WO2017069578A1 - L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 l-이소루신을 생산하는 방법 - Google Patents

L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 l-이소루신을 생산하는 방법 Download PDF

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gene
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권수연
장재우
김민세
김주정
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    • C12Y102/04001—Pyruvate dehydrogenase (acetyl-transferring) (1.2.4.1)
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    • C12Y203/01182—(R)-Citramalate synthase (2.3.1.182)
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    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01033—3-Isopropylmalate dehydratase (4.2.1.33)

Definitions

  • the present application relates to a microorganism of the genus Corynebacterium having L-isoleucine production capacity and a method for producing L-isoleucine using the same.
  • Branched-chain amino acid refers to three kinds of L-valine, L-leucine and L-isoleucine, and is industrially used for food additives, pharmaceuticals, and the like.
  • L-isoleucine is metabolized in the muscle to produce energy, and is involved in the production of hemoglobin to reduce fatigue and promote growth. Accordingly, it is being used in a variety of solutions, such as infusions and nutrients, and is increasingly used in sports nutrition.
  • threonine dehydratase (gene ilvA), which produces 2-ketobutyric acid from L-threonine during the L-isoleucine biosynthesis step, and acetohydroxy acid synthase in the next step synthase, gene ilvBN), are all inhibited by L-isoleucine.
  • Another object of the present application is to provide a method of producing L-isoleucine, comprising culturing a recombinant microorganism into which the novel biosynthetic pathway has been introduced, and recovering L-isoleucine from the microorganism or the medium. It is.
  • Microorganisms of the genus Corynebacterium having L-isoleucine production capacity of the present application have high yields of L-isoleucine through a novel biosynthetic pathway in which citramalate synthase activity is introduced and does not use L-threonine as a precursor. Can be produced as
  • one aspect of the present application provides a microorganism of the genus Corynebacterium ( Lynesorcin ) having a production capacity of L-isoleucine, including a protein having citramalate synthase activity.
  • Lynesorcin genus Corynebacterium
  • L-isoleucine is one of the essential amino acids structurally corresponding to the branched chain amino acids together with L-valine, L-leucine and the formula HO 2 CCH (NH 2 ) CH (CH 3 ) CH 2 CH 3 L-amino acid.
  • L-isoleucine production capacity in the present application means that the microorganisms exhibit the ability to accumulate L-isoleucine in the medium or microorganisms when cultured in the medium. Such L-isoleucine producing ability may be a property retained by wild type strains or may be endowed or enhanced by strain improvement.
  • the microorganism in order to have L-isoleucine production capacity, may be modified by recombinant mutations such as obtaining nutritionally demanding mutant strains, analog resistant mutants, or metabolic control mutants, or enhancing the activity of L-isoleucine biosynthesis-related enzymes.
  • the methods used to modify microorganisms, such as production, can be applied alone or in combination.
  • genes involved in enhanced L-isoleucine biosynthesis in particular ilvG, ilvM, ilvE, ilvD and ilvA genes, may be enhanced alone or in combination of two or more thereof.
  • the ilvG, ilvM, ilvE, ilvD and ilvA genes are the large subunits, small subunits, transaminase, dihydroxy acid dehydratase and threonine deaminase of isozyme II of acetohydroxy acid synthase, respectively. Encrypt the first.
  • citramalate synthase (EC2.3.1.182) is an enzyme that catalyzes the process of converting acetyl-CoA and pyruvate to citramalate and coenzyme A.
  • the enzyme meth furnace knife Lactococcus Jana when (Methanocaldococcus jannaschii).. (Howell et al, J Bacteriol 181:..
  • Leptospira interrogating elegans Leptospira interogans
  • Leptospira interogans Leptospira interogans
  • Geobacter It is found in archaea such as sulfurreducens and participates in the threonine-independent pathway of isoleucine biosynthesis (Risso et al ., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008).
  • Such enzymes are known to have high specificity for pyruvate as a substrate and are typically inhibited by isoleucine.
  • protein having citramalate synthase activity and “gene encoding the same” may include without limitation any protein having such citramalate synthase activity and any gene encoding the same. .
  • the protein having citramalate synthase activity may be derived from Metanorkaldococcus, and more specifically, derived from Metanorkaldococcus yanashi.
  • the citramalate synthase has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and the cimA gene encoding it has a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • the cimA gene encoding it has a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • there is a difference in the amino acid sequence of the protein showing the activity or because a large number of functionally identical nucleic acids can encode any given protein due to the degeneracy of the genetic code, It is not limited to the sequence numbers disclosed above.
  • substantially homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90%, even more specifically at least 95%, even more specifically at least 98% Any protein having substantially citramalate synthase activity as the amino acid sequence represented may be included in the scope of the present application without limitation.
  • sequences may have a deleted, modified, substituted or added amino acid sequence. It is obvious that it is included in the scope of the present application.
  • the gene encoding the citramalate synthase may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide may be variously modified in the coding region due to degeneracy of the codon or in consideration of the codon preferred in the organism to express the protein, without changing the amino acid sequence of the protein.
  • the polynucleotide sequence may have, for example, a polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and may have a nucleotide sequence having an homology of 80%, specifically 90% or more, more specifically 99% or more. However, it is not limited thereto.
  • variants with improved citramalate synthase activity the present application as variants of the protein of SEQ ID NO: 1 provides a CimA (M) mutation library obtained using error-prone PCR.
  • CimA (M) mutation library according to the present application
  • CimA (M) m1 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (specifically can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4);
  • CimA (M) m 2 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (specifically, may be encoded from a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6);
  • CimA (M) m3 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (specifically can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8);
  • CimA (M) m4 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 (specifically, may be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10);
  • CimA (M) m5 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (specifically can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12);
  • CimA (M) m6 having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (specifically can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14);
  • CimA (M) m7 having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (specifically, may be encoded from a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16).
  • amino acid sequence substantially shows an amino acid sequence of at least 80%, more specifically at least 90%, even more specifically at least 95%, even more specifically at least 99%.
  • protein having the activity of the citramalate synthase variant can be included in the scope of the present application without limitation.
  • homology means the degree of coincidence with a given amino acid sequence or base sequence and may be expressed in percentage.
  • homologous sequences thereof having the same or similar activity as a given amino acid sequence or base sequence are designated as "% homology".
  • % homology For example, using standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, in particular BLAST 2.0, or by hybridization experiments used under defined stringent conditions The appropriate hybridization conditions defined are within the scope of the art (see, eg, Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989) and can be determined by methods well known to those skilled in the art.
  • the microorganism of the present application consists of the citramalate synthase of Metanokaldococcus Yanashi derived SEQ ID NO: 1 and its variants consisting of SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, and 15 It may include a gene encoding a protein of an amino acid sequence selected from the group. More specifically, a recombinant vector containing each of the genes may be transformed into a microorganism to express a target gene.
  • the term "recombinant vector” refers to a DNA preparation containing a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding said target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of the target protein in a suitable host.
  • the regulatory sequence may comprise a promoter capable of initiating transcription, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the recombinant vector can be transformed into a suitable host cell and then replicated or functioned independently of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the recombinant vector used in the present application is not particularly limited as long as it is replicable in a host cell, and may be produced using any vector known in the art.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, etc. can be used as a phage vector or cosmid vector, and pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based, etc.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited and known expression vectors can be used. Specifically, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target protein in a chromosome may be introduced through a chromosome insertion vector in a host cell.
