KR101951557B1

KR101951557B1 - 활성형 d-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 활성형 d-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101951557B1
Application number: KR1020170088632A
Authority: KR
Inventors: 박진승; 박보성; 양영렬; 오린석; 이나훔; 문준옥
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2017-07-12
Publication date: 2019-02-22
Also published as: KR20190007571A; US20210317419A1; JP2020525045A; CN111032874A; BR112020000525A2; EP3653715A1; US11708564B2; EP3653715A4; WO2019013569A1; JP7162660B2

Abstract

본 출원은 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물에 관한 것이다.

Description

활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법{Microorganism expressing an active D-proline reductase and Method for producing active D-proline reductase using the same}

본 출원은 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 당해 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 이를 바탕으로 D-프롤린 및 D-프롤린 유사 물질을 환원하는 방법 및 PrdA 단백질과 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질에 관한 것이다.

석유 수급의 불안 및 고갈에 대한 위기 의식과 더불어 환경 친화적인 제품 개발 트랜드로 인해 바이오 플라스틱, 바이오 에너지 등 바이오매스 유래의 제품에 대한 연구 개발이 진행되고 있으며, 특히 나일론의 경우 다양한 바이오매스 유래의 단량체를 적용하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 일례로 바이오매스 유래의 퓨트레신(putrescine)의 적용을 통한 나일론 4,6 개발, 바이오매스 유래 카다베린(cadaverine)의 적용을 통해 나일론 6,6의 헥사메틸렌 다이아민(hexamethylene diamine, HMDA)을 대체할 수 있는 나일론 5,6에 대한 연구가 진행되고 있다. 또한 글루탐산(glutamic acid)을 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 생산이 가능한 4-아미노부티릭산(또는 감마-아미노부티릭산(gamma-aminobutyric acid, GABA))를 단량체로 사용하여 나일론 4 제품 개발에 대한 연구도 진행되고 있다.

5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid)은 나일론 5의 단량체로써, 프롤린(proline)으로부터 D-프롤린 리덕타제에 의해 전환되는 것으로 알려져있다. 그러나, 상기 D-프롤린 리덕타제의 활성화를 위해서는 PrdA 단백질의 정확한 자가절단과 동시에 피루보닐 그룹이 도입되어야 한다. 그러나, 이것이 기술적 한계로 여겨지고 있어 활성형 D-프롤린 리덕타제를 제조할 수 있는 방법의 요구가 증대되고 있다.

이에, 본 발명자들은 D-프롤린 리덕타제(D-rpoline reductase)를 활성형으로 생산 가능한 재조합 발현 시스템 및 균주 개발을 위해 지속적으로 연구하였으며, 이와 더불어 다양한 D-프롤린 유사 기질에 대한 적용 가능성 연구를 수행하였다. 이로부터 PrdA 단백질 및 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제(D-rpoline reductase)를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환하는 PrdH 단백질을 최초로 규명하였다. 또한, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 이로부터 생산된 D-프롤린 리덕타제의 활성을 성공적으로 증명하였다.

본 출원의 하나의 목적은 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 상기 미생물 또는 배지로부터 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계를 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물 또는 상기 미생물이 생산하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 이용하여 아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA), γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA) 및 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산 (5-amino-4-hydroxypentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 PrdA 단백질 및 PrdB과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 PrdH 단백질을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 다른 목적은 prdA 또는 prdA와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계, prdB 또는 prdB와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계를 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원에서 용어, "D-프롤린 리덕타제(D-Proline reductase)"는 PrdA 단백질과 PrdB 단백질로 이루어진 단백질 복합체를 의미한다. 주요 기능은 D-형의 프롤린(D-Proline)이 환원되어 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환되는 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 상기 반응은 혐기 균주의 에너지원(ATP) 공급을 위해 활용되는 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)의 마지막 단계에 해당하는 것으로 알려져 있다(Bouillaut et al., J. Bacteriol., 2013, 195(4), 844-854).

상기 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)는 스티클랜드 발효 (Stickland Reaction)라고도 불리우며, 아미노산이 유기산으로 결합되는 동안 산화 및 환원되는 것을 포함하는 반응을 의미한다. 구체적으로, 전자 공여체인 아미노산은 원래 아미노산보다 짧은 1 탄소 원자가 휘발성 카르복실 산으로 산화된다. 예를 들어, 3 개의 탄소 사슬을 갖는 알라닌은 2 개의 탄소를 갖는 아세테이트로 전환된다. 아미노산은 스티글랜드 수여체(acceptor), 스티글랜드 공여체(doner)일 수 있다.

상기 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 대표적인 균주로는 펩토클로스트리디움 디피실리 630(Peptoclostridium difficile 630) (클로스트리디움 디필리실 (Clostridium difficile 630)), 펩토클로스트리디움 스틱클랜디 (Peptoclostridium stiklandii ) ((클로스트리디움 스틱클랜디) (Clostridium stiklandii)), 또는 유박테리움 엑시도미노필리움 (Eubacterium acidaminophilum ) 가 있으며, 락토바실러스 살리바리어스 (Lactobacillus salivarius )와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 계열의 일부 균주들도 이에 해당한다고 알려져 있다. 따라서, 상기 균주들을 이용하여, 본 출원의 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질, 그리고 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산할 수 있다.

D-프롤린 리덕타제의 주요 기능은 D-프롤린(D-Proline)으로부터 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)의 전환 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 현재까지 D-프롤린 리덕타제에 대한 명확한 반응 기작은 알려진바 없지만 다음과 같은 반응 기작이 제안되고 있다. 우선 alpha-PrdA, beta-PrdA, 및 PrdB 단백질 복합체로 이루어진 D-프롤린 리덕타제의 구성 단백질 중 alpha-PrdA 단백질의 아미노 말단에 위치하고 있는 피루보일 그룹(pyruvoyl group)과 기질인 D-프롤린의 아민 그룹과의 상호 결합으로 인해 기질의 활성 에너지가 낮아지게 된다. 다음 단계로 PrdB 단백질에 위치하고 있는 셀레노시스테인에 의해 D-프롤린의 알파 탄소와 아민 그룹 사이의 C-N 결합이 끊어지게 되고, 그 결과 D-프롤린으로부터 5-아미노발레릭산으로 전환반응이 일어나게 된다(Kabisch et al., J. Biol. Chem., 1999, 274(13), 8445-8454). 본 출원에서 용어, "활성형 D-프롤린 리덕타제"는 본 출원의 보조 단백질인 PrdH에 의해, D-프롤린 리턱타제를 구성하는 PrdA 단백질과 PrdB 단백질 중, PrdA 단백질이 정확한 자가절단에 의해, alpha-PrdA 및 beta-PrdA로 분리되며, 이중 분리된 alpha-PrdA 부분의 아미노 말단 쪽으로 피루보일 그룹이 결합한 alpha-PrdA, beta-PrdA 및 PrdB 단백질로 이루어진 단백질 복합체를 의미한다. 이와 같은 활성형 D-프롤린 리덕타제는 피루보일 그룹이 결합한 alpha-PrdA의 피루보일 그룹이 기질인 D-프롤린, 또는 D-프롤린과 유사한 기질들과의 결합을 통해 상기 기질들을 환원시킬 수 있는 상태의 활성형 효소를 의미한다. 예를 들어, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제는 기질인 D-프롤린을 5-아미노발레릭산(5-aminovalerate)으로 전환시킬 수 있다.

본 출원에서 용어, D-프롤린은 α-아미노산인 L-프롤린의 광학 이성질체이다. 특히, L-프롤린의 경우 비필수 아미노산으로 L-글루타메이트로부터 합성 할 수 있으며, 라세메이즈에 의해서 D-프롤린으로 전환이 가능하다.

본 출원에서 용어, "PrdA 단백질"은 D-프롤린 리덕타제의 단백질 복합체를 구성하는 일 구성요소로서, 상기 PrdA 단백질은 자가 절단 과정을 통해서 alpha-PrdA 단백질(카르복실 말단 단편) 및 beta-PrdA 단백질(아미노 말단 단편)로 나뉘어지게 된다. 일반적인 자가 절단 과정은 단순한 펩타이드 본드의 절단을 통해서 일어나지만 PrdA 단백질의 자가 절단 과정은 펩타이드 본드의 절단 과정과 동시에 alpha-PrdA 단백질의 아미노 말단에 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 도입되는 특성이 있다. PrdA 단백질이 독립적으로 존재할 경우 단백질 자체의 불완전성으로 인해 비특이적인 절단/분해 과정이 수반되며, alpha-PrdA 단백질 및 beta-PrdA 단백질로 완벽히 분리되지 않는 문제점이 있다.

상기 피루보일 그룹은 기질의 활성 에너지를 낮추는 역할을 하기 때문에 D-프롤린 리덕타제의 활성에 필수적인 잔기로 알려져 있다(Kabisch et al., J. Biol. Chem., 1999, 274(13), 8445-8454). 하지만 일반적인 가수 분해 반응을 통한 단백질 절단 기작은 상기 피루보일 그룹이 도입되지 않기 때문에 이를 해결하기 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다. PrdA 단백질(pro-PrdA 단백질) 자체의 구조적 불안정성으로 인해 일어나는 비특이적 단백질 분해 과정을 방지하기 위해서, 아미노 말단이 제거된 PrdA 단백질 단편을 대상으로 NaBH₄등의 환원제를 첨가하여 인위적인 절단 과정을 유도한 연구가 진행된 바 있다. 그 결과 원하는 위치 특이적 절단은 확인되었지만, 피루보일 그룹의 도입은 이루어지지 않은 것으로 확인되었다(Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3538-3544).

상기 PrdA 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdA 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 대표적인 예로, 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리 630)) 또는 락토바실러스 살리바리어스 유래 PrdA 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로써 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 19의 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 및 상기 서열번호 19와 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PrdA 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원에서 용어, "PrdB 단백질"은 D-프롤린 리덕타제의 단백질 복합체를 구성하는 일 구성요소로서, 상기 PrdB 단백질은 비천연 아미노산(non-natural amino acid)인 셀레노시스테인(selenocystein, Sec)을 포함하고 있는 셀레노 단백질이다. 셀레노시스테인은 일명 21번째 아미노산으로 불리는 비천연 아미노산으로써, 일반적인 단백질 합성 기작을 통해서 단백질 내에 도입되지 않는다는 특징을 지니고 있다(Itoh et al., Science, 340(6128), 2013, 75-78.). 특히 64개의 코돈 중 UGA 코돈, 즉 정지 코돈(stop codon)을 사용하여 도입이 진행되기 때문에 셀레노시스테인 도입 시스템이 없을 경우 상기 정지 코돈에서 단백질 합성이 중단되는 현상이 나타난다. 또한 상기 셀레노시스테인 도입 코돈을 일반적인 정지 코돈으로 인식하지 않기 위해서 SECIS(SElenoCysteine Incorporation Sequence)라고 일컬어지는 서열/구조 특이적 mRNA의 2차 구조가 UGA 코돈 아래쪽으로 위치해야 하며, 이와 연계하여 단백질 내에 도입하기 위한 sel 시스템(SelABCD)이 확보되어야 한다(Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2486-2492).

상기 PrdB 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdA 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 대표적인 예로, 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리 630) 또는 또는 락토바실러스 살리바리어스 유래 PrdB 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로써 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 21의 폴리펩티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 및 상기 서열번호 21과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PrdB 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원에서 용어, "PrdH 단백질"은 D-프롤린 리덕타제를 구성하는 PrdA단백질 및 PrdB단백질를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF를 이용하여 코딩된 신규 단백질을 의미한다. 본 출원에서는 이를 PrdH라 명명하였다. 또한, D-프롤린 리덕타제 활성을 갖는 균주의 종속 또는 특성에 따라, 상기 PrdH 단백질은 PrdA 또는 PrdB와 일부 겹쳐 존재할 수 있으며, PrdH의 정지 코돈(Stop codon)이 PrdB의 개시 코돈(Start codon) 뒤에 있을 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 PrdH단백질은 PrdA 단백질 및 PrdB과 동시발현되어, PrdA 단백질의 정확한 자가 절단 및 피루보일 그룹의 도입을 유도함으로써, 활성형 D-프롤린 리덕타제로 구성될 수 있도록 한다. 구체적으로 상기 PrdH 단백질은 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdH 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 즉, 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdA 단백질 및 PrdB단백질를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF를 포함하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 대표적인 예로, 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리 630) 또는 또는 락토바실러스 살리바리어스 유래 PrdH 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 펩토클로스트리디움 디피실리 630 유래 PrdH 단백질과 락토바실러스 살리바리어스 유래의 PrdH 단백질 40%의 상동성을 가지며, 상기 각 두 미생물 유래의 PrdA 단백질 및 PrdB 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF라는 공통점을 가진다. 보다 구체적인 예를 들어, 상기 PrdH단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 본 출원의 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PrdH 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 서열번호 1 또는 서열번호 23으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는PrdH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범위 내에 속하며, 예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 0의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.

코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃,1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.

혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.

구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.

폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).

상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.

본 출원에서 용어, "활성의 강화"는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 자연적 혹은 인위적으로 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 나타나게 되는 것을 의미한다. "내재적 활성"은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.

예를 들어, 상기 활성 강화는 외래의 D-프롤린 리덕타제를 숙주세포에 도입하거나 도입하여 강화하는 것, 또는 내재적 D-프롤린 리덕타제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 출원에서 활성 증가는,

1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는

4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.

다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있다. 상기 프로모터와 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.

마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.

본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 또한 상기 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 표적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원의 일 구체적인 예는 상기 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물에 추가로 PrdD, PrdE, 및 PrdE₂로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공한다.

또한, 본 출원의 일 구체적인 예는 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물에 추가로 PrdC, PrdG, 또는 PrdF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공한다.

