WO2012087039A2 - 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 및 이를 발현하는 미생물 - Google Patents

호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 및 이를 발현하는 미생물 Download PDF

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    • C12Y203/01031—Homoserine O-acetyltransferase (2.3.1.31)

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide modified to have homoserine acetyl transferase activity, a polynucleotide encoding the same, a recombinant vector comprising the polynucleotide, a microorganism transformed with the recombinant vector and O-acetyl homoserine using the microorganism. It relates to a production method.
  • Methionine is one of the essential amino acids in vivo and is widely used in feed and food additives. It is also used as a synthetic raw material for fluids and pharmaceuticals. Methionine acts as a precursor to compounds such as choline (lecithin) and creatine, and is also used as a synthetic material for cysteine and taurine. Methionine also serves to provide sulfur.
  • S-adenosyl-methionine is derived from L-methionine and serves to provide methylation in vivo and is involved in the synthesis of various neurotransmitters of the brain.
  • Methionine and / or S-adenosyl-L-methionine (SAM) plays a variety of roles in vivo, such as inhibiting fat accumulation in the liver and arteries and alleviating depression, inflammation, liver disease, myalgia, and the like.
  • methionine can be produced through chemical synthesis and biological synthesis for use in food and pharmaceuticals, including animal feed.
  • US Patent Publication No. 2005 / 0054060A1 of 2005 discloses a method for producing L-methionine, which is a method of producing L-methionine, by applying a mutation to cystathionine synthase to produce microorganisms, and directly using H 2 S without cysteine. Or a method of synthesizing homocysteine or methionine using CH 3 SH. In this method, mutated cystathionine synthase was introduced directly into cells to synthesize methionine according to intracellular methionine synthesis.
  • the present inventors have developed a two-step process for producing L-methionine by the enzymatic conversion reaction from the L-methionine precursor (PCT / KR2007 / 003650). In this way, the problem of cytotoxicity caused by H 2 S or CH 3 SH and the problem of inhibiting metabolic processes by generated L-methionine could be solved. In addition, there is a feature that can selectively produce only L-methionine, not a mixed form of D-methionine and L-methionine.
  • O-succinyl homoserine and O-acetyl homoserine which may be used as methionine precursors, may be used.
  • O-acetyl homoserine is advantageous over O-succinyl homoserine in terms of production yield of methionine relative to the precursor. Specifically, O-acetyl homoserine can produce only 0.91 mole of methionine from 1 mole, whereas O-succinyl homoserine can produce only 0.67 mole of methionine from 1 mole.
  • O-acetyl homoserine as a methionine precursor can reduce the final production cost of methionine, so it is very important to produce high yield of O-acetyl homoserine for economic mass production of methionine.
  • microorganisms use O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine as methionine precursors, and specifically, genus Escherichia, enterobacteria, Salmonellar, In the case of Bacillus sp.
  • O-succinyl-homoserine is synthesized from homoserine and succinyl-coA by homoserine succinyl transferase (L-homoserine O-succinyl transferase).
  • the present inventors have studied to produce a strain of the genus Escherichia that produces O-acetyl homoserine, which is advantageous in terms of yield of methionine, without introducing foreign genes.
  • the mutant polypeptide in which the 111th amino acid of succinyl homoserine transferase was substituted with glutamic acid it was confirmed that homoserine succinyl transferase activity was converted to homoserine acetyl transferase activity and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector operably linked to the polynucleotide.
  • Still another object of the present invention is to provide a microorganism comprising the polynucleotide.
  • Still another object of the present invention is to provide a microorganism transformed with a recombinant vector to which the polynucleotide is operably linked.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing O-acetyl homoserine using a microorganism expressing a variant polypeptide having homoserine acetyl transferase activity.
  • O-acetyl homoserine can be produced from homoserine without introducing a foreign gene into a microorganism expressing an enzyme that converts homoserine to O-succinyl homoserine. It can be used as a precursor for methionine production. Therefore, if the present invention is applied to produce a methionine product used for food, there is an advantage that can solve the problem of demonstrating safety against consumer anxiety, poor recognition and foreign gene introduction for foreign gene introduction. .
  • FIG. 1 shows a recombinant vector operably linked to a polynucleotide encoding a variant polypeptide according to the present invention.
  • FIG. 2 is a comparison of homology of homoserine O-succinyl transferase amino acid primary sequence in E. coli variants.
  • Comparisons include wild type homoserine O-succinyl transferase, feedback deregulated variant homoserine O-succinyl transferase met10A, met11A, and PCT publication (WO 2005/108561) disclosed in PCT Publication (WO 2008/127240). Feedback deregulated variant homoserine O-succinyl transferase.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the production of an FRT-one step deletion cassette using an overlapping PCR method to replace the acs promoter in the chromosome with the pro promoter.
  • the present invention provides a homonucleotide wherein the 111th amino acid is substituted with glutamic acid from the starting methionine of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide having at least 95% homology with the polypeptide sequence.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 or a polypeptide having at least 95% homology with the polypeptide sequence.
  • variant polypeptides having serine O-acetyl transferase activity are provided.
  • polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity is prepared by using homoserine and succinyl-coA present in the methionine biosynthetic pathway, as shown in the reaction scheme shown below.
  • a polypeptide having the activity of synthesizing O-succinyl homoserine is meant.
  • the polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity may be a polypeptide derived from the genus Enterobacteria, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, Escherichia, preferably from Escherichia microorganisms. It may be a polypeptide having homoserine succinyl transferase activity, more preferably a polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity from E. coli.
  • the polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity is a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 having homoserine succinyl transferase activity or a polypeptide having the activity shown in the above scheme. Polypeptides having at least% homology may also be included.
  • the homology of the homoserine O-succinyl transferase amino acid sequences of the E. coli strains was compared.
  • the homoserine O-succinyl transferase polypeptide present in the E. coli strains was less than 5%.
  • variants comprising the variants (ie, having at least 95% homology with each other), it can be seen that there is no significant difference in homoserine O-succinyl transferase activity (FIG. 2).
  • polypeptides having 95% or more homology with the polypeptide of SEQ ID NO: 17 of the present invention may have the same homoserine O-succinyl transferase activity.
  • the term “variant polypeptide” refers to a polypeptide having homoserine O-acetyl transferase activity unlike wild type by substituting a part of an amino acid sequence of a polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity.
  • the variant polypeptide of the present invention converts substrate specificity from succinyl-coA to acetyl-coA by replacing some amino acids of the polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity.
  • it means a variant polypeptide showing the same activity as the following scheme.
  • the variant polypeptide is substituted with glutamic acid at the 111th amino acid from the starting methionine of the polypeptide represented by SEQ ID NO: 17 or a polypeptide having at least 95% homology with the polypeptide sequence (SEQ ID NO: 18), and further
  • the 112 th amino acid may be a variant polypeptide substituted with threonine (SEQ ID NO: 19) or histidine (SEQ ID NO: 20).
  • the variant polypeptide may be a polypeptide having any one amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 to 20.
  • a plasmid capable of expressing a polypeptide substituted with glutamic acid glycine No. 111 of the homoserine succinyl transferase encoded by the metA gene derived from E. coli consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 39 and
  • a plasmid capable of expressing a polypeptide in which amino acid 112 was substituted with threonine or histidine was prepared (Example 2).
  • the microorganism expressing the variant polypeptide of the present invention has the advantage of producing high production yield of O-acetyl homoserine as a methionine precursor without introducing a foreign gene for displaying homoserine acetyl transferase activity.
  • the variant polypeptide may be a variant polypeptide in which some amino acids of the polypeptide having homoserine succinyl transferase activity are substituted to release feedback control to methionine.
  • the mutant polypeptide of the present invention is overproduced with O-acetyl homoserine.
  • it may be a variant polypeptide in which feedback regulation to methionine is released.
  • the amino acid substitution for releasing the feedback regulation for the methionine can be carried out according to the method disclosed in PCT Publication (WO 2008/127240), specifically of the polypeptide having homoserine succinyl transferase activity
  • Feedback control for methionine can be released through substitution of amino acid 29 with proline, substitution of amino acid 114 with glycine, substitution of amino acid 140 with serine, or amino acid substitution of one or more of the three amino acid substitutions. have.
  • two or more, most preferably all three amino acids may be substituted.
  • the variant polypeptide deregulated feedback to the methionine may be a variant polypeptide having any one of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 to 23.
  • amino acids 29, 114 and 140 of the polypeptide having homoserine succinyl transferase activity encoded by the metA gene derived from E. coli are replaced with proline, glycine and serine, respectively, to control feedback on methionine.
  • [pCL_Pcj1_metA # 11 (ET)] in which amino acids 111 and 112 were substituted with glutamic acid and threonine, respectively, and 111 and 112, respectively.