  • Introduction of the polynucleotide into the chromosome may be by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • transformation in the present application means introducing a recombinant vector comprising a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide it may include all of them, whether inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • operably linked means that the gene sequence is functionally linked with a promoter sequence for initiating and mediating the transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium is additionally enhanced isopropylmalate dehydrogenase and 3-isopropylmalate dehydratase. ) May be included.
  • stressening the activity of a protein in the present application means that the activity of the protein is increased compared to the wild type or pre-mutation state. Specifically, increase in endogenous gene activity encoding the protein, amplification of endogenous genes from internal or external factors, deletion of inhibitory regulatory factors of gene expression, increase in gene copy number, introduction of genes from outside, modification of expression control sequences In particular, the activity may be increased by promoter replacement or modification and increase in protein activity due to mutation in the gene.
  • the increase in the number of copies of the polynucleotide is not particularly limited thereto, but may be performed in a form operably linked to a vector or by insertion into a chromosome in a host cell.
  • a host capable of being cloned and functioning independently of a host, in which a polynucleotide encoding a protein of the present application is operably linked can be performed by introducing into a host cell, or the host is operably linked.
  • a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome in the cell may be introduced into the host cell to increase the copy number of the polynucleotide in the chromosome of the host cell.
  • modifying the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited, but deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or their nucleic acid sequence to further enhance the activity of the expression control sequence. It can be carried out by inducing a variation in sequence in combination or by replacing with a nucleic acid sequence having stronger activity.
  • the expression control sequences include, but are not limited to, promoters, operator sequences, sequences encoding ribosomal binding sites, sequences that control the termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong heterologous promoter may be linked to the top of the polynucleotide expression unit instead of the original promoter.
  • the strong promoter include a cj7 promoter (Korean Patent Nos. 10-0620092 and WO 2006/065095), an EF-Tu promoter, and groEL. Promoters, aceA or aceB promoters, and the like, and more preferably, can be operably linked to the cj7 promoter, a Corynebacterium-derived promoter, to improve the expression rate of the polynucleotide encoding the enzyme.
  • modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited, but the mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further enhance the activity of the polynucleotide sequence. Or by replacing with a polynucleotide sequence that has been modified to have stronger activity.
  • isopropylmaleate dehydrogenase and “isopropylmaleate dehydratase” are enzymes involved in the L-leucine, L-isoleucine and L-valine biosynthetic pathways, Eggplant proteins and genes encoding the same may include any protein having the above enzymatic activity and any gene encoding the same without limitation.
  • isopropylmaleate dehydrogenase (EC1.1.1.85) may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, and more specifically, Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium). glutamicum ) May be derived.
  • isopropyl maleate dehydrogenase of the present application may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17.
  • substantially homologous to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 is at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90%, even more specifically at least 95%, even more specifically at least 99%
  • Any protein having substantially isopropylmaleate dehydrogenase activity as the amino acid sequence represented may be included in the scope of the present application without limitation.
  • the gene encoding the isopropyl maleate dehydrogenase may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • SEQ ID NO: 17 a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the gene is not limited to the disclosed SEQ ID NO, but may have, for example, a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18, with a homology of 80%, specifically 90% or more, more specifically 99% or more.
  • the isopropyl maleate dehydratase (EC4.2.1.33) in the present application may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium glutamicum May be derived.
  • the isopropylmaleate dehydratase of the present application is composed of two small / large subunits, each of which may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21. .
  • Any protein having substantially isopropylmaleate dehydratase activity as an amino acid sequence showing identity can be included in the scope of the present application without limitation.
  • the gene encoding the isopropyl maleate dehydratase may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21.
  • the gene is not limited to the disclosed SEQ ID NO.
  • it may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22, and may have a nucleotide sequence having a homology of 80%, specifically 90% or more, more specifically 99% or more.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may further include an enzyme involved in the enhanced L-isoleucine biosynthesis pathway.
  • enzyme involved in the L-isoleucine biosynthesis pathway includes aspartate kinase (lysC gene), aspartate- ⁇ -semialdehyde dehydrogenase, asd Gene), homoserine dehydrogenase (hom gene), homoserine kinase (hombrine kinase, thrB gene), threonine synthase (thrC gene), threonine dehydrolase (gene) threonine dehydratase (ilvA gene), aminotransferase (aminotransferase, ilvE gene), and the like, but are not limited thereto.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may further include pyruvate dehydrogenase.
  • pyruvate dehydrogenase (EC1.2.4.1) is an enzyme that converts pyruvate to acetyl-CoA and CO 2 .
  • a strain lacking the aceE gene encoding the enzyme may be prepared to increase the supply of acetyl-CoA used as a precursor of the cimA gene.
  • pyruvate dehydrogenase (EC1.2.4.1) in the present application may be derived from a microorganism of the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium glutamicum May be derived.
  • pyruvate dehydrogenase of the present application may have an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25.
  • Any protein having substantially pyruvate dehydrogenase activity as the amino acid sequence represented may be included in the scope of the present application without limitation.
  • the gene encoding the pyruvate dehydrogenase may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25.
  • the gene is not limited to the disclosed SEQ ID NO.
  • it may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26, and may have a nucleotide sequence having an homology of 80%, specifically 90% or more, more specifically 99% or more.
  • activation means that the gene encoding the polypeptide is not expressed, exhibits a decrease in activity due to incomplete expression in gene expression, or does not produce a functional polypeptide that is functional even if expressed. .
  • gene inactivation may be a complete (knock-out) or partial (e.g., hypomorphic gene where the gene is below normal expression levels, or a mutant gene that exhibits a partial decrease in activity that affects it).
  • activation of the polypeptide includes not only the activity of the polypeptide is reduced, but also the case where the activity of the polypeptide is removed compared to the unmodified strain. Specifically, inactivation of threonine dehydratase in the present application,
  • the method for deleting a part or all of the polynucleotide encoding the protein is performed by replacing a polynucleotide encoding an intrinsic target protein in a chromosome with a polynucleotide or a marker gene in which some nucleic acid sequences are deleted through a bacterial chromosome insertion vector. Can be performed.
  • the term "some" may vary depending on the type of polynucleotide, but may be specifically 1 to 300, more specifically 1 to 100, and even more specifically 1 to 50.
  • the method of modifying the expression control sequence to reduce the expression of the polynucleotide is not particularly limited, but deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the nucleic acid sequence to further weaken the activity of the expression control sequence or
  • the combination can be carried out by inducing a mutation on an expression control sequence or by replacing with a nucleic acid sequence having weaker activity.
  • the expression control sequence may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, and a sequence that controls the termination of transcription and translation, but is not limited thereto.
  • a method of modifying a polynucleotide sequence on a chromosome is carried out by inducing a mutation in the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof to further weaken the activity of the protein, or weaker. It can be carried out by replacing with a polynucleotide sequence modified to have activity, but is not limited thereto.
  • the microorganism having isoleucine producing ability may be included in the scope of the present application without limitation as long as the microorganism capable of introducing and expressing the protein having the citramalate synthase activity.
  • Examples include Escherichia sp., Shigella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp., Enterobacter sp.
  • the microorganism of the present application is a microorganism belonging to the genus Corynebacterium, more specifically Corynebacterium glutamicum, but is not limited thereto.