상기 "PrdD 단백질, PrdE 단백질, Prd E₂ 단백질, PrdC 단백질, PrdG 단백질, PrdF 단백질"은 D-프롤린 리덕타제의 Prd 오페론을 구성하는 단백질을 의미한다. 구체적으로 D-프롤린 리덕타제를 구성하고 있는 PrdA 및 PrdB 단백질 외에 prd 오페론을 구성하고 있는 단백질은 PrdDEE₂CGFR로 알려져 있다. 현재까지 가장 잘 알려진 prd 오페론은 Clostridium sticklandii 균주에 존재하며, 상기 단백질 명칭은 C. stricklnadii의 오페론(NCBI GenBank: FP565809.1) 구성을 기준으로 한다(Jackson et al., J. Bacteriol., 2006, 188, 8487-8495).

Prd 오페론을 구성하고 있는 각 단백질의 기능은 명확히 규명되지 않았지만, PrdD, PrdE, 및 PrdE₂ 단백질은 PrdA 단백질과 높은 서열 상동성을 갖고 있다. 이 중, PrdD 단백질은 beta-PrdA 단백질과 높은 상동성을 보이며, PrdE 및 PrdE₂ 단백질은 alpha-PrdA 단백질과 높은 상동성을 보인다. 상기 PrdD, PrdE, 및 PrdE₂ 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 본 출원에서 PrdD, PrdE, 및 PrdE₂ 단백질은 펩토클로스트리디움 디피실레 630(펩토클로스트리디움 디피실리 630 (Clostridium difficile 630))유래 PrdD, PrdE, 및 PrdE₂ 단백질, 구체적으로 서열번호 7, 9, 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 8, 10, 12의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

PrdC 단백질은 NADH를 활용하여 D-프롤린 리덕타제에 전자 전달에 관여하는 것으로 보고되고 있으며(Fonknechten et al., BMC Genomics, 2010, 11, 555), PrdG 단백질은 멤브레인 단백질로 알려져 있지만 그 기능성에 대해 보고된 적은 없다. 상기 PrdC 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 본 출원에서 PrdC, PrdG 단백질은 펩토클로스트리디움 디피실레 630(Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630))유래 PrdC, PrdG 단백질, 구체적으로 서열번호 13, 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 14, 16의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, PrdF 단백질은 프롤린 라세메이즈(proline racemase)로써 프롤린의 광학 이성질체 형성에 관여하는 단백질로 알려져 있으며, PrdR 단백질은 prd 오페론의 활성화와 관련된 기능을 갖는 것으로 보고되고 있다 (Bouillaut et al., J. Bacteriol., 2013, 195(4), 844-854). 상기 PrdF 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 본 출원에서 PrdF 단백질은 펩토클로스트리디움 디피실레 630(Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630))유래 PrdF 단백질, 구체적으로 서열번호 17의 아미노산 서열 또는서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 용어, '활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물'이란, PrdA 단백질의 정확한 자가 절단을 통해 얻어진 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 결합된 alpha-PrdA와 beta-PrdA 및 PrdB로 구성된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 의미한다. 상기 '미생물'은 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 에스케리키아속의 예로 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 상기 D-프롤린 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현할 수 있는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 에스케리키아 속 미생물은 상기 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 출원의 또 다른 양태는, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기 미생물 또는 배지로부터 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계를 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법일 수 있다.

상기 '활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물'에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

상기 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 , 구체적으로는 25 내지 40 를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배지 및 배양 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 증류, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 활성형 D-프롤린 리덕타제는 정제된 형태 또는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 함유한 미생물 발효액일 수 있다.

본 출원의 또 다른 양태는, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 또는 이로부터 생산된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 이용하여 D-프롤린 또는 이의 유사체를 환원방법에 의해 전환시키는 방법일 수 있다.

구체적으로는, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 또는 이로부터 생산된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 이용하여 아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA), γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA) 및 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산 (5-amino-4-hydroxypentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생산하는 방법일 수 있다.

상기 D-프롤린 유사체는 D-프롤린과 유사한 구조를 갖는 물질로서 카복실기와 알파 탄소, 아미노기가 순차적으로 연결되며, 상기 알파 탄소와 아미노기를 포함하는 링 구조를 가진 물질이면, 링의 크기에 상관없으며, 본 출원의 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 환원될 수 있는 모든 유사체를 포함한다. 구체적으로, D-아제티딘-2카르복실산(D-azetidine-2-carboxylic acid), 트랜스-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline), 시스-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.

또한, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의한 환원은, D-프롤린 또는 그 유사체 구조에서 알파 탄소와 아미노기 사이의 결합이 끊어져, 링 구조가 풀리는 전환반응을 의미한다. 구체적으로, D-프롤린은 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환될 수 있다. 또한 상기 D-아제티딘-2카르복실산(D-azetidine-2-carboxylic acid)의 경우, D-프롤린 대비 하나의 탄소가 부족한 4각 링 형태의 구조를 가지며, 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 전환 반응이 진행될 경우 γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA)이 생성될 수 있다. 또한, D-프롤린의 링 구조에 하이드록실 그룹(-OH)이 추가된 형태의 cis-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline) 또는 trans-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline)는 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 전환 반응이 진행될 경우, 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산(5-amino-4-hydroxypentanoic acid)가 생성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 또 다른 양태는, PrdA 단백질 및 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질일 수 있다.

상기 'PrdA 단백질', 'PrdB 단백질', 'PrdH 단백질', '활성형 D-프롤린 리덕타제'에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 출원에서 용어, '동시 발현'은 2 이상의 단백질의 발현 또는 2 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 동시에 나타나는 것을 의미한다. 상기 유전자 또는 단백질의 발현 방법은 당업계에 공지된 방법 중에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 출원에서 용어, "비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환"이란, 비활성 상태인 D-프롤린 리덕타제가 활성형 D-프롤린 리덕타제의 활성을 갖도록 전환되는 것을 의미한다. 비활성형 D-프롤린 리덕타제가 PrdA 단백질의 정확한 자가 절단을 통해 얻어진 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 결합된 alpha-PrdA와 beta-PrdA 및 PrdB로 구성된 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환되는 것을 의미한다. 상기 '비활성형 D-프롤린 리덕타제'는 PrdA 단백질이 자가절단되지 않거나, 자가절단되더라도 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 결합되지 않은 alpha-PrdA와 beta-PrdA로 구성되거나, PrdA 또는 PrdB의 단백질이 발현되지 않거나, 또는 발현되더라도 활성이 없는 경우를 의미할 수 있다.

본 출원의 또 다른 양태는, prdA 또는 prdA와 prdH 유전자를 포함하는 발현 카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계 및 prdB 또는 prdB와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계를 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법일 수 있다.

상기 'PrdA 단백질', 'PrdB 단백질', 'PrdH 단백질', '발현 카세트', '활성형 D-프롤린 리덕타제', '활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물'에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 출원에서 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 새롭게 제안하였으며, 기존의 D-프롤린 리덕타제를 구성하는 PrdA와 PrdB의 복합체와 상호작용하여 발현시, 또는 Prd 오페론과 함께 발현시에 활성형 D-프롤린 리덕타제의 활성이 증가하여 새로운 활성형 D-프롤린 리덕타제를 제공하여 D-프롤린 또는 이의 유사체의 전환방법을 제공한다.

도 1은 D-프롤린 리덕타제의 활성 생산 방법에 대한 개략도이다.
도 2는 PrdA 단백질의 발현 조건에 따른 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 PrdA 단백질 발현시 교반 유무에 따른 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 4는 PrdB 단백질의 발현에 따른 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 5는 PrdH 단백질에 의한 PrdA 단백질의 자가 절단에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 6은 재조합 발현된 D-프롤린 리덕타제의 활성 및 PrdDEE₂ 단백질의 활성 영향에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 7은 PrdH 단백질의 범용적 적용성에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 8은 PrdC 단백질에 의한 D-프롤린 리덕타제의 활성 영향에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 9는 PrdG 단백질에 의한 D-프롤린 리덕타제의 활성 영향(A) 및 PrdG 단백질의 특성 분석(B)에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 10은 재조합 활성형 D-프롤린 리덕타제 및 추가 단백질의 동시 발현을 통해 당원으로부터 5-아미노발레릭산을 생산한 내용에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 11은 활성형 D-프롤린 리덕타제를 통해 D-프롤린 유사 물질에 대한 전환능을 평가한 TLC 분석 결과이다.

이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: PrdA 및 PrdH 단백질 발현

1-1: PrdA 단백질의 발현을 위한 유전자 선정

PrdA 단백질의 발현을 위해 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 대표적인 균주로 알려진 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래의 D-프롤린 리덕타제 PrdA 단백질의 아미노산 서열(Q17ZY9, UniProtKB, 서열번호 3)을 대상으로 실험을 수행하였다. 상기 D-프롤린 리덕타제 PrdA 단백질의 유전자 염기 서열(CD630_32440, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 4)을 이용하여 발현 벡터를 구성하였다.

1-2: PrdA 발현 벡터( pETDuet _H6- prdA -H6)의 제작

상기 염기 서열을 대상으로 양 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하고, 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자와 pETDuet-1 벡터를 NdeI/XhoI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보한 뒤, T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdA 발현 벡터(pETDuet_H6-prdA-H6)를 구축하였다.

1-3: PrdA 단백질의 자가절단 위치 특이적 변이 발현 벡터( pETDuet _H6-prdA(C421A)-H6)의 제작

또한, PrdA 단백질의 자가 절단이 일어나는 위치로 알려진 421번째 아미노산에 alanine scanning 방법을 적용하였다. 421번째 아미노산인 시스테인을 알라닌으로 치환(C421A)하기 위하여 위치 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 진행하였다. 이를 위해 상기 구축된 pETDuet_H6-prdA-H6벡터와 C421A 변이를 위해 설계된 서열번호 25 및 26 프라이머(표 1)를 Pfu PCR 프리믹스에 첨가하여 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR 반응은 94°C에서 1분 변성, 55°C에서 1분의 어닐링 및 72°C 에서 10분간 신장과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물에 DpnI(37°C, 3시간)을 처리하여 대장균(DH5α)에 형질전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 배양하여 균체를 확보한 뒤 플라스미드 벡터를 분리하고 서열 확인을 통해 pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6 벡터를 확보하였다.

서열번호	프라이머	서열(5'-3')
25	PrdA(C421A)-F	GGTATCCATGCATTAACTGCCATAGGACCTGCATC AAAAG
26	PrdA(C421A)-R	CTTTTGATGCAGGTCCTATGGCAGTTAATGCAT GGA TAC C

* 밑줄: C421A 변이부분

1-4: PrdA 및 PrdH 단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)의 제작

PrdA 단백질의 자가 절단 과정을 유도하기 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 prd 오페론을 구성하는 단백질 중 구조 단백질인 PrdA 및 PrdB를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF를 이용하여 코딩된 신규 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY5, UniProtKB, 서열번호 1 / 염기서열: CD630_32430, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 2; 이하 PrdH 단백질이라 명명함)의 동시 발현을 시도하였다. 이를 위해 상기 염기 서열을 대상으로 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였으며, 합성된 prdH 유전자와 기 구축된 pETDuet_H6-prdA-H6 벡터를 NcoI/NotI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdA 및 PrdH 단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)를 구축하였다.

1-5: 구축된 3가지 발현벡터의 PrdA 단백질의 발현 여부 및 PrdA의 자가절단 여부 확인

다음 단계로 상기 구축된 pETDuet_H6-prdA-H6, pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6, 또는 pETDuet_prdH_H6-prdA-H6 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 뒤, 암피실린 항생제(0.1mg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지(50ml)에 접종하여 37°C, 200rpm 조건에서 배양을 진행하였다.

목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM 아이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 이하 IPTG)를 첨가하였다.

또한, 기질 결합을 통한 PrdA 단백질의 자가 절단을 유도해보는 목적에서, pETDuet_H6-prdA-H6 벡터로 형질전환된 대장균을 배양한 배양액에는 기질인 D-프롤린(10mM)을 첨가 또는 미첨가하여 배양하였다.

이후, 30°C, 200rpm 교반조건또는 30°C, 정치배양 조건에서 각각 16시간을 추가로 배양하였다. 정치배양 조건은 발현된 PrdA 단백질의 비특이적 분해 현상을 줄이기 위해 교반 과정을 생략하여 수행되었다.

재조합 발현된 PrdA 단백질의 발현 여부를 확인하기 위해서 확보된 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리(15000 rpm, 4°C, 10분)를 통해 상등액을 분리하여 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다. 분석 결과 PrdA 단백질의 이론 분자량과 동일한 67.6 kDa의 분자량을 갖는 목적 단백질의 발현을 확인하였다(도 2). 그러나, 모두 비활성의 PrdA 단백질이 갖는, 자가 절단이 되지 않은 pro-PrdA 단백질 형태로 발현되었으며, 이로 인해 나타나는 추가적인 단백질의 생성(alpha-PrdA, 21.9kDa 및 beta-PrdA, 44.7kDa)도 확인되지 않았다. 또한, 웨스턴 블롯 결과에서 나타난 비특이적으로 분해된 단백질 밴드를 확인함으로써, 자가 절단되지 않은 pro-PrdA 단백질의 구조적 불안정성으로 인해 단백질의 분해가 많이 일어난 것을 확인하였다(도 2, lane2)). 또한, 자가 절단이 일어나는 위치로 알려진 PrdA 단백질의 421번째 시스테인 서열을 알라닌으로 치환한 PrdA(C421A) 변이 단백질의 발현 패턴 양상 및 야생형 PrdA의 발현 패턴이 동일하다는 것으로부터 PrdA 단백질의 독립적인 기작으로는 자가 절단이 일어나지 않음을 재확인하였다(도 2, lane 3). 또한 기질 결합을 통한 PrdA 단백질의 자가 절단을 유도하기 위해 D-프롤린을 첨가하거나(도2, lane4), PrdA 단백질을 PrdH 단백질과 동시에 발현한 경우 역시 PrdA 단백질의 자가 절단은 일어나지 않았음을 확인하였다(도2, lane5).