  • CJM2 pCL_Pcj1_metA (# 11) EH strain and CJM3 in which amino acids 111 and 112 were substituted with glutamic acid and histidine, respectively, among strains expressing a variant polypeptide in which feedback control to methionine was released
  • O-acetyl homoserine production of pCL_Pcj1_metA (# 11) EH strain was 11.1 g / L and 24.8 g / L, showing high production of O-acetyl homoserine, which is similar to the strain introducing the foreign homoserine acetyl transferase gene. It was confirmed that O-acetyl homoserine accumulated at the level (Experimental Example 2, Tables 2 and 3).
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the variant polypeptide, or a recombinant vector to which the polynucleotide is operably linked.
  • the polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are long chained by covalent bonds and are strands of DNA or RNA having a predetermined length or more, and are polynucleotides encoding the variant polypeptides. .
  • the polynucleotide may be a polynucleotide having any one nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24 to 29.
  • the recombinant vector is a means for expressing a variant polypeptide by introducing DNA into a host cell to make a microorganism expressing the variant polypeptide of the present invention, a plasmid vector, a cosmid vector, a bacteriophage vector and the like.
  • a plasmid vector a plasmid vector
  • cosmid vector a bacteriophage vector
  • Known expression vectors can be used, and the vectors can be readily prepared by those skilled in the art according to any known method using DNA recombination techniques.
  • the recombinant vector may use pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 vectors, preferably pCL1920 vector.
  • “Operably linked” refers to that expression control sequences are linked to regulate transcription and translation of the polynucleotide sequence encoding the variant polypeptide, wherein the polynucleotide sequence is expressed under the control of an expression control sequence (including a promoter) to Maintaining an accurate frame of translation such that a variant polypeptide encoded by the sequence is produced.
  • the present invention provides a microorganism comprising a polynucleotide encoding the variant polypeptide and a microorganism transformed with a recombinant vector operably linked to the polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the term "transformation” means that the gene is introduced into the host cell to be expressed in the host cell, and if the transformed gene can be expressed in the host cell, the insertion into the chromosome of the host cell Or located outside the chromosome without limitation.
  • the gene also includes DNA and RNA as polynucleotides capable of encoding a polypeptide.
  • the gene may be introduced in any form as long as it can be expressed by being introduced into a host cell.
  • the gene may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a polynucleotide construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette typically includes a promoter, transcription termination signal, ribosomal binding site, and translation termination signal operably linked to the gene.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the gene may be introduced into the host cell in the form of a polynucleotide structure itself or operably linked to a sequence required for expression in the host cell.
  • the microorganism is a prokaryotic or eukaryotic microorganism comprising a polynucleotide encoding a variant polypeptide, or transformed into a recombinant vector operably linked to a polynucleotide encoding a variant polypeptide, to express the variant polypeptide
  • the microorganism is a microorganism expressing a polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity, for example, the genus Bacillus, Escherichia, Enterobacteria, Salmonella, and preferably It may be a microorganism of the genus Escherichia, more preferably E. coli.
  • the E. coli CJM2 pCL_Pcj1_metAEL, CJM2 pCL_Pcj1_metAET, CJM2 pCL_Pcj1_metAEH strain (Example 2 and Experimental Example 2) and methionine transformed with a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a variant polypeptide of the present invention.
  • CJM2 pCL_Pcj1_metA (# 11) EL, CJM2 pCL_Pcj1_metA (# 11) ET, CJM2 pCL_Pcj1_metA (# 11) EH strains were named CA05-0546, CA05-0547 and CA05-0548, respectively. He deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on Sunday and was given accession numbers KCCM11145P, KCCM11146P and KCCM11147P, respectively.
  • the present invention provides a variant polypeptide having homoserine O-acetyl transferase activity in which some amino acids of the polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity are substituted, thereby providing a polypeptide having homoserine O-succinyl transferase activity.
  • the microorganism may further enhance the activity of acetyl-CoA synthetase or the activity of pantothenate kinase in order to overproduce O-acetyl homoserine. It may be a microorganism modified to release feedback inhibition by accumulation.
  • acetyl-CoA synthetase and pantothenate kinase can be derived from various microorganisms, and genes encoding proteins having this activity are collectively referred to as acs and coaA, respectively.
  • acetyl-CoA synthetase activity enhancement can enhance gene expression by modifying the promoter region of the acs gene encoding the acetyl-CoA synthetase and the nucleotide sequence of the 5'-UTR region, By introducing mutations into the ORF region of a gene, the activity of the protein can be enhanced, and by introducing the gene further on the chromosome, the expression level of the protein can be enhanced, and the gene is linked to a self-promoter or a separate promoter with enhanced activity. By introducing together, the strain can be transformed to enhance the expression level of the protein.
  • the present invention can enhance the acetyl-CoA synthetase activity through substitution of a promoter with enhanced activity, inducing a mutation of the promoter or increasing gene copy number so that activity is enhanced, whereby O-acetyl homo Methods for improving serine production capacity, and E. coli produced using such a method can be provided.
  • promoters such as pTac, pTrc, pPro, pR, pL and the like which are known as promoters having enhanced activity may be used.
  • the present invention can provide an O-acetyl homoserine producing strain, wherein the promoter of acs gene involved in acetyl-CoA biosynthesis is substituted with the pro promoter, which is a constant expression promoter, overexpressing the acs gene.
  • the pro promoter may be used in whole or in part of SEQ ID NO: 30.
  • the present invention may further provide a microorganism into which pantothenate kinase variants have been introduced in which feedback inhibition by CoA accumulation has been released on the CoA biosynthetic pathway. More specifically, the alginine at position 106 in the amino acid sequence of Pantothenate kinase is substituted with alanine (SEQ ID NO: 40) to release feedback inhibition by CoA accumulation, thereby reducing O-acetyl homoserine production ability. Can be improved.
  • the microorganism further comprises a phosphoenolpyruvate carboxylase coding gene (ppc), an aspartate aminotransferase coding gene (aspC) and an aspartate semialdehyde dehydrogenase coding gene (asd).
  • ppc phosphoenolpyruvate carboxylase coding gene
  • aspC aspartate aminotransferase coding gene
  • asd aspartate semialdehyde dehydrogenase coding gene
  • the copy number of one or more genes selected from the group consisting of may be increased, or the promoter of the gene may be a microorganism which is substituted with a promoter having enhanced activity or modified to enhance activity.
  • the above series of enzymes have the activity of synthesizing O-acetyl homoserine from phosphoenolpyruvate as shown in the following scheme.
  • enhanced expression of genes having this series of activities can lead to the accumulation of O-acetyl homoserine in cells.
  • the thrA gene which encodes an enzyme that plays two roles, aspartate kinase and homoserine dehydrogenase, has already been enhanced through feedback release to the CJM2 strain in Experimental Example 2, and the remaining three Enzymes can enhance activity by increasing the copy number of a gene or by replacing a promoter of the gene with a promoter with enhanced activity or by mutating such activity.
  • the term "increasing copy number" may consist of a method of additionally introducing a gene of interest onto a chromosome or introducing a plasmid with the gene of the enzyme.
  • the CJM2 strain which lacks the metA and metB genes, lacks the acs promoter, produces a CJM2-AP strain replaced with a pro promoter, and transforms the trait to have a feedback resistant coaA trait in the CJM2-AP strain.
  • the CJM3 strain After converting the CJM2-AP / CO strain with an excessive increase in the Acetyl-coA pool, the CJM3 strain with two copy amplified copies of three genes, ppc, aspC and asd, was prepared.
  • the CJM3 strains into which pCL_Pcj1_metA # 11 (EL), pCL_Pcj1_metA # 11 (EH) and pCL_Pcj1_metA # 11 (ET) are introduced are named CA05-0578, CA05-0579, and CA05-0580, respectively.
  • the Korean Microbiological Conservation Center was deposited and received accession numbers KCCM11228P, KCCM11229P and KCCM11230P, respectively (Experimental Example 2).
  • the present invention provides a method of culturing a microorganism comprising a polynucleotide encoding the variant polypeptide or a microorganism transformed with a recombinant vector operably linked to the polynucleotide encoding the variant polypeptide, and It provides a method for producing O-acetyl homoserine comprising the step of obtaining O-acetyl homoserine produced in the microbial culture process.
  • the production of O-acetyl homoserine using the microorganism expressing the variant polypeptide may be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • Examples of the culturing method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultivation, and the medium used for culturing may suitably satisfy the requirements of a particular strain.
  • the medium used in the present invention can be used in combination of one carbon source or a carbon source of sucrose, glucose, glycerol, acetic acid, nitrogen source that can be used is peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor and soybean Organic nitrogen sources and urea such as wheat, and inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, anmonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts as phosphorus (P) sources. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate. In addition, amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included, and these media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture. In addition, during culture, compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture, and antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble formation. Can be.
  • oxygen or oxygen containing gas may be injected into the culture to maintain the aerobic state of the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without the injection of gas to maintain the anaerobic and unaerobic state.
  • the temperature of the culture may be 27 °C to 37 °C, preferably 30 °C to 35 °C. The incubation period can continue to be incubated while the desired useful substance is produced, preferably for 10 to 100 hours.
