WO2019013569A1 - 활성형 d-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 활성형 d-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법 - Google Patents

활성형 d-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 활성형 d-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법 Download PDF

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prdh
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박진승
박보성
양영렬
오린석
이나훔
문준옥
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y121/04—Oxidoreductases acting on X-H and Y-H to form an X-Y bond (1.21) with a disulfide as acceptor (1.21.4)
    • C12Y121/04001—D-Proline reductase (dithiol) (1.21.4.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a D-proline reductase-expressing microorganism and an active D-proline reductase thereof, wherein the activity of PrdA protein, PrdB protein and PrdH protein is enhanced. Based on this, a method of reducing D-proline and D-proline-like substances, and a method of simultaneously expressing Prd protein and PrdB protein and having an activity of converting an inactive D-proline reductase to an active D-prolyl reductase Lt; / RTI > protein.
  • 5-aminovaleric acid is a monomer of nylon 5, which is known to be converted from proline by the D-proline reductase.
  • a pyrroleyl group in order to activate the D-proline reductase, a pyrroleyl group must be introduced simultaneously with the precise self-cleavage of the PrdA protein.
  • this is regarded as a technical limitation, and a demand for a method capable of producing an active D-proline reductase is increasing.
  • the present inventors have continuously studied for the development of recombinant expression systems and strains capable of producing D-proline reductase (D-rpoline reductase) in an active form, and have conducted studies on applicability to various D-proline-like substrates. From this, we first identified the PrdH protein, which was co-expressed with the PrdA protein and the PrdB protein, converting the inactive D-rpoline reductase into the active D-prolyl reductase. In addition, the activity of the microorganisms expressing the active D-proline reductase and the D-proline reductase produced therefrom has been successfully demonstrated.
  • One object of the present application is to provide a microorganism expressing an active D-proline reductase, wherein the activity of PrdA protein, PrdB protein and PrdH protein is enhanced.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an active D-proline reductase comprising culturing the microorganism in a medium, and recovering the active D-proline reductase from the microorganism or medium .
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing 5-aminovaleric acid (5-AVA), gamma -aminobutyric acid (5-aminobutyric acid), and aminobutyric acid (5-aminobutyric acid) using an active D-proline reductase produced by the microorganism or the microorganism.
  • GABA 5-aminovaleric acid
  • gamma -aminobutyric acid gamma -aminobutyric acid
  • aminobutyric acid aminobutyric acid
  • the present invention also provides a method for producing at least one selected from the group consisting of 5-amino-4-hydroxypentanoic acid.
  • Another object of the present application is to provide a PrdH protein that is co-expressed with the PrdA protein and PrdB to convert an inactive D-proline reductase to an active D-prolyl reductase.
  • Another object comprises the step of transforming an expression cassette comprising, prdB or prdB and prdH gene transformed with an expression cassette comprising a prdA or prdA and prdH gene into a host cell in a host cell, And a method for producing a microorganism expressing an active D-proline reductase.
  • the present application newly proposed a polypeptide capable of converting an inactive D-prolinyl reductase into an active D-prolyl reductase, and interacts with a complex of PrdA and PrdB constituting the existing D-proline reductase, , Or the Prd operon to increase the activity of the active D-proline reductase to provide a novel active D-proline reductase, thereby providing a method of converting D-proline or an analogue thereof.
  • FIG. 4 shows Western blot analysis results according to the expression of PrdB protein.
  • FIG. 5 is a Western blot analysis result on the self-cleavage of the PrdA protein by the PrdH protein.
  • FIG. 11 shows the results of TLC analysis evaluating the ability to convert D-proline-like substances through the active D-proline reductase.
  • active D-prolinyl reductase in the present application means that, among the PrdA protein and PrdB protein constituting D-proline ritratase, the PrdA protein is precisely cleaved by PrdH, Refers to a protein complex consisting of alpha-PrdA, beta-PrdA, and PrdB proteins separated by -PrdA and beta-PrdA, wherein the pyloyl group is bonded to the amino terminal of the double-separated alpha-PrdA moiety.
  • PrdA protein is a component of the protein complex of D-proline reductase.
  • the PrdA protein is an alpha-PrdA protein (carboxyl terminal fragment) and a beta-PrdA protein (Amino terminal fragment).
  • alpha-PrdA protein carboxyl terminal fragment
  • beta-PrdA protein Amino terminal fragment
  • the PrdA protein self-cleavage process is characterized by the introduction of a pyruvoyl group at the amino terminus of the alpha-PrdA protein at the same time as the cleavage of the peptide bond .
  • the pylorbyl group is known to be an essential residue for the activity of D-proline reductase, because it acts to lower the activation energy of the substrate (Kabisch et al., J. Biol. Chem., 1999, 274 (13), 8445 -8454).
  • the pivalobyl group is not introduced into the protein cleavage mechanism through a general hydrolysis reaction, various studies have been conducted to solve this problem.
  • the PrdA protein fragment from which the amino-terminal was removed was subjected to artificial cleavage by inducing the addition of a reducing agent such as NaBH 4 Has progressed.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions that include a hybridization step at a Tm value of 55 ° C and using the conditions described above.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C, or 65 ° C, but is not limited thereto and may be suitably adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used but are not limited thereto.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited, and known expression vectors can be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein can be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome can be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. And may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette can typically include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • various factors that can help the efficient production of the target protein can be included inside or outside the expression cassette.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operatively linked to the sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • one specific example of the present application is a microorganism expressing an active D-prolyl reductase having enhanced activity of PrdA protein, PrdB protein and PrdH protein, in addition to a microorganism expressing at least one of PrdC, PrdG, or PrdF And a microorganism expressing an active D-proline reductase, wherein the activity of the protein is enhanced.
  • PrdD, PrdE, and PrdE 2 protein has the PrdA protein with high sequence homology or identity.
  • PrdD protein shows high homology or identity with beta-PrdA protein
  • PrdE and PrdE 2 proteins show high homology or identity with alpha-PrdA protein.
  • the PrdD, PrdE, and PrdE 2 protein can be obtained from the GenBank sequences of the known database NCBI.
  • PrdD, PrdE, and PrdE 2 proteins pepto Clostridium difficile silane 630 (pepto Clostridium difficile Silicate 630 (Clostridium difficile 630)) derived PrdD, PrdE, and PrdE 2 protein, in particular SEQ ID NO: 7, 9 , 11, or a protein having an amino acid sequence encoded by the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, 10, or 12, but is not limited thereto.
  • Escherichia Escherichia
  • Escherichia An air Winiah (Erwinia) genus
  • Serratia marcescens Serratia marcescens
  • Providencia Providencia
  • Corynebacterium Corynebacterium
  • Brevibacterium Brevibacterium Microbial strains belonging to the genus Escherichia, and examples of Escherichia genus include, but are not limited to, Escherichia coli.
  • the Escherichia genus microorganism producing the active D-proline reductase capable of expressing the polypeptide having the D-proline reductase activity of the present application can be obtained by expressing the polypeptide by various known methods in addition to the introduction of the vector It can contain all microorganisms.
  • cultivation means that the microorganism is grown under moderately controlled environmental conditions.
  • the culturing process of the present invention can be carried out according to a suitable culture medium and culture conditions known in the art. Such a culturing process can be easily adjusted by those skilled in the art depending on the strain to be selected.
  • the step of culturing the microorganism is not particularly limited, but can be carried out by a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method and the like.
  • the culturing conditions are not particularly limited, but may be carried out at a suitable pH (for example, a pH of 5 to 9, specifically, a pH of 5 to 10, and a pH of 5 to 10) using a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia or an acidic compound such as phosphoric acid or sulfuric acid. PH 6 to 8, most specifically pH 6.8).
  • a suitable pH for example, a pH of 5 to 9, specifically, a pH of 5 to 10, and a pH of 5 to 10
  • a suitable pH for example, a pH of 5 to 9, specifically, a pH of 5 to 10, and a pH of 5 to 10
  • a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia or an acidic compound such as phosphoric acid or sulfuric acid.
  • PH 6 to 8 most specifically pH 6.8
  • defoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit the formation of bubbles.
  • oxygen or oxygen-containing gas is injected into
  • cultured E. coli transformed with pETDuet_H6-prdA-H6 vector was cultured with or without D-proline (10 mM) as a substrate.
  • selC gene and pCDFDuet_prdB-H6 vector constructed above were separated by agarose gel after XbaI restriction enzyme treatment, and finally, pCDFDuet_prdB-H6_P selC -selC vector was constructed through T4 ligase reaction.
  • PrdA protein expression vector pETDuet_H6-prdA-H6
  • PrdB protein expression vector pCDFDuet_prdB-H6-P selC _selC and pACYCDuet_selA_selB vector combinations.
  • the above three expression vectors were transformed into E. coli BL21 (DE3) and cultured in LB medium (50 ml) containing antibiotics (ampicillin 0.1 mg / ml, spectinomycin 50 ⁇ g / ml, chloramphenicol 30 ⁇ g / ml) (37 ° C, 200 rpm).
  • PrdA PrdH and co-expression vector pETDuet_prdH_H6-prdA-H6
  • PrdB protein expression vector pCDFDuet_prdB-H6-P selC _selC and pACYCDuet_selA_selB vector combinations.
  • the culture was carried out in the same manner as in 1).
  • LsPrdA protein and the LsPrdB (U151C) protein were coexpressed, the non-cleaved form of the LsPrdA protein (Pro-LsPrdA protein) and the LsPrdB protein were expressed, and at the same time, the non-specific degradation phenomenon of the LsPrdA protein was confirmed lane1).
  • Pro-LsPrdA protein was decreased and additional protein band was confirmed.