  • It provides a method for producing L-isoleucine, comprising recovering L-isoleucine from the microorganism or the medium.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium into which a gene encoding a protein having citramalate synthase activity is introduced is as described above.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be a gene encoding a citramalate synthase derived from Methanocaldococcus ( Methanocaldococcus ), specifically SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7
  • a gene encoding citramalate synthase having an amino acid sequence selected from the group consisting of 9, 11, 13, and 15 may be introduced.
  • microorganism of the genus Corynebacterium is an enhanced activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase (3-isopropylmalate dehydrogenase) and isopropylmalate dehydratase (3-isopropylmalate dehydratase) Can be. Further, the microorganism of the genus Corynebacterium may additionally be inactivated activity of pyruvate dehydrogenase.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium may be Corynebacterium glutamicum into which a gene encoding citramalate synthase is introduced.
  • the step of culturing the Corynebacterium microorganism according to the present application is not particularly limited, but may be performed by a known batch culture method, continuous culture method, fed-batch culture method.
  • the culture conditions are not particularly limited, but using a basic compound (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg phosphoric acid or sulfuric acid) to an appropriate pH (eg pH 5 to 9, specifically PH 6 to 8) can be adjusted.
  • a basic compound eg sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg phosphoric acid or sulfuric acid
  • an appropriate pH eg pH 5 to 9, specifically PH 6 to 8
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to inhibit bubble generation.
  • Oxygen or an oxygen-containing gas mixture may be introduced into the culture to maintain aerobic conditions and the incubation temperature may be maintained at 20 to 45 ° C., specifically 25 to 40 ° C. Cultivation continues until the desired amount of L-isoleucine is achieved, and can usually be incubated for 10 to 160 hours to achieve this goal. L-isoleucine produced by the culture may be secreted into the medium or remain in the cell.
  • the culture medium used may include sugars and carbohydrates (e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), fats and fats (e.g. soybean oil, sunflower seeds) as carbon sources.
  • sugars and carbohydrates e.g. glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • fats and fats e.g. soybean oil, sunflower seeds
  • fatty acids e.g. palmitic acid, stearic acid and linoleic acid
  • alcohols e.g. glycerol and ethanol
  • organic acids e.g. acetic acid
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea, or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and Ammonium nitrate) and the like can be used individually or in combination. However, it is not limited to this.
  • potassium dihydrogen phosphate dipotassium hydrogen phosphate
  • the corresponding sodium-containing salts may be used individually or in combination, but is not limited thereto. It may also include, but is not limited to, essential growth-promoting substances such as other metal salts (eg magnesium sulfate or iron sulfate), amino acids and vitamins.
  • other metal salts eg magnesium sulfate or iron sulfate
  • the method for producing isoleucine may be further supplied with acetate in the culturing step of the microorganism of the genus Corynebacterium.
  • the method for recovering the L-isoleucine produced in the culturing step may be carried out from the culture medium using a suitable method known in the art according to a culturing method, for example, a batch, continuous or fed-batch culturing method.
  • Amino acids can be collected.
  • centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization and HPLC may be used, but is not limited to these.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium into which a gene encoding a protein having citramalate synthase activity is introduced is as described above.
  • the microorganism of the genus Corynebacterium having L-isoleucine production capacity of the present application is introduced through the new biosynthetic pathway that does not utilize L-threonine as a precursor due to the introduction of citramalate synthase activity. Isoleucine can be produced in high yield.
  • Genomic DNA was extracted from Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661.
  • the cimealdococcus Yanashi DSM 2661-derived citramalate synthase has a 491 amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 1, and the cimA gene encoding it has a base sequence as set out in SEQ ID NO: 2.
  • PCR was carried out using the extracted gDNA as a template and primer pairs of SEQ ID NOs: 35 and 36. In this case, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 60 seconds of stretching at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of desired size, which was named "cimA (M) fragment".
  • Primer cimA-5-NdeI (SEQ ID NO .: 35):
  • PCR was performed using p117-cj7-gfp containing a promoter cj7 derived from a microorganism of the genus Corynebacterium as a template (Korean Patent No. 10-0620092). Where 'p117' is E. coli - Corynebacterium shuttle vector) pECCG117 (Biotechnology Letters 13 (10): 721-726, 1991). The PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 20 seconds of annealing at 56 ° C, and 30 seconds at 72 ° C using primer pairs of SEQ ID NOs: 27 and 28.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 323 bp size, which was named "cj7 fragment”.
  • fusion PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 27 and 36. The PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 60 seconds of stretching at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 1799 bp size, which was named "cj7-cimA (M) fragment".
  • the cj7-cimA (M) fragment obtained above was treated with restriction enzymes KpnI and XbaI, and then ligation with the linear p117 fragment treated with the same restriction enzyme.
  • the recombinant vector thus prepared was transformed into E. coli DH5 ⁇ cells by heat shock (hereinafter referred to as heat shock transformation), which was plated in LB solid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight at 37 ° C.
  • heat shock transformation heat shock transformation
  • One cultivated colony of platinum was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit (Qiagen, catalog # 27104, hereinafter identical). .
  • the preparation of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzymes KpnI and XbaI.
  • the primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 30 were used for 30 seconds denaturation at 95 ° C, 30 seconds annealing at 56 ° C, and 90 seconds at 72 ° C. Clones were identified by PCR under conditions of 30 repetitions.
  • the recombinant vector obtained therefrom was named "p117-cj7-cimA (M)".
  • Primer 117-F (SEQ ID NO .: 29):
  • 3-isopropylmalate dehydrogenase and isopropylmalate dehydrolase derived from a microorganism of the genus Corynebacterium leuBCD gene fragment encoding isopropylmalate dehydratase was prepared as follows.
  • Isopropylmalate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 has a 340 amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 17, and the leuB gene encoding it has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 18 .
  • PCR was performed using the extracted gDNA as a template and primer pairs of SEQ ID NOs: 31 and 32. In this case, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 60 seconds of stretching at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of a desired size, which was named "leuB fragment”.
  • Primer leuB-5-cimA (SEQ ID NO .: 31):
  • PCR was performed using gDNA of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template to obtain a 2078 bp fragment containing an ORF of the leuCD gene encoding isopropylmaleate dehydratase (EC4.2.1.33). .
  • the leuC gene encodes a large subunit of isopropylmaleate dehydratase, wherein the leuC gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 has a nucleotide sequence as set out in SEQ ID NO: 20, from which sequence The polypeptide having an amino acid sequence set forth as No. 19 is encoded.
  • the leuD gene encodes a small subunit of isopropylmaleate dehydratase, and the leuD gene from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 has a nucleotide sequence as set out in SEQ ID NO: 22. Encoding a polypeptide having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 21.
  • the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 80 seconds at 72 ° C using primer pairs of SEQ ID NOs: 33 and 34.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of desired size, which was named "leuCD fragment”.
  • the leuB fragment and the leuCD fragment obtained above were used as a template, and fusion PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 31 and 34.
  • the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 120 seconds of stretching at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a 3437 bp size band, which was named "leuBCD fragment”.
  • the recombinant vector p117-cj7-cimA (M) prepared in Example ⁇ 1-2> was treated with XbaI, and Example ⁇ 1-3>.