  • Primers used for PCR were prepared on the basis of the NC_000913 Escherichia coli chromosomal sequence registered in the National Institutes of Health (NIH Gene Bank), and primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively, restriction enzyme EcoRV site and HindIII site Have.
  • the metX gene encoding the homoserine O-acetyl transferase (SEQ ID NO: 44) was obtained by PCR using a primer of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 using a chromosome of Deinococcus radiodurans as a template. Amplified.
  • the primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 have restriction enzyme EcoRV sites and HindIII sites, respectively.
  • PCR conditions were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, denatured at 94 ° C. for 30 seconds, annealing at 56 ° C. for 30 seconds, and polymerization was repeated 25 times at 72 ° C. for 25 minutes, followed by polymerization at 72 ° C. for 7 minutes. It was.
  • the pCL1920 plasmid containing the PCR product and cj1 promoter (KR 2006-0068505) thus obtained was cloned by treatment with EcoRV and HindIII restriction enzymes, respectively.
  • transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 50 ⁇ g / ml of specinomycin to obtain a plasmid.
  • the obtained plasmids were named pCL_Pcj1_metA and pCL_Pcj1_metXdr, respectively.
  • the pCL_Pcj1_metA plasmid prepared in Example 1 was substituted with glutamic acid (Glu) as amino acid, glycine (Gly), the 111 amino acid of O-succinyl transferase (G111E).
  • the primer sequence used is as follows.
  • the plasmid containing the produced mutant G111E metA gene was named pCL_Pcj1_metA (EL).
  • amino acid 111 of the O-succinyl transferase was substituted with glutamic acid in glycine and amino acid 112 was further substituted with threonine (L112T) or histidine (L112H) in leucine.
  • the primer sequence used at this time is as follows.
  • the plasmid containing the metA gene in which amino acid 111 was substituted with glycine to glutamic acid and amino acid 112 was replaced with threonine in leucine was named pCL_Pcj1_metA (ET).
  • the plasmid containing the metA gene in which amino acid 111 was substituted for glycine to glutamic acid and amino acid 112 for leucine to histidine was named pCL_Pcj1_metA (EH).
  • a metA gene (metA # 11) having a feedback feedback-releasing property to methionine was prepared using the same method as in Example 2. Specifically, amino acid number 29 of O-succinyl transferase from serine to proline (S29P), amino acid number 114 from glutamic acid to glycine (E114G), 140 according to the contents disclosed in PCT Publication (WO 2008/127240). The amino acid was substituted from phenylalanine to serine (F140S).
  • the primer sequence used at this time is as follows.
  • the plasmid containing the metA # 11 gene in which amino acid 111 was substituted with glyca to glutamic acid, was converted to pCL_Pcj1_metA # 11 (EL), amino acid 111 was glycine to glutamic acid, and amino acid 112 was changed from leucine to threonine.
  • the plasmid containing the metA # 11 gene substituted with pCL_Pcj1_metA # 11 (ET), amino acid 111 from glycine to glutamic acid, and amino acid 112 from leucine to histidine was substituted with pCL_Pcj1_metA # 11. It was named (EH).
  • E. coli O9 H4 (strain HS), E. coli O139: H28 (strain E24377A).
  • amino acid primary sequence of the mutated homoserine O-succinyl transferase in which feedback control to methionine was released was also compared using the above program.
  • the primary sequences compared were wild type homoserine O-succinyl transferase, the feedback deregulated variant homoserine O-succinyl transferase met10A, met11A and PCT publication (WO 2005) disclosed in PCT Publication (WO 2008/127240). / 108561) is a deregulated variant homoserine O-succinyl transferase.
  • homoserine O-succinyl transferase polypeptides present in Escherichia coli have at least 95% homology with each other, and there is no significant difference in homoserine succinyl transferase activity despite a sequence difference of less than 5%. Indicates.
  • CJM2 is a strain capable of producing an excess of homoserine in a strain and producing O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine depending on the gene introduced.
  • the production of homoserine and acetyl coay in E. coli must be smooth.
  • the promoter of the acs (acetyl-coA synthetase) gene is replaced with the constitutive promoter of SEQ ID NO. 30 to induce constant overexpression of the target gene. It was.
  • a modified method of FRT-one-step PCR was used (PNAS (2000) vol. 97: 6640-6645). To prepare a cassette as shown in FIG. 5, the chloramphenicol resistance gene FRT cassette derived from pKD3 (PNAS (2000) vol.
  • 97: 6640-6645 was PCR using SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 32 And PCR of the pro promoter region using SEQ ID NO: 34, and the two PCR products were prepared in one cassette (acs promoter deletion-pro promoter replacement cassette) using the Overlapping PCR method (Nucleic Acids Res. 1988 August 11; 16 (15). ): 7351-7367).
  • the denaturation step was performed at 94 ° C. for 30 seconds, the annealing step at 55 ° C. for 30 seconds, and the extension step at 72 ° C. for 1 minute, which was performed 30 times.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on 1.0% agarose gel, and then DNA was purified from a band of about 1.2 kbp size.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to a CJM2 strain previously transformed with a pKD46 vector (PNAS (2000) vol. 97: 6640-6645).
  • the recovered strains were plated in LB plate medium containing 25 ⁇ g / L chloramphenicol and incubated overnight at 37 ° C. to select strains showing resistance.
  • PCR was carried out under the same conditions using the same primers using the selected strain as a template, followed by confirming that the gene size was observed at 1.2 Kb on the 1.0% agarose gel to confirm the acs promoter deletion and the replacement with the pro promoter.
  • the identified strains were transformed with pCP20 vector (PNAS (2000) vol. 97: 6640-6645) and cultured in LB medium, and the gene size was 150 bp on 1.0% agarose gel through PCR under the same conditions. Smaller final acs promoter deletions and replacement strains with the pro promoter were made and confirmed that chloramphenicol markers were removed.
  • the produced strain was named CJM2-AP.
  • a coaA gene encoding pantothenate kinase was performed by PCR using a primer of SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 containing restriction enzyme EcoRI as a template. Secured.
  • the polymerase was PfuUltra TM high-trust DNA polymerase (Stratagene), and PCR conditions were denatured 96 ° C., 30 seconds; Annealing 50 ° C., 30 seconds; And 30 degreeC of the polymerization reaction 72 degreeC and 2 minutes was repeated.
  • the coaA gene and pSG76C plasmid (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428) obtained by the above method were treated with EcoRI restriction enzyme, respectively, and then linked.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed using the plasmid prepared by the above method, and transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 25 ⁇ g / ml of chloramphenicol to obtain pSG-76C-coaA.
  • PSG-76C-coaA (R106A) was prepared using primers of SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 38 using site directed mutagenesis (Stratagene, USA) method using the obtained pSG-76C-coaA.
  • CJM2-AP strain was transformed into the pSG76C-coaA (R106A) plasmid and cultured in LB-Cm (Yeast extract 10 g / L, NaCl 5 g / L, Tryptone 10 g / L, Chloramphenicol 25 ⁇ g / L) medium Then, colonies with chloramphenicol resistance were selected. Selected transformants are strains in which pSG76c-coaA (R106A) is inserted primarily into the coaA portion of the genome.
  • the strain into which the obtained coaA (R106A) gene was inserted was transformed with pASceP (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428), a vector expressing a restriction enzyme I-SceI that cleaves the I-SceI portion present in pSG76c.
  • Strains growing in LB-Ap Yeast extract 10 g / L, NaCl 5 g / L, Tryptone 10 g / L, Ampicilline 100 ⁇ g / L) were selected.
  • CoaA gene was amplified using the primers SEQ ID NO: 35 and SEQ ID NO: 36 in the selected strains, and the amplified gene was confirmed to have been replaced with coaA (R106) through the Macrogen (Korea) sequencing service (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 22 4409-4415).
  • the strain thus produced was named CJM2-AP / CO.
  • the CJM2-AP / CO strain is a strain that shows an excessive increase in Acetyl-coA pool as well as homoserine.
  • CJM2 or CJM2-AP / CO strain is a strain in which homoserine is overproduced, but in order to further improve the productivity of homoserine, we tried to amplify the copy number of three genes of ppc, aspC and asd.
  • PSG76c-2ppc, pSG76c-2aspC, pSG76c-2asd plasmids were prepared by the methods disclosed in Examples ⁇ 1-1> to ⁇ 1-3> of Korean Patent Publication No. 20112011-0023703, and the above plasmids were introduced into the CJM2-AP / CO strain. In the method of Example ⁇ 1-5>, two copies of the above three genes were sequentially amplified. The strain thus produced was named CJM3.
  • CJM3 is a strain that accumulates more homoserine in the strain than CJM2 strain and can produce O-acetyl homoserine or O-succinyl homoserine depending on the plasmid introduced.
  • CJM2 strains introduced with pCL_Pcj1_metA # 11 (EL), pCL_Pcj1_metA # 11 (EH), and pCL_Pcj1_metA # 11 (ET) were named CA05-0546, CA05-0547 and CA05-0548, respectively, and as of December 2010 14 He deposited with the Korea Microbiological Conservation Center on Sunday and was given accession numbers KCCM11145P, KCCM11146P and KCCM11147P, respectively.