  • LsPrdA protein self-cleavage was confirmed (FIG. 7, lane 2).
  • the LsPrdH protein has about 55% amino acid sequence homology with the established PrdH protein, but has the same property that it is encoded in the genomic structure by the gene ORF located between the prdA gene and the prdB gene.
  • PrdH and LsPrdH proteins which have relatively low level of sequence homology but exist at similar positions in the genome structure, are the same, and the active D -
  • PrdH and LsPrdH proteins which have relatively low level of sequence homology but exist at similar positions in the genome structure, are the same, and the active D -
  • PrdH and LsPrdH proteins which have relatively low level of sequence homology but exist at similar positions in the genome structure
  • PrdD protein (amino acid sequence: Q17ZY7, UniProtKB, SEQ ID NO: 7 / nucleotide sequence: CD630_32400, NCBI GeneBank AM180355.1, SEQ ID NO: 8) derived from Peptococcal tritium difficilia 630 (Clostridium difficile 630) SEQ ID NO: Q17ZY2, UniProtKB, SEQ ID NO: 9 / base sequence: CD630_32390, NCBI GeneBank AM180355.1, SEQ ID NO: 10), and PrdE 2 protein (amino acid sequence: Q17ZY3, UniProtKB, SEQ ID NO: 11 / base sequence: CD630_32380, NCBI GeneBank AM180355 1, SEQ ID NO: 12) were added to the ribosome binding site between the genes so that they could be expressed simultaneously with the PrdA protein.
  • PrdG protein is presumed to be membrane protein, but no precise function has been reported to date.
  • PrdG protein (Amino acid sequence: Q17ZY0, UniProtKB, SEQ ID NO: 15 / nucleotide sequence: CD630_32360, NCBI GeneBank AM180355.1, which is not named PrdG protein in the sequence database) and PrdG protein
  • SEQ ID NO: 16 The nucleotide sequence of PrdG protein (SEQ ID NO: 16) based on the homology of C. sticklandii PrdG protein was synthesized using NcoI / NotI restriction endonuclease sequence at amino terminus and carboxyl terminus, respectively.
  • the three kinds of expression vectors were transformed into E. coli BL21 (DE3) and cultured in LB medium containing antibiotics (ampicillin 0.1 mg / ml, spectinomycin 50 ⁇ g / ml, chloramphenicol 30 ⁇ g / ml) Deg.] C, 200 rpm).
  • antibiotics ampicillin 0.1 mg / ml, spectinomycin 50 ⁇ g / ml, chloramphenicol 30 ⁇ g / ml
  • 0.1 mM IPTG was added when the OD600 value reached 0.5-0.6, 10 ⁇ M sodium selenite was added, and then 16 hours was further cultured.
  • the obtained E. coli cells were subjected to centrifugation after correcting the final OD to 50, and then washed with 1 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0) after the first washing.
  • D-proline a substrate for the D-proline reductase
  • the metabolic pathway is designed to convert L-proline to D-proline and utilize it.
  • proline racemase having proline isomer forming ability must be present at the same time.
  • PrdA PrdH and protein expression vector pETDuet_prdH_prdA
  • PrdBCG pCDFDuet_prdG_prdB-P selC _selC and pACYCDuet_selA-prdC_selB vector
  • PrdA PrdH and protein expression vector pETDuet_prdH_prdA
  • PrdBCGF protein expression vector P-pCDFDuet_prdGF_prdB selC _selC and pACYCDuet_selA- prdC_selB vector.

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Abstract

본 출원은 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물에 관한 것이다.

Description

활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법
본 출원은 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 당해 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한 이를 바탕으로 D-프롤린 및 D-프롤린 유사 물질을 환원하는 방법 및 PrdA 단백질과 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질에 관한 것이다.
석유 수급의 불안 및 고갈에 대한 위기 의식과 더불어 환경 친화적인 제품 개발 트랜드로 인해 바이오 플라스틱, 바이오 에너지 등 바이오매스 유래의 제품에 대한 연구 개발이 진행되고 있으며, 특히 나일론의 경우 다양한 바이오매스 유래의 단량체를 적용하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 일례로 바이오매스 유래의 퓨트레신(putrescine)의 적용을 통한 나일론 4,6 개발, 바이오매스 유래 카다베린(cadaverine)의 적용을 통해 나일론 6,6의 헥사메틸렌 다이아민(hexamethylene diamine, HMDA)을 대체할 수 있는 나일론 5,6에 대한 연구가 진행되고 있다. 또한 글루탐산(glutamic acid)을 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 생산이 가능한 4-아미노부티릭산(또는 감마-아미노부티릭산(gamma-aminobutyric acid, GABA))를 단량체로 사용하여 나일론 4 제품 개발에 대한 연구도 진행되고 있다.
5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid)은 나일론 5의 단량체로써, 프롤린(proline)으로부터 D-프롤린 리덕타제에 의해 전환되는 것으로 알려져있다. 그러나, 상기 D-프롤린 리덕타제의 활성화를 위해서는 PrdA 단백질의 정확한 자가절단과 동시에 피루보닐 그룹이 도입되어야 한다. 그러나, 이것이 기술적 한계로 여겨지고 있어 활성형 D-프롤린 리덕타제를 제조할 수 있는 방법의 요구가 증대되고 있다.
본 발명자들은 D-프롤린 리덕타제(D-rpoline reductase)를 활성형으로 생산 가능한 재조합 발현 시스템 및 균주 개발을 위해 지속적으로 연구하였으며, 이와 더불어 다양한 D-프롤린 유사 기질에 대한 적용 가능성 연구를 수행하였다. 이로부터 PrdA 단백질 및 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제(D-rpoline reductase)를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환하는 PrdH 단백질을 최초로 규명하였다. 또한, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 및 이로부터 생산된 D-프롤린 리덕타제의 활성을 성공적으로 증명하였다.
본 출원의 하나의 목적은 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 상기 미생물 또는 배지로부터 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계를 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 상기 미생물 또는 상기 미생물이 생산하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 이용하여 아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA), γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA) 및 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산 (5-amino-4-hydroxypentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 PrdA 단백질 및 PrdB과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 PrdH 단백질을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 목적은 prdA 또는 prdA와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계, prdB 또는 prdB와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계를 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원에서 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시킬 수 있는 폴리펩티드를 새롭게 제안하였으며, 기존의 D-프롤린 리덕타제를 구성하는 PrdA와 PrdB의 복합체와 상호작용하여 발현시, 또는 Prd 오페론과 함께 발현시에 활성형 D-프롤린 리덕타제의 활성이 증가하여 새로운 활성형 D-프롤린 리덕타제를 제공하여 D-프롤린 또는 이의 유사체의 전환방법을 제공한다.
도 1은 D-프롤린 리덕타제의 활성 생산 방법에 대한 개략도이다.
도 2는 PrdA 단백질의 발현 조건에 따른 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 PrdA 단백질 발현시 교반 유무에 따른 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 4는 PrdB 단백질의 발현에 따른 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 5는 PrdH 단백질에 의한 PrdA 단백질의 자가 절단에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 6은 재조합 발현된 D-프롤린 리덕타제의 활성 및 PrdDEE2 단백질의 활성 영향에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 7은 PrdH 단백질의 범용적 적용성에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 8은 PrdC 단백질에 의한 D-프롤린 리덕타제의 활성 영향에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 9는 PrdG 단백질에 의한 D-프롤린 리덕타제의 활성 영향(A) 및 PrdG 단백질의 특성 분석(B)에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 10은 재조합 활성형 D-프롤린 리덕타제 및 추가 단백질의 동시 발현을 통해 당원으로부터 5-아미노발레릭산을 생산한 내용에 대한 TLC 분석 결과이다.
도 11은 활성형 D-프롤린 리덕타제를 통해 D-프롤린 유사 물질에 대한 전환능을 평가한 TLC 분석 결과이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원에서 용어, "D-프롤린 리덕타제(D-Proline reductase)"는 PrdA 단백질과 PrdB 단백질로 이루어진 단백질 복합체를 의미한다. 주요 기능은 D-형의 프롤린(D-Proline)이 환원되어 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환되는 과정에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 상기 반응은 혐기 균주의 에너지원(ATP) 공급을 위해 활용되는 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)의 마지막 단계에 해당하는 것으로 알려져 있다(Bouillaut et al., J. Bacteriol., 2013, 195(4), 844-854).
상기 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)는 스티클랜드 발효 (Stickland Reaction)라고도 불리우며, 아미노산이 유기산으로 결합되는 동안 산화 및 환원되는 것을 포함하는 반응을 의미한다. 구체적으로, 전자 공여체인 아미노산은 원래 아미노산보다 짧은 1 탄소 원자가 휘발성 카르복실 산으로 산화된다. 예를 들어, 3 개의 탄소 사슬을 갖는 알라닌은 2 개의 탄소를 갖는 아세테이트로 전환된다. 아미노산은 스티글랜드 수여체(acceptor), 스티글랜드 공여체(doner)일 수 있다.
상기 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 대표적인 균주로는 펩토클로스트리디움 디피실리 630(Peptoclostridium difficile 630) (클로스트리디움 디필리실 (Clostridium difficile 630)), 펩토클로스트리디움 스틱클랜디 (Peptoclostridium stiklandii) ((클로스트리디움 스틱클랜디) (Clostridium stiklandii)), 또는 유박테리움 엑시도미노필리움 (Eubacterium acidaminophilum) 가 있으며, 락토바실러스 살리바리어스 (Lactobacillus salivarius)와 같은 락토바실러스(Lactobacillus) 계열의 일부 균주들도 이에 해당한다고 알려져 있다. 따라서, 상기 균주들을 이용하여, 본 출원의 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질, 그리고 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산할 수 있다.