  • the leuBCD fragments obtained at were treated with restriction enzyme XbaI and then these two fragments were ligated.
  • the recombinant vector thus produced was transformed into E. coli DH5 ⁇ cells by heat shock, which was plated in LB solid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight at 37 ° C.
  • One cultivated colony of platinum was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • the preparation of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme XbaI.
  • the primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 30 were denatured at 95 ° C for 30 seconds, annealed at 56 ° C for 30 seconds, and stretched for 180 seconds at 72 ° C for 30 times. Clones were identified by PCR under repeated conditions.
  • the recombinant vector obtained therefrom was named "p117-cj7-cimA (M) -leuBCD".
  • a cimA (M) fragment obtained in Example ⁇ 1-1> was used as a template and a diversified PCR random mutagenesis was used.
  • kit, Clonetech, catalog # 630703 the PCR reaction was performed under the condition of the mutation reaction 4 in Table III of the product user manual.
  • primer pairs of SEQ ID NOs: 35 and 36 were used, and 25 cycles of denaturation at 95 ° C. and 30 seconds extension at 68 ° C. were performed.
  • cimA (M) m fragment The PCR product (hereinafter referred to as "cimA (M) m fragment") was obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and then eluting.
  • CimA obtained in Example ⁇ 1-5> obtained by treating recombinant vector p117-cj7-cimA (M) prepared in Example ⁇ 1-2> with restriction enzymes NdeI and XbaI and then treated with the same restriction enzyme Ligation with (M) m fragments.
  • the recombinant vector thus produced was transformed into E. coli DH5 ⁇ cells by heat shock, which was plated in LB solid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight at 37 ° C. The cultured colonies were collected and plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit to obtain "p117-cj7-cimA (M) m. Mutation library ".
  • Threonine dehydratase is an enzyme that converts L-threonine, a precursor of L-isoleucine biosynthesis, to 2-ketobutyric acid.
  • the threonine dehydratase from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 23, and the ilvA gene encoding it has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 24.
  • any protein having substantially threonine dehydratase activity is included in the scope of the present application without limitation.
  • genomic DNA extracted from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 using the genome-tip system (Qiagen) was used as a template, and a primer pair of SEQ ID NOs: 37 and 38, and SEQ ID NO: PCR was performed using primer pairs of 39 and 40, respectively.
  • the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C., 30 seconds of annealing at 56 ° C., and 45 seconds of elongation at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluted with bands of 547 bp and 467 bp, respectively.
  • Two fragments of the ilvA gene obtained above were used as a template and fusion PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 37 and 40. In this case, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 60 seconds of stretching at 72 ° C.
  • DilvA fragment obtained above was treated with restriction enzyme XbaI, and then ligated with a linear pDZ fragment obtained by treating pDZ vector (Korean Patent No. 10-0924065) with the same restriction enzyme to produce an ilvA gene-deficient recombinant vector. It was.
  • the recombinant vector thus prepared was transformed into E. coli DH5 ⁇ cells by heat shock, which was plated in LB solid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight at 37 ° C.
  • One cultivated colony of platinum was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • Preparation of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme XbaI, using primer pairs of SEQ ID NOs: 41 and 42, followed by 30 seconds denaturation at 95 ° C., 30 seconds annealing at 56 ° C., and 90 seconds elongation at 72 ° C. Clones were identified by PCR under conditions of 30 repetitions.
  • the recombinant vector obtained therefrom was named "pDZ-ilvA (Del)".
  • Primer ilvA-3-XbaI (SEQ ID NO .: 40):
  • the recombinant vector pDZ-ilvA (Del) prepared in Example ⁇ 2-1> was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 by electroporation, followed by a solid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml. Smear was selected to select single colonies.
  • strains in which the pDZ-ilvA (Del) vector was introduced into the chromosome by the second pass were selected.
  • GDNA obtained from each of the above selected strains was used as a template, and PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 43 and 44. At this time, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 90 seconds at 72 ° C.
  • genomic DNA extracted from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was used as a template, and PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 45 and 46 below. At this time, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 90 seconds at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 2666 bp size, which was named "lysC-asd fragment”.
  • Genomic DNA extracted from Nebacterium glutamicum ATCC13032 was used as a template and PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 47 and 48. At this time, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 90 seconds at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 2633 bp size, which was named "hom-thrB fragment”.
  • PCR was carried out using primers of SEQ ID NOs: 49 and 50 as templates. In this case, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 60 seconds of stretching at 72 ° C.
  • PCR results amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 1703 bp size, which was named "thrC fragment”.
  • Primer thrC-3-ilvA (SEQ ID NO: 50):
  • PCR was performed using the extracted genomic DNA as a template and primer pairs of SEQ ID NOs: 51 and 52 shown below. In this case, the PCR reaction was repeated 30 times with 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 60 seconds of stretching at 72 ° C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 1862 bp size, which was named "ilvA fragment”.
  • the thrC fragment and ilvA fragment obtained above were used as a template, and fusion PCR was performed using primer pairs of SEQ ID NOs: 49 and 52. At this time, the PCR reaction was repeated 30 times in 30 seconds denaturation at 95 °C, 30 seconds annealing at 56 °C and 120 seconds elongation process at 72 °C.
  • PCR products amplified therefrom were obtained by electrophoresis on 1.0% agarose gel and eluting a band of 3565 bp size, which was named "thrC-ilvA fragment”.
  • Example ⁇ 2-3> In order to prepare L-isoleucine biosynthetic pathway gene-enhanced recombinant vector, the lysC-asd fragment obtained in Example ⁇ 2-3> was treated with restriction enzymes KpnI and SfoI, and then linear p117 fragment treated with KpnI and EcoRV. And ligation.
  • Plasmid DNA was recovered in the same manner as in Example ⁇ 1-2>. Whether or not the recombinant vector was prepared was cloned by PCR under the conditions of repeating 30 sec denaturation at 95 ° C., 30 sec annealing at 56 ° C., and 100 sec elongation at 72 ° C. with primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 30. Confirmed. The recombinant vector obtained therefrom was named "p117-lysC-asd".
  • the hom-thrB fragment obtained in Example ⁇ 2-3> was treated with the restriction enzyme BamHI and then ligated with the linear p117-lysC-asd fragment treated with BamHI.
  • Plasmid DNA was recovered in the same manner as in Example ⁇ 1-2>. Whether to construct a recombinant vector was cloned by PCR under the conditions of repeating 30 seconds of denaturation at 95 ° C, 30 seconds of annealing at 56 ° C, and 180 seconds of elongation at 72 ° C with primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 30. Confirmed. The recombinant vector obtained therefrom was named "p117-lysC-asd-hom-thrB".
  • the thrC-ilvA fragment obtained in Example ⁇ 2-3> was treated with the restriction enzyme SpeI, and then ligated with the linear p117-lysC-asd-hom-thrB fragment treated with SpeI.
  • Plasmid DNA was recovered in the same manner as in Example ⁇ 1-2>. Whether or not the recombinant vector was prepared was confirmed by the PCR under the conditions of 30 times of denaturation at 95 ° C., 30 seconds of annealing at 56 ° C., and 300 seconds at 72 ° C. with primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 30. It was.
  • the resulting recombinant vector was termed "p117-IBGC (Isoleucine Biosynthesis Genes Cluster)", which contains six lysC, asd, hom, thrB, thrC and ilvA gene fragments involved in L-isoleucine biosynthesis.