  • CJM3 strains introduced with pCL_Pcj1_metA # 11 (EL), pCL_Pcj1_metA # 11 (EH), and pCL_Pcj1_metA # 11 (ET) were named CA05-0578, CA05-0579 and CA05-0580, respectively, and 12 December 2011.
  • the Korea Microorganism Conservation Center was deposited with KCCM11228P, KCCM11229P, and KCCM11230P, respectively.
  • a flask test was performed to compare the amount of methionine precursor produced by each strain into which nine plasmids were introduced, and the yield.
  • the flask test was performed by streaking each strain in an LB plate and incubating for 16 hours in a 31 ° C. incubator, then inoculating a single colony with 3 ml of LB medium and incubating for 16 hours in a 200 rpm / 31 ° C. incubator. It was.

Abstract

본 발명은 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지도록 변형시킨 폴리펩티드에 관한 것으로, 구체적으로 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 시작 메치오닌으로부터 111번째 아미노산을 치환시킴으로써 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공한다.

Description

호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 및 이를 발현하는 미생물
본 발명은 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지도록 변형된 폴리펩티드, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 이용한 O-아세틸 호모세린의 생산 방법에 관한 것이다.
메치오닌은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며, 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 메치오닌은 콜린 (레시틴)과 크레아틴과 같은 화합물의 전구체로 작용하며, 시스테인과 타우린의 합성원료로도 쓰인다. 또한, 메치오닌은 황을 제공하는 역할을 한다.
S-아데노실-메치오닌은 L-메치오닌으로부터 유래하며 생체 내에서 메칠기를 제공하는 역할을 하며, 뇌의 다양한 신경전달물질 (neurotransmitter)의 합성에 관련되어 있다. 메치오닌 및/또는 S-아데노실-L-메치오닌 (SAM)은 생체 내에서 간과 동맥에서 지방축적을 억제하고 우울, 염증, 간질환, 근육통을 완화하는 등의 다양한 역할을 한다.
이러한 메치오닌은 동물 사료를 비롯한 식품과 의약품에서 이용하기 위하여 화학합성과 생물학적 합성을 통하여 생산할 수 있다.
화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)-하이단토인 (5-(β-methylmercapto ethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메치오닌을 생산한다. 그러나, 이런 화학 합성을 통하여 생산된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산되는 단점이 있다.
생물학적 합성으로, 2005년 미국공개특허 US2005/0054060A1호에는 L-메치오닌을 생산하는 방법으로서, 미생물을 제작하기 위하여 시스타치오닌 신타아제 (cystathionine synthase)에 변이를 가하여 시스테인을 이용하지 않고 직접 H2S 또는 CH3SH를 이용하여 호모시스테인 또는 메치오닌을 합성하는 방법을 개시하였다. 당해 방법에서는 변이된 시스타치오닌 신타아제를 직접 세포에 도입하여 세포내의 메치오닌 합성과정에 따라 메치오닌을 합성하였다. 그러나, 이 방법에서는 세포내의 메치오닌 대사경로를 이용하기 때문에 합성 메치오닌에 의한 저해 작용으로 매우 적은 양의 메치오닌 생산만 가능하며, H2S 또는 CH3SH가 세포에 독성을 유발한다는 점에서 실효성이 떨어지는 문제가 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 L-메치오닌 전구체로부터 효소전환 반응에 의하여 L-메치오닌을 생산하는 이단계 공법을 개발한바 있다(PCT/KR2007/003650). 이와 같은 방법으로 H2S 또는 CH3SH에 의한 세포독성 문제 및 생성된 L-메치오닌에 의한 대사과정 저해 작용 문제가 해결될 수 있었다. 뿐만 아니라, D-메치오닌과 L-메치오닌의 혼합형태가 아닌 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있다는 특징이 있다.
상기의 이단계 공법에서는 메치오닌 전구체로 사용될 수 있는 O-숙시닐 호모세린 (O-succinyl homoserine)과 O-아세틸 호모세린 (O-acetyl homoserine)이 사용될 수 있다. 메치오닌 전환 반응시, 전구체 대비 메치오닌의 생산 수율 측면에서 O-아세틸 호모세린은 O-숙시닐 호모세린에 비하여 유리하다. 구체적으로, O-아세틸 호모세린은 1 몰 (mole)로부터 0.91 몰의 메치오닌을 생산하는데 비하여 O-숙시닐 호모세린의 경우에는 1 몰로부터 0.67 몰의 메치오닌만을 생산할 수 있다. 따라서, O-아세틸 호모세린을 메치오닌 전구체로 사용하면 최종 메치오닌 생산 단가를 낮출 수 있는 효과를 거둘 수 있으므로, 메치오닌의 경제적인 대량 생산을 위하여 O-아세틸 호모세린을 고수율로 생산하는 것이 매우 중요하다.
한편, 미생물은 종류에 따라 메티오닌 전구체로서 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린을 사용하는데, 구체적으로, 에스케리키아 (Escherichia)속, 엔테로박테리아 (enterobacteria)속, 살모넬라 (Salmonellar)속, 바실러스 (Bacillus)속 미생물의 경우에는 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 (L-homoserine O-succinyl transferase)에 의해 호모세린과 숙시닐 코에이 (succinyl-coA)로부터 O-숙시닐-호모세린을 합성하고 (Biochemistry. 1999 Oct 26; 38(43): 14416-23), 코리네박테리움 (Corynerbacterium)속, 렙토스피라 (Leptospira)속, 데이노코쿠스 (Deinococcus)속, 슈도모나스 (Pseudomonas)속, 마이코박테리움 (Mycobacterium)속 미생물의 경우에는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 (L-homoserine O-acetyl transferase)에 의해 호모세린과 아세틸 코에이 (acetyl-coA)로부터 O-아세틸-호모세린을 합성한다(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Mar. 2002, p. 1277-1286).
따라서, 실험용 및 산업용 목적의 재조합 단백질을 생산하기 위하여 유용하게 사용되고 있는 에스케리키아 (Escherichia)속 미생물을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생합성하기 위해서는 외래 유전자 (foreign gene)인 metX 유전자를 도입하여 O-아세틸 호모세린 트랜스퍼라제를 발현해주어야 한다. 하지만, 식품용으로 사용되는 제품을 생산하기 위하여 사용하는 미생물의 경우에는 외래 유전자의 도입에 대하여 소비자의 인식이 좋지 않으며, 외래 유전자 도입에 대한 안전성을 증명해야 하는 문제점을 가질 수 있다.
이에, 본 발명자들은 메치오닌 생산수율 측면에서 유리한 O-아세틸 호모세린을 외래 유전자의 도입 없이 생산하는 에스케리키아 (Escherichia)속 균주를 제작하기 위하여 연구한 결과, 대장균 (E. coli) 유래의 O-숙시닐 호모세린 트랜스퍼라제의 111번째 아미노산을 글루탐산으로 치환한 변이형 폴리펩티드의 경우, 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성이 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성으로 변환되었음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라아제 (Homoserine O-Succinyl transferase) 활성을 가지는 폴리펩티드를 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지도록 변형시킨 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 호모세린을 O-숙시닐 호모세린으로 전환하는 효소를 발현하는 미생물에 외래 유전자를 도입하지 않고도, 호모세린으로부터 O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있으며, 상기 O-아세틸 호모세린은 메치오닌 생산을 위한 전구체로서 이용될 수 있다. 따라서, 식품용으로 사용되는 메치오닌 제품을 생산하기 위하여 본 발명을 적용하면, 외래 유전자 도입에 대한 소비자의 불안, 좋지 않은 인식 및 외래 유전자 도입에 대하여 안전성을 증명해야 하는 문제점을 해결할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 대장균 변이체 (variants)에서 나타나는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 아미노산 1차 서열의 상동성을 비교한 도면이다.
도 3 및 도 4는 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 아미노산 1차 서열의 상동성을 비교한 도면이다. 비교 대상은 야생형 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제, PCT 공개특허 (WO 2008/127240)에 개시된 피드백 조절 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 met10A, met11A, 및 PCT 공개특허 (WO 2005/108561)에 개시된 피드백 조절 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제이다.
도 5는 염색체 내 acs 프로모터를 pro 프로모터로 교체하기 위하여 overlapping PCR 방법을 사용한 FRT-one step deletion 카세트 제작 도이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드의 시작 메치오닌으로부터 111번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드는 하기에 나타낸 반응식과 같이, 메치오닌 생합성 경로에 존재하는 호모세린 (homoserine)과 숙시닐-코에이 (succinyl-coA)를 이용하여 O-숙시닐 호모세린 (O-succinyl homoserine)을 합성하는 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.