D-프롤린 리덕타제의 주요 기능은 D-프롤린(D-Proline)으로부터 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)의 전환 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 현재까지 D-프롤린 리덕타제에 대한 명확한 반응 기작은 알려진바 없지만 다음과 같은 반응 기작이 제안되고 있다. 우선 alpha-PrdA, beta-PrdA, 및 PrdB 단백질 복합체로 이루어진 D-프롤린 리덕타제의 구성 단백질 중 alpha-PrdA 단백질의 아미노 말단에 위치하고 있는 피루보일 그룹(pyruvoyl group)과 기질인 D-프롤린의 아민 그룹과의 상호 결합으로 인해 기질의 활성 에너지가 낮아지게 된다. 다음 단계로 PrdB 단백질에 위치하고 있는 셀레노시스테인에 의해 D-프롤린의 알파 탄소와 아민 그룹 사이의 C-N 결합이 끊어지게 되고, 그 결과 D-프롤린으로부터 5-아미노발레릭산으로 전환반응이 일어나게 된다(Kabisch et al., J. Biol. Chem., 1999, 274(13), 8445-8454). 본 출원에서 용어, "활성형 D-프롤린 리덕타제"는 본 출원의 보조 단백질인 PrdH에 의해, D-프롤린 리턱타제를 구성하는 PrdA 단백질과 PrdB 단백질 중, PrdA 단백질이 정확한 자가절단에 의해, alpha-PrdA 및 beta-PrdA로 분리되며, 이중 분리된 alpha-PrdA 부분의 아미노 말단 쪽으로 피루보일 그룹이 결합한 alpha-PrdA, beta-PrdA 및 PrdB 단백질로 이루어진 단백질 복합체를 의미한다. 이와 같은 활성형 D-프롤린 리덕타제는 피루보일 그룹이 결합한 alpha-PrdA의 피루보일 그룹이 기질인 D-프롤린, 또는 D-프롤린과 유사한 기질들과의 결합을 통해 상기 기질들을 환원시킬 수 있는 상태의 활성형 효소를 의미한다. 예를 들어, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제는 기질인 D-프롤린을 5-아미노발레릭산(5-aminovalerate)으로 전환시킬 수 있다.
본 출원에서 용어, D-프롤린은 α-아미노산인 L-프롤린의 광학 이성질체이다. 특히, L-프롤린의 경우 비필수 아미노산으로 L-글루타메이트로부터 합성 할 수 있으며, 라세메이즈에 의해서 D-프롤린으로 전환이 가능하다.
본 출원에서 용어, "PrdA 단백질"은 D-프롤린 리덕타제의 단백질 복합체를 구성하는 일 구성요소로서, 상기 PrdA 단백질은 자가 절단 과정을 통해서 alpha-PrdA 단백질(카르복실 말단 단편) 및 beta-PrdA 단백질(아미노 말단 단편)로 나뉘어지게 된다. 일반적인 자가 절단 과정은 단순한 펩타이드 본드의 절단을 통해서 일어나지만 PrdA 단백질의 자가 절단 과정은 펩타이드 본드의 절단 과정과 동시에 alpha-PrdA 단백질의 아미노 말단에 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 도입되는 특성이 있다. PrdA 단백질이 독립적으로 존재할 경우 단백질 자체의 불완전성으로 인해 비특이적인 절단/분해 과정이 수반되며, alpha-PrdA 단백질 및 beta-PrdA 단백질로 완벽히 분리되지 않는 문제점이 있다.
상기 피루보일 그룹은 기질의 활성 에너지를 낮추는 역할을 하기 때문에 D-프롤린 리덕타제의 활성에 필수적인 잔기로 알려져 있다(Kabisch et al., J. Biol. Chem., 1999, 274(13), 8445-8454). 하지만 일반적인 가수 분해 반응을 통한 단백질 절단 기작은 상기 피루보일 그룹이 도입되지 않기 때문에 이를 해결하기 위한 다양한 연구가 진행되어 왔다. PrdA 단백질(pro-PrdA 단백질) 자체의 구조적 불안정성으로 인해 일어나는 비특이적 단백질 분해 과정을 방지하기 위해서, 아미노 말단이 제거된 PrdA 단백질 단편을 대상으로 NaBH4등의 환원제를 첨가하여 인위적인 절단 과정을 유도한 연구가 진행된 바 있다. 그 결과 원하는 위치 특이적 절단은 확인되었지만, 피루보일 그룹의 도입은 이루어지지 않은 것으로 확인되었다(Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3538-3544).
상기 PrdA 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdA 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 대표적인 예로, 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리 630)) 또는 락토바실러스 살리바리어스 유래 PrdA 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로써 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 서열번호 19의 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 및 상기 서열번호 19와 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PrdA 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "PrdB 단백질"은 D-프롤린 리덕타제의 단백질 복합체를 구성하는 일 구성요소로서, 상기 PrdB 단백질은 비천연 아미노산(non-natural amino acid)인 셀레노시스테인(selenocystein, Sec)을 포함하고 있는 셀레노 단백질이다. 셀레노시스테인은 일명 21번째 아미노산으로 불리는 비천연 아미노산으로써, 일반적인 단백질 합성 기작을 통해서 단백질 내에 도입되지 않는다는 특징을 지니고 있다(Itoh et al., Science, 340(6128), 2013, 75-78.). 특히 64개의 코돈 중 UGA 코돈, 즉 정지 코돈(stop codon)을 사용하여 도입이 진행되기 때문에 셀레노시스테인 도입 시스템이 없을 경우 상기 정지 코돈에서 단백질 합성이 중단되는 현상이 나타난다. 또한 상기 셀레노시스테인 도입 코돈을 일반적인 정지 코돈으로 인식하지 않기 위해서 SECIS(SElenoCysteine Incorporation Sequence)라고 일컬어지는 서열/구조 특이적 mRNA의 2차 구조가 UGA 코돈 아래쪽으로 위치해야 하며, 이와 연계하여 단백질 내에 도입하기 위한 sel 시스템(SelABCD)이 확보되어야 한다(Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2486-2492).
상기 PrdB 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdA 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 대표적인 예로, 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리 630) 또는 또는 락토바실러스 살리바리어스 유래 PrdB 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로써 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 서열번호 21의 폴리펩티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 및 상기 서열번호 21과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PrdB 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "PrdH 단백질"은 D-프롤린 리덕타제를 구성하는 PrdA 단백질 및 PrdB 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF를 이용하여 코딩된 신규 단백질을 의미한다. 본 출원에서는 이를 PrdH라 명명하였다. 또한, D-프롤린 리덕타제 활성을 갖는 균주의 종속 또는 특성에 따라, 상기 PrdH 단백질은 PrdA 또는 PrdB와 일부 겹쳐 존재할 수 있으며, PrdH의 정지 코돈(Stop codon)이 PrdB의 개시 코돈(Start codon) 뒤에 있을 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 PrdH단백질은 PrdA 단백질 및 PrdB와 동시발현되어, PrdA 단백질의 정확한 자가 절단 및 피루보일 그룹의 도입을 유도함으로써, 활성형 D-프롤린 리덕타제로 구성될 수 있도록 한다. 구체적으로 상기 PrdH 단백질은 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdH 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 즉, 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주의 PrdA 단백질 및 PrdB단백질를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF를 포함하는 서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. 대표적인 예로, 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리 630) 또는 락토바실러스 살리바리어스 유래 PrdH 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 펩토클로스트리디움 디피실리 630 유래 PrdH 단백질과 락토바실러스 살리바리어스 유래의 PrdH 단백질은 40%의 상동성 또는 동일성을 가지며, 상기 각 두 미생물 유래의 PrdA 단백질 및 PrdB 단백질을 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF라는 공통점을 가진다. 보다 구체적인 예를 들어, 상기 PrdH단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 출원의 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23과 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 PrdH 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 상기 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48 : 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
또한, 본원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질'이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 구체적으로, 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 보존적 치환, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (synonymous mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 출원에서 용어, "보존적 치환(conservative substitution)"은 아미노산 서열내 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이형은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판을 포함한다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다. 상기 서열번호 1 또는 서열번호 23으로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 PrdH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범위 내에 속하며, 예를 들어, 서열번호 2 또는 서열번호 24의 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
코돈 축퇴성 (codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 이와 상동성 또는 동일성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원에서 용어, "활성의 강화"는 효소 단백질의 활성이 도입되거나, 미생물이 가진 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 활성이 향상된 것을 의미한다. 상기 활성의 "도입"은, 자연적 혹은 인위적으로 미생물이 본래 가지고 있지 않았던 특정 단백질의 활성이 나타나게 되는 것을 의미한다. "내재적 활성"은, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 미생물의 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주가 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 말한다.
예를 들어, 상기 활성 강화는 외래의 D-프롤린 리덕타제를 숙주세포에 도입하거나 도입하여 강화하는 것, 또는 내재적 D-프롤린 리덕타제의 활성을 강화하는 것을 모두 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 활성 증가는,
1) 상기 효소들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 효소들의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동 가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 또한 카피수 증가의 한 양태로, 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 효소와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 효소가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있다. 상기 프로모터와 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
마지막으로, 4) 상기 1) 내지 3)의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법은, 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가, 이의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형, 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 및 상기 효소의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 변형 중 1 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 또한 상기 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 표적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 일 구체적인 예는 상기 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물에 추가로 PrdD, PrdE, 및 PrdE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공한다.
또한, 본 출원의 일 구체적인 예는 PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물에 추가로 PrdC, PrdG, 또는 PrdF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제공한다.