PrdA 단백질을 단독으로 발현했을 경우 발현된 단백질의 비특이적 분해 현상을 줄이기 위해 교반 과정 없이 정치 배양된 PrdA 단백질의 발현 패턴을 분석하였다. 이 경우 상대적으로 낮은 수준의 발현량으로 인해 단백질 자체의 분해 현상이 개선되었지만, 자가 절단은 일어나지 않은 것으로 확인되었다(도3, lane 3,4). 구체적으로는, beta-PrdA 단백질과 유사한 크기의 절단 단백질을 확인할 수 있었지만, alpha-PrdA 단백질의 확인이 되지 않는 것을 통해 비특이적 절단으로 생성된 절단 단백질임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 선행 연구 결과(대한민국 특허공개 제 2015-0029526 호; Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3538-3544)와 동일한 결과임을 확인할 수 있다.

실시예 2: PrdB 단백질 발현

2-1: PrdB 단백질의 발현을 위한 유전자 선정

PrdB 단백질의 발현을 위해 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 대표적인 균주로 알려 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 D-프롤린 리덕타제 PrdB 단백질의 아미노산 서열(Q17ZY6, UniProtKB, 서열번호 5)을 대상으로 진행하였으며, 상기 단백질의 유전자 염기 서열(CD630_32410, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 6)을 이용하여 발현 벡터를 구성하였다.

2-2: PrdB 발현 벡터( pCDFDuet _ prdB -H6)의 제작

상기 염기 서열을 대상으로 카르복실 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하고, 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자와 pCDFDuet-1 벡터를 NdeI/XhoI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보한 뒤, T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdB 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6)를 구축하였다.

2-3: PrdB 단백질 내 셀레노시스테인 도입용 벡터의 제작

PrdB 단백질은 셀레노단백질(selenoprotein)로 알려져 있다. 즉, PrdB 단백질의 아미노산 서열 중 셀레노시스테인을 포함하고 있으며, 상기 셀레노시스테인은 비천연 아미노산이기 때문에 일반적인 단백질 생합성 과정을 통해 도입이 어렵다는 기술적 한계를 가지고 있다. 따라서 본 출원에서는 기공지 기술인 sel 오페론 시스템(selABC)의 도입(Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2486-2492)을 통해 PrdB 단백질의 셀레노시스테인 도입을 시도하였다.

2-3-1: selAB 도입 벡터( pACYCDuet _ selB / pACYCDuet _selA_ selB )

이를 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 SelA 단백질 (아미노산 서열: Q182I2, UniProtKB / 염기서열: CD630_24950, NCBI GeneBank AM180355.1)과 SelB 단백질 (아미노산 서열: Q182I0, UniProtKB / 염기서열: CD630_24930, NCBI GeneBank AM180355.1)을 사용하였으며, 각각 아미노 말단과 카르복실 말단에 NcoI/NotI 및 NdeI/XhoI 조합의 제한효소 서열을 갖도록 유전자를 합성하였다.

다음 단계로 상용벡터인 pACYCDuet-1 플라스미드 벡터(Novagene)와 selB 유전자를 대상으로 NdeI/XhoI 조합의 제한효소를 처리하여 아가로스 젤을 통해 분리한 뒤 T4 라이게이즈 반응을 통해 pACYCDuet_selB 벡터를 구축하였다. 그리고 상기 벡터(pACYCDuet_selB)를 대상으로 추가적인 NcoI/NotI 조합의 제한효소 반응을 통해 selA 유전자를 삽입하여 최종적으로 pACYCDuet_selA_selB 벡터를 구축하였다.

2-3-2: selC 도입 벡터( pCDFDuet _ prdB -H6_ P _selC - selC )

selC 유전자는 셀레노시스테인 특이적 tRNA로써 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 selC 유전자(염기서열: CDIF630_02727, NCBI GeneBank CP010905.1)와 selC 고유의 프로모터 및 터미네이터를 포함할 수 있도록 아미노 말단으로부터 150개, 카르복실 말단으로부터 250개의 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하였으며, 최종적으로 양 말단에 XbaI 제한 효소 서열을 첨가하여 합성을 진행하였다. 이렇게 확보된 selC 유전자와 앞서 구축된 pCDFDuet_prdB-H6 벡터를 대상으로 XbaI제한효소 처리 후 아가로스 젤을 통해 분리한 뒤, T4 라이게이즈 반응을 통해 최종적으로 pCDFDuet_prdB-H6_P_selC-selC 벡터를 구축하였다.

2-4: 구축된 3가지 발현벡터의 PrdB 단백질의 발현 여부 확인

1) PrdB 단백질 단독 발현

상기 실시예 2-2에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(스펙티노마이신 50μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지(50ml)에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm).

2) PrdB 단백질 및 selC 동시 발현

상기 실시예 2-3에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.

3) PrdB 단백질 및 selAB 단백질 동시 발현상기 실시예 2-2에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6 및 실시예 2-3에서 제작된 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.

4) PrdB 단백질 및 selABC 동시 발현

실시예 2-3에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.

목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 또한, 셀레노시스테인 생합성 및 도입에 필요한 셀레늄을 공급하기 위해 10 μM 아셀렌산나트륨(sodium selenite)을 공급 또는 미공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.

분석 결과 PrdB 단백질을 단독으로 발현했을 경우 셀레노시스테인의 낮은 도입 효율로 인해 매우 낮은 수준의 PrdB 단백질 발현을 확인하였으며(도4, lane 1, 2), PrdB 단백질 및 selC 동시 발현(도 4, lane 3, 4) 또는 PrdB 및 SelAB 단백질의 동시 발현(도 4, lane 5, 6) 시에도 동일한 결과를 확인하였다(도 4). 하지만 PrdB 단백질과 selABC 유전자가 동시에 발현된 경우 PrdB 단백질의 발현량이 현격히 증가함을 확인하였으며(도4, lane 7), 이는 상기 sel 오페론을 구성하고 있는 SelA 및 SelB 단백질과 셀레노시스테인 특이적 tRNA인 SelC의 영향으로 비천연 아미노산인 셀레노시스테인이 PrdB 단백질 내에 효율적으로 도입되었다는 것을 의미한다. 또한 아셀렌산나트륨(sodium selenite)을 첨가한 경우(도 4, lane 8; 최종 농도 10μM), 첨가하지 않는 경우(lane 7)와 비교해서 PrdB 단백질의 발현량이 더욱 증가한 결과를 확인할 수 있으며, 이를 통해서 셀레노시스테인의 효율적인 도입 시스템 구축이 PrdB 단백질이 발현량 증대에 주요 요소임을 확인하였다다.

실시예 3: PrdH 단백질의 기능성 검증 및 PrdH 단백질 발현을 포함하는 D-프롤린 리덕타제의 활성 평가

3-1: PrdH 기능성 검증을 위한 D-프롤린 리덕타제 단백질 발현

상기 확인된 정보를 바탕으로 D-프롤린 리덕타제의 발현을 시도하였으며, 이를 위해 다음과 같은 벡터 조합을 평가하였다.

1) PrdA 및 PrdB 단백질 동시 발현

기 구축된 PrdA 단백질 발현 벡터(pETDuet_H6-prdA-H6)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지(50ml)에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm).

2) PrdA, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질 동시 발현

기 구축된 PrdA 및 PrdH 동시 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6) 와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.

3) PrdA(C421A), PrdB 단백질 및 PrdH 단백질 동시 발현

기 구축된 PrdA(C421A) 단백질과 PrdH 단백질의 동시 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA(C421A)-H6)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 배양방법은 1) 및 2)와 동일하게 진행하였다.

목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 배양액의 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때, 각 배양액에 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다.

3-2: PrdH 단백질 도입을 통한 PrdA 단백질의 자가절단 확인 - 웨스턴 블롯 분석

상기 실시예 3-1에서 획득된 각 배양액의 대장균 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.

분석 결과 PrdA 단백질과 PrdB 단백질만을 동시에 발현한 경우 PrdA 단백질의 자가 절단 현상은 확인되지 않았다(도 5, lane 1). 하지만 PrdH 단백질과 PrdA 및 PrdB 단백질을 동시에 발현한 경우 비활성 형태의 PrdA 단백질(Pro-PrdA 단백질)이 사라짐과 동시에 추가적인 단백질 밴드가 형성된 것을 확인하였다(도 5, lane2).

상기 실험 결과가 PrdA단백질 고유의 자가 절단 메커니즘으로부터 기인된 것을 확인하기 위해서 PrdA 단백질의 자가 절단 위치로 알려진 421번째 아미노산 시스테인을 알라닌으로 치환(C421A)하여 PrdB 및 PrdH 단백질과 동시에 발현한 결과 Pro-PrdA 단백질이 유지됨과 동시에 절단 된 단백질은 확인되지 않았다(도 5, lane3). 이는 추가로 나타난 단백질들이 PrdA 단백질의 421번째 시스테인 위치에서 특이적으로 절단된 것을 의미한다.

따라서 PrdH 단백질이 PrdA 단백질의 자가 절단에 필수적인 단백질 이라는 것을 확인하였으며, PrdA 단백질의 활성 확보에 중요한 기능을 하는 보조 단백질이라는 것을 확인하였다.

이와 더불어 선행 실시예를 통해 PrdA 단백질과 PrdH 단백질을 동시에 발현했음에도 불구하고 PrdA 단백질의 자가 절단이 일어나지 않은 결과(실시예 1; 도 2, lane5)를 통해서 PrdA 단백질의 자가 절단을 유도하기 위해서는 PrdH 단백질뿐만 아니라 PrdB 단백질이 동시에 존재하여야 하며, 이는 PrdA 단백질과 PrdB 단백질이 일정 수준 이상의 복합체를 우선적으로 형성한 뒤 PrdH 단백질에 의해서 절단되는 과정이 진행되는 것을 확인할 수 있다.

3-3: PrdH 단백질이 동시 발현된 D-프롤린 리덕타제 활성 평가 - TLC 분석

3-1에서 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M phosphate buffer(pH8.0)에 희석하였다. 다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, DTT(최종 농도 25mM) 및 D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가하여 6 시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.

PrdA, PrdB 및 PrdH 단백질을 동시에 발현된 균주의 경우, TLC 상에서 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)에 해당하는 스팟이 생성되는 것을 확인하였으며(도 6, lane1), PrdH 단백질이 존재하지 않을 경우에는 활성이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 6, lane2). 이는 PrdH 단백질의 부재로 인해 PrdA 단백질의 자가절단이 일어나지 않고, 이로 인해 D-프롤린 리덕타제의 활성이 나타나지 않았음을 의미한다.

PrdA, PrdB 및 PrdH 단백질을 동시에 발현된 균주를 CC04-9007로 명명하였으며 2017년 2월 2일자로 부타페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11963P를 부여받았다.

실시예 4. PrdH 단백질의 범용성 검증

4-1: PrdH 단백질의 범용성 검증을 위한 균주 선정

상기 PrdH 단백질이 PrdA 단백질의 자가 절단에 범용적으로 적용될 수 있는 필수 보조 단백질임을 검증하기 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 이외에 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주로 알려진 Lactobacillus salivarius 유래 PrdA(이하 LsPrdA) 단백질의 자가 절단에 PrdH (이하 LsPrdH) 단백질의 관여 여부를 확인하였다.

4-2: LsPrdA 발현 벡터( pETDuet _H6- LsprdA -H6)의 제작

LsPrdA 단백질(아미노산 서열: E1JLY6, UniProtKB, 서열번호 19 / 염기서열: HMPREF9269_1797, NCBI GeneBank AEBA01000066.1, 서열번호 20)은 해당 유전자 서열 양 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하고, 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다. pETDuet-1 벡터와 상기 합성된 유전자를 제한효소 NdeI/XhoI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pETDuet_H6-LsprdA-H6 발현 벡터를 구축하였다.

4-3: LsPrdA 및 LsPrdH 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터(pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6)의 제작

추가적으로 LsPrdH 단백질(아미노산 서열: E1JLY7, UniProtKB, 서열번호 23 / 염기서열: HMPREF9269_1798, NCBI GeneBank AEBA01000066.1, 서열번호 24)의 유전자 서열의 양 말단에 NcoI/NotI 조합의 제한효소 서열을 첨가한 뒤 합성을 진행하였으며, 상기 구축된 pETDuet_H6-LsPrdA-H6 발현 벡터를 대상으로 제한효소 NcoI/NotI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6 발현 벡터를 구축하였다.

4-4: LsPrdB 발현 벡터( pCDFDuet _ LsprdB ( U151C )-H6)의 제작

Lactobacillus salivarius 유래 PrdB(이하 LsPrdB) 단백질(아미노산 서열: E1JLY8 및 E1JLY9, UniProtKB, 서열번호 21 / 염기서열: HMPREF9269_1799 및 HMPREF9269_1800, NCBI GeneBank AEBA01000066.1, 서열번호 22; 서열 데이터베이스 상에서 LsPrdB 단백질 내에 존재하는 정지 코돈(stop codon, UAG) 서열이 셀레노시스테인의 도입을 위한 서열이 아니라 단백질 발현 정지 코돈으로 인식되어 두 개의 단백질 또는 염기 서열로 표현됨. 따라서 상기 두 염기 서열 및 두 염기 서열 사이에 존재하는 서열을 모두 LsPrdB 단백질의 염기 서열로 추정하고 발현 벡터를 구축하였음.)은 해당 유전자 카르복실 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하였다. 또한, PrdB 단백질의 효율적인 발현을 위해 셀레노시스테인이 도입되는 코돈(UGA)이 정지코돈으로 인식되지 않도록 시스테인 코돈(UGT)으로 치환한 뒤 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다.