Homoserine + Succinyl-CoA -> O-Succinyl-Homoserine
상기 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드는 엔테로박테리아속, 살모넬라속, 슈도모나스속, 바실러스속, 에스케리키아속 미생물로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 에스케리키아속 미생물 유래의 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 (E. coli) 유래의 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드는 상기 반응식에 나타난 활성을 가지는 폴리펩티드이면, 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드또는 이와 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드도 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서 여러 종의 대장균의 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과, 여러 종의 대장균에 존재하는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 폴리펩티드는 5% 미만의 변이를 포함하는 변이체 (variant)가 존재하지만 (즉, 서로간에 95% 이상의 상동성을 갖는다), 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성에는 큰 차이가 없음을 알 수 있었다(도 2). 이와 같은 결과는 본 발명의 서열번호 17의 폴리펩티드와 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드도 동일한 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가질 수 있음을 시사하는 것으로, 이러한 시사점은 당업자에게 자명한 사실로 여겨지고 있으며, 본 출원인은 이를 시각화한 것이다.
본 발명에 있어서, 용어 "변이형 폴리펩티드"는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 일부가 치환됨으로써 야생형과 달리 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 즉, 본 발명의 변이형 폴리펩티드는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 일부 아미노산을 치환함으로써 기질 특이성이 숙시닐 코에이 (succinyl-coA)에서 아세틸 코에이 (Acetyl-coA)로 변환된, 즉 하기 반응식과 동일한 활성을 나타내는 변이형 폴리펩티드를 의미한다.
Homoserine + Acetyl-CoA -> O-AcetylHomoserine
본 발명에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 17로 표시되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드의 시작 메치오닌으로부터 111번째 아미노산이 글루탐산으로 치환되고 (서열번호 18), 추가로 112번째 아미노산이 쓰레오닌 (서열번호 19) 또는 히스티딘 (서열번호 20)으로 치환된 변이형 폴리펩티드 일 수 있다.
상기와 같이 추가적으로 112번째 아미노산인 류이신을 쓰레오닌 또는 히스티딘으로 변환시킨 경우 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성이 강화됨을 확인할 수 있다(표 2 및 3).
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 18 내지 20의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 서열번호 39로 표시되는 염기서열로 이루어진 대장균 유래의 metA 유전자에 의해 코딩된 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제의 111번 글리신을 글루탐산으로 치환한 폴리펩티드를 발현할 수 있는 플라스미드, 및 상기 치환에 추가로 112번 아미노산을 쓰레오닌 또는 히스티딘으로 치환한 폴리펩티드를 발현할 수 있는 플라스미드를 제작하였다(실시예 2).
또한, 본 발명의 실험예를 통하여 야생형 metA 유전자 (서열번호 39)를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 균주 CJM2 pCL_Pcj1_metA(wt) 및 CJM3 pCL_Pcj1_metA(wt)에 의해서는 O-숙시닐 호모세린만 생성됨을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 의해 형질전환된 균주에 의해서는 O-아세틸 호모세린만이 축적됨을 확인할 수 있었다(실험예 2, 표 2 및 3).
이로써, 본 발명의 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물은 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 나타내기 위한 외래 유전자를 도입하지 않고도, 메치오닌 전구체로서 생산수율이 높은 O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있는 이점을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 일부 아미노산이 치환되어 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 즉, 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라아제는 배지에 첨가되는 미량의 메치오닌에 의해서 피드백 조절을 받아 대부분의 활성이 억제되는 특성을 나타내기 때문에, 본 발명의 변이형 폴리펩티드는 O-아세틸 호모세린의 과량생산을 위하여 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이형 폴리펩티드일 수 있는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 메치오닌에 대한 피드백 조절을 해제하기 위한 아미노산 치환은 PCT 공개특허 (WO 2008/127240)에 개시된 방법에 따라 수행할 수 있으며, 구체적으로 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 29번 아미노산을 프롤린으로 치환, 114번 아미노산을 글리신으로 치환, 140번 아미노산을 세린으로 치환 또는 상기 3종의 아미노산 치환 중 1종 이상이 조합된 아미노산 치환을 통하여 메치오닌에 대한 피드백 조절을 해제할 수 있다. 바람직하게는 2종 이상, 가장 바람직하게는 3종 모두의 아미노산이 치환될 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 23의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 변이형 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 대장균 유래의 metA 유전자에 의해 코딩된 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 29, 114번 및 140번 아미노산을 각각 프롤린, 글리신 및 세린으로 치환하여 메치오닌에 대한 피드백 조절을 해제하고, 111번 아미노산이 글루탐산으로 치환된 [pCL_Pcj1_metA#11(EL)], 111번 및 112번 아미노산이 각각 글루탐산 및 쓰레오닌으로 치환된 [pCL_Pcj1_metA#11(ET)], 111번 및 112번 아미노산이 각각 글루탐산 및 히스티딘으로 치환된 [pCL_Pcj1_metA#11(EH)] 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드를 제작하였다(실시예 3).
또한, 본 발명의 실험예를 보면, 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이형 폴리펩티드를 발현하는 균주 중 111번 및 112번 아미노산이 각각 글루탐산 및 히스티딘으로 치환된 CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH 균주 및 CJM3 pCL_Pcj1_metA(#11)EH 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량이 11.1 g/L 및 24.8 g/L로 높은 O-아세틸 호모세린의 생산량을 보여, 외래의 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 유전자를 도입한 균주와 유사한 수준으로 O-아세틸 호모세린이 축적됨을 확인할 수 있었다(실험예 2, 표 2 및 3).
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 단위체 (monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체 (polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 내지 29의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 본 발명의 변이형 폴리펩티드를 발현시키는 미생물을 만들기 위하여 숙주세포에 DNA를 도입하여 변이형 폴리펩티드를 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 벡터를 사용할 수 있고, 바람직하게는 pCL1920 벡터를 사용할 수 있다.
상기 "작동 가능하게 연결된"은 발현 조절 서열이 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 해독을 조절하도록 연결된 것을 말하며, 발현 조절 서열 (프로모터 포함)의 조절하에 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되어 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 변이형 폴리펩타이드가 생성되도록 정확한 해독 프레임을 유지시키는 것을 포함한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 및 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "형질전환"이란 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미하며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함된다.
또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 유전자는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터, 전사종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
상기 미생물은 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 원핵 미생물 또는 진핵 미생물로서, 예컨대, 에스케리키아 (Escherichia)속, 바실러스 (Bacilus)속, 에어로박터 (Aerobacter)속, 세라티아 (Serratia)속, 프로비덴시아 (Providencia)속, 어위니아 (Erwinia)속, 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces)속, 엔테로박테리아 (enterobacteria)속, 지고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces)속, 렙토스피라 (Leptospira)속, 데이노코쿠스 (Deinococcus)속, 피치아 (Pichia)속, 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces)속, 칸디다 (Candida)속, 한세눌라 (Hansenula)속, 데바리오마이세스 (Debaryomyces)속, 뮤코 (Mucor)속, 토룰롭시스 (Torulopsis)속, 메틸로박터 (Methylobacter)속, 살모넬라 (Salmonella)속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속, 슈도모나스 (Pseudomonas)속, 브레비박테리움 (Brevibacterium)속 또는 코리네박테리움 (Corynebacterium)속의 미생물 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 발현하는 미생물로서, 예컨대, 바실러스 속, 에스케리키아속, 엔테로박테리아 속, 살모넬라 속의 미생물 일 수 있으며, 바람직하게는 에스케리키아 속 미생물일 수 있고, 보다 바람직하게는 대장균일 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 CJM2 pCL_Pcj1_metAEL, CJM2 pCL_Pcj1_metAET, CJM2 pCL_Pcj1_metAEH 균주 (실시예 2 및 실험예 2) 및 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균 CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EL, CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)ET, CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH 균주를 제작하였다(실시예 3 및 실험예 2). 상기 균주 중에서, CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EL, CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)ET, CJM2 pCL_Pcj1_metA(#11)EH 균주를 각각 CA05-0546, CA05-0547 및 CA05-0548로 명명하고, 2010년 12월 14일에 한국미생물보존센터에 기탁하여, 각각 기탁번호 KCCM11145P, KCCM11146P 및 KCCM11147P를 부여받았다.
본 발명은 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 일부 아미노산이 치환된 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제공하므로, 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드만을 발현하는 미생물에 본 발명의 변이형 폴리펩티드를 발현하도록 하면, 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 metX 등의 외래 유전자의 도입 없이 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드를 발현시킬 수 있는 이점을 가진다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 O-아세틸 호모세린을 과량 생산하기 위해서 추가로 아세틸-CoA 신테타아제 (acetyl-CoA synthetase)의 활성이 강화되거나 또는 판토테네이트 키나아제 (pantothenate kinase)의 활성이 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제되도록 변형된 미생물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 아세틸-CoA 신테타아제, 판토테네이트 키나아제는 다양한 미생물로부터 유래될 수 있으며, 이 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 acs, coaA로 통칭한다.