상기 "PrdD 단백질, PrdE 단백질, Prd E2 단백질, PrdC 단백질, PrdG 단백질, PrdF 단백질"은 D-프롤린 리덕타제의 Prd 오페론을 구성하는 단백질을 의미한다. 구체적으로 D-프롤린 리덕타제를 구성하고 있는 PrdA 및 PrdB 단백질 외에 prd 오페론을 구성하고 있는 단백질은 PrdDEE2CGFR로 알려져 있다. 현재까지 가장 잘 알려진 prd 오페론은 Clostridium sticklandii 균주에 존재하며, 상기 단백질 명칭은 C. stricklnadii의 오페론(NCBI GenBank: FP565809.1) 구성을 기준으로 한다(Jackson et al., J. Bacteriol., 2006, 188, 8487-8495).
Prd 오페론을 구성하고 있는 각 단백질의 기능은 명확히 규명되지 않았지만, PrdD, PrdE, 및 PrdE2 단백질은 PrdA 단백질과 높은 서열 상동성 또는 동일성을 갖고 있다. 이 중, PrdD 단백질은 beta-PrdA 단백질과 높은 상동성 또는 동일성을 보이며, PrdE 및 PrdE2 단백질은 alpha-PrdA 단백질과 높은 상동성 또는 동일성을 보인다. 상기 PrdD, PrdE, 및 PrdE2 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 본 출원에서 PrdD, PrdE, 및 PrdE2 단백질은 펩토클로스트리디움 디피실레 630(펩토클로스트리디움 디피실리 630 (Clostridium difficile 630))유래 PrdD, PrdE, 및 PrdE2 단백질, 구체적으로 서열번호 7, 9, 11의 아미노산 서열 또는 서열번호 8, 10, 12의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
PrdC 단백질은 NADH를 활용하여 D-프롤린 리덕타제에 전자 전달에 관여하는 것으로 보고되고 있으며(Fonknechten et al., BMC Genomics, 2010, 11, 555), PrdG 단백질은 멤브레인 단백질로 알려져 있지만 그 기능성에 대해 보고된 적은 없다. 상기 PrdC 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 본 출원에서 PrdC, PrdG 단백질은 펩토클로스트리디움 디피실레 630(Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630))유래 PrdC, PrdG 단백질, 구체적으로 서열번호 13, 15의 아미노산 서열 또는 서열번호 14, 16의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, PrdF 단백질은 프롤린 라세메이즈(proline racemase)로써 프롤린의 광학 이성질체 형성에 관여하는 단백질로 알려져 있으며, PrdR 단백질은 prd 오페론의 활성화와 관련된 기능을 갖는 것으로 보고되고 있다 (Bouillaut et al., J. Bacteriol., 2013, 195(4), 844-854). 상기 PrdF 단백질은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 본 출원에서 PrdF 단백질은 펩토클로스트리디움 디피실레 630(Peptoclostridium difficile 630 (Clostridium difficile 630))유래 PrdF 단백질, 구체적으로 서열번호 17의 아미노산 서열 또는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, '활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물'이란, PrdA 단백질의 정확한 자가 절단을 통해 얻어진 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 결합된 alpha-PrdA와 beta-PrdA 및 PrdB로 구성된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 의미한다. 상기 '미생물'은 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 에스케리키아속의 예로 대장균일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 상기 D-프롤린 리덕타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현할 수 있는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 에스케리키아 속 미생물은 상기 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계 및 상기 미생물 또는 배지로부터 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계를 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법일 수 있다.
상기 '활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물'에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
상기 "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 , 구체적으로는 25 내지 40 를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법은 당업계에 공지된 최적화된 배지 및 배양 조건에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 증류, 이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 활성형 D-프롤린 리덕타제는 정제된 형태 또는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 함유한 미생물 발효액일 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 또는 이로부터 생산된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 이용하여 D-프롤린 또는 이의 유사체를 환원방법에 의해 전환시키는 방법일 수 있다.
구체적으로는, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물 또는 이로부터 생산된 활성형 D-프롤린 리덕타제를 이용하여 아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA), γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA) 및 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산 (5-amino-4-hydroxypentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생산하는 방법일 수 있다.
상기 D-프롤린 유사체는 D-프롤린과 유사한 구조를 갖는 물질로서 카복실기와 알파 탄소, 아미노기가 순차적으로 연결되며, 상기 알파 탄소와 아미노기를 포함하는 링 구조를 가진 물질이면, 링의 크기에 상관없으며, 본 출원의 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 환원될 수 있는 모든 유사체를 포함한다. 구체적으로, D-아제티딘-2카르복실산(D-azetidine-2-carboxylic acid), 트랜스-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline), 시스-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.
또한, 상기 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의한 환원은, D-프롤린 또는 그 유사체 구조에서 알파 탄소와 아미노기 사이의 결합이 끊어져, 링 구조가 풀리는 전환반응을 의미한다. 구체적으로, D-프롤린은 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)으로 전환될 수 있다. 또한 상기 D-아제티딘-2카르복실산(D-azetidine-2-carboxylic acid)의 경우, D-프롤린 대비 하나의 탄소가 부족한 4각 링 형태의 구조를 가지며, 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 전환 반응이 진행될 경우 γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA)이 생성될 수 있다. 또한, D-프롤린의 링 구조에 하이드록실 그룹(-OH)이 추가된 형태의 cis-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline) 또는 trans-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline)는 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 전환 반응이 진행될 경우, 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산(5-amino-4-hydroxypentanoic acid)가 생성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 또 다른 양태는, PrdA 단백질 및 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질일 수 있다.
상기 'PrdA 단백질', 'PrdB 단백질', 'PrdH 단백질', '활성형 D-프롤린 리덕타제'에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 출원에서 용어, '동시 발현'은 2 이상의 단백질의 발현 또는 2 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 동시에 나타나는 것을 의미한다. 상기 유전자 또는 단백질의 발현 방법은 당업계에 공지된 방법 중에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 출원에서 용어, "비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환"이란, 비활성 상태인 D-프롤린 리덕타제가 활성형 D-프롤린 리덕타제의 활성을 갖도록 전환되는 것을 의미한다. 비활성형 D-프롤린 리덕타제가 PrdA 단백질의 정확한 자가 절단을 통해 얻어진 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 결합된 alpha-PrdA와 beta-PrdA 및 PrdB로 구성된 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환되는 것을 의미한다. 상기 '비활성형 D-프롤린 리덕타제'는 PrdA 단백질이 자가절단되지 않거나, 자가절단되더라도 피루보일 그룹(pyruvoyl group)이 결합되지 않은 alpha-PrdA와 beta-PrdA로 구성되거나, PrdA 또는 PrdB의 단백질이 발현되지 않거나, 또는 발현되더라도 활성이 없는 경우를 의미할 수 있다.
본 출원의 또 다른 양태는, prdA 또는 prdA와 prdH 유전자를 포함하는 발현 카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계 및 prdB 또는 prdB와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계를 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법일 수 있다.
상기 'PrdA 단백질', 'PrdB 단백질', 'PrdH 단백질', '발현 카세트', '활성형 D-프롤린 리덕타제', '활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물'에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: PrdA 및 PrdH 단백질 발현
1-1: PrdA 단백질의 발현을 위한 유전자 선정
PrdA 단백질의 발현을 위해 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 대표적인 균주로 알려진 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래의 D-프롤린 리덕타제 PrdA 단백질의 아미노산 서열(Q17ZY9, UniProtKB, 서열번호 3)을 대상으로 실험을 수행하였다. 상기 D-프롤린 리덕타제 PrdA 단백질의 유전자 염기 서열(CD630_32440, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 4)을 이용하여 발현 벡터를 구성하였다.
1-2: PrdA 발현 벡터(pETDuet_H6-prdA-H6)의 제작
상기 염기 서열을 대상으로 양 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하고, 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자와 pETDuet-1 벡터를 NdeI/XhoI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보한 뒤, T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdA 발현 벡터(pETDuet_H6-prdA-H6)를 구축하였다.
1-3: PrdA 단백질의 자가절단 위치 특이적 변이 발현 벡터(pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6)의 제작
또한, PrdA 단백질의 자가 절단이 일어나는 위치로 알려진 421번째 아미노산에 alanine scanning 방법을 적용하였다. 421번째 아미노산인 시스테인을 알라닌으로 치환(C421A)하기 위하여 위치 특이적 변이(site-directed mutagenesis)를 진행하였다. 이를 위해 상기 구축된 pETDuet_H6-prdA-H6벡터와 C421A 변이를 위해 설계된 서열번호 25 및 26 프라이머(표 1)를 Pfu PCR 프리믹스에 첨가하여 유전자를 증폭하였다. 이때, PCR 반응은 94℃에서 1분 변성, 55℃에서 1분의 어닐링 및 72℃ 에서 10분간 신장과정을 30회 반복하였다. 이 PCR 결과물에 DpnI(37℃, 3시간)을 처리하여 대장균(DH5α)에 형질전환시켰다. 형질 전환된 대장균을 배양하여 균체를 확보한 뒤 플라스미드 벡터를 분리하고 서열 확인을 통해 pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6 벡터를 확보하였다.
서열번호 프라이머 서열(5'-3')
25 PrdA(C421A)-F GGTATCCATGCATTAACTGCCATAGGACCTGCATC AAAAG
26 PrdA(C421A)-R CTTTTGATGCAGGTCCTATGGCAGTTAATGCAT GGA TAC C
* 밑줄: C421A 변이부분
1-4: PrdA 및 PrdH 단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)의 제작
PrdA 단백질의 자가 절단 과정을 유도하기 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 prd 오페론을 구성하는 단백질 중 구조 단백질인 PrdA 및 PrdB를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF를 이용하여 코딩된 신규 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY5, UniProtKB, 서열번호 1 / 염기서열: CD630_32430, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 2; 이하 PrdH 단백질이라 명명함)의 동시 발현을 시도하였다. 이를 위해 상기 염기 서열을 대상으로 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였으며, 합성된 prdH 유전자와 기 구축된 pETDuet_H6-prdA-H6 벡터를 NcoI/NotI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdA 및 PrdH 단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6)를 구축하였다.