  • p117-IBGC Isoleucine Biosynthesis Genes Cluster
  • Recombinant vectors p117-cj7-cimA (M) and p117-cj7-cimA (M) prepared in the strains Corynebacterium glutamicum ATCC13032 in Examples ⁇ 1-2>, ⁇ 1-4>, and ⁇ 2-4> ) -leuBCD and p117-IBGC were introduced by electroporation, respectively, and single colonies were selected by plating them in solid medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • strains selected therefrom were corynebacterium glutamicum "ATCC13032 / p117-cj7-cimA (M)", “ATCC13032 / p117-cj7-cimA (M) -leuBCD” and "ATCC13032 / p117-IBGC”, respectively. Named it.
  • p117-cj7-cimA (M) and p117-cj7-cimA (M) -leuBCD were also transferred to the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ ilvA strain prepared in Example ⁇ 2-2>, respectively.
  • Single colonies were selected by introduction into the perforation method and plated in solid medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin.
  • the strains selected therefrom were named Corynebacterium glutamicum "ATCC13032 ⁇ ilvA / p117-cj7-cimA (M)" and "ATCC13032 ⁇ ilvA / p117-cj7-cimA (M) -leuBCD", respectively.
  • the strains were inoculated in 250 ml Erlenmeyer flasks containing 25 ml of titer medium containing glucose as shown in the following Table 1, and then incubated for 30 hours at 32 °C, 200 rpm incubator.
  • the L-isoleucine concentration produced therefrom is shown in Table 2 below.
  • the wild type strain ATCC13032 lacking the ilvA gene produced 0.02 g / L of L-isoleucine
  • -IBGC produced 0.70 g / L of L-isoleucine, which showed a 3400% improvement in L-isoleucine production compared to wild type.
  • the transforming strains ATCC13032 / p117-cj7-cimA (M) and ATCC13032 / p117-cj7-cimA (M) -leuBCD produced 0.83 g / L and 1.25 g / L of L-isoleucine, respectively. Isoleucine production was 4050% and 6150% higher than wild type, respectively.
  • the ATCC13032 ⁇ ilvA strain lacking the ilvA gene lost the production of L-isoleucine, but the ATCC13032 ⁇ ilvA / p117-cj7-cimA (M) strain in which the cimA gene was introduced was 0.08 g / L, cimA.
  • Acetate lacking the aceE gene encoding pyruvate dehydrogenase of wild-type Corynebacterium glutamicum ATCC13032 for the supply of acetyl-CoA used as a precursor of the cimA gene ( acetate) was produced and named "ATCC13032 ⁇ aceE" (Schreiner et al ., J Bacteriol. 187: 6005-18, 2005).
  • the pyruvate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum ATCC13032 has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and the aceE gene encoding it has the base sequence set forth in SEQ ID NO: 26.
  • the recombinant vectors p117-cj7-cimA (M) and p117-cj7-cimA (M) m mutant libraries prepared in Example 1 were introduced into the ATCC13032 ⁇ aceE strain prepared above by electroporation.
  • the thus prepared strains were named "ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M)" and "ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) m mutant library", respectively.
  • the strains ATCC13032 ⁇ aceE, ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) and ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) m mutant libraries were plated in a solid medium containing 25 ⁇ g / ml of kanamycin to form a single colony. After screening, the selected strains were evaluated for titer on L-isoleucine productivity.
  • titer evaluation was performed using a titer medium containing acetate in the form of ammonium acetate (Ammonium acetate) as shown in Table 3 below.
  • the strains were inoculated in a 250 ml Erlenmeyer flask containing 25 ml titer medium and then incubated for 30 hours in an incubator at 32 ° C., 200 rpm. From this, seven colonies with increased L-isoleucine concentration were selected, and a list thereof and L-isoleucine concentration produced are shown in Table 4 below.
  • the parent strain ATCC13032 ⁇ aceE strain produced 0.05 g / L L-isoleucine, but the transforming strains produced 0.84 ⁇ 2.23 g / L L-isoleucine It showed improved L-isoleucine production compared to the parent strain, which is about 1580% to 4360% improvement in L-isoleucine production compared to the parent strain.
  • the transforming strain ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) m3 showed the highest L-isoleucine production capacity compared to the parent strain ATCC13032 ⁇ aceE.
  • CimA (M) m1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, which can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • CimA (M) m2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, which may be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6;
  • CimA (M) m3 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 which can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8;
  • CimA (M) m4 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, which can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10;
  • CimA (M) m5 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, which can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12;
  • CimA (M) m6 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, which can be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14;
  • CimA (M) m7 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, which may be encoded from a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
  • E. coli DH5 ⁇ cells were transformed by heat shock with a recombinant vector prepared therefrom, which were plated in LB solid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and incubated overnight at 37 ° C.
  • One platinum incubated above was inoculated in 3 ml of LB liquid medium containing kanamycin 25 ⁇ g / ml and cultured overnight, and then plasmid DNA was recovered using a plasmid miniprep kit.
  • the production of the recombinant vector was confirmed by treatment with restriction enzyme XbaI, and the repetition process of 30 seconds denaturation at 95 ° C., 30 seconds annealing at 56 ° C., and 180 seconds extension at 72 ° C. was carried out with primer pairs of SEQ ID NOs: 29 and 30.
  • the clone was confirmed by performing PCR under the following condition.
  • the recombinant vector was named "p117-cj7-cimA (M) m3-leuBCD".
  • P117-cj7-cimA (M) of Example ⁇ 1-2>, p117-cj7-cimA (M) -leuBCD of Example ⁇ 1-4>, p117-cj7-cimA of Example ⁇ 3-1> (M) m3 and p117-cj7-cimA (M) m3-leuBCD of Example ⁇ 3-2> were respectively introduced into the ATCC13032 ⁇ aceE strain used in Example ⁇ 3-1> by electroporation, followed by kanamycin 25 Single colonies were selected by plating on solid medium containing ⁇ g / ml.
  • the parent strain ATCC13032 ⁇ aceE produced 0.04 g / L of L-isoleucine, but the transforming strain ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) was 0.98 g / L, ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) -leuBCD yielded L-isoleucine production of 2.09 g / L, which was 0.94 g / L and 2.05 g / L higher than the parent strain, respectively.
  • transgenic strains ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) m3 and ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) comprising the cimA (M) m3 mutant gene obtained in Example ⁇ 3-1> m3-leuBCD showed L-isoleucine production of 2.22 g / L and 3.76 g / L, respectively. This is an increase of 5450% and 9300% of the parent strain, respectively, indicating that CimA (M) m3 mutants were more effective in increasing L-isoleucine production than the wild type.
  • ATCC13032 ⁇ aceE / p117-cj7-cimA (M) m3 was named “Corynebacterium glutamicum CA10-1002” and as of February 27, 2015 under the Treaty of Budapest. It was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) and was given accession number KCCM11672P.
  • Recombinant vectors p117-cj7-cimA (M), p117-cj7-cimA (M) -leuBCD, p117-cj7-cimA (M) m3 and p117 used in Examples ⁇ 3-1> and ⁇ 3-2> -cj7-cimA (M) m3-leuBCD was introduced into the L-isoleucine producing strain Corynebacterium glutamicum KCCM11248P (Korean Patent No. 10-1335789) by electroporation, and kanamycin 25 ⁇ g / ml Single colonies were selected by smearing these solid media.