본 발명에 있어서, 아세틸-CoA 신테타아제 활성 강화는 상기 아세틸-CoA 신테타아제를 코딩하는 acs 유전자의 프로모터 부위 및 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 유전자 발현을 강화시킬 수 있으며, 해당 유전자의 ORF 부위에 변이를 도입함으로써 단백질의 활성을 강화시킬 수 있으며, 해당 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 단백질 발현량을 강화시킬 수 있으며, 해당 유전자를 자가 프로모터 또는 활성이 증진된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질 전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 활성이 증진된 프로모터로의 치환, 활성이 증진되도록 프로모터의 변이 유발 또는 유전자 카피수 증가를 통하여 아세틸-CoA 신테타아제 활성을 강화시킬 수 있으며, 이에 의하여 O-아세틸 호모세린 생산능을 향상시키는 방법, 및 이러한 방법을 이용하여 제작된 대장균을 제공할 수 있다. 상기 활성이 증진된 프로모터로 치환하기 위하여, 활성이 증진된 프로모터로 알려진 pTac, pTrc, pPro, pR, pL 등의 프로모터가 사용될 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 본 발명은 아세틸-CoA 생합성에 관여하는 acs 유전자의 프로모터가 항시발현 프로모터인 pro 프로모터로 치환되어 상기 acs 유전자가 과발현된, O-아세틸 호모세린 생산 균주를 제공할 수 있다. 상기 pro 프로모터는 서열번호 30의 전체 또는 일부가 사용될 수 있다.
본 발명은 추가로 CoA 생합성 경로상에서 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제된 판토테네이트 키나아제 (pantothenate kinase) 변이체가 도입된 미생물을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 판토테네이트 키나아제 (Pantothenate kinase)의 아미노산 서열에서 106번째 위치의 알지닌이 알라닌으로 치환되어 (서열번호 40) CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제됨으로써 O-아세틸 호모세린 생산능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기의 미생물은 추가로 포스포에놀피루브산 카복실라제 암호화 유전자 (ppc), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 암호화 유전자 (aspC) 및 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 암호화 유전자 (asd)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 카피수가 증가되거나, 또는 상기 유전자의 프로모터가 활성이 증진된 프로모터로 치환되거나 또는 활성이 증진되도록 변이된 미생물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기의 일련의 효소들은 하기 반응식에 나타난 바와 같이 포스포에놀파이루베이트로부터 O-아세틸 호모세린을 합성하는 활성을 가지고 있다. 따라서, 이러한 일련의 활성을 가지는 유전자의 발현을 강화할 경우 세포 내에 O-아세틸 호모세린의 축적을 유도할 수 있다.
포스포에놀피루브산 카복실라제 (ppc)
Phosphoenolpyruvate + H2O + CO2 <-> Oxaloaxetate + Phosphate
아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (aspC)
Oxaloacetate + Glutamate <-> Aspartate + a-ketoglutarate
아스파르테이트 키나제 (thrA)
Aspartate + ATP <-> Aspartyl-4-phosphate + ADP
아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 (asd)
Aspartyl-4-phosphate + NADPH <-> Aspartate-semialdehyde + Phosphate + NADP+
호모세린 디하드로게나제 (thrA)
Aspartate-semialdehyde + NADPH <-> Homoserine
상기의 반응식에서 아스파르테이트 키나제와 호모세린 디하이드로게나제의 두 가지 역할을 하는 효소를 암호화하는 thrA 유전자는 실험예 2에 있는 CJM2 균주에 피드백 해제를 통한 강화가 이미 이루어진 상태이며, 나머지 3가지 효소는 유전자의 카피수가 증가되거나 또는 상기 유전자의 프로모터를 활성이 증진된 프로모터로 치환되거나 또는 활성이 증진되도록 변이시키는 방법으로 활성을 강화시킬 수 있다.
본 발명에서, 용어 "카피수 증가"는 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입하거나 당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하는 방법으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 metA 및 metB 유전자가 결손된 균주인 CJM2 균주의 acs 프로모터를 결손시키고, pro 프로모터로 교체한 CJM2-AP 균주를 제작하고, CJM2-AP 균주에서 feedback resistant coaA 형질을 갖도록 형질을 전환하여 Acetyl-coA pool이 과량 증가되어 있는 CJM2-AP/CO 균주를 제작한 후, ppc, aspC, asd 3가지 유전자의 카피수가 2 카피 증폭된 CJM3 균주를 제작하였다. 이후, 본 발명에서는 pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) 및 pCL_Pcj1_metA#11(ET)이 도입된 CJM3 균주를 각각 CA05-0578, CA05-0579 및 CA05-0580으로 명명하고, 2011년 12월 12일에 한국미생물보존센터 기탁하여, 각각 기탁번호 KCCM11228P, KCCM11229P 및 KCCM11230P를 부여받았다(실험예 2).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 또는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 단계, 및 상기 미생물 배양과정에서 생성된 O-아세틸 호모세린을 수득하는 단계를 포함하는 O-아세틸 호모세린의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 변이형 폴리펩티드를 발현하는 상기 미생물을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 것은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
배양방법의 예로 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니며, 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 배지는 수크로스, 포도당, 글리세롤, 아세트산 중 하나의 탄소원 또는 이들의 탄소원을 복합적으로 사용할 수 있으며, 사용될 수 있는 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.
상기 배지에는 인(P)원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 이 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있으며, 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여 배양물의 pH를 조정할 수 있고, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 또는 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃ 일 수 있다. 배양기간은 원하는 유용 물질이 생성되는 동안에는 계속 배양할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 시간 동안 배양할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 및 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 포함하는 플라스미드 제작
미국생물자원센터 (American Type Culture Collection)로부터 구매한 대장균 W3110 균주 (기탁번호 ATCC9637)의 염색체를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 유전자를 증폭하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크 (NIH Gene Bank)에 등록되어 있는 NC_000913의 대장균 염색체 염기서열을 바탕으로 제작하였으며, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머는 각각 제한효소 EcoRV 부위 및 HindIII 부위를 가지고 있다.
<서열 번호 1>
5' AATTGATATCATGCCGATTCGTGTGCCGG 3'
<서열 번호 2>
5' AATTAAGCTTTTAATCCAGCGTTGGATTCATGTG 3'
데이노코쿠스 라디오두란스 (Deinococcus radiodurans)의 염색체를 주형으로 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 metX 유전자 (서열번호 44)를 증폭하였다. 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머는 각각 제한효소 EcoRV 부위 및 HindIII 부위를 가지고 있다.
<서열 번호 3>
5' AATTGATATCATGACCGCCGTGCTCGC 3'
<서열 번호 4>
5' AATTAAGCTTTCAACTCCTGAGAAACGCCCC 3'
PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃에서 30초간 변성, 56℃에서 30초간 어닐링 (annealing), 72℃에서 5분간 중합을 25회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다.
이렇게 획득된 PCR 산물 및 cj1 프로모터 (KR 2006-0068505)가 들어 있는 pCL1920 플라스미드에 각각 EcoRV 및 HindIII 제한효소를 처리하여 클로닝 하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환한 후, 스펙티노마이신 (spectinomycin) 50 μg/㎖를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드를 각각 pCL_Pcj1_metA 및 pCL_Pcj1_metXdr로 명명하였다.
실시예 2 : 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 제작
site directed mutagenesis kit (Stratagene, 미국)을 이용하여, 상기 실시예 1에서 제작된 pCL_Pcj1_metA 플라스미드를 주형으로 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 111번 아미노산인 글리신 (Gly)을 글루탐산 (Glu)으로 치환하였다(G111E). 사용한 프라이머 서열은 하기와 같다.
<서열 번호 5>
5' ttgtaactggtgcgccgctggaactggtggggtttaatgatgtc 3'
<서열 번호 6>
5' gacatcattaaaccccaccagttccagcggcgcaccagttacaa 3'
제작된 변이 G111E metA 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA(EL)로 명명하였다.
또한, 상기 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 111번 아미노산을 글리신에서 글루탐산으로 치환하고, 추가로 112번 아미노산을 류이신에서 쓰레오닌 (L112T) 또는 히스티딘 (L112H)으로 치환하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 하기와 같다.
류이신을 쓰레오닌으로 치환
<서열 번호 7>
5' tgtaactggtgcgccgctggaaaccgtggggtttaatgatgtcg 3'
<서열 번호 8>
5' cgacatcattaaaccccacggtttccagcggcgcaccagttaca 3'
류이신을 히스티딘으로 치환
<서열 번호 9>
5' tgtaactggtgcgccgctggaacatgtggggtttaatgatgtcg 3'
<서열 번호 10>
5' cgacatcattaaaccccacatgttccagcggcgcaccagttaca 3'
제작된 플라스미드 중 111번 아미노산이 글리신에서 글루탐산으로, 112번 아미노산이 류이신에서 쓰레오닌으로 치환된 metA 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA(ET)로 명명하였다. 마찬가지로, 111번 아미노산이 글리신에서 글루탐산으로, 112번 아미노산이 류이신에서 히스티딘으로 치환된 metA 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA(EH)로 명명하였다.