1-5: 구축된 3가지 발현벡터의 PrdA 단백질의 발현 여부 및 PrdA의 자가절단 여부 확인
다음 단계로 상기 구축된 pETDuet_H6-prdA-H6, pETDuet_H6-prdA(C421A)-H6, 또는 pETDuet_prdH_H6-prdA-H6 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 한 뒤, 암피실린 항생제(0.1mg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지(50ml)에 접종하여 37℃, 200rpm 조건에서 배양을 진행하였다.
목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM 아이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 이하 IPTG)를 첨가하였다.
또한, 기질 결합을 통한 PrdA 단백질의 자가 절단을 유도해보는 목적에서, pETDuet_H6-prdA-H6 벡터로 형질전환된 대장균을 배양한 배양액에는 기질인 D-프롤린(10mM)을 첨가 또는 미첨가하여 배양하였다.
이후, 30℃, 200rpm 교반조건 또는 30℃, 정치배양 조건에서 각각 16시간을 추가로 배양하였다. 정치배양 조건은 발현된 PrdA 단백질의 비특이적 분해 현상을 줄이기 위해 교반 과정을 생략하여 수행되었다.
재조합 발현된 PrdA 단백질의 발현 여부를 확인하기 위해서 확보된 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리(15000 rpm, 4℃, 10분)를 통해 상등액을 분리하여 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다. 분석 결과 PrdA 단백질의 이론 분자량과 동일한 67.6 kDa의 분자량을 갖는 목적 단백질의 발현을 확인하였다(도 2). 그러나, 모두 비활성의 PrdA 단백질이 갖는, 자가 절단이 되지 않은 pro-PrdA 단백질 형태로 발현되었으며, 이로 인해 나타나는 추가적인 단백질의 생성(alpha-PrdA, 21.9kDa 및 beta-PrdA, 44.7kDa)도 확인되지 않았다. 또한, 웨스턴 블롯 결과에서 나타난 비특이적으로 분해된 단백질 밴드를 확인함으로써, 자가 절단되지 않은 pro-PrdA 단백질의 구조적 불안정성으로 인해 단백질의 분해가 많이 일어난 것을 확인하였다(도 2, lane2)). 또한, 자가 절단이 일어나는 위치로 알려진 PrdA 단백질의 421번째 시스테인 서열을 알라닌으로 치환한 PrdA(C421A) 변이 단백질의 발현 패턴 양상 및 야생형 PrdA의 발현 패턴이 동일하다는 것으로부터 PrdA 단백질의 독립적인 기작으로는 자가 절단이 일어나지 않음을 재확인하였다(도 2, lane 3). 또한 기질 결합을 통한 PrdA 단백질의 자가 절단을 유도하기 위해 D-프롤린을 첨가하거나(도 2, lane4), PrdA 단백질을 PrdH 단백질과 동시에 발현한 경우 역시 PrdA 단백질의 자가 절단은 일어나지 않았음을 확인하였다(도 2, lane5).
PrdA 단백질을 단독으로 발현했을 경우 발현된 단백질의 비특이적 분해 현상을 줄이기 위해 교반 과정 없이 정치 배양된 PrdA 단백질의 발현 패턴을 분석하였다. 이 경우 상대적으로 낮은 수준의 발현량으로 인해 단백질 자체의 분해 현상이 개선되었지만, 자가 절단은 일어나지 않은 것으로 확인되었다(도3, lane 3,4). 구체적으로는, beta-PrdA 단백질과 유사한 크기의 절단 단백질을 확인할 수 있었지만, alpha-PrdA 단백질의 확인이 되지 않는 것을 통해 비특이적 절단으로 생성된 절단 단백질임을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 선행 연구 결과(대한민국 특허공개 제 2015-0029526 호; Bednarski et al., Eur. J. Biochem., 2001, 268, 3538-3544)와 동일한 결과임을 확인할 수 있다.
실시예 2: PrdB 단백질 발현
2-1: PrdB 단백질의 발현을 위한 유전자 선정
PrdB 단백질의 발현을 위해 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 대표적인 균주로 알려 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 D-프롤린 리덕타제 PrdB 단백질의 아미노산 서열(Q17ZY6, UniProtKB, 서열번호 5)을 대상으로 진행하였으며, 상기 단백질의 유전자 염기 서열(CD630_32410, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 6)을 이용하여 발현 벡터를 구성하였다.
2-2: PrdB 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6)의 제작
상기 염기 서열을 대상으로 카르복실 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하고, 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다. 합성된 유전자와 pCDFDuet-1 벡터를 NdeI/XhoI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보한 뒤, T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdB 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6)를 구축하였다.
2-3: PrdB 단백질 내 셀레노시스테인 도입용 벡터의 제작
PrdB 단백질은 셀레노단백질(selenoprotein)로 알려져 있다. 즉, PrdB 단백질의 아미노산 서열 중 셀레노시스테인을 포함하고 있으며, 상기 셀레노시스테인은 비천연 아미노산이기 때문에 일반적인 단백질 생합성 과정을 통해 도입이 어렵다는 기술적 한계를 가지고 있다. 따라서 본 출원에서는 기공지 기술인 sel 오페론 시스템(selABC)의 도입(Su et al., Nucleic Acids Res., 2005, 33(8), 2486-2492)을 통해 PrdB 단백질의 셀레노시스테인 도입을 시도하였다.
2-3-1: selAB 도입 벡터(pACYCDuet_selB/ pACYCDuet_selA_selB)
이를 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 SelA 단백질 (아미노산 서열: Q182I2, UniProtKB / 염기서열: CD630_24950, NCBI GeneBank AM180355.1)과 SelB 단백질 (아미노산 서열: Q182I0, UniProtKB / 염기서열: CD630_24930, NCBI GeneBank AM180355.1)을 사용하였으며, 각각 아미노 말단과 카르복실 말단에 NcoI/NotI 및 NdeI/XhoI 조합의 제한효소 서열을 갖도록 유전자를 합성하였다.
다음 단계로 상용벡터인 pACYCDuet-1 플라스미드 벡터(Novagene)와 selB 유전자를 대상으로 NdeI/XhoI 조합의 제한효소를 처리하여 아가로스 젤을 통해 분리한 뒤 T4 라이게이즈 반응을 통해 pACYCDuet_selB 벡터를 구축하였다. 그리고 상기 벡터(pACYCDuet_selB)를 대상으로 추가적인 NcoI/NotI 조합의 제한효소 반응을 통해 selA 유전자를 삽입하여 최종적으로 pACYCDuet_selA_selB 벡터를 구축하였다.
2-3-2: selC 도입 벡터(pCDFDuet_prdB-H6_P selC -selC)
selC 유전자는 셀레노시스테인 특이적 tRNA로써 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 selC 유전자(염기서열: CDIF630_02727, NCBI GeneBank CP010905.1)와 selC 고유의 프로모터 및 터미네이터를 포함할 수 있도록 아미노 말단으로부터 150개, 카르복실 말단으로부터 250개의 뉴클레오타이드를 추가적으로 포함하였으며, 최종적으로 양 말단에 XbaI 제한 효소 서열을 첨가하여 합성을 진행하였다. 이렇게 확보된 selC 유전자와 앞서 구축된 pCDFDuet_prdB-H6 벡터를 대상으로 XbaI제한효소 처리 후 아가로스 젤을 통해 분리한 뒤, T4 라이게이즈 반응을 통해 최종적으로 pCDFDuet_prdB-H6_PselC-selC 벡터를 구축하였다.
2-4: 구축된 3가지 발현벡터의 PrdB 단백질의 발현 여부 확인
1) PrdB 단백질 단독 발현
상기 실시예 2-2에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(스펙티노마이신 50μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지(50ml)에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm).
2) PrdB 단백질 및 selC 동시 발현
상기 실시예 2-3에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6-PselC_selC 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.
3) PrdB 단백질 및 selAB 단백질 동시 발현상기 실시예 2-2에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6 및 실시예 2-3에서 제작된 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.
4) PrdB 단백질 및 selABC 동시 발현
실시예 2-3에서 제작된 pCDFDuet_prdB-H6-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.
목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였다. 또한, 셀레노시스테인 생합성 및 도입에 필요한 셀레늄을 공급하기 위해 10 μM 아셀렌산나트륨(sodium selenite)을 공급 또는 미공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.
분석 결과 PrdB 단백질을 단독으로 발현했을 경우 셀레노시스테인의 낮은 도입 효율로 인해 매우 낮은 수준의 PrdB 단백질 발현을 확인하였으며(도4, lane 1, 2), PrdB 단백질 및 selC 동시 발현(도 4, lane 3, 4) 또는 PrdB 및 SelAB 단백질의 동시 발현(도 4, lane 5, 6) 시에도 동일한 결과를 확인하였다(도 4). 하지만 PrdB 단백질과 selABC 유전자가 동시에 발현된 경우 PrdB 단백질의 발현량이 현격히 증가함을 확인하였으며(도4, lane 7), 이는 상기 sel 오페론을 구성하고 있는 SelA 및 SelB 단백질과 셀레노시스테인 특이적 tRNA인 SelC의 영향으로 비천연 아미노산인 셀레노시스테인이 PrdB 단백질 내에 효율적으로 도입되었다는 것을 의미한다. 또한 아셀렌산나트륨(sodium selenite)을 첨가한 경우(도 4, lane 8; 최종 농도 10μM), 첨가하지 않는 경우(lane 7)와 비교해서 PrdB 단백질의 발현량이 더욱 증가한 결과를 확인할 수 있으며, 이를 통해서 셀레노시스테인의 효율적인 도입 시스템 구축이 PrdB 단백질이 발현량 증대에 주요 요소임을 확인하였다.