이를 바탕으로 pCDFDuet-1 벡터와 상기 합성된 유전자를 제한효소 NdeI/XhoI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6 발현 벡터를 구축하였다.

4-5: LsPrdH 단백질 도입을 통한 LsPrdA 자가절단 확인 - 웨스턴 블롯 분석

상기와 같이 구축된 LsPrdA 단백질 발현벡터(pETDuet_H6-LsprdA-H6) 와 LsPrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)의 조합, 또는 LsPrdA 및 LsPrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6)와 LsPrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 2가지 조합의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.

실험 결과 LsPrdA 단백질 및 LsPrdB(U151C) 단백질을 동시 발현한 경우 절단되지 않은 형태의 LsPrdA 단백질(Pro-LsPrdA 단백질)과 LsPrdB 단백질의 발현이 되었으며, 동시에 LsPrdA 단백질의 비특이적 분해 현상을 확인하였다(도7, lane1). 반면, LsPrdH 단백질과 동시 발현한 경우 Pro-LsPrdA 단백질이 감소함과 동시에 추가적인 단백질 밴드가 확인된 결과로부터 LsPrdA 단백질의 자가 절단 현상을 확인할 수 있었다(도7, lane2). LsPrdH 단백질은 기 확보된 PrdH 단백질과 약 55% 수준의 아미노산 서열 상동성을 갖지만 게놈 구조 상에 prdA 유전자와 prdB 유전자 사이에 위치하고 있는 유전자 ORF로 코딩된다는 동일한 특성을 가지고 있다.

이를 통해 상대적으로 낮은 수준의 서열 상동성을 갖지만 게놈 구조 상 유사한 위치에 존재하고 있는 두 단백질(PrdH 및 LsPrdH 단백질)의 기능이 동일하다는 것을 확인하였으며, 균주의 종류 및 서열 상동성과 상관 없이 활성형 D-프롤린 리덕타제의 생산을 위해 필수 단계인 PrdA 단백질의 자가 절단 과정을 유도하는 PrdH 단백질의 범용적 기능성을 확인하였다.

실시예 5: D-프롤린 리덕타제 오페론이 전체 발현된 단백질의 활성 평가 - PrdDEE ₂ 단백질과의 동시발현

활성이 확인된 D-프롤린 리덕타제를 대상으로 다른 prd 오페론 내 단백질들의 영향을 평가하기 위해 추가적인 동시 발현을 진행하였다. 그 첫 단계로 PrdDEE₂ 단백질들의 동시 발현을 진행하였다.

5-1: PrdA , PrdH 및 PrdDEE ₂ 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터 (pETDuet_prdH_prdADEE ₂ )의 제작

펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 PrdD 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY7, UniProtKB, 서열번호 7 / 염기서열: CD630_32400, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 8), PrdE 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY2, UniProtKB, 서열번호9 / 염기서열: CD630_32390, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호10), 및 PrdE₂ 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY3, UniProtKB, 서열번호 11 / 염기서열: CD630_32380, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 12)의 각 유전자들을 PrdA 단백질과 동시에 발현할 수 있도록 각 유전자 사이에 리보솜 결합 서열(ribosome binding site)을 첨가한 뒤, 양 말단에 NdeI/XhoI 조합의 제한 효소 서열을 추가하여 합성(prdADEE₂)을 진행하였다. 구체적으로, 실시예 1-4에서 기 구축된 pETDuet_prdH_H6-prdA-H6 발현 벡터와 합성된 prdDEE ₂ 유전자를 제한효소 NdeI/XhoI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pETDuet_prdH_prdADEE₂ 발현 벡터를 구축하였다.

5-2: PrdA , PrdB , PrdH 및 PrdDEE ₂ 단백질의 동시 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인- TLC 분석

PrdADEE₂ 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdADEE₂)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다.

상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M phosphate buffer(pH 8.0)에 희석하였다.

다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, DTT(최종 농도 25mM) 및 D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가하한 뒤, 6 시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.

그 결과 PrdAHB 단백질 조합 대비 PrdAHBDEE₂ 조합의 경우에서 TLC 상의 5-아미노발레릭산 스팟 크기가 상대적으로 더 클 뿐만 아니라 D-프롤린 리덕타제의 초기 반응 속도 역시 빠른 확인하였으며(도 6, lane3), 이러한 결과를 통해 PrdDEE₂ 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대를 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 추가적인 PrdC 단백질 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인

다음 단계로 PrdC 단백질의 동시 발현을 진행하였다. D-프롤린 리덕타제의 경우 NADH를 소모해서 전환 반응을 진행하는 것으로 알려져 있으며, PrdC의 경우 상기 NADH를 통한 전자 전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에, PrdC 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 전자 전달에 기여하게 될 것이다. 이에, PrdC단백질의 효과를 확인하기 위해서 환원제인 DTT 유무에 따른 실험을 진행하였다.

6-1: PrdC 단백질 발현 벡터 ( pACYCDuet _selA- prdC _ selB )의 제작

펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 PrdC 단백질 (아미노산 서열: Q17ZZ2, UniProtKB, 서열번호 13 / 염기서열: CD630_32470, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 14)의 유전자를 기존 D-프롤린 리덕타제 발현 시스템에 첨가하기 위해서, SelA 및 SelB 단백질과 동시에 발현할 수 있도록 벡터를 제작하였다. selA와 prdC 유전자 사이에 리보솜 결합 서열(ribosome binding site)를 첨가한 뒤, 양 말단에 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 추가하여 합성(selA-prdC)을 진행하였다. 기 구축된 pACYCDuet_selA_selB 발현 벡터와 합성된 selA-prdC 유전자를 제한효소 NcoI/NotI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pACYCDuet_selA-prdC_selB 발현 벡터를 구축하였다.

6-2: PrdA , PrdB , PrdH 및 PrdC 단백질의 동시 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인- TLC 분석

PrdADEE₂ 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdADEE₂)와 PrdB 및 PrdC 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다.

상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH8.0)에 희석하였다. 이의 대조군으로는 실시예 5의 PrdADEE₂ 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdADEE₂)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)가 동시 발현된 대장균을 사용하였다. 다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가한 뒤 DTT(최종 농도 25mM)의 유무에 따라 6시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.

반응 결과 DTT를 첨가한 경우에 비해 상대적으로 낮은 반응 속도가 확인되었지만, PrdC 단백질이 존재하는 경우에서만 DTT가 첨가되지 않은 조건임에도 불구하고 D-프롤린이 전환되어 5-아미노발레릭산이 생산되는 것을 확인하였다(도8, lane2). 이를 통해 PrdC 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 전자 전달에 기여한다는 사실을 확인하였으며, 추가적인 환원제(DTT) 첨가 없이 세포 내 NADH 등의 환원력을 활용하여 전환 반응이 가능함을 확인하였다.

실시예 7: 추가적인 prdG 단백질 발현 및 D-프롤린 리덕타제 의 활성 증대 확인

PrdG 단백질은 막단백질로 추정되지만 정확한 기능에 대해서는 현재까지 보고된 바 없다.

7-1: PrdG 및 PrdB 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터(pCDFDuet_prdG_prdB-P _selC _selC)의 제작

펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 PrdG 단백질(아미노산 서열: Q17ZY0, UniProtKB, 서열번호 15 / 염기서열: CD630_32360, NCBI GeneBank AM180355.1; 서열 데이터베이스 상 PrdG 단백질로 명명되어 있지는 않지만 C. sticklandii PrdG 단백질의 상동성을 기반으로 PrdG 단백질이라 명명, 서열번호 16)의 염기 서열을 대상으로 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였으며, 합성된 prdG 유전자와 기 구축된 pCDFDuet_prdB-P_selC_selC 벡터를 NcoI/NotI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdG 단백질과 PrdB 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC)를 구축하였다.

7-2: PrdA , PrdB , PrdH 및 PrdCG 단백질의 동시 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인- TLC 분석

PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdB 단백질 발현 벡터 조합(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB), 또는 PrdA 와 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdB 및 PrdCG 단백질 동시 발현 벡터 조합 (pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB)의 동시 발현을 진행하였다.

상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH8.0)에 희석하였다.

PrdG 단백질이 막단백질인 것을 고려하여 PrdAHB 조합 및 PrdAHBCG 조합을 대상으로, 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가한 뒤 DTT(최종 농도 25mM)의 유무, 1% 글루코스의 유무에 따라 상기 전세포 반응뿐만 아니라 동일한 OD 조건에서 배양 균체의 파쇄액 및 이를 원심분리 하여 획득한 상등액에 대한 추가적인 반응을 동일하게 진행하였으며, 6시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.

실험 결과, PrdC 단백질이 추가되어 있는 PrdAHBCG 조합의 경우 DTT 유무와 상관 없이 활성이 나타남을 재확인하였으며(도9, wo, lane4 내지 6), 특이적으로 균체 파쇄액의 상등액을 대상으로 DTT를 첨가하여 반응을 진행한 경우 PrdAHBCG 조합의 경우에서 PrdAHB 조합에 비해 상대적으로 낮은 수준의 활성을 확인하였다(도 9, DTT, lane6).

이를 통해 발현된 D-프롤린 리덕타제가 원심 분리를 통해 상당 부분 제거된 것을 확인할 수 있으며, 이는 막단백질의 특성을 지닌 PrdG 단백질과의 결합으로 인해 원심 분리 시 침전 후 제거된 것임을 알 수 있다. 또한 DTT를 기반으로 하는 전환 반응의 경우 전세포 및 세포 파쇄액에서 PrdAHB 및 PrdAHBCG 조합 모두 유사한 수준의 활성을 나타냈지만, DTT의 첨가 없이 NADH 공급을 증대하기 위해 1% 글루코스만 첨가한 경우 PrdAHBCG 조합의 경우에서만 활성이 확인되었다(도 9, 1% glucose). PrdC 단백질이 NADH 이용성과 관계가 있다는 실시예 6의 실험 결과를 바탕으로 PrdG 단백질은 PrdC 단백질과의 연계를 통해 세포 내 NADH의 활용이 용이한 D-프롤린 리덕타제 복합체를 형성을 유도한다는 것을 알 수 있다. 즉, DTT와 같은 환원제를 사용할 경우 매개 단백질의 유무와 상관 없이 D-프롤린 환원효소에 직접적으로 전자 전달이 가능하지만, 외부에서 첨가된 환원제 없이 세포 내 NADH를 사용할 경우 전자 전달을 도와줄 수 있는 매개 단백질(PrdC 단백질)이 필요하며, 효율적인 전자 전달 시스템의 구축을 위해 PrdG 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 집적도를 높이는 기능을 수행함으로써 활성 개선 효과를 유도하는 것으로 판단된다.

실시예 8: 보조 단백질 PrdH를 이용해 D-프롤린으로부터 5- 아미노발레릭산을 생산하는 균주 제조

8- 1: 5 - 아미노발레릭산의 생산 균주의 제작

미생물이 당원으로부터 5-아미노발레릭산을 생산하기 위해서는 D-프롤린 리덕타제의 기질인 D-프롤린이 공급되어야 한다. 하지만 대장균의 경우 D-프롤린을 생산하는 생합성 경로가 없기 때문에 L-프롤린을 D-프롤린으로 전환한 뒤, 이를 활용하는 방향으로 대사 경로를 설계하였다. 구체적으로, 프롤린 이성질체 형성능을 갖는 프롤린 라세메이즈(proline racemase)가 동시에 존재해야 한다. 따라서 본 출원에서는 기공지 기술인 프롤린 라세메이즈의 도입(Rudnick et al., Biochemistry, 1975, 14(20), 4515-4522)을 통해 실험을 진행하였다.

이를 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 프롤린 라세메이즈 단백질(아미노산 서열: Q17ZY4, UniProtKB, 서열번호 17 / 염기서열: CD630_32370, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 18)의 유전자 prdF를 기존 D-프롤린 리덕타제 발현 시스템에 첨가하기 위해서 PrdG 단백질과 동시에 발현할 수 있도록 각 유전자 사이에 리보솜 결합 서열(ribosome binding site)를 첨가한 뒤, 양 말단에 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 추가하여 합성(prdGF)을 진행하였다.

기 구축된 pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC 발현 벡터와 합성된 prdGF 유전자를 제한효소 NcoI/NotI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pCDFDuet_prdGF_prdB-P_selC_selC 발현 벡터를 구축하였다.

8-2: 활성 D-프롤린 리덕타제에 의한 5- 아미노발레릭산의 생산 확인 - LC/MS 및 TLC 분석

PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdBCG(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터)의 조합, 그리고 PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdBCGF 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdGF_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터)의 조합 발현을 진행하였다. 상기 2가지 조합의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite와 1%의 글루코스(NADH 강화)를 공급한 뒤, 30℃, 200 rpm에서 24시간을 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 획득한 배양액을 대상으로 LC/MS 및 TLC 분석을 진행하였다.

실험 결과 프롤린 라세메이즈가 존재하는 경우에서 약 67.7ppm의 5-아미노발레릭산을 확인하였으며(도10, lane3), 프롤린 라세메이즈가 존재하지 않는 경우에는 5-아미노발레릭산이 전혀 생산되지 않는 것을 확인하였다(도 10, lane1 내지 2). 즉, 생산된 5-아미노발레릭산은 첨가된 당원으로부터 대장균 내의 대사과정을 거쳐 L-프롤린이 생산된 뒤, 프롤린 라세메이즈에 의해 D-프롤린 형태로 전환되어 최종적으로 도입된 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 5-아미노발레릭산이 생산되었음을 확인할 수 있다.