  • Selected strains were KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M), KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M) -leuBCD, KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M) m3 and KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M), respectively.
  • M KCCM11248P / p117-cj7-cimA
  • M KCCM11248P / p117-cj7-cimA
  • M m3
  • strains were cultured in an Erlenmeyer flask using the isoleucine titer medium prepared in the composition of Table 6 as described below to confirm L-isoleucine productivity.
  • the parent strain KCCM11248P produced 3.33 g / L of L-isoleucine, but the transforming strain KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M) was 4.04 g / L, KCCM11248P / p117-cj7- cimA (M) -leuBCD was 4.82 g / L, which showed 0.71 g / L and 1.49 g / L L-isoleucine production, respectively.
  • the transforming strains KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M) m3 and KCCM11248P / p117-cj7-cimA (M) m3-leuBCD showed L-isoleucine production of 4.71 g / L and 11.21 g / L, respectively. This is an increase of 41.4% and 236.6%, respectively.

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Abstract

본 출원은 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물, 및 이를 이용하여 L-이소루신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-이소루신을 생산하는 방법
본 출원은 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물 및 이를 이용하여 L-이소루신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
분지쇄 아미노산(branched-chain amino acid)은 L-발린, L-루신 및 L-이소루신 3종을 지칭하는 것으로, 식품 첨가제, 약학제 등의 용도로 산업적으로 이용된다. 특히, L-이소루신은 근육에서 대사되어 에너지를 생성하며, 헤모글로빈의 생성에 관여하여 피로 경감과 성장 촉진 기능을 한다. 이에 따라, 수액제제 및 영양제 등 다양하게 이용되고 있으며 스포츠 영양식품에도 사용이 증가되고 있다.
미생물을 이용한 L-이소루신의 생합성은 피루브산(pyruvate)과 2-케토부티르산(2-ketobutyrate)을 전구체로 사용하여 3개의 중간대사 물질을 거쳐 합성된다(Jinhwan Park et al., Appl. Microbial. Biotechnol. 85: 491-506, 2010).
그러나, L-이소루신 생합성 단계 중 L-쓰레오닌으로부터 2-케토부티르산을 생성하는 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase, 유전자 ilvA)와 다음 단계의 아세토하이드록시산 신타아제(acetohydroxy acid synthase, 유전자 ilvBN)는 모두 L-이소루신에 의해 피드백 저해를 받는다.
따라서, L-이소루신에 의한 피드백 해제를 통해 생합성에 관련된 효소들을 조절하는 것이 고수율의 L-이소루신 생산 균주를 만드는 데에 중요한 요소임을 알 수 있다(Jinhwan Park et al., Biotechnology Journal, 560-577, 2010). 이와 더불어 분지쇄 아미노산은 피루브산(pyruvate)까지 동일한 생합성 경로를 통해 생성되기 때문에, 고수율의 L-이소루신을 대량 생산하기 위해서는 2-케토부티르산 전단계인 L-쓰레오닌의 원활한 공급이 이루어져야 한다(대한민국 등록특허 제10-0823044호).
본 발명자들은 L-쓰레오닌을 전구체로 이용하지 않는 신규 생합성 경로를 검토하던 중, 시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 유전자를 L-이소루신 생합성 경로에 도입한 결과 L-이소루신 생산이 향상된 것을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 목적은 신규 생합성 경로가 도입된 L-이소루신 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적은 상기 신규 생합성 경로가 도입된 재조합 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 미생물 또는 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는, L-이소루신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 시트라말레이트 신타아제 활성이 도입되어 L-쓰레오닌을 전구체로 이용하지 않는 새로운 생합성 경로를 통해 L-이소루신을 고수율로 생산할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 출원의 일 양태는 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 포함하는 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물을 제공한다.
본 출원에서 용어 "L-이소루신"은 필수 아미노산의 하나로 구조적으로 L-발린, L-루신과 함께 분지쇄 아미노산에 해당하는 화학식 HO2CCH(NH2)CH(CH3)CH2CH3인 L-아미노산을 의미한다.
본 출원에서 용어 "L-이소루신 생산능을 가지는"은 해당 미생물이 배지에서 배양될 때 배지 또는 미생물 내에 L-이소루신을 축적할 수 있는 능력을 나타냄을 의미한다. 이러한 L-이소루신 생성능은 야생형 균주에 의해 보유된 특성이거나 균주 개량에 의해 부여된 또는 증강된 특성일 수 있다.
예를 들어, L-이소루신 생산능을 갖기 위해서 해당 미생물은 영양 요구성 변이주, 아날로그 내성 변이주, 또는 대사 제어 변이주의 취득, 또는 L-이소루신 생합성 관련 효소의 활성을 강화시키는 등의 재조합 변이주의 제작 등 미생물의 변형에 이용된 방법을 단독 또는 조합으로 적용할 수 있다.
또한, L-이소루신 생합성 관련 효소 활성을 강화하는 경우, 강화되는 L-이소루신 생합성에 관여하는 유전자, 구체적으로 ilvG, ilvM, ilvE, ilvD 및 ilvA 유전자는 단독 또는 2종 이상으로 조합하여 강화될 수 있다. 상기 ilvG, ilvM, ilvE, ilvD 및 ilvA 유전자는 각각 아세토하이드록시산 신타제의 이소자임 II의 대형 서브유니트, 소형 서브유니트, 트랜스아미나제, 디하이드록시산 데하이드라타제 및 쓰레오닌 데아미나제를 암호화한다.
본 출원에서 용어 "시트라말레이트 신타아제(EC2.3.1.182)"는 아세틸-CoA와 파이루베이트를 시트라말레이트 및 코엔자임 A(coenzyme A)로 변환하는 과정을 촉매하는 효소이다. 이 효소는 메타노칼도코커스 야나시(Methanocaldococcus jannaschii)(Howell et al., J Bacteriol. 181: 331-333, 1999), 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interogans)(Xu et al., J Bacteriol. 186: 5400-5409, 2004), 지오박터 설푸레두센스(Geobacter sulfurreducens) 등의 고세균류에서 발견되며 이소루신 생합성의 쓰레오닌-비의존형 경로에 참여한다(Risso et al., J Bacteriol. 190: 2266-2274, 2008). 상기 효소는 기질로서 파이루베이트에 대한 특이성이 높고, 전형적으로 이소루신에 의해 저해되는 것으로 공지되어 있다.
본 출원에서 용어 "시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질" 및 "이를 코딩하는 유전자"에는 상기와 같은 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로는, 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질은 메타노칼도코커스 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 메타노칼도코커스 야나시 유래일 수 있다. 상기 시트라말레이트 신타아제는 서열번호: 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 cimA 유전자는 서열번호: 2로 기재되는 염기 서열을 갖는다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 개시된 서열번호에 한정되지 않는다.
또한, 실질적으로 서열번호: 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
나아가, 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 서열번호: 1의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
또한, 상기 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다. 그러나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 시트라말레이트 신타아제 활성이 향상된 변이형을 수득하기 위하여, 서열번호: 1의 단백질의 변이형으로서 본 출원은 error-prone PCR을 이용하여 수득된 CimA(M) 돌연변이 라이브러리를 제공한다.