실시예 3: PrdH 단백질의 기능성 검증 및 PrdH 단백질 발현을 포함하는 D-프롤린 리덕타제의 활성 평가
3-1: PrdH 기능성 검증을 위한 D-프롤린 리덕타제 단백질 발현
상기 확인된 정보를 바탕으로 D-프롤린 리덕타제의 발현을 시도하였으며, 이를 위해 다음과 같은 벡터 조합을 평가하였다.
1) PrdA 및 PrdB 단백질 동시 발현
기 구축된 PrdA 단백질 발현 벡터(pETDuet_H6-prdA-H6)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지(50ml)에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm).
2) PrdA, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질 동시 발현
기 구축된 PrdA 및 PrdH 동시 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA-H6) 와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 배양방법은 1)과 동일하게 진행하였다.
3) PrdA(C421A), PrdB 단백질 및 PrdH 단백질 동시 발현
기 구축된 PrdA(C421A) 단백질과 PrdH 단백질의 동시 발현 벡터(pETDuet_prdH_H6-prdA(C421A)-H6)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-H6-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 배양방법은 1) 및 2)와 동일하게 진행하였다.
목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 배양액의 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때, 각 배양액에 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다.
3-2: PrdH 단백질 도입을 통한 PrdA 단백질의 자가절단 확인 - 웨스턴 블롯 분석
상기 실시예 3-1에서 획득된 각 배양액의 대장균 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.
분석 결과 PrdA 단백질과 PrdB 단백질만을 동시에 발현한 경우 PrdA 단백질의 자가 절단 현상은 확인되지 않았다(도 5, lane 1). 하지만 PrdH 단백질과 PrdA 및 PrdB 단백질을 동시에 발현한 경우 비활성 형태의 PrdA 단백질(Pro-PrdA 단백질)이 사라짐과 동시에 추가적인 단백질 밴드가 형성된 것을 확인하였다(도 5, lane2).
상기 실험 결과가 PrdA단백질 고유의 자가 절단 메커니즘으로부터 기인된 것을 확인하기 위해서 PrdA 단백질의 자가 절단 위치로 알려진 421번째 아미노산 시스테인을 알라닌으로 치환(C421A)하여 PrdB 및 PrdH 단백질과 동시에 발현한 결과 Pro-PrdA 단백질이 유지됨과 동시에 절단 된 단백질은 확인되지 않았다(도 5, lane3). 이는 추가로 나타난 단백질들이 PrdA 단백질의 421번째 시스테인 위치에서 특이적으로 절단된 것을 의미한다.
따라서 PrdH 단백질이 PrdA 단백질의 자가 절단에 필수적인 단백질 이라는 것을 확인하였으며, PrdA 단백질의 활성 확보에 중요한 기능을 하는 보조 단백질이라는 것을 확인하였다.
이와 더불어 선행 실시예를 통해 PrdA 단백질과 PrdH 단백질을 동시에 발현했음에도 불구하고 PrdA 단백질의 자가 절단이 일어나지 않은 결과(실시예 1; 도 2, lane5)를 통해서 PrdA 단백질의 자가 절단을 유도하기 위해서는 PrdH 단백질뿐만 아니라 PrdB 단백질이 동시에 존재하여야 하며, 이는 PrdA 단백질과 PrdB 단백질이 일정 수준 이상의 복합체를 우선적으로 형성한 뒤 PrdH 단백질에 의해서 절단되는 과정이 진행되는 것을 확인할 수 있다.
3-3: PrdH 단백질이 동시 발현된 D-프롤린 리덕타제 활성 평가 - TLC 분석
3-1에서 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M phosphate buffer(pH8.0)에 희석하였다. 다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, DTT(최종 농도 25mM) 및 D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가하여 6 시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.
PrdA, PrdB 및 PrdH 단백질을 동시에 발현된 균주의 경우, TLC 상에서 5-아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA)에 해당하는 스팟이 생성되는 것을 확인하였으며(도 6, lane1), PrdH 단백질이 존재하지 않을 경우에는 활성이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 6, lane2). 이는 PrdH 단백질의 부재로 인해 PrdA 단백질의 자가절단이 일어나지 않고, 이로 인해 D-프롤린 리덕타제의 활성이 나타나지 않았음을 의미한다.
PrdA, PrdB 및 PrdH 단백질을 동시에 발현된 균주를 CC04-9007로 명명하였으며 2017년 2월 2일자로 부타페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM11963P를 부여받았다.
실시예 4. PrdH 단백질의 범용성 검증
4-1: PrdH 단백질의 범용성 검증을 위한 균주 선정
상기 PrdH 단백질이 PrdA 단백질의 자가 절단에 범용적으로 적용될 수 있는 필수 보조 단백질임을 검증하기 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 이외에 스티클랜드 반응 경로(Stickland reaction)를 갖는 균주로 알려진 Lactobacillus salivarius 유래 PrdA(이하 LsPrdA) 단백질의 자가 절단에 PrdH (이하 LsPrdH) 단백질의 관여 여부를 확인하였다.
4-2: LsPrdA 발현 벡터(pETDuet_H6-LsprdA-H6)의 제작
LsPrdA 단백질(아미노산 서열: E1JLY6, UniProtKB, 서열번호 19 / 염기서열: HMPREF9269_1797, NCBI GeneBank AEBA01000066.1, 서열번호 20)은 해당 유전자 서열 양 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하고, 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다. pETDuet-1 벡터와 상기 합성된 유전자를 제한효소 NdeI/XhoI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pETDuet_H6-LsprdA-H6 발현 벡터를 구축하였다.
4-3: LsPrdA 및 LsPrdH 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터(pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6)의 제작
추가적으로 LsPrdH 단백질(아미노산 서열: E1JLY7, UniProtKB, 서열번호 23 / 염기서열: HMPREF9269_1798, NCBI GeneBank AEBA01000066.1, 서열번호 24)의 유전자 서열의 양 말단에 NcoI/NotI 조합의 제한효소 서열을 첨가한 뒤 합성을 진행하였으며, 상기 구축된 pETDuet_H6-LsPrdA-H6 발현 벡터를 대상으로 제한효소 NcoI/NotI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6 발현 벡터를 구축하였다.
4-4: LsPrdB 발현 벡터(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)의 제작
Lactobacillus salivarius 유래 PrdB(이하 LsPrdB) 단백질(아미노산 서열: E1JLY8 및 E1JLY9, UniProtKB, 서열번호 21 / 염기서열: HMPREF9269_1799 및 HMPREF9269_1800, NCBI GeneBank AEBA01000066.1, 서열번호 22; 서열 데이터베이스 상에서 LsPrdB 단백질 내에 존재하는 정지 코돈(stop codon, UAG) 서열이 셀레노시스테인의 도입을 위한 서열이 아니라 단백질 발현 정지 코돈으로 인식되어 두 개의 단백질 또는 염기 서열로 표현됨. 따라서 상기 두 염기 서열 및 두 염기 서열 사이에 존재하는 서열을 모두 LsPrdB 단백질의 염기 서열로 추정하고 발현 벡터를 구축하였음.)은 해당 유전자 카르복실 말단에 웨스턴 블롯 분석을 위한 6X 히스티딘 태그(H6)를 추가하였다. 또한, PrdB 단백질의 효율적인 발현을 위해 셀레노시스테인이 도입되는 코돈(UGA)이 정지코돈으로 인식되지 않도록 시스테인 코돈(UGT)으로 치환한 뒤 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NdeI, XhoI의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였다.
이를 바탕으로 pCDFDuet-1 벡터와 상기 합성된 유전자를 제한효소 NdeI/XhoI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6 발현 벡터를 구축하였다.
4-5: LsPrdH 단백질 도입을 통한 LsPrdA 자가절단 확인 - 웨스턴 블롯 분석
상기와 같이 구축된 LsPrdA 단백질 발현벡터(pETDuet_H6-LsprdA-H6) 와 LsPrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)의 조합, 또는 LsPrdA 및 LsPrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_LsprdH_H6-LsprdA-H6)와 LsPrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_LsprdB(U151C)-H6)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 2가지 조합의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리를 통해 상등액을 분리하여 웨스턴 블롯 분석을 진행하였다.
실험 결과 LsPrdA 단백질 및 LsPrdB(U151C) 단백질을 동시 발현한 경우 절단되지 않은 형태의 LsPrdA 단백질(Pro-LsPrdA 단백질)과 LsPrdB 단백질의 발현이 되었으며, 동시에 LsPrdA 단백질의 비특이적 분해 현상을 확인하였다(도7, lane1). 반면, LsPrdH 단백질과 동시 발현한 경우 Pro-LsPrdA 단백질이 감소함과 동시에 추가적인 단백질 밴드가 확인된 결과로부터 LsPrdA 단백질의 자가 절단 현상을 확인할 수 있었다(도7, lane2). LsPrdH 단백질은 기 확보된 PrdH 단백질과 약 55% 수준의 아미노산 서열 상동성을 갖지만 게놈 구조 상에 prdA 유전자와 prdB 유전자 사이에 위치하고 있는 유전자 ORF로 코딩된다는 동일한 특성을 가지고 있다.