8-3: 배양 배지 내 첨가된 D-프롤린으로부터 5- 아미노발레릭산 생산

당원으로부터 직접 발효를 통해 5-아미노발레릭산을 생산하는 공정 외에 활성형 D-프롤린 리덕타제를 포함하는 미생물의 배양 중에 외부에서 추가된 D-프롤린을 5-아미노발레릭산으로 전환시키기 위한 실험을 진행하였다.

구체적으로, 배양 배지 내에 첨가된 D-프롤린으로부터 5-아미노발레릭산의 생합성 가능 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 기 구축된 PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdBCG 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdG_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 및 1%의 글루코스를 공급한 뒤, 5mM D-프롤린의 유무에 따라 30℃, 200 rpm에서 24시간을 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 획득한 배양액을 대상으로 LC/MS 분석을 진행하였다.

분석 결과 D-프롤린을 첨가하지 않은 경우 5-아미노발레릭산이 확인되지 않았지만 5mM의 D-프롤린을 첨가한 경우 HPLC(Shimadzu) 분석을 통해 평균 196.7ppm (1.68mM)의 5-아미노발레릭산의 생산이 확인되었다.

실시예 9: D-프롤린 리덕타제 기반 D-프롤린 유사 기질 평가

구축된 활성형 D-프롤린 리덕타제의 활성을 추가 확인하기 위해 프롤린 이외의 다양한 기질을 대상으로 전환 반응을 진행하였다. 본 실시예에서, D-프롤린 리덕타제의 기질로는 D-프롤린과 유사한 구조를 갖는 D-아제티딘-2-카르복실산(D-azetidine-2-carboxylic acid, D-Aze), D-프롤린의 링 구조에 하이드록실 그룹(-OH)이 추가된 형태의 cis-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline), trans-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline)이 사용되었다.

이를 위해 기 구축된 PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-P_selC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M phosphate buffer(pH8.0)에 희석하였다. 다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, DTT(최종 농도 25mM) 및 다양한 기질(최종 농도 10mM, 도 11A)을 첨가한 뒤, 6 시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다. D-아제티딘-2-카르복실산은 D-프롤린 대비 하나의 탄소가 부족한 4각 링 형태의 구조를 가지며, D-프롤린 리덕타제에 의해 전환 반응이 진행될 경우 γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA)이 생성된다. 반응 결과, D-아제티딘-2-카르복실산의 경우 D-프롤린 대비 상대적으로 낮은 반응 속도를 보이지만 TLC 상에서 뚜렷한 GABA의 생산을 확인할 수 있다(도 11B, lane6).

cis-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline) 또는 trans-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline) 은 전환 반응이 진행될 경우 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산(5-amino-4-hydroxypentanoic acid)가 생성된다. 반응 결과, D-프롤린 대비 상대적으로 낮은 반응 속도를 보이지만 하이드록실 그룹의 이성질체 형상과 상관 없이 TLC 상에서 기질 감소와 더불어 새롭게 생성된 TLC 스팟을 확인할 수 있다(도 11C, lane5 및 lane8).

이를 통해 발현된 활성형 D-프롤린 리덕타제의 경우 기존에 알려진 D-프롤린 뿐만 아니라 링 구조의 크기가 다른 기질뿐만 아니라 추가적인 변형이 이루어진 유사 기질에 대해서도 전환 반응이 가능하다는 것을 확인할 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11963P