구체적으로, 본 출원에 따른 CimA(M) 돌연변이 라이브러리는
서열번호: 3의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m1(구체적으로 서열번호: 4의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 5의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m2(구체적으로 서열번호: 6의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m3(구체적으로 서열번호: 8의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 9의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m4(구체적으로 서열번호: 10의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 11의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m5(구체적으로 서열번호: 12의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음);
서열번호: 13의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m6(구체적으로 서열번호: 14의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음); 및
서열번호: 15의 아미노산 서열을 가지는 CimA(M)m7(구체적으로 서열번호: 16의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있음)을 포함할 수 있다.
또한, 실질적으로 상기 서열번호의 아미노산 서열과 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 시트라말레이트 신타아제 변이체의 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
본 출원에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고(예, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989 참고), 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, 본 출원의 미생물은 메타노칼도코커스 야나시 유래 서열번호: 1의 시트라말레이트 신타아제 및 이의 변이체로서 서열번호: 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로는 상기 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터를 미생물 내로 형질전환시켜 목적 유전자를 발현시킬 수 있다.
본 출원에서 사용된 용어 "재조합 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 재조합 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 재조합 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 제작될 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 숙주세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 도입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
한편, 본 출원의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 활성이 강화된 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "단백질의 활성의 강화"란, 당해 단백질의 활성이 야생형 또는 변이 전 상태에 비하여 활성이 증가되는 것을 의미한다. 구체적으로, 당해 단백질을 코딩하는 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자의 증폭, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현 조절서열의 변형, 특히 프로모터 교체 또는 변형 및 유전자 내 돌연변이에 의한 단백질 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제 또는 이소프로필말레이트 디하이드라타아제 단백질의 활성을 강화시키는 것은
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열의 변형,
3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 상기 유전자 발현의 억제 조절 인자의 결실, 또는
4) 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기에서 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 cj7 프로모터(대한민국 등록특허 제10-0620092호 및 WO 2006/065095), EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으며, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 유래 프로모터인 cj7 프로모터와 작동가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
본 출원에서 용어 "이소프로필말레이트 디하이드로게나아제" 및 "이소프로필말레이트 디하이드라타아제"는 L-루신, L-이소루신 및 L-발린 생합성 경로에 관여하는 효소로서, 이들 활성을 가지는 단백질 및 이를 코딩하는 유전자에는 상기와 같은 효소 활성을 가지는 임의의 단백질 및 이를 코딩하는 임의의 유전자가 제한 없이 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(EC1.1.1.85)는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 한편, 본 출원의 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 17로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 실질적으로 서열번호: 17의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 상기 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 17로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 유전자는 개시된 서열번호에 한정되지 않으나, 예를 들면 서열번호: 18의 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다.
또한, 본 출원에서 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(EC4.2.1.33)는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 한편, 본 출원의 이소프로필말레이트 디하이드라타아제는 2개의 소단위(small/large subunits)로 구성되는데, 이들 각각은 서열번호: 19 및 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 실질적으로 서열번호: 19 및 21의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 이소프로필말레이트 디하이드라타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 상기 이소프로필말레이트 디하이드라타아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 19 및 서열번호: 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 유전자는 개시된 서열번호에 한정되지 않는다. 예를 들면 서열번호: 20 및 서열번호: 22의 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다.
한편, 본 출원의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 활성이 강화된 L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 효소를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 효소"에는 아스파르테이트 키나아제(aspartate kinase, lysC 유전자), 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase, asd 유전자), 호모세린 디하이드로게나아제(homoserine dehydrogenase, hom 유전자), 호모세린 키나아제(homoserine kinase, thrB 유전자), 쓰레오닌 신타아제(threonine synthase, thrC 유전자), 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase, ilvA 유전자), 아미노트랜스퍼라제(aminotransferase, ilvE 유전자) 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 출원의 구체적 실시양태에서 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 불활성화된 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "파이루베이트 디하이드로게나아제(EC1.2.4.1)"는 파이루베이트를 아세틸-CoA 및 CO2로 전환시키는 효소이다. 본 출원에서는 cimA 유전자의 전구체로 사용되는 아세틸-CoA의 공급을 증가시키기 위해 상기 효소를 코딩하는 aceE 유전자가 결손된 균주를 제조할 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 파이루베이트 디하이드로게나아제(EC1.2.4.1)는 코리네박테리움 속 미생물 유래일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 한편, 본 출원의 파이루베이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 25로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다. 또한, 실질적으로 서열번호: 25의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 파이루베이트 디하이드로게나아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
또한, 상기 파이루베이트 디하이드로게나아제를 코딩하는 유전자는 서열번호: 25로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 가질 수 있다. 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하거나, 또는 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해 기능상 동일한 다수의 핵산이 임의의 소정의 단백질을 코딩할 수 있기 때문에, 상기 유전자는 개시된 서열번호에 한정되지 않는다. 예를 들면, 서열번호: 26의 염기 서열을 가질 수 있으며, 이와 상동성이 80%, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 99% 이상인 염기서열을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어 "불활성화"란, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나, 유전자 발현에 있어 불완전한 발현으로 인한 활성의 감소를 나타내거나, 발현되더라도 기능성이 있는 해당 폴리펩티드를 생산하지 않는 것을 의미한다.
또한, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 완전하게 불활성화되어 있는 것뿐만 아니라 그 발현 수준이 현저하게 낮아 실질적으로 발현되지 않는 것도 포함되는 의미이다. 따라서, 유전자 불활성화는 완전(녹-아웃)하거나 부분적(예를 들면, 유전자가 정상의 발현 수준 미만을 나타내는 저차형 유전자(hypomorph)이거나 이것이 영향을 미치는 활성에 있어서 부분적인 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 생성물)일 수 있다.
나아가, 본 출원에서 해당 폴리펩티드의 "불활성화"에는 변형되지 않은 균주에 비해 해당 폴리펩티드의 활성이 감소된 것뿐만 아니라 이의 활성이 제거된 경우도 포함한다. 구체적으로, 본 출원에서 쓰레오닌 디하이드라타아제의 불활성화는,
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기에서 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세균 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더욱 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더욱 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있다.
다음으로, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절서열을 변형하는 방법은, 특별히 이에 한정되지 않으나, 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열 상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 출원의 또 다른 구체적 실시양태에서 이소류신 생산능을 가지는 미생물은 상기 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질이 도입되어 발현될 수 있는 미생물이면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함될 수 있다. 예로는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속 (Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속 (Arcanobacterium sp.), 알칼리제네스 속(Alcaligenes sp) 등에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 본 출원의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물이며, 보다 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰이나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 양태는
시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
상기 미생물 또는 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계를 포함하는, L-이소루신 생산 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
간략히 설명하면, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 메타노칼도코커스(Methanocaldococcus) 유래의 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
또한, 본 출원에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)의 활성이 강화된 것일 수 있다. 나아가, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 추가적으로 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)의 활성이 불활성화된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 일예에 따른 코리네박테리움 속 미생물은 시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 유전자가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 본 출원에 따른 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다.
이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8)를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있다. 배양은 원하는 L-이소루신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속되며, 이러한 목적을 달성하기 위해 보통 10 내지 160시간 동안 배양할 수 있다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-이소루신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다, 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 구체적 실시양태에서 이소류신을 생산하는 방법은 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양 단계에서 아세테이트가 추가로 공급될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 배양 단계에서 생산된 L-이소루신을 회수하는 방법은 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예컨대, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 양태는
시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의 이소류신 생산 용도를 제공한다.
