e trans- 4-hidroxi-D-prolina, em que um grupo hidroxila (-OH) foi adicionado à estrutura de anel de D-prolina, foram usados como substratos da D-prolina redutase.
[00143] Para essa finalidade, o vetor que expressa proteínas PrdA e PrdH construído anteriormente (pETDuet. prdH prdA) e o vetor que expressa proteína PrdB (combinação de vetor pCDFDuet. prdB-P;suc. selC e pACYCDuet selA selB) foram coexpressos. Os três tipos dos vetores de expressão foram transformados em E. coli BL21(DE3) e cultivados em um meio LB que contém antibióticos (0,1 mg/ml de ampicilina, 50 ugml de espectinomicina e 30 ug/ml de cloranfenicol) (37 ºC, 200 rpm). Para induzir a superexpressão das proteínas desejadas, quando o valor de ODçoo alcançou 0,5 — 0,6, IPTG 0,1 mM foi adicionado e 10 uM de selenito de sódio foram supridos e, então, cultivados por 16 horas. As células de E. coli obtidas foram ajustadas para uma OD final de 50, seguido de centrifugação. Após a lavagem primária, as células de E. coli foram diluídas com 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 8,0). Em seguida, cada 200 ul das amostras diluídas foi dispensado e DTT (concentração final de 25 mM) e vários substratos (concentração final de 10 mM, Figura 11A) foram adicionados e deixados reagir por 6 horas, seguido da análise de TLC. O ácido D-azetidina-2-carboxílico tem uma estrutura de anel de 4 membros devido à falta de um átomo de carbono, em comparação com a D- prolina, e quando convertido pela D-prolina redutase, o ácido y-aminobutírico (GABA) é produzido. Como resultado da reação, o ácido D-azetidina-2- carboxílico mostrou uma taxa de reação relativamente baixa, em comparação com a D-prolina, mas a produção de GABA foi claramente observada em TLC (Figura 11B, faixa 6).
[00144] Quando cis-4-hidroxi-D-prolina ou trans-4-hidroxi-D-prolina é submetida à reação de conversão, é produzido o ácido 5-amino-4- hidroxipentanoico. Como resultado da reação, cis-4-hidroxi-D-prolina ou trans- 4-hidroxi-D-prolina mostraram uma taxa de reação relativamente baixa, em comparação com a D-prolina, mas a redução de substrato em TLC e o ponto de TLC recém-formado foram observados, independentemente da forma de isômero do grupo hidroxila (Figura 11C, pista 5 e pista 8).
[00145] Esses resultados indicam que a D-prolina redutase ativa expressa tem capacidade para converter outros substratos que têm tamanhos diferentes da estrutura de anel e análogos de substrato que têm modificação adicional, bem como a D-prolina conhecida.
[00146] Com base na descrição acima, será entendido pelos versados na técnica que a presente revelação pode ser implantada em uma forma específica diferente sem alterar o espírito técnico ou as características essenciais da mesma. Portanto, deve-se entender que a modalidade acima não é limitativa, mas ilustrativa em todos os aspectos. O escopo da revelação é definido pelas reivindicações anexas em vez da descrição que precede as mesmas e, portanto, todas as alterações e modificações que estão incluídas nos limites das reivindicações, ou equivalentes de tais limites, portanto, são destinadas a serem abrangidas pelas reivindicações.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa, caracterizado pelo fato de que as atividades de proteína PrdA, proteína PrdB e proteína PrdH são intensificadas.
    2. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína PrdA compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:
    19.
    3. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína PrdB compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO:
    21.
    4. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína PrdH é uma proteína codificada por um gene ORF presente entre um gene que codifica a proteína PrdA e um gene que codifica a proteína PrdB.
    5. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína PrdH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: | ou SEQ ID NO:
    23.
    6. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as atividades de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em PrdD, PrdE e PrdE?2 são adicionalmente intensificadas.
    7. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as atividades de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em PrdC, PrdG e PrdF são adicionalmente intensificadas.
    8. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um micro-organismo do gênero Escherichia.
    9. Micro-organismo que expressa D-prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é E. coli.
    10. Método para produzir D-prolina redutase ativa, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: cultivar o micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações | a 9, em um meio, e recuperar a D-prolina redutase ativa a partir do micro-organismo ou do meio.
    11. Método para produzir um ou mais selecionados do grupo que consiste em ácido aminovalérico (ácido 5-aminovalérico, 5-AVA), ácido y- aminobutírico (GABA) e ácido 5-amino-4-hidroxipentanoico, caracterizado pelo fato de ser com o uso do micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, ou a prolina redutase produzida pelo micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
    12. Proteína PrdH, caracterizada pelo fato de que tem atividade para converter D-prolina redutase inativa em D-prolina redutase ativa, enquanto é coexpressa com a proteína PrdA e a proteína PrdB.
    13. Proteína PrdH de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína PrdA compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 19.
    14. Proteína PrdH de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína PrdB compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 21.
    15. Proteína PrdH de acordo com a reivindicação 12,
    caracterizada pelo fato de que a proteína PrdH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23.
    16. Método para produzir um micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa, o método caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula hospedeira com um cassete de expressão que compreende gene prdA ou genes prdA e prdH; e transformar a célula hospedeira com um cassete de expressão que compreende gene prdB ou genes prdB e prdH.
    17. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que a proteína PrdA compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 19.
    18. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que a proteína PrdB compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 21.
    19. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que a proteína PrdH é uma proteína codificada por um gene ORF presente entre um gene que codifica a proteína PrdA e um gene que codifica a proteína PrdB.
    20. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que a proteína PrdH compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 23.
    21. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que as atividades de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em PrdD, PrdE e PrdE2 são adicionalmente intensificadas.
    22. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que as atividades de uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em PrdC, PrdG e PrdF são adicionalmente intensificadas.
    23. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um micro-organismo do gênero Escherichia.
    24. Método para produzir o micro-organismo que expressa D- prolina redutase ativa de acordo com a reivindicação 16, o método caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é E. coli.
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