수탁일자 : 20170202

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Microorganism expressing an active D-proline reductase and Method for producing active D-proline reductase using the same <130> KPA170082-KR <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 94 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdH <400> 1 Met Asp Arg Leu Lys Tyr Ile Ser Ser Glu Thr Phe Tyr Glu Gly Ile 1 5 10 15 Ile Val Asp Ile Lys Gly Gly Gly Val Thr Ile Asp Leu Lys Gly Arg 20 25 30 Leu Gly Gln Phe Lys Ile Pro Asn Arg Met Leu Ile Thr Asp Tyr Glu 35 40 45 Leu Lys Ile Gly Gln Glu Val Gly Phe Met Leu Ser Tyr Pro Glu Val 50 55 60 Leu Ser Pro Glu Pro Asn Gln Glu Tyr Val Glu Asn Ile Arg Arg Glu 65 70 75 80 Lys Glu Lys Gln Ala Glu Met Gln Ser Lys Gln Glu Glu Lys 85 90 <210> 2 <211> 285 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdH <400> 2 atggataggt taaaatatat ctcatcagag actttttatg aaggtattat agttgacatc 60 aaaggcggtg gagtgactat agacctaaaa ggtagacttg gacaatttaa aatacctaat 120 agaatgctta taactgacta cgaacttaag ataggtcaag aagttggatt catgctaagc 180 tatcctgagg tattaagtcc agagcctaat caagagtatg tagaaaatat taggagagaa 240 aaagaaaaac aagcagaaat gcaatcaaaa caagaagaaa aataa 285 <210> 3 <211> 626 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdA <400> 3 Met Ser Ile Thr Leu Glu Thr Ala Gln Ala His Ala Asn Asp Pro Ala 1 5 10 15 Val Cys Cys Cys Arg Phe Glu Ala Gly Thr Ile Ile Ala Pro Glu Asn 20 25 30 Leu Glu Asp Pro Ala Ile Phe Ala Asp Leu Glu Asp Ser Gly Leu Leu 35 40 45 Thr Ile Pro Glu Asn Gly Leu Thr Ile Gly Gln Val Leu Gly Ala Lys 50 55 60 Leu Lys Glu Thr Leu Asp Ala Leu Ser Pro Met Thr Thr Asp Asn Val 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Lys Ala Gly Glu Ala Lys Glu Glu Val Val Glu Glu Thr 85 90 95 Val Glu Glu Ala Ala Pro Val Ser Glu Ala Ala Val Val Pro Val Ser 100 105 110 Thr Gly Val Ala Gly Glu Thr Val Lys Ile His Ile Gly Glu Gly Lys 115 120 125 Asn Ile Ser Leu Glu Ile Pro Leu Ser Val Ala Gly Gln Ala Gly Val 130 135 140 Ala Ala Pro Val Ala Asn Val Ala Ala Pro Val Ala Ser Ala Ala Ala 145 150 155 160 Glu Val Ala Pro Lys Val Glu Glu Lys Lys Leu Leu Arg Ser Leu Thr 165 170 175 Lys Lys His Phe Lys Ile Asp Lys Val Glu Phe Ala Asp Glu Thr Lys 180 185 190 Ile Glu Gly Thr Thr Leu Tyr Ile Arg Asn Ala Glu Glu Ile Cys Lys 195 200 205 Glu Ala Asn Glu Thr Gln Glu Leu Val Val Asp Met Lys Leu Glu Ile 210 215 220 Ile Thr Pro Asp Lys Tyr Glu Thr Tyr Ser Glu Ala Val Leu Asp Ile 225 230 235 240 Gln Pro Ile Ala Thr Lys Glu Glu Gly Glu Leu Gly Ser Gly Ile Thr 245 250 255 Arg Val Ile Asp Gly Ala Val Met Val Leu Thr Gly Thr Asp Glu Asp 260 265 270 Gly Val Gln Ile Gly Glu Phe Gly Ser Ser Glu Gly Glu Leu Asn Thr 275 280 285 Thr Ile Met Trp Gly Arg Pro Gly Ala Ala Asp Lys Gly Glu Ile Phe 290 295 300 Ile Lys Gly Gln Val Thr Ile Lys Ala Gly Thr Asn Met Glu Arg Pro 305 310 315 320 Gly Pro Leu Ala Ala His Arg Ala Phe Asp Tyr Val Thr Gln Glu Ile 325 330 335 Arg Glu Ala Leu Lys Lys Val Asp Asn Ser Leu Val Val Asp Glu Glu 340 345 350 Val Ile Glu Gln Tyr Arg Arg Glu Gly Lys Lys Lys Val Val Val Ile 355 360 365 Lys Glu Ile Met Gly Gln Gly Ala Met His Asp Asn Leu Ile Leu Pro 370 375 380 Val Glu Pro Val Gly Thr Leu Gly Ala Gln Pro Asn Val Asp Leu Gly 385 390 395 400 Asn Met Pro Val Val Leu Ser Pro Leu Glu Val Leu Asp Gly Gly Ile 405 410 415 His Ala Leu Thr Cys Ile Gly Pro Ala Ser Lys Glu Met Ser Arg His 420 425 430 Tyr Trp Arg Glu Pro Leu Val Ile Arg Ala Met Glu Asp Glu Glu Ile 435 440 445 Asp Leu Val Gly Val Val Phe Val Gly Ser Pro Gln Val Asn Ala Glu 450 455 460 Lys Phe Tyr Val Ser Lys Arg Leu Gly Met Leu Val Glu Ala Met Glu 465 470 475 480 Val Asp Gly Ala Val Val Thr Thr Glu Gly Phe Gly Asn Asn His Ile 485 490 495 Asp Phe Ala Ser His Ile Glu Gln Ile Gly Met Arg Gly Ile Pro Val 500 505 510 Val Gly Val Ser Phe Ser Ala Val Gln Gly Ala Leu Val Val Gly Asn 515 520 525 Lys Tyr Met Thr His Met Val Asp Asn Asn Lys Ser Lys Gln Gly Ile 530 535 540 Glu Asn Glu Ile Leu Ser Asn Asn Thr Leu Ala Pro Glu Asp Ala Val 545 550 555 560 Arg Ile Met Ala Met Leu Lys Asn Ala Ile Glu Gly Val Glu Val Lys 565 570 575 Ala Pro Glu Arg Lys Trp Asn Pro Asn Val Lys Leu Asn Asn Ile Glu 580 585 590 Ala Ile Glu Lys Val Thr Gly Glu Lys Ile Val Leu Glu Glu Asn Glu 595 600 605 Gln Ser Leu Pro Met Ser Lys Lys Arg Arg Glu Ile Tyr Glu Lys Asp 610 615 620 Glu Asn 625 <210> 4 <211> 1881 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdA <400> 4 atgtcaataa ctttagaaac agctcaagcc catgcaaatg acccagcagt ttgttgttgt 60 agatttgaag cgggaacaat tatagcgcca gaaaacttag aagatccagc aatatttgca 120 gacttagagg attctggatt attaacaata ccagaaaatg gattaactat aggtcaagta 180 ctaggagcta agttaaaaga aactttagat gcactttctc caatgactac agataacgta 240 gaaggataca aagcaggaga ggctaaagaa gaagtagtag aagaaacagt agaagaagca 300 gctccagtat cagaagcagc agtagttcca gtaagcacag gagttgcagg tgaaacagtt 360 aaaatacaca taggtgaagg taagaacata agcttagaga tacctttatc agtagctggt 420 caagcaggag ttgctgctcc agtagcaaac gttgctgctc cagtggcaag tgcagcagca 480 gaagtagctc caaaagttga agaaaagaaa cttttaagaa gcttaactaa aaaacacttt 540 aaaatagata aagttgaatt tgctgatgaa actaaaatag aaggaactac tttatacatc 600 agaaacgcag aagaaatatg taaagaagct aatgaaactc aagagttagt tgtagatatg 660 aagttagaaa taataactcc tgataaatat gaaacttaca gtgaagctgt attagatata 720 caaccaatcg ctactaaaga agaaggcgaa ttaggttcag gtataactag agttatagat 780 ggagctgtaa tggtattaac tggtacagat gaagatggag ttcaaatagg tgaatttggt 840 tcttcagaag gtgagttaaa tactactata atgtggggta gaccaggtgc tgctgacaaa 900 ggtgaaatat tcatcaaagg tcaagtaaca ataaaagcag gaactaacat ggaaagacca 960 ggacctttag ctgctcaccg tgcatttgac tatgtaactc aagaaataag agaagcatta 1020 aagaaagttg acaactcttt agtagttgat gaagaagtaa tagagcaata cagaagagaa 1080 ggtaaaaaga aagttgttgt tataaaagaa ataatgggac aaggtgcaat gcatgataac 1140 ctaatattac cagttgagcc agttggtaca ttaggagctc aaccaaacgt tgacttagga 1200 aacatgccag ttgtattatc tccacttgaa gtattagatg gtggtatcca tgcattaact 1260 tgtataggac ctgcatcaaa agaaatgtca agacattact ggagagagcc attagtaata 1320 agagctatgg aagacgaaga aatagattta gtaggtgttg tatttgttgg ttctccacaa 1380 gtaaatgctg agaaattcta tgtatctaag agattaggta tgttagttga agctatggaa 1440 gttgatggag ctgtagtaac tactgaaggt ttcggaaaca accatataga tttcgcatct 1500 cacatagagc aaataggtat gagaggtata ccagtagttg gtgtaagttt ctcagctgtt 1560 caaggtgctc tagttgttgg taataaatac atgactcaca tggtagacaa caataagtct 1620 aagcaaggta tagagaatga aatattatct aacaacactt tagctccaga agatgctgtt 1680 agaataatgg ctatgcttaa aaatgctata gaaggtgtag aagttaaagc tcctgaaaga 1740 aaatggaatc caaatgttaa attaaataac atagaagcta tagaaaaagt tacaggagaa 1800 aaaatagtat tagaagagaa tgagcaatct ctaccaatga gtaagaagag aagagaaata 1860 tacgaaaaag acgaaaacta a 1881 <210> 5 <211> 240 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdB <400> 5 Met Ser Leu Thr Thr Val Gln Gly Leu Gln Ser Glu Ile Phe Val Pro 1 5 10 15 Ile Thr Pro Pro Pro Val Trp Thr Pro Val Thr Lys Glu Leu Lys Asp 20 25 30 Met Thr Ile Ala Leu Ala Thr Ala Ala Gly Val His Leu Lys Ser Asp 35 40 45 Lys Arg Phe Asn Leu Ala Gly Asp Thr Thr Phe Arg Ala Ile Pro Asn 50 55 60 Thr Ala Thr Val Asp Glu Met Met Val Ser His Gly Gly Tyr Asp Asn 65 70 75 80 Gly Asp Val Asn Lys Asp Ile Asn Cys Met Phe Pro Ile Asp Arg Leu 85 90 95 His Glu Leu Ala Ala Glu Gly Phe Ile Lys Gly Val Ala Pro Met His 100 105 110 Tyr Ala Phe Met Gly Gly Gly Gly Asn Gln His Val Phe Thr Glu Glu 115 120 125 Thr Gly Pro Ala Ile Ala Ala Lys Leu Lys Glu Glu Gly Val Asp Gly 130 135 140 Val Val Met Thr Ala Gly Gly Thr Cys His Arg Thr Ala Val Ile Val 145 150 155 160 Gln Arg Ala Ile Glu Glu Ala Gly Ile Pro Thr Ile Ile Ile Ala Ala 165 170 175 Leu Pro Pro Val Val Arg Gln Asn Gly Thr Pro Arg Ala Val Ala Pro 180 185 190 Leu Val Pro Met Gly Ala Asn Ala Gly Glu Pro His Asn Ile Glu Met 195 200 205 Gln Thr His Ile Leu Arg Asp Thr Leu Glu Gln Leu Val Ala Ile Pro 210 215 220 Ser Ala Gly Lys Ile Val Pro Leu Pro Tyr Glu Tyr Lys Ala His Val 225 230 235 240 <210> 6 <211> 726 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdB <400> 6 atgagcctta caacagtaca aggacttcaa tctgaaatat tcgttccaat aacacctcct 60 ccagtttgga ctcctgtaac taaagaatta aaagatatga ctatagcttt agctacagca 120 gctggtgttc atttaaaatc tgacaagaga tttaatctag caggagatac tacatttaga 180 gctataccta atacagctac agttgatgaa atgatggtat cacatggtgg atatgacaat 240 ggagatgtaa acaaagatat aaactgtatg ttccctatag atagattaca tgaattagct 300 gcagaaggat ttatcaaagg agtagctcct atgcactatg cattcatggg tggtggagga 360 aaccaacatg tcttcactga agaaactggt cctgctatcg ctgctaaact taaggaagag 420 ggagtagacg gtgtagttat gacagctggc tgaggtactt gccatagaac tgccgtgatc 480 gtgcagagag caatagagga agctggaata cctacaataa taatagcagc tcttcctcca 540 gtagttagac aaaacggaac tcctagagca gttgctccat tagttccaat gggtgctaat 600 gctggtgaac cacataatat agaaatgcaa acacatatat taagagatac attagagcaa 660 ttagttgcaa taccatctgc tggtaagata gttccattac catacgaata taaagctcac 720 gtttaa 726 <210> 7 <211> 252 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdD <400> 7 Met Glu Glu Lys Ile Met Arg Arg Leu Val Ile Lys Pro Phe His Met 1 5 10 15 Asn Glu Val Asn Phe Gly Ser Lys Thr Ser Ile Lys Lys Asp Val Leu 20 25 30 Thr Ile Asp Leu Ser Ser Ile Asp Glu Ile Lys Glu Arg Glu Glu Leu 35 40 45 Ile Thr Asp Ile Lys Val Asp Ile Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Asp Arg 50 55 60 Glu Ile Asn Thr Ile Met Asp Ile Ile Pro Ile Ser Thr Lys Val Leu 65 70 75 80 Gly Arg Leu Gly Glu Gly Ile Thr His Thr Leu Thr Gly Val Tyr Val 85 90 95 Met Leu Thr Gly Ala Asp Glu Asp Gly Asn Gln Met His Glu Phe Gly 100 105 110 Ser Ser Glu Gly Ile Leu Lys Asp Gln Met Val Phe Gly Arg Tyr Gly 115 120 125 Thr Pro Ser Val Glu Asp Tyr Ile Ile His Val Asp Val Thr Leu Lys 130 135 140 Gly Gly Leu Pro Phe Glu Arg Thr Leu Pro Leu Ala Ala Phe Arg Ala 145 150 155 160 Cys Asp Asp Phe Ile Gln Glu Ile Arg Ala Ser Leu Lys Met Glu Asp 165 170 175 Gly Arg Asn Ala Thr Gln Val Arg Glu Tyr Phe Asp Lys Ile Arg Pro 180 185 190 Asn Ala Lys Lys Val Val Ile Val Lys Gln Ile Ala Gly Gln Gly Ala 195 200 205 Met Tyr Asp Asn Gln Leu Phe Ser Lys Glu Pro Ser Gly Phe Glu Gly 210 215 220 Gly Thr Ser Ile Ile Asp Met Gly Asn Val Pro Met Ile Ile Ser Pro 225 230 235 240 Asn Glu Tyr Arg Asp Gly Ala Leu Arg Ala Met Thr 245 250 <210> 8 <211> 759 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdD <400> 8 atggaagaaa aaataatgag aagacttgtt ataaaaccgt ttcatatgaa tgaagttaat 60 ttcggttcaa aaacttctat aaagaaagat gtacttacaa tagatttatc aagtatagat 120 gaaataaaag aaagagaaga gttaataaca gacataaaag tagacattat aaaacctgga 180 gattatgaca gagaaattaa tactattatg gacattatac caatatcaac aaaagtttta 240 ggcagactgg gagagggtat tacacatact ttaacgggtg tatatgtaat gttaactggt 300 gcagatgaag atggaaatca aatgcatgaa tttggttctt cagaaggaat tttgaaagac 360 caaatggtat ttgggagata tggaactcca tcagttgaag attatataat ccatgtagat 420 gtaactttaa agggaggttt accttttgaa agaacacttc cacttgcagc attcagagca 480 tgtgatgatt ttatacaaga aataagagca tctttgaaaa tggaagacgg aagaaatgct 540 actcaagttc gtgaatattt tgacaaaatt cgaccaaatg caaaaaaggt tgtcatagta 600 aaacaaatag caggtcaagg tgctatgtat gacaatcagt tattctcaaa ggaacctagt 660 ggatttgaag gaggaacatc aattatagat atgggaaatg tacctatgat tatatctcct 720 aatgaataca gagatggtgc ccttagagct atgacttaa 759 <210> 9 <211> 155 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdE <400> 9 Met Gly Ile Gly Pro Ser Thr Lys Glu Thr Ser Leu His His Phe Arg 1 5 10 15 Asp Pro Leu Leu Asp Ile Val Glu Ser Asp Lys Asp Val Asp Leu Leu 20 25 30 Gly Val Ile Val Val Gly Thr Pro Asp Gly Asn Glu Asn Lys Thr Phe 35 40 45 Val Gly Gln Arg Thr Ala Ala Trp Leu Glu Ala Met Arg Val Asp Gly 50 55 60 Ala Ile Val Ser Ser Asp Gly Trp Gly Asn Ser His Val Asp Tyr Ala 65 70 75 80 Asn Thr Phe Glu Glu Ile Gly Lys Arg Asp Ile Pro Val Val Gly Val 85 90 95 Thr Phe Asn Gly Thr Gln Ala Lys Phe Val Val Ser Asn Gln Tyr Met 100 105 110 Asp Thr Ile Val Asp Met Asn Lys Ser Lys Glu Gly Ile Glu Thr Glu 115 120 125 Val Val Gly Glu Asn Asn Thr Asn Glu Ile Asp Ala Lys Lys Ala Leu 130 135 140 Ala Phe Leu Lys Leu Lys Met Arg Lys His Gly 145 150 155 <210> 10 <211> 468 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdE <400> 10 atgggaatag gaccttcaac aaaagaaaca tctcttcatc actttagaga cccactttta 60 gacatagttg aaagtgataa ggatgtagat ttacttggag taatagtagt aggaactcca 120 gatggaaatg aaaataaaac ctttgtggga caaagaacgg ccgcttggct ggaagccatg 180 agagtagatg gagctatagt ttcatcagat ggttggggaa actcacatgt tgactacgct 240 aacacatttg aggaaatagg aaaaagagat atacctgtag ttggagttac atttaatggg 300 actcaagcta agtttgttgt aagcaatcaa tatatggata ccatagttga tatgaacaaa 360 tcaaaagaag gtattgagac agaagtagtt ggagaaaaca acacaaatga aatagatgct 420 aaaaaagctt tggcattttt aaaacttaaa atgagaaaac atggataa 468 <210> 11 <211> 160 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdE2 <400> 11 Met Ser Phe Val Gly Ile Ser Thr Ser Met Lys Asn Thr Ser Leu His 1 5 10 15 Ile Phe Arg Asp Pro Leu Leu Asp Leu Ile Asp Asn Asp Ser Asp Ile 20 25 30 Asp Leu Leu Gly Val Val Val Val Gly Thr Ser Glu His Asn Glu Trp 35 40 45 Lys Thr Phe Leu Ala Thr Arg Leu Gly Arg Trp Ile Glu Ser Leu Arg 50 55 60 Pro Asp Gly Val Ile Ile Thr Leu Asp Met Ala Gly Asn Gln His Ile 65 70 75 80 Asp Phe Thr Asn Ala Ile Ala Glu Phe Val Lys Ser Asp Ile Pro Thr 85 90 95 Val Gly Leu Thr Ile Met Gly Ala Asp Gly Leu Val Ile Thr Asn Pro 100 105 110 Tyr Leu Asp Lys Ala Thr Ile Ile Asp Tyr Lys Lys Thr Thr Gly Tyr 115 120 125 Ile Glu Thr Glu Val Val Gly Asp Asn His Met Asp Glu Val Asp Val 130 135 140 Lys Lys Ala Leu Ala Phe Leu Lys Leu Lys Met Arg Lys Asp Ala Lys 145 150 155 160 <210> 12 <211> 483 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdE2 <400> 12 atgagttttg tgggaatttc tacatcaatg aaaaacacat cacttcatat atttagagac 60 ccgttactag atttgataga taatgattct gacatagact tgttaggagt ggttgtagtt 120 gggacatcag agcacaatga atggaaaaca tttttagcaa ctagacttgg aagatggatt 180 gaatcattgc gacctgatgg agtgattata actttagata tggcaggaaa ccagcacatt 240 gattttacaa atgctatagc agagtttgta aaatcagata tacctacagt aggtcttact 300 attatgggag cagatggatt agtaattacc aatccatatt tggataaagc taccataatt 360 gattataaaa agacaacagg ctacatagaa acagaagtag ttggagacaa tcacatggac 420 gaagttgatg ttaaaaaagc attggctttc ctaaaattaa aaatgcgtaa agacgcaaaa 480 taa 483 <210> 13 <211> 437 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdC <400> 13 Met Asn Lys Leu Tyr Ser Ile Leu Leu Lys Gln His Val Gly Gly Pro 1 5 10 15 Asp Lys Pro Val Val Ser Val Gly Asp Val Val Lys Lys Gly Thr Leu 20 25 30 Ile Ala Glu Pro Thr Gly Leu Gly Ala Asn Ile Tyr Ala Ser Val Ser 35 40 45 Gly Lys Ile Ser Glu Ile Asn Asp Gln Ala Ile Val Ile Glu Ala Asp 50 55 60 Glu Val Gln Glu Asp Thr Phe Glu Pro Leu Lys Gly Glu Gly Ile Leu 65 70 75 80 Asp Leu Ile Lys Glu Ala Gly Val Val Gly Met Gly Gly Ala Gly Phe 85 90 95 Pro Thr His Val Lys Leu Asn Ile Asp Leu Asn Gly Gly Thr Ile Leu 100 105 110 Ala Asn Ala Ala Glu Cys Glu Pro Leu Leu Ala His Asn Ile Lys Glu 115 120 125 Ile Glu Glu Arg Pro Glu Ile Val Tyr Gln Gly Ile Lys Tyr Ala Met 130 135 140 Glu Val Thr Asn Ala Gly Lys Gly Met Leu Ala Ile Lys Ser Lys His 145 150 155 160 Pro Lys Ala Ile Glu Ala Phe Lys Lys Val Ile Lys Pro Gly Asp Asn 165 170 175 Ile Glu Val Ala Glu Leu Val Asp Met Tyr Pro Met Gly Glu Glu Arg 180 185 190 Ala Ile Val Arg Asp Val Leu Gly Lys Leu Leu Glu Pro Thr Gln Leu 195 200 205 Pro Ser Glu Ala Asn Ala Val Val Ile Asn Val Glu Thr Leu Thr Arg 210 215 220 Ile Val Glu Ala Val Glu Gln Lys Arg Pro Val Ile Ser Lys Asn Ile 225 230 235 240 Thr Val Val Gly Gln Leu Asn Ser Gly Lys Glu Ser Ile Val Phe Glu 245 250 255 Asp Val Pro Ile Gly Thr Thr Val Gly Glu Leu Ile Glu Arg Ala Gly 260 265 270 Gly Ile Lys Gly Glu Tyr Gly Glu Ile Ile Leu Gly Gly Pro Phe Thr 275 280 285 Gly Lys Ala Thr Thr Leu Asp Ala Pro Ile Thr Lys Thr Ser Gly Gly 290 295 300 Ile Ile Val Thr Met Pro Phe Val Asn Glu Lys Arg Lys Met Gly Leu 305 310 315 320 Leu Val Cys Ala Cys Gly Pro Asn Glu Glu Arg Met Arg Asp Ile Ala 325 330 335 Thr Lys Met Gly Val Thr Asp Ile Val Ser Val Gln Lys Cys Lys Gln 340 345 350 Ala Gln Glu Ile Lys Gly Ala Leu Lys Cys Glu Asn Pro Gly His Cys 355 360 365 Pro Gly Gln Ala Gln Lys Cys Ile Glu Phe Lys Lys Ala Gly Ala Glu 370 375 380 Val Ile Leu Ile Gly Asn Cys Thr Asp Cys Ser Asn Thr Val Met Gly 385 390 395 400 Ser Ala Pro Lys Leu Lys Leu Gly Val Tyr His Ile Thr Asp His Val 405 410 415 Met Arg Thr Val Asn His Pro Leu Ile Arg Arg Ile Lys Gly Asp Val 420 425 430 Arg Leu Lys Ile Lys 435 <210> 14 <211> 1314 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdC <400> 14 ttgaacaaac tatattctat tttattaaaa caacacgttg gtggtccaga taagccagta 60 gtaagtgttg gagatgtagt aaaaaaagga