이를 통해 상대적으로 낮은 수준의 서열 상동성을 갖지만 게놈 구조 상 유사한 위치에 존재하고 있는 두 단백질(PrdH 및 LsPrdH 단백질)의 기능이 동일하다는 것을 확인하였으며, 균주의 종류 및 서열 상동성과 상관 없이 활성형 D-프롤린 리덕타제의 생산을 위해 필수 단계인 PrdA 단백질의 자가 절단 과정을 유도하는 PrdH 단백질의 범용적 기능성을 확인하였다.
실시예 5: D-프롤린 리덕타제 오페론이 전체 발현된 단백질의 활성 평가 - PrdDEE 2 단백질과의 동시발현
활성이 확인된 D-프롤린 리덕타제를 대상으로 다른 prd 오페론 내 단백질들의 영향을 평가하기 위해 추가적인 동시 발현을 진행하였다. 그 첫 단계로 PrdDEE2 단백질들의 동시 발현을 진행하였다.
5-1: PrdA, PrdH 및 PrdDEE 2 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터 (pETDuet_prdH_prdADEE 2 )의 제작
펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 PrdD 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY7, UniProtKB, 서열번호 7 / 염기서열: CD630_32400, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 8), PrdE 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY2, UniProtKB, 서열번호9 / 염기서열: CD630_32390, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호10), 및 PrdE2 단백질 (아미노산 서열: Q17ZY3, UniProtKB, 서열번호 11 / 염기서열: CD630_32380, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 12)의 각 유전자들을 PrdA 단백질과 동시에 발현할 수 있도록 각 유전자 사이에 리보솜 결합 서열(ribosome binding site)을 첨가한 뒤, 양 말단에 NdeI/XhoI 조합의 제한 효소 서열을 추가하여 합성(prdADEE2)을 진행하였다. 구체적으로, 실시예 1-4에서 기 구축된 pETDuet_prdH_H6-prdA-H6 발현 벡터와 합성된 prdDEE 2 유전자를 제한효소 NdeI/XhoI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pETDuet_prdH_prdADEE2 발현 벡터를 구축하였다.
5-2: PrdA, PrdB, PrdH 및 PrdDEE 2 단백질의 동시 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인- TLC 분석
PrdADEE2 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdADEE2)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다.
상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M phosphate buffer(pH 8.0)에 희석하였다.
다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, DTT(최종 농도 25mM) 및 D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가하한 뒤, 6 시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.
그 결과 PrdAHB 단백질 조합 대비 PrdAHBDEE2 조합의 경우에서 TLC 상의 5-아미노발레릭산 스팟 크기가 상대적으로 더 클 뿐만 아니라 D-프롤린 리덕타제의 초기 반응 속도 역시 빠른 확인하였으며(도 6, lane3), 이러한 결과를 통해 PrdDEE2 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대를 유도한다는 사실을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 추가적인 PrdC 단백질 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인
다음 단계로 PrdC 단백질의 동시 발현을 진행하였다. D-프롤린 리덕타제의 경우 NADH를 소모해서 전환 반응을 진행하는 것으로 알려져 있으며, PrdC의 경우 상기 NADH를 통한 전자 전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에, PrdC 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 전자 전달에 기여하게 될 것이다. 이에, PrdC단백질의 효과를 확인하기 위해서 환원제인 DTT 유무에 따른 실험을 진행하였다.
6-1: PrdC 단백질 발현 벡터 (pACYCDuet_selA-prdC_selB)의 제작
펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 PrdC 단백질 (아미노산 서열: Q17ZZ2, UniProtKB, 서열번호 13 / 염기서열: CD630_32470, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 14)의 유전자를 기존 D-프롤린 리덕타제 발현 시스템에 첨가하기 위해서, SelA 및 SelB 단백질과 동시에 발현할 수 있도록 벡터를 제작하였다. selA와 prdC 유전자 사이에 리보솜 결합 서열(ribosome binding site)를 첨가한 뒤, 양 말단에 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 추가하여 합성(selA-prdC)을 진행하였다. 기 구축된 pACYCDuet_selA_selB 발현 벡터와 합성된 selA-prdC 유전자를 제한효소 NcoI/NotI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pACYCDuet_selA-prdC_selB 발현 벡터를 구축하였다.
6-2: PrdA, PrdB, PrdH 및 PrdC 단백질의 동시 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인- TLC 분석
PrdADEE2 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdADEE2)와 PrdB 및 PrdC 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다.
상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH8.0)에 희석하였다. 이의 대조군으로는 실시예 5의 PrdADEE2 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdADEE2)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)가 동시 발현된 대장균을 사용하였다. 다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가한 뒤 DTT(최종 농도 25mM)의 유무에 따라 6시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.
반응 결과 DTT를 첨가한 경우에 비해 상대적으로 낮은 반응 속도가 확인되었지만, PrdC 단백질이 존재하는 경우에서만 DTT가 첨가되지 않은 조건임에도 불구하고 D-프롤린이 전환되어 5-아미노발레릭산이 생산되는 것을 확인하였다(도8, lane2). 이를 통해 PrdC 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 전자 전달에 기여한다는 사실을 확인하였으며, 추가적인 환원제(DTT) 첨가 없이 세포 내 NADH 등의 환원력을 활용하여 전환 반응이 가능함을 확인하였다.
실시예 7: 추가적인 prdG 단백질 발현 및 D-프롤린 리덕타제 의 활성 증대 확인
PrdG 단백질은 막단백질로 추정되지만 정확한 기능에 대해서는 현재까지 보고된 바 없다.
7-1: PrdG 및 PrdB 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터(pCDFDuet_prdG_prdB-P selC _selC)의 제작
펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 PrdG 단백질(아미노산 서열: Q17ZY0, UniProtKB, 서열번호 15 / 염기서열: CD630_32360, NCBI GeneBank AM180355.1; 서열 데이터베이스 상 PrdG 단백질로 명명되어 있지는 않지만 C. sticklandii PrdG 단백질의 상동성을 기반으로 PrdG 단백질이라 명명, 서열번호 16)의 염기 서열을 대상으로 아미노 말단과 카르복실 말단에 각각 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 갖는 유전자를 합성하였으며, 합성된 prdG 유전자와 기 구축된 pCDFDuet_prdB-PselC_selC 벡터를 NcoI/NotI 제한효소를 이용하여 특이적으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 PrdG 단백질과 PrdB 단백질을 동시에 발현할 수 있는 벡터(pCDFDuet_prdG_prdB-PselC_selC)를 구축하였다.
7-2: PrdA, PrdB, PrdH 및 PrdCG 단백질의 동시 발현 및 D-프롤린 리덕타제의 활성 증대 확인- TLC 분석
PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdB 단백질 발현 벡터 조합(pCDFDuet_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB), 또는 PrdA 와 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdB 및 PrdCG 단백질 동시 발현 벡터 조합 (pCDFDuet_prdG_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB)의 동시 발현을 진행하였다.
상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M 포스페이트 버퍼(phosphate buffer, pH8.0)에 희석하였다.
PrdG 단백질이 막단백질인 것을 고려하여 PrdAHB 조합 및 PrdAHBCG 조합을 대상으로, 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, D-프롤린(최종 농도 10mM)을 첨가한 뒤 DTT(최종 농도 25mM)의 유무, 1% 글루코스의 유무에 따라 상기 전세포 반응뿐만 아니라 동일한 OD 조건에서 배양 균체의 파쇄액 및 이를 원심분리 하여 획득한 상등액에 대한 추가적인 반응을 동일하게 진행하였으며, 6시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다.
실험 결과, PrdC 단백질이 추가되어 있는 PrdAHBCG 조합의 경우 DTT 유무와 상관 없이 활성이 나타남을 재확인하였으며(도9, wo, lane4 내지 6), 특이적으로 균체 파쇄액의 상등액을 대상으로 DTT를 첨가하여 반응을 진행한 경우 PrdAHBCG 조합의 경우에서 PrdAHB 조합에 비해 상대적으로 낮은 수준의 활성을 확인하였다(도 9, DTT, lane6).
이를 통해 발현된 D-프롤린 리덕타제가 원심 분리를 통해 상당 부분 제거된 것을 확인할 수 있으며, 이는 막단백질의 특성을 지닌 PrdG 단백질과의 결합으로 인해 원심 분리 시 침전 후 제거된 것임을 알 수 있다. 또한 DTT를 기반으로 하는 전환 반응의 경우 전세포 및 세포 파쇄액에서 PrdAHB 및 PrdAHBCG 조합 모두 유사한 수준의 활성을 나타냈지만, DTT의 첨가 없이 NADH 공급을 증대하기 위해 1% 글루코스만 첨가한 경우 PrdAHBCG 조합의 경우에서만 활성이 확인되었다(도 9, 1% glucose). PrdC 단백질이 NADH 이용성과 관계가 있다는 실시예 6의 실험 결과를 바탕으로 PrdG 단백질은 PrdC 단백질과의 연계를 통해 세포 내 NADH의 활용이 용이한 D-프롤린 리덕타제 복합체를 형성을 유도한다는 것을 알 수 있다. 즉, DTT와 같은 환원제를 사용할 경우 매개 단백질의 유무와 상관 없이 D-프롤린 환원효소에 직접적으로 전자 전달이 가능하지만, 외부에서 첨가된 환원제 없이 세포 내 NADH를 사용할 경우 전자 전달을 도와줄 수 있는 매개 단백질(PrdC 단백질)이 필요하며, 효율적인 전자 전달 시스템의 구축을 위해 PrdG 단백질이 D-프롤린 리덕타제의 집적도를 높이는 기능을 수행함으로써 활성 개선 효과를 유도하는 것으로 판단된다.