실시예 3 : 피드백 조절 해제 (feedback-resistance)된 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 제작
상기 실시예 1에서 제작된 pCL_Pcj1_metA 플라스미드를 주형으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법을 사용하여 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제 (feedback resistance)된 특성을 갖는 metA 유전자 (metA #11)를 제작하였다. 구체적으로, PCT 공개특허 (WO 2008/127240)에 개시된 내용에 따라 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 29번 아미노산을 세린에서 프롤린으로 (S29P), 114번 아미노산을 글루탐산에서 글리신으로 (E114G), 140번 아미노산을 페닐알라닌에서 세린으로 치환 (F140S)하였다. 이때 사용한 프라이머 서열은 하기와 같다.
세린을 프롤린으로 치환
<서열 번호 11>
5' ATGACAACTTCTCGTGCGCCTGGTCAGGAAATTCG 3'
<서열 번호 12>
5' CGAATTTCCTGACCAGGCGCACGAGAAGTTGTCAT 3'
글루탐산을 글리신으로 치환
<서열 번호 13>
5' CGCCGCTGGGCCTGGTGGGGTTTAATGATGTCGCT 3'
<서열 번호 14>
5' AGCGACATCATTAAACCCCACCAGGCCCAGCGGCG 3'
페닐알라닌을 세린으로 치환
<서열 번호 15>
5' CACGTCACCTCGACGCTGAGTGTCTGCTGGGCGGT 3'
<서열 번호 16>
5' ACCGCCCAGCAGACACTCAGCGTCGAGGTGACGTG 3'
각각의 상기 변이를 순차적으로 도입하여, 3종 변이를 모두 도입한 metA(#11) 유전자를 함유한 플라스미드를 제조한 후, pCL_Pcj1_metA#11로 명명하였다.
이후, 상기 제작된 pCL_Pcj1_metA#11 플라스미드를 주형으로 하여 상기 실시예 2의 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드의 변이를 동일하게 갖는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 플라스미드를 제작하였다.
제작된 플라스미드 중 111번 아미노산이 글리신에서 글루탐산으로 치환된 metA #11 유전자를 포함한 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA#11(EL)로, 111번 아미노산이 글리신에서 글루탐산으로, 112번 아미노산이 류이신에서 쓰레오닌으로 치환된 metA #11 유전자를 포함한 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA#11(ET)로, 111번 아미노산이 글리신에서 글루탐산으로, 112번 아미노산이 류이신에서 히스티딘으로 치환된 metA #11 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA#11(EH)로 명명하였다.
실험예 1 : 대장균 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 및 피드백 조절 해제된 대장균 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제들의 상동성 비교
대장균 변이체 (variants) E. coli O9:H4 (strain HS), E. coli O139: H28 (strain E24377A). 및 E. coli O157:H7, E. coli (strain ATCC8739)에서 나타나는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 아미노산 1차 서열 [순서대로 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43]을 CLC Main Workbench (CLC bio, 덴마크) 프로그램을 이용하여 비교해 보았다.
비교 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대장균 변이체에서 나타나는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 아미노산 1차 서열은 5% 미만의 변이가 나타남을 알 수 있었다(도 2).
또한, 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 아미노산 1차 서열도 상기 프로그램을 이용하여 비교해 보았다. 비교한 1차 서열은 야생형 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제, PCT 공개특허 (WO 2008/127240)에 개시된 피드백 조절 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 met10A, met11A 및 PCT 공개특허 (WO 2005/108561)에 개시된 피드백 조절 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제이다.
비교 결과, 도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 변이 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제의 아미노산 1차 서열은 5% 미만의 변이가 존재함을 알 수 있었다(도 3 및 4).
이러한 결과는, 대장균에 존재하는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제 폴리펩티드는 서로 간에 95% 이상의 상동성을 갖고 있으며, 5% 미만의 서열차이에도 불구하고 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성에는 큰 차이가 없음을 나타낸다.
실험예 2 : 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드의 기질 특이성 및 활성 비교 시험
2-1 : 실험균주의 제작
2-1-1) metA 및 metB 유전자 결손
O-아세틸 호모세린을 과량 생산하는 변이형 폴리펩티드의 활성을 비교하기 위해서 호모세린을 축적하고, 생산된 O-아세틸 호모세린의 이용성이 결손된 균주를 제작하였다. 상기 균주 제작은 국제특허 PCT/KR2005/00344에 명기된 쓰레오닌 생산균주인 FTR2533 (KCCM 10541) 균주를 기반으로 하여, 공개특허 EP2108693A2에 개시된 실시예 1-1 내지 1-4의 방법으로 metA 및 metB 유전자가 결손된 균주를 제작하고, CJM2로 명명하였다. CJM2는 균주 내에 호모세린이 과량 축적되며, 도입되는 유전자에 따라 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린을 생산할 수 있는 균주이다.
2-1-2) acs promoter 교체
O-아세틸 호모세린을 과량 생산하기 위해서 대장균 내에 호모세린과 아세틸 코에이 생성이 원활해야 한다. 첫째로 아세틸 코에이 (acetyl-coA) 공급을 원활하게 하기 위해서 acs (acetyl-coA synthetase)유전자의 프로모터를 서열번호 30의 항시발현 프로모터 (constitutive promoter)인 pro로 치환하여 목적 유전자의 상시 과발현을 유도하였다. 상기 프로모터 교체를 위해서, FRT-one-step PCR의 변형된 방법을 이용하였다(PNAS (2000) vol.97: 6640-6645). 도 5에 도시한 그림과 같은 카세트를 제작하기 위하여 서열번호 31과 서열번호 33을 이용하여 pKD3 (PNAS (2000) vol.97: 6640-6645) 유래 클로람페니콜 내성 유전자 FRT 카세트를 PCR하고, 서열번호 32와 서열번호 34를 이용한 pro 프로모터 부위를 PCR하여 두 PCR 결과물을 Overlapping PCR 방법을 이용하여 하나의 카세트 (acs 프로모터 결손-pro 프로모터 교체 카세트)로 제작하였다(Nucleic Acids Res. 1988 August 11; 16(15): 7351-7367). 변성 단계는 94℃에서 30초, 어닐링 단계는 55℃에서 30초, 연장 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하였다.
<서열 번호 31>
5' AGGGGCTTCATCCGAATTGCGCCATTGTTGCAATGGCGGTGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTC 3'
<서열 번호 32>
5' GATATTCATATGGACCATGGCTCGAGCATAGCATTTTTATCC 3'
<서열 번호 33>
5' GGATAAAAATGCTATGCTCGAGCCATGGTCCATATGAATATC 3'
<서열 번호 34>
5' CGATGTTGGCAGGAATGGTGTGTTTGTGAATTTGGCTCATATGTACCTTTCTCCTCTTTA 3'
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 약 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터 (PNAS (2000) vol.97: 6640-6645)로 미리 형질전환시킨 CJM2 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 CJM2 균주는 100 μg/L 암피실린 (ampicilin)과 5 mM 아라비노스 (l-arabinose)가 포함된 LB 배지를 이용하여 30℃에서 OD600=0.6까지 배양시킨 후, 멸균 증류수로 1회, 10% 글리세롤 (glycerol)로 2회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 25 μg/L 클로람페니콜을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR한 후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2 Kb로 관찰되는 것을 확인함으로써 acs 프로모터 결손 및 pro 프로모터로의 교체를 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (PNAS (2000) vol.97: 6640-6645)로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 acs 프로모터 결손 및 pro 프로모터로의 교체 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 CJM2-AP로 명명하였다.
2-1-3) 피드백 저항성 coaA 대체
상기의 CJM2-AP 균주에서 feedback resistant coaA 형질을 갖도록 하기 위하여, w3110 gDNA를 주형으로 제한효소 EcoRI이 포함된 서열번호 35 및 서열번호 36의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, pantothenate kinase를 암호화하는 coaA 유전자를 확보하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 50℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 2분을 30회 반복하였다.
상기의 방법으로 획득된 coaA 유전자 및 pSG76C 플라스미드 (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428)에 각각 EcoRI 제한효소를 처리한 후, 연결하였다. 상기 방법으로 제작된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α에 형질전환한 후, 클로람페니콜 25 μg/㎖를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 pSG-76C-coaA를 획득하였다.
<서열번호 35>
5' ATGAGTATAAAAGAGCAAAC 3'
<서열번호 36>
5' TTATTTGCGTAGTCTGACC 3'
상기에서 획득된 pSG-76C-coaA를 이용하여 site directed mutagenesis (Stratagene, 미국) 방법으로 서열번호 37 및 서열번호 38의 프라이머를 이용하여 pSG-76C-coaA(R106A)를 제작하였다.
<서열번호 37>
5' GGAAAAGTACAACCGCCgccGTATTGCAGGCGCTATT 3'
<서열번호 38>
5' AATAGCGCCTGCAATACggcGGCGGTTGTACTTTTCC 3'
CJM2-AP 균주에 상기의 pSG76C-coaA(R106A) 플라스미드를 형질전환하여 LB-Cm (Yeast extract 10 g/L, NaCl 5 g/L, Tryptone 10 g/L, 클로람페니콜 25 μg/L) 배지에서 배양한 후 클로람페니콜 내성을 갖는 콜로니를 선발하였다. 선별된 형질전환체는 pSG76c-coaA(R106A)가 유전체 내의 coaA 부분에 1차로 삽입된 균주이다.