actctaatcg cagaaccaac tggattaggg 120 gcaaatattt atgccagtgt tagtggaaaa ataagtgaaa taaatgacca agcgatagta 180 attgaagctg atgaagtaca agaagatact tttgaaccat taaaaggaga aggtatactt 240 gacttaatta aagaagctgg agtagtagga atgggtggag caggattccc tactcatgta 300 aaattaaaca tagatttaaa tggtggaaca atattagcaa atgcagctga atgtgaacct 360 ttattagctc ataatataaa agaaatagaa gaaagaccag aaatagttta tcaaggtata 420 aaatatgcta tggaagttac taatgctgga aaaggtatgc tagcaataaa aagtaagcat 480 ccaaaagcaa tagaagcttt caaaaaagta ataaagccag gagacaacat agaagttgca 540 gaactagttg atatgtaccc aatgggagaa gagagagcaa tagtaagaga cgttctagga 600 aaattacttg agccaactca attaccttca gaggctaatg cagtagtaat aaacgtagaa 660 acactaacta gaatagtaga ggctgttgag caaaaaagac cagttatatc taaaaatata 720 actgtagttg gtcaattaaa cagtggaaaa gaatctatag tgtttgaaga tgtgccaatt 780 ggaacaactg tcggagaatt aattgaaaga gctggtggaa taaaaggtga atatggtgaa 840 ataatcctag gaggaccttt cactggtaaa gctactactt tagatgctcc aataactaaa 900 actagtggtg gtataatagt tactatgcca tttgttaatg aaaagagaaa aatgggtctt 960 ttagtttgtg catgtggacc taatgaagaa agaatgagag atatagcaac taaaatggga 1020 gttactgata tagtatcagt tcaaaaatgt aaacaagctc aagaaattaa aggtgcatta 1080 aaatgtgaaa atccaggaca ctgtccagga caagctcaaa aatgtattga atttaagaaa 1140 gctggagcag aagttatatt aataggaaac tgtactgact gtagtaacac agtaatgggt 1200 tctgcaccaa aattaaaatt aggtgtatat catattactg accatgtaat gagaacagtt 1260 aatcacccat taataagaag aataaaaggt gacgtaagat taaaaataaa ataa 1314 <210> 15 <211> 293 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdG <400> 15 Met Val Ala Ile Leu Lys Ala Leu Tyr Val Val Phe Ala Ala Ile Phe 1 5 10 15 Ala Val Val Phe Gly Lys Asp Val Ala Lys Ala Asn Lys Glu Gly Lys 20 25 30 Leu Glu Glu Gln Ser Thr Pro Lys Val Ala Val Thr Gly Phe Ile Thr 35 40 45 Asp Phe Phe Asp Thr Leu Gly Ile Gly Ser Phe Ala Pro Thr Ile Ala 50 55 60 Met Ser Lys Ala Leu Lys Leu Asn Ile Pro Asp Lys Lys Met Pro Gly 65 70 75 80 Thr Leu Asn Val Ala His Thr Ile Pro Val Val Thr Glu Ala Phe Ile 85 90 95 Phe Thr Ser Ile Ile Pro Val Asp Gly Val Thr Leu Val Ser Met Val 100 105 110 Val Ala Ala Ala Val Gly Ser Tyr Ile Gly Ala Gly Ile Ile Ala Lys 115 120 125 Met Asp Glu Arg Lys Ile Gln Leu Val Met Gly Val Thr Leu Ala Leu 130 135 140 Thr Ala Ile Leu Met Leu Leu Gly His Pro Trp Ile Asn Val Leu Pro 145 150 155 160 Gly Gly Gly Asn Glu Leu Gly Leu Thr Gly Val Lys Leu Val Ile Gly 165 170 175 Val Ile Gly Asn Phe Ile Leu Gly Ala Leu Met Thr Ala Gly Ile Gly 180 185 190 Leu Tyr Ala Pro Gly Met Ala Met Val Tyr Phe Leu Gly Met Ser Ala 195 200 205 Lys Val Ala Phe Pro Ile Val Met Gly Ser Cys Ala Leu Leu Met Pro 210 215 220 Val Ala Ser Met Lys Phe Ile Lys Glu Asp Ala Tyr Thr Lys Lys Ala 225 230 235 240 Ser Val Ile Ile Ala Ile Cys Gly Leu Ile Gly Val Phe Val Ala Ala 245 250 255 Tyr Ile Val Lys Thr Leu Pro Met Asp Ile Leu Lys Ala Leu Val Ile 260 265 270 Val Val Ile Ala Tyr Thr Ser Ala Thr Met Ile Met Ala Ala Asn Lys 275 280 285 Asn Lys Lys Thr Ala 290 <210> 16 <211> 882 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdG <400> 16 atggtagcaa tcttaaaggc attatatgta gtattcgcag caatctttgc agttgtgttt 60 ggtaaagacg tagctaaagc aaacaaagag gggaaactag aagaacaaag tactccaaaa 120 gttgctgtaa caggatttat aacagacttc tttgatacat taggaatagg gtcatttgct 180 ccaacaatag caatgtcaaa ggctttaaag ttaaatatac cagataaaaa aatgcctggt 240 acattaaacg tagcacatac tattccagtt gttacagaag cattcatatt tacatcaatc 300 ataccagttg atggtgttac tttagtatct atggttgtgg cagcagcagt tggttcatat 360 ataggtgcag gaataatagc taagatggac gagagaaaaa tacaacttgt tatgggtgta 420 actttagcat taacagcaat attaatgtta ttaggtcatc cttggattaa cgtattacca 480 ggtggaggaa atgaattagg tcttactggt gttaaattag taataggtgt aataggtaac 540 tttatactag gagctttaat gacagctggt ataggtctat atgctccagg tatggcaatg 600 gtttatttct taggaatgtc tgcaaaagtt gcattcccaa tagttatggg ttcttgtgca 660 ttattaatgc cagttgcaag tatgaaattc ataaaagaag atgcatatac taaaaaagca 720 tcagttataa tagctatatg tggtttaata ggagttttcg tagctgcata tatagtaaaa 780 actctaccaa tggatatatt aaaagcatta gtaatagtag ttatagctta tacttctgct 840 acaatgataa tggctgcaaa taaaaacaaa aagactgctt ag 882 <210> 17 <211> 335 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> PrdF <400> 17 Met Lys Phe Ser Arg Ser Ile Gln Ala Ile Asp Ser His Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Ala Thr Arg Ile Val Val Gly Gly Ile Pro Asn Ile Lys Gly Asn 20 25 30 Ser Met Pro Glu Lys Lys Glu Tyr Leu Glu Glu Asn Leu Asp Tyr Leu 35 40 45 Arg Thr Ala Ile Met Leu Glu Pro Arg Gly His Asn Asp Met Phe Gly 50 55 60 Ser Val Met Thr Gln Pro Cys Cys Pro Asp Ala Asp Phe Gly Ile Ile 65 70 75 80 Phe Met Asp Gly Gly Gly Tyr Leu Asn Met Cys Gly His Gly Thr Ile 85 90 95 Gly Ala Met Thr Ala Ala Ile Glu Thr Gly Val Val Pro Ala Val Glu 100 105 110 Pro Val Thr His Val Val Met Glu Ala Pro Ala Gly Ile Ile Arg Gly 115 120 125 Asp Val Thr Val Val Asp Gly Lys Ala Lys Glu Val Ser Phe Leu Asn 130 135 140 Val Pro Ala Phe Leu Tyr Lys Glu Gly Val Glu Val Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Val Gly Thr Val Lys Phe Asp Ile Ser Phe Gly Gly Ser Phe Phe Ala 165 170 175 Ile Ile His Ala Ser Gln Leu Gly Leu Lys Ile Glu Pro Gln Asn Ala 180 185 190 Gly Lys Leu Thr Glu Leu Ala Met Lys Leu Arg Asp Ile Ile Asn Glu 195 200 205 Lys Ile Glu Ile Gln His Pro Thr Leu Ala His Ile Lys Thr Val Asp 210 215 220 Leu Val Glu Ile Tyr Asp Glu Pro Thr His Pro Glu Ala Thr Tyr Lys 225 230 235 240 Asn Val Val Ile Phe Gly Gln Gly Gln Val Asp Arg Ser Pro Cys Gly 245 250 255 Thr Gly Thr Ser Ala Lys Leu Ala Thr Leu His Ala Lys Gly Glu Leu 260 265 270 Lys Val Gly Glu Lys Phe Val Tyr Glu Ser Ile Leu Gly Thr Leu Phe 275 280 285 Lys Gly Glu Ile Val Glu Glu Thr Lys Val Ala Asp Phe Asn Ala Val 290 295 300 Val Pro Lys Ile Thr Gly Ser Ala Tyr Ile Thr Gly Phe Asn His Phe 305 310 315 320 Val Ile Asp Glu Glu Asp Pro Leu Lys His Gly Phe Ile Leu Lys 325 330 335 <210> 18 <211> 1008 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> PrdF <400> 18 atgaaattta gcagaagtat acaagctata gactctcata cagcaggtga agcaactaga 60 atagttgtag gtggaatacc taacataaaa ggaaattcta tgcctgagaa aaaagaatat 120 ttagaggaaa atctagatta tttaagaact gctataatgt tagagccaag aggacataat 180 gatatgtttg gttctgtaat gactcaacct tgttgcccag atgctgactt tggaataatc 240 ttcatggatg gtggcggata ccttaacatg tgtggccatg gtacaatagg agctatgaca 300 gcagctatag aaacaggtgt agttccagca gtagagcctg taactcatgt agttatggaa 360 gctccagcag gaataataag aggagacgtt acagttgtag atggaaaagc taaagaagta 420 tcattcttaa acgtaccagc tttcttatat aaagaaggtg ttgaagttga cttaccaggt 480 gttggaactg ttaaatttga catatcattt ggtggaagct tctttgctat aatacatgca 540 agtcaattag gtttaaaaat cgaacctcaa aatgctggta aattaactga actagctatg 600 aaacttagag atataataaa tgagaaaata gaaatacaac atccaacttt agctcatata 660 aaaactgtag acttagttga aatatatgat gagccaactc atccagaagc tacttacaaa 720 aatgtagtta tatttggtca aggtcaagtt gacagatctc catgtggaac tggaacaagt 780 gctaaattag ctactttaca tgctaaaggt gaattaaaag taggagaaaa attcgtatat 840 gaaagtatat taggaacttt attcaaaggt gaaatagttg aagaaactaa agttgcagat 900 ttcaatgctg tagtacctaa aataactggt tctgcttata taactggatt taatcatttt 960 gtaatagatg aagaagaccc acttaaacat ggatttattc ttaaataa 1008 <210> 19 <211> 634 <212> PRT <213> Lactobacillus salivarius <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(634) <223> PrdA(LsPrdA) <400> 19 Met Ser Ile Ser Val Glu Gln Ala Lys Glu His Ala Lys Asp Pro Ala 1 5 10 15 Val Leu Cys Cys Arg Arg Glu Ala Gly Lys Val Leu Glu Ala Ala Asp 20 25 30 Phe Glu Asp Pro Thr Leu Phe Asp Asp Tyr Val Ser Ser Gly Leu Leu 35 40 45 Glu Ile Pro Glu Asp Thr Leu Thr Ile Glu Gln Ala Leu Gly Ala Thr 50 55 60 Leu Asn Thr Thr Thr Asp Ala Leu Asn Pro Leu Val Pro Gly Ile Val 65 70 75 80 Asp Asn Ile Gln Gly Asn Glu Glu Ala Ser Glu Ser Asp Lys Asp Glu 85 90 95 Asn Val Glu Glu Glu Thr Pro Val Val Ala Glu Ala Asn Asn Glu Val 100 105 110 Val Asn Ser Thr Ser Ser Asn Gly Thr Phe His Leu Arg Ile Ala Lys 115 120 125 Gly Glu Gly Ile Asp Leu Glu Ile Pro Leu Asp Val Leu Lys Lys Asn 130 135 140 Thr Ala Asn Ser Ala Val Asp Val Pro Lys Ala Glu Thr Ser Ala Asp 145 150 155 160 Val Thr Asn Lys Asp Val Ala Glu Asp Glu Glu Ser Ala Glu Asp Ala 165 170 175 Lys Val Val Arg Thr Leu Thr Lys Lys Tyr Phe Lys Val Asp Glu Val 180 185 190 Lys Phe Gly Asp Thr Thr Lys Phe Asp Gly Thr Thr Leu Tyr Leu Arg 195 200 205 Asn Pro Lys Glu Leu Cys Lys Glu Ala Val Asp Thr Glu Ala Ile Val 210 215 220 Lys Gly Met Glu Ile Glu Ile Ile Thr Pro Asp Asp Tyr Ser Asn Tyr 225 230 235 240 Ser Asn Thr Ile Met Asp Val Gln Pro Ile Ala Thr Lys Glu Gly Asp 245 250 255 Ser Asp Leu Gly Val Gly Val Thr Lys Val Val Asp Gly Ala Val Val 260 265 270 Val Leu Thr Gly Thr Asp Glu Asn Gly Val Gln Val Gly Glu Phe Gly 275 280 285 Ser Ser Glu Gly Pro Leu Asn Glu Asn Ile Met Trp Asn Arg Pro Gly 290 295 300 Ala Val Asp Lys Gly Glu Ile Met Ile Lys Ile Asp Val Val Ile Glu 305 310 315 320 Ala Gly Thr Asn Arg Glu Arg Lys Gly Pro Leu Gly Ala His Leu Ala 325 330 335 Ala Asp Tyr Ile Thr Gln Glu Ile Arg Glu Ala Leu Lys Asp Val Asp 340 345 350 Asp Ser Ser Ala Val Arg Thr Glu Glu Phe Val Gln Lys Arg His Pro 355 360 365 Lys Gln Lys Arg Val Leu Ile Val Lys Glu Ile Met Gly Gln Gly Ala 370 375 380 Met His Asp Asn Leu Ile Met Pro Val Glu Pro Val Gly Thr Leu Gly 385 390 395 400 Ala Lys Pro Asn Val Asp Leu Gly Asn Leu Pro Val Val Leu Ala Pro 405 410 415 Thr Glu Leu Leu Asp Gly Gly Val His Ala Leu Thr Cys Ile Gly Pro 420 425 430 Ala Ser Lys Glu Thr Ser Arg His Tyr Phe Arg Glu Pro Leu Val Glu 435 440 445 Glu Ala Met Ala Asp Glu Asp Ile Asp Leu Val Gly Ile Ala Leu Val 450 455 460 Gly Ser Pro Gln Glu Asn Val Gln Lys Phe Tyr Val Ser Lys Arg Leu 465 470 475 480 Gly Met Met Val Glu Ala Met Asn Leu Asp Gly Ala Ile Val Thr Thr 485 490 495 Glu Gly Phe Gly Asn Asn His Ile Asp Phe Ala Ser His Ile Glu Gln 500 505 510 Ile Gly Glu Arg Gly Val Asp Val Val Gly Met Thr Tyr Ala Ala Val 515 520 525 Gln Gly Gln Leu Val Val Gly Asn Lys Tyr Met Asp Ala Met Val Asp 530 535 540 Asn Asn Lys Ser Arg Gln Gly Ile Glu Asn Glu Ile Leu Glu Asn Asn 545 550 555 560 Thr Leu Ser Arg Glu Asp Ala Ile Arg Ala Leu Ala Met Leu Glu Thr 565 570 575 Lys Met Ala Gly Gly Ser Ile Lys Lys Pro Glu Arg Gln Trp Asn Pro 580 585 590 Asn Val Lys Gln Asn Asn Ile Glu Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys 595 600 605 Lys Ile Asp Leu Val Glu Asn Glu Gln Ser Leu Pro Met Ser Lys Lys 610 615 620 Arg Arg Glu Ile Tyr Glu Lys Asp Ala Gln 625 630 <210> 20 <211> 1905 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius <220> <221> gene <222> (1)..(1905) <223> PrdA(LsPrdA) <400> 20 atgtcaattt cagttgaaca agctaaagaa catgctaagg atccagcagt tctttgctgt 60 agaagagagg caggaaaagt tctggaagct gccgattttg aagacccaac tttgtttgat 120 gactatgtta gttcaggact tttagaaata cctgaagata cgttaactat tgaacaagca 180 ttgggtgcaa cattaaatac tactacggat gcattaaatc ctttagttcc aggtattgta 240 gataatattc agggaaatga agaagcatct gaaagtgata aggacgaaaa tgttgaagaa 300 gaaacaccag ttgtagcaga agctaacaat gaagtagtaa attcaacatc atcaaatggt 360 acattccatt taagaatcgc taaaggtgaa ggtattgatt tagaaatacc tttggatgta 420 ttaaaaaaaa acacagctaa ctcagctgta gatgtcccca aggcggaaac aagtgctgat 480 gtaactaata aggatgttgc agaagatgaa gaatcagcag aagatgctaa agttgttcgt 540 actctaacta aaaaatactt caaagtagat gaagttaaat ttggagacac aacaaagttt 600 gatggaacaa cactttactt acgtaatcct aaagaacttt gcaaagaagc tgttgatact 660 gaagcaatcg ttaagggtat ggaaatcgaa attatcacac ctgatgatta ttccaactat 720 agtaacacta ttatggatgt tcaaccaatc gctacaaaag aaggagatag tgatttgggt 780 gtaggcgtta caaaagttgt ggatggtgct gtagtagtac tcacaggtac tgatgaaaat 840 ggtgtccaag ttggtgaatt tggttcttca gaaggtccat tgaatgaaaa tattatgtgg 900 aatcgtcctg gtgcagttga taaaggcgaa atcatgatta agattgatgt tgttatcgaa 960 gctggaacta accgtgaacg taaaggacct ttaggagcac atttagcagc agactacatt 1020 acacaagaaa ttagagaagc actaaaagat gttgatgata gttcagcagt tagaactgaa 1080 gaatttgttc aaaaacgtca tcctaagcaa aagagagtat taattgtaaa agaaatcatg 1140 ggtcaaggtg caatgcacga taatttaatt atgcctgtgg aaccagttgg tactcttggt 1200 gcaaagccaa atgttgattt aggtaacttg ccagttgtat tagctccaac ggaattatta 1260 gatggtggtg tacatgcttt aacatgtatt ggacctgctt ctaaggaaac atccagacat 1320 tacttcagag aacctttggt agaagaagca atggctgatg aagatattga tttagttggt 1380 attgcattag tcggttcacc tcaagaaaat gttcaaaaat tctatgtttc taagagatta 1440 ggtatgatgg tagaagctat gaatttagat ggtgctattg ttacaacaga aggatttggt 1500 aataaccata tcgactttgc ttctcacatc gaacaaattg gtgaaagagg agtagatgtt 1560 gttggaatga catatgctgc tgtccaagga caattagttg ttggtaacaa gtatatggat 1620 gcaatggtgg ataacaacaa atcccgtcaa ggtattgaaa acgaaattct tgaaaacaat 1680 actctatcac gtgaagatgc tatcagagct ttagcaatgt tggaaacaaa gatggctggt 1740 ggatcaatta agaaacctga acgtcaatgg aatccaaatg ttaagcaaaa taatatcgaa 1800 attattgaaa aagaaaccgg taagaagatt gacttagttg agaatgaaca atctctacca 1860 atgagtaaga agcgtcgtga aatttacgaa aaggatgctc aatag 1905 <210> 21 <211> 240 <212> PRT <213> Lactobacillus salivarius <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(240) <223> PrdB(LsPrdB) <400> 21 Met Ser Leu Lys Lys Tyr Asp Gly Leu Gln Ser Glu Ile Phe Val Pro 1 5 10 15 Ile Thr Pro Thr Pro Val Trp Ala Pro Val Lys Lys Lys Leu Lys Asp 20 25 30 Met Thr Val Ala Ile Val Thr Ala Ala Gly Val His Leu Lys Ser Asp 35 40 45 Lys Pro Phe Asn Leu Ala Gly Asp Thr Ser Tyr Arg Val Val Pro Ser 50 55 60 Thr Ala Thr Asp Asp Glu Leu Met Val Ser His Gly Gly Tyr Asp Asn 65 70 75 80 Thr Asp Val Asn Arg Asp Ile Asn Cys Met Phe Pro Ile Asp Arg Leu 85 90 95 Arg Glu Leu Ala Glu Lys Gly Phe Ile Lys Asn Ile Ala Pro Asn Met 100 105 110 Tyr Thr Cys Met Gly Gly Gly Gly Asp Val Lys Val Phe Thr Glu Glu 115 120 125 Thr Gly Pro Glu Ile Ala Gln Lys Leu Leu Asp Glu His Val Asp Ala 130 135 140 Val Val Met Thr Ala Gly Gly Thr Cys His Arg Thr Ala Val Ile Val 145 150 155 160 Gln Arg Ala Ile Glu Ser Val Gly Ile Pro Thr Ile Ile Ile Ala Ala 165 170 175 Leu Pro Pro Val Val Arg Gln Gln Gly Ser Pro Arg Ala Val Ala Pro 180 185 190 Arg Val Pro Met Gly Ala Asn Ala Gly Glu Pro His Asn Val Glu Met 195 200 205 Gln Thr Gly Ile Leu Lys Asp Thr Leu Glu Gln Leu Glu Lys Leu Asp 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Ile Val Pro Leu Pro Tyr Glu Tyr Ile Ala Asn Ile 225 230 235 240 <210> 22 <211> 726 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius <220> <221> gene <222> (1)..(726) <223> PrdB(LsPrdB) <400> 22 atgagtctta agaaatatga tggactacaa tccgaaatat ttgtacctat tactcctacg 60 ccagtgtggg ctccagttaa aaagaagcta aaagatatga ctgtagcaat tgtaactgct 120 gctggtgtac atttgaaatc agataaacca tttaatttag ctggtgatac ttcatataga 180 gtagtacctt caactgcaac tgatgatgaa ttgatggtat cacatggtgg ttatgataac 240 actgatgtta acagagatat taactgtatg ttcccaattg atagattaag agaacttgca 300 gagaaaggat ttattaagaa tattgcgcca aacatgtata catgtatggg tggtggtgga 360 gacgttaaag tctttactga agaaactggt ccagaaattg cccaaaaatt attggatgaa 420 catgtagatg ctgtcgtaat gactgctggt tgaggtacct gtcatagaac tgccgtgatc 480 gtgcagagag ctattgaatc agttggtatc ccaacaatta ttattgcagc cttacctcca 540 gtagtacgtc aacaaggatc tcctagagct gttgctcctc gagttcctat gggggctaat 600 gccggagaac cacacaacgt cgaaatgcaa acaggtattt tgaaagatac gttagagcaa 660 ttagaaaaat tagattcccc aggtaagatt gtgccactac catatgaata tatagcaaat 720 atatag 726 <210> 23 <211> 105 <212> PRT <213> Lactobacillus salivarius <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(105) <223> PrdH(LsPrdH) <400> 23 Met Glu Glu Gln Ser Thr Gly Phe Asp Lys Leu Lys Tyr Ala Ser Thr 1 5 10 15 Glu Arg Val Trp Glu Gly Ile Ile Ile Glu Leu Thr Asp Ala Ser Val 20 25 30 Ile Ile Asp Leu Lys Gly Arg Leu Gly Arg Leu Glu Ile Pro Asn Arg 35 40 45 Met Ile Ile Ser Asp Tyr Glu Leu Lys Val Gly Gln Glu Val Ala Phe 50 55 60 Leu Met Ser Tyr Pro Glu Val Leu Asp Ser Glu Pro Asn Gln Lys Tyr 65 70 75 80 Leu Gly Ala Leu Asn Ala Tyr His Lys Lys Met Lys Glu Ile Lys Glu 85 90 95 Lys Gln Arg Arg Asp Lys Asn Glu Ser 100 105 <210> 24 <211> 318 <212> DNA <213> Lactobacillus salivarius <220> <221> gene <222> (1)..(318) <223> PrdH(LsPrdH) <400> 24 atggaagaac aaagtacagg atttgacaag ttgaaatatg cctcaactga aagagtatgg 60 gagggtataa taatagaatt gacagatgcg agtgtcataa ttgatcttaa aggacgtcta 120 ggtagactag aaattcctaa tagaatgatt attagtgact atgagttgaa agtcggtcag 180 gaagtagcat tcttaatgtc atatcccgaa gttttggata gtgaacctaa tcaaaaatat 240 ttaggagcac taaatgcata ccataaaaaa atgaaagaaa taaaagaaaa gcaaaggaga 300 gataaaaatg agtcttaa 318 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrdA(C421A)-F <400> 25 ggtatccatg cattaactgc cataggacct gcatcaaaag 40 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrdA(C421A)-R <400> 26 cttttgatgc aggtcctatg gcagttaatg catggatacc 40