실시예 8: 보조 단백질 PrdH를 이용해 D-프롤린으로부터 5-아미노발레릭산을 생산하는 균주 제조
8-1: 5-아미노발레릭산의 생산 균주의 제작
미생물이 당원으로부터 5-아미노발레릭산을 생산하기 위해서는 D-프롤린 리덕타제의 기질인 D-프롤린이 공급되어야 한다. 하지만 대장균의 경우 D-프롤린을 생산하는 생합성 경로가 없기 때문에 L-프롤린을 D-프롤린으로 전환한 뒤, 이를 활용하는 방향으로 대사 경로를 설계하였다. 구체적으로, 프롤린 이성질체 형성능을 갖는 프롤린 라세메이즈(proline racemase)가 동시에 존재해야 한다. 따라서 본 출원에서는 기공지 기술인 프롤린 라세메이즈의 도입(Rudnick et al., Biochemistry, 1975, 14(20), 4515-4522)을 통해 실험을 진행하였다.
이를 위해 펩토클로스트리디움 디피실리 630 (클로스트리디움 디피실리630) 유래 프롤린 라세메이즈 단백질(아미노산 서열: Q17ZY4, UniProtKB, 서열번호 17 / 염기서열: CD630_32370, NCBI GeneBank AM180355.1, 서열번호 18)의 유전자 prdF를 기존 D-프롤린 리덕타제 발현 시스템에 첨가하기 위해서 PrdG 단백질과 동시에 발현할 수 있도록 각 유전자 사이에 리보솜 결합 서열(ribosome binding site)를 첨가한 뒤, 양 말단에 NcoI/NotI 조합의 제한 효소 서열을 추가하여 합성(prdGF)을 진행하였다.
기 구축된 pCDFDuet_prdG_prdB-PselC_selC 발현 벡터와 합성된 prdGF 유전자를 제한효소 NcoI/NotI 조합으로 절단한 후, 아가로스 젤 분리를 통해 각각의 유전자 절단을 확보하여 T4 라이게이즈 효소 반응을 통해 pCDFDuet_prdGF_prdB-PselC_selC 발현 벡터를 구축하였다.
8-2: 활성 D-프롤린 리덕타제에 의한 5-아미노발레릭산의 생산 확인 - LC/MS 및 TLC 분석
PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdBCG(pCDFDuet_prdG_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터)의 조합, 그리고 PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdBCGF 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdGF_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터)의 조합 발현을 진행하였다. 상기 2가지 조합의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite와 1%의 글루코스(NADH 강화)를 공급한 뒤, 30℃, 200 rpm에서 24시간을 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 획득한 배양액을 대상으로 LC/MS 및 TLC 분석을 진행하였다.
실험 결과 프롤린 라세메이즈가 존재하는 경우에서 약 67.7ppm의 5-아미노발레릭산을 확인하였으며(도10, lane3), 프롤린 라세메이즈가 존재하지 않는 경우에는 5-아미노발레릭산이 전혀 생산되지 않는 것을 확인하였다(도 10, lane1 내지 2). 즉, 생산된 5-아미노발레릭산은 첨가된 당원으로부터 대장균 내의 대사과정을 거쳐 L-프롤린이 생산된 뒤, 프롤린 라세메이즈에 의해 D-프롤린 형태로 전환되어 최종적으로 도입된 활성형 D-프롤린 리덕타제에 의해 5-아미노발레릭산이 생산되었음을 확인할 수 있다.
8-3: 배양 배지 내 첨가된 D-프롤린으로부터 5-아미노발레릭산 생산
당원으로부터 직접 발효를 통해 5-아미노발레릭산을 생산하는 공정 외에 활성형 D-프롤린 리덕타제를 포함하는 미생물의 배양 중에 외부에서 추가된 D-프롤린을 5-아미노발레릭산으로 전환시키기 위한 실험을 진행하였다.
구체적으로, 배양 배지 내에 첨가된 D-프롤린으로부터 5-아미노발레릭산의 생합성 가능 여부를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 이를 위해 기 구축된 PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdBCG 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdG_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA-prdC_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 및 1%의 글루코스를 공급한 뒤, 5mM D-프롤린의 유무에 따라 30℃, 200 rpm에서 24시간을 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 획득한 배양액을 대상으로 LC/MS 분석을 진행하였다.
분석 결과 D-프롤린을 첨가하지 않은 경우 5-아미노발레릭산이 확인되지 않았지만 5mM의 D-프롤린을 첨가한 경우 HPLC(Shimadzu) 분석을 통해 평균 196.7ppm (1.68mM)의 5-아미노발레릭산의 생산이 확인되었다.
실시예 9: D-프롤린 리덕타제 기반 D-프롤린 유사 기질 평가
구축된 활성형 D-프롤린 리덕타제의 활성을 추가 확인하기 위해 프롤린 이외의 다양한 기질을 대상으로 전환 반응을 진행하였다. 본 실시예에서, D-프롤린 리덕타제의 기질로는 D-프롤린과 유사한 구조를 갖는 D-아제티딘-2-카르복실산(D-azetidine-2-carboxylic acid, D-Aze), D-프롤린의 링 구조에 하이드록실 그룹(-OH)이 추가된 형태의 cis-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline), trans-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline)이 사용되었다.
이를 위해 기 구축된 PrdA 및 PrdH 단백질 발현 벡터(pETDuet_prdH_prdA)와 PrdB 단백질 발현 벡터(pCDFDuet_prdB-PselC_selC 및 pACYCDuet_selA_selB 벡터 조합)의 동시 발현을 진행하였다. 상기 3종류의 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환 하였으며, 항생제(암피실린 0.1mg/ml, 스펙티노마이신 50μg/ml, 클로람페니콜 30μg/ml)가 포함되어 있는 LB 배지에서 배양을 진행하였다 (37℃, 200 rpm). 그리고 목적 단백질의 과발현을 유도하기 위해서 OD600 값이 0.5~0.6에 도달했을 때 0.1 mM IPTG를 첨가하였으며, 10 μM sodium selenite 공급한 뒤, 16시간을 추가로 배양하였다. 획득된 대장균 균체를 최종 OD를 50으로 보정하여 원심분리를 진행한 뒤, 1차 washing 후 1mL의 0.1M phosphate buffer(pH8.0)에 희석하였다. 다음 단계로 희석된 각각의 샘플 200ul을 분주하여, DTT(최종 농도 25mM) 및 다양한 기질(최종 농도 10mM, 도 11A)을 첨가한 뒤, 6 시간 동안의 반응 뒤에 TLC 분석을 진행하였다. D-아제티딘-2-카르복실산은 D-프롤린 대비 하나의 탄소가 부족한 4각 링 형태의 구조를 가지며, D-프롤린 리덕타제에 의해 전환 반응이 진행될 경우 γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA)이 생성된다. 반응 결과, D-아제티딘-2-카르복실산의 경우 D-프롤린 대비 상대적으로 낮은 반응 속도를 보이지만 TLC 상에서 뚜렷한 GABA의 생산을 확인할 수 있다(도 11B, lane6).
cis-4-하이드록시-D-프롤린(cis-4-hydroxy-D-Proline) 또는 trans-4-하이드록시-D-프롤린(trans-4-hydroxy-D-Proline) 은 전환 반응이 진행될 경우 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산(5-amino-4-hydroxypentanoic acid)가 생성된다. 반응 결과, D-프롤린 대비 상대적으로 낮은 반응 속도를 보이지만 하이드록실 그룹의 이성질체 형상과 상관 없이 TLC 상에서 기질 감소와 더불어 새롭게 생성된 TLC 스팟을 확인할 수 있다(도 11C, lane5 및 lane8).
이를 통해 발현된 활성형 D-프롤린 리덕타제의 경우 기존에 알려진 D-프롤린 뿐만 아니라 링 구조의 크기가 다른 기질뿐만 아니라 추가적인 변형이 이루어진 유사 기질에 대해서도 전환 반응이 가능하다는 것을 확인할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2018007914-appb-I000001

Claims (24)

  1. PrdA 단백질, PrdB 단백질 및 PrdH 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 PrdA단백질 및 PrdB단백질를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF로부터 코딩된 단백질인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 추가적으로 PrdD, PrdE 및 PrdE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  7. 제1항에 있어서, 추가적으로 PrdC, PrdG 및 PrdF로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아속 미생물인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 미생물 또는 배지로부터 활성형 D-프롤린 리덕타제를 회수하는 단계;
    를 포함하는 활성형 D-프롤린 리덕타제를 생산하는 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 미생물 또는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 미생물이 생산하는 프롤린 리덕타제를 이용하여 아미노발레릭산(5-aminovaleric acid, 5-AVA), γ-아미노부티릭산(γ-aminobutyric acid, GABA) 및 5-아미노-4-하이드록시펜타노익산 (5-amino-4-hydroxypentanoic acid)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 생산하는 방법.
  12. PrdA 단백질 및 PrdB 단백질과 동시 발현되어, 비활성형 D-프롤린 리덕타제를 활성형 D-프롤린 리덕타제로 전환시키는 활성을 갖는 PrdH 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, PrdH 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, PrdH 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, PrdH 단백질.
  16. prdA 또는 prdA와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
    prdB 또는 prdB와 prdH 유전자를 포함하는 발현카세트를 숙주세포에 형질전환하는 단계;
    를 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 PrdA 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 PrdB 단백질은 서열번호 5 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 PrdA단백질 및 PrdB단백질를 코딩하는 유전자 사이에 존재하는 유전자 ORF로부터 코딩된 단백질인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 PrdH 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  21. 제16항에 있어서, 추가적으로 PrdD, PrdE 및 PrdE2로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  22. 제16항에 있어서, 추가적으로 PrdC, PrdG 및 PrdF로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질의 활성이 강화된, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아속 미생물인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
  24. 제16항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인, 활성형 D-프롤린 리덕타제를 발현하는 미생물을 제조하는 방법.
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