확보된 coaA(R106A) 유전자가 삽입된 균주를 pSG76c 내에 존재하는 I-SceI 부분을 절단하는 제한효소 I-SceI를 발현하는 벡터인 pASceP (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, July 1997, 4426-4428)로 형질전환하여 LB-Ap (Yeast extract 10 g/L, NaCl 5 g/L, Tryptone 10 g/L, Ampicilline 100 μg/L)에서 생장하는 균주를 선별하였다. 선별된 균주에서 서열번호 35 및 서열번호 36의 프라이머를 이용하여 coaA 유전자를 증폭하였고, 증폭된 유전자는 마크로젠 (한국) 시퀀싱 서비스를 통하여 coaA(R106)으로 교체되었음을 확인하였다(Nucleic Acids Research, 1999, Vol.27, No.22 4409-4415). 이렇게 제작된 균주는 CJM2-AP/CO라고 명명하였다. CJM2-AP/CO 균주는 호모세린 뿐만 아니라, Acetyl-coA pool이 과량 증가되어 있는 특성을 보이는 균주이다.
2-1-4) 호모세린 생합성 경로의 key 유전자 카피수 증가
CJM2 또는 CJM2-AP/CO 균주는 호모세린이 과량 생산되는 균주이지만, 호모세린의 생산성을 보다 향상시키기 위하여 ppc, aspC, asd 3가지 유전자의 카피수를 증폭하고자 하였다. 공개특허 KR2011-0023703의 실시예 <1-1> 내지 <1-3>에 개시된 방법으로 pSG76c-2ppc, pSG76c-2aspC, pSG76c-2asd 플라스미드를 제작하고 CJM2-AP/CO 균주에 상기의 플라스미드를 도입하고 실시예 <1-5>의 방법으로 상기의 3가지 유전자를 순차적으로 2 카피 증폭된 균주를 제작하였다. 이렇게 제작된 균주는 CJM3라고 명명하였다. CJM3는 균주 내에 호모세린이 CJM2 균주에 비해 보다 더 과량 축적되며, 도입되는 플라스미드에 따라 O-아세틸 호모세린 또는 O-숙시닐 호모세린을 생산할 수 있는 균주이다
2-2 : 실험 방법 및 실험 결과
CJM2와 CJM3 2종의 균주를 컴피턴트 세포 (competent cell)로 제작하고, 컴피턴트 세포에 전기천공 방법 (electroporation)으로 pCL_Pcj1_metX, pCL_Pcj1_metA, pCL_Pcj1_metA(EL), pCL_Pcj1_metA(EH), pCL_Pcj1_metA(ET), pCL_Pcj1_metA#11, pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH), pCL_Pcj1_metA#11(ET)의 9종의 플라스미드를 각각 도입하였다.
이중에서, pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) 및 pCL_Pcj1_metA#11(ET)가 도입된 CJM2 균주를 각각 CA05-0546, CA05-0547 및 CA05-0548로 명명하고, 2010년 12월 14일에 한국미생물보존센터에 기탁하여, 각각 기탁번호 KCCM11145P, KCCM11146P 및 KCCM11147P를 부여받았다.
또한, pCL_Pcj1_metA#11(EL), pCL_Pcj1_metA#11(EH) 및 pCL_Pcj1_metA#11(ET)이 도입된 CJM3 균주를 각각 CA05-0578, CA05-0579 및 CA05-0580으로 명명하고, 2011년 12월 12일에 한국미생물보존센터 기탁하여, 각각 기탁번호 KCCM11228P, KCCM11229P 및 KCCM11230P를 부여받았다.
이후, 9종의 플라스미드가 도입된 각각의 균주가 생산하는 메치오닌 전구체 종류와 생산량을 비교하기 위해서 플라스크 테스트를 수행하였다. 플라스크 테스트는 각각의 균주를 LB 플레이트에서 스트리킹 (streaking)하고 31℃ 배양기에 16시간 동안 배양한 후, 단일 콜로니를 LB 배지 3 ㎖에 접종한 후 200 rpm/31℃ 배양기에서 16시간 동안 배양함으로써 수행하였다.
250 ㎖ 플라스크에 표 1의 메치오닌 전구체 생산배지 25 ㎖를 넣고, 앞서 배양한 배양액을 500 ㎕씩 투입하였다. 이후, 플라스크를 200 rpm/31℃ 배양기에서 40시간 동안 배양한 후, HPLC를 이용하여 각각의 플라스미드가 도입된 균주에서 얻어지는 메치오닌 전구체의 종류 및 양을 비교하고, 그 결과를 표 2 (CJM2 계열 균주에대한 결과) 및 표 3 (CJM3 계열 균주에 대한 결과)에 나타내었다.
표 1
Figure PCTKR2011009966-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2011009966-appb-T000002
표 3
Figure PCTKR2011009966-appb-T000003
그 결과, 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 야생형 metA 유전자를 포함하는 pCL_Pcj1_metA(wt)에 의해서는 O-숙시닐 호모세린만이 생산되었으나, 본 발명에 따른 3종의 변이 metA 유전자를 포함하는 균주에 의해서는 O-아세틸 호모세린만이 축적됨을 확인할 수 있었다. 즉, 호모세린 숙시닐 트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산을 치환함으로써, 폴리펩티드의 활성이 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제로 변경되었음을 확인할 수 있었다.
또한, CJM3 계열 균주에서 상기 3종의 변이 중, 아미노산 서열 111번이 글루탐산으로 치환된 경우 (EL)에는 O-아세틸 호모세린 생산량이 2.1 g/L 이었으나, 추가로 112번 아미노산이 히스티딘으로 치환된 경우 (EH)에는 3.2 g/L의 O-아세틸 호모세린이 생산되어, 가장 많은 양의 O-아세틸 호모세린이 생산됨을 확인할 수 있었다.
메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 발현하는 균주에서도 동일한 경향성을 보였다. 구체적으로, 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제되고, 111번 및 112번 아미노산이 각각 글루탐산 및 히스티딘으로 치환된 metA #11(EH) 유전자를 도입한 균주에서 24.8 g/L의 가장 많은 양의 O-아세틸 호모세린이 생상되었으며, 이는 외래 유전자로서 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제를 도입한 경우 (CJM3 pCL_Pcj1_metX, 23.7 g/L)와 유사한 수준으로 O-아세틸 호모세린이 축적됨을 확인할 수 있었다.
Figure PCTKR2011009966-appb-I000001
Figure PCTKR2011009966-appb-I000002
Figure PCTKR2011009966-appb-I000003
Figure PCTKR2011009966-appb-I000004
Figure PCTKR2011009966-appb-I000005
Figure PCTKR2011009966-appb-I000006

Claims (18)

  1. 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드의 시작 메치오닌으로부터 111번째 아미노산이 글루탐산으로 치환된 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 추가로 112번째 아미노산이 쓰레오닌 또는 히스티딘으로 치환된 것인 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 18 내지 20의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인 변이형 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 아미노산을 치환하여 메치오닌에 대한 피드백 조절이 해제된 것인 변이형 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 29번째 아미노산이 프롤린으로 치환, 114번째 아미노산이 글리신으로 치환, 140번째 아미노산이 세린으로 치환, 또는 상기 3종의 아미노산 치환 중 1종 이상이 조합된 것인 변이형 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 추가로 112번째 아미노산이 쓰레오닌 또는 히스티딘으로 치환된 것인 변이형 폴리펩티드.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 21 내지 23의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것인 변이형 폴리펩티드.
  8. 제1항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 내지 29의 염기서열 중 어느 하나의 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제8항의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결된 재조합 벡터.
  11. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 추가로 아세틸-CoA 신테타아제 (acetyl-CoA synthetase)의 활성이 내재적 아세틸-CoA 신테타아제 활성에 비하여 강화되거나, 또는 판토테네이트 키나아제 (pantothenate kinase) 활성이 CoA 축적에 의한 피드백 저해가 해제되도록 변형된 것인 미생물.
  13. 제11항에 있어서, 추가로 포스포에놀피루브산 카복실라제 암호화 유전자 (ppc), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 암호화 유전자 (aspC) 및 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 암호화 유전자 (asd)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 카피수가 증가되거나, 또는 상기 유전자의 프로모터가 활성이 증가된 프로모터로 치환되거나 활성이 증가되도록 변이된 미생물.
  14. 제10항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 (Escherichia)속인 미생물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 미생물은 수탁번호 KCCM11145P, KCCM11146P, KCCM11147P, KCCM11228P, KCCM11229P 또는 KCCM11230P인 미생물.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 미생물 배양과정에서 생성된 O-아세틸 호모세린을 수득하는 단계를 포함하는 O-아세틸 호모세린의 생산방법.
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