Claims

PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 추가적으로 PrdD, PrdE 및 PrdE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 추가적으로 PrdC, PrdG 및 PrdF로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아속 미생물인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 미생물 또는 배지로부터 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계;
를 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법.
ⅰ) PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 D-프롤린, D-아제티딘-2카르복실산 (D-azetidine-2-carboxylic acid), 트랜스-4-하이드록시-D-프롤린 (trans-4-hydroxy-D-Proline) 및 시스-4-하이드록시-D-프롤린 (cis-4-hydroxy-D-Proline)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나가 포함된 배지에서 배양하는 단계; 또는
ⅱ) a) PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 배양하는 단계; 및 b) 상기 a)단계로부터 수득한 활성형 D-프롤린 리덕타제와 기질인 D-프롤린, D-아제티딘-2카르복실산 (D-azetidine-2-carboxylic acid), 트랜스-4-하이드록시-D-프롤린 (trans-4-hydroxy-D-Proline) 및 시스-4-하이드록시-D-프롤린 (cis-4-hydroxy-D-Proline)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 반응시키는 단계를 포함하는,
아미노발레릭산 (5-aminovaleric acid, 5-AVA), γ-아미노부티릭산 (γ-aminobutyric acid, GABA) 및 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산 (5-amino-4-hydroxypentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생산하는 방법.
PrdA 단백질 및 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질을 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제 생산용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, PrdH 단백질을 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제 생산용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, PrdH 단백질을 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제 생산용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, PrdH 단백질을 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제 생산용 조성물.
prdA 또는 prdA와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
prdB 또는 prdB와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계;
를 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 prdA는 서열번호 3 또는 서열번호 19로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 PrdA 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 prdB는 서열번호 5 또는 서열번호 21로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 PrdB 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 prdH는 서열번호 1 또는 서열번호 23로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 PrdH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 추가적으로 PrdD, PrdE 및 PrdE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 추가적으로 PrdC, PrdG 및 PrdF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아속 미생물인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제 생산용 조성물은 PrdA 단백질 및 PrdB 단백질을 추가로 포함하는 것인, 활성형 D-프롤린 리덕타제 생산용 조성물.