상기 용도에 있어서, 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 설명한 바와 같이, 본 출원의 L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물은 시트라말레이트 신타아제 활성이 도입되어 L-쓰레오닌을 전구체로 이용하지 않는 새로운 생합성 경로를 통해 L-이소루신을 고수율로 생산할 수 있다.
실시예 1: 메타노칼도코커스 유래의 cimA 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
<1-1> 메타노칼도코커스 유래의 cimA 유전자 단편의 준비
시트라말레이트 신타아제를 코딩하는 cimA 유전자(NC_000909.1)의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 1476 bp 단편을 얻기 위해, 제노믹-팁 시스템(Genomic-tip system, Qiagen)을 이용하여 메타노칼도코커스 야나시(Methanocaldococcus jannaschii) DSM 2661로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
메타노칼도코커스 야나시 DSM 2661 유래 시트라말레이트 신타아제는 서열번호: 1로 기재되는 491개의 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 cimA 유전자는 서열번호: 2로 기재되는 염기 서열을 갖는다.
상기에서 추출된 gDNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 35 및 36의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "cimA(M) 단편"이라 명명하였다.
프라이머 cimA-5-NdeI (서열번호: 35):
5'-GCATCATATGATGGTAAGGATATTC-3'
프라이머 cimA-3-XbaI (서열번호: 36):
5'-CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT-3'
<1-2> 재조합 벡터 p117- cj7 - cimA(M)의 제작
공지된 코리네박테리움 속 미생물 유래의 프로모터 cj7을 포함하는 p117-cj7-gfp를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다(대한민국 등록특허 제10-0620092호). 여기서 'p117'은 대장균-코리네박테리움 셔틀 벡터(E. coli-Corynebacterium shuttle vector)인 pECCG117(Biotechnology Letters 13(10): 721-726, 1991)을 나타내는 것이다. 상기 PCR 반응은 하기 서열번호: 27 및 28의 프라이머 쌍을 사용하여 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 20초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 323 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "cj7 단편"이라 명명하였다.
프라이머 Pcj7-5-KpnI(서열번호: 27):
5'-GATGGTACCACCCCAGAAACATCCCAGC-3'
프라이머 Pcj7-3 NdeI(서열번호: 28):
5'-CGATCATATGGAGTGTTTCCTTTCGTTGGG-3'
상기에서 준비한 cj7 단편과 상기 실시예 <1-1>에서 제작한 cimA(M) 단편을 주형으로 하고, 서열번호: 27 및 36의 프라이머 쌍을 사용하여 융합(sewing) PCR을 실시하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1799 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "cj7-cimA(M) 단편"이라 명명하였다.
상기에서 수득한 cj7-cimA(M) 단편을 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 선형 p117 단편과 라이게이션(ligation)하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환(heat shock transformation, 이하 동일함)시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트(Qiagen, 카달로그# 27104, 이하 동일함)를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 하기 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-cj7-cimA(M)"이라 명명하였다.
프라이머 117-F(서열번호: 29):
5'-CCACAGCCGACAGGATGGTGA-3'
프라이머 117-R(서열번호: 30):
5'-CTCAGGGTGTAGCGGTTCGGT-3'
<1-3> 2-케토부티르산 생합성 경로에 관여하는 leuBCD 유전자 단편의 준비
2-케토부티르산 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 코리네박테리움 속 미생물 유래의 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)를 코딩하는 leuBCD 유전자 단편을 하기와 같이 준비하였다.
먼저, 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(EC1.1.1.85)을 코딩하는 leuB 유전자의 ORF를 포함하는 1359 bp 단편을 얻기 위해, 제노믹-팁 시스템(Qiagen)을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 17로 기재되는 340개의 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 leuB 유전자는 서열번호: 18로 기재되는 염기 서열을 가진다.
상기에서 추출된 gDNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 31 및 32의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "leuB 단편"이라 명명하였다.
프라이머 leuB-5-cimA(서열번호: 31):
5'-TTGTTGAATTAATCTAGAGGTGACACCCCAGTGG-3'
프라이머 leuB-3-leuC(서열번호: 32):
5'-TCGCAGCTGCCACCGATATTTAGCTTTGCAGCGC-3'
이소프로필말레이트 디하이드라타아제(EC4.2.1.33)를 코딩하는 leuCD 유전자의 ORF를 포함하는 2078 bp 단편을 얻기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 gDNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하였다.
leuC 유전자는 이소프로필말레이트 디하이드라타아제의 큰 소단위(large subunit)을 코딩하는데, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 leuC 유전자는 서열번호: 20으로 기재되는 염기 서열을 가지며 이로부터 서열번호: 19로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩한다. 또한, leuD 유전자는 이소프로필말레이트 디하이드라타아제의 작은 소단위(small subunit)를 코딩하는데, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 leuD 유전자는 서열번호: 22로 기재되는 염기 서열을 가지며 이로부터 서열번호: 21로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 코딩한다.
상기 PCR 반응은 하기 서열번호: 33 및 34의 프라이머 쌍을 사용하여 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 80초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 원하는 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "leuCD 단편"이라 명명하였다.
프라이머 leuC-5-leuB(서열번호: 33):
5'-GCGCTGCAAAGCTAAATATCGGTGGCAGCTGCGA-3'
프라이머 leuD-3-XbaI(서열번호: 34):
5'-TGGCGGCCGCTCTAGAGCTTTCGCTATCAGACTG-3'
상기에서 수득한 leuB 단편과 leuCD 단편을 주형으로 하고 서열번호: 31 및 34의 프라이머 쌍을 사용하는 융합 PCR을 실시하였다. PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 120초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 3437 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "leuBCD 단편"이라 명명하였다.
<1-4> 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)-leuBCD의 제작
2-케토부티르산 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)를 XbaI으로 처리하고, 상기 실시예 <1-3>에서 수득한 leuBCD 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 이들 두 단편을 라이게이션하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 상기 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 180초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-cj7-cimA(M)-leuBCD"라 명명하였다.
<1-5> Eerror-prone PCR을 이용한 cimA(M) 변이체 단편의 준비
cimA 유전자에 무작위 변이가 도입된 DNA 풀(pool)을 확보하기 위하여, 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 cimA(M) 단편을 주형으로 하고 다양화 PCR 랜덤 돌연변이화 키트(diversify PCR random mutagenesis kit, Clonetech, 카달로그# 630703)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 제품 사용자 매뉴얼의 표 Ⅲ 내 돌연변이화 반응 4를 조건으로 하여 진행되었다. 이를 위해 하기 서열번호: 35 및 36의 프라이머 쌍을 사용하였으며, 95℃에서 30초의 변성 및 68℃에서 30초의 신장 과정을 25회 반복 수행하였다.
이로부터 염기 치환변이가 무작위적으로 도입된 cimA(M) 유전자 변이체 풀(mutated art cimA DNA pool)을 PCR 결과물로 수득하였다. 상기 PCR 결과물(이하, "cimA(M)m 단편"이라 명명함)을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 용리하여 수득하였다.
프라이머 cimA-5-NdeI(서열번호: 35):
5'-GCATCATATGATGGTAAGGATATTC-3'
프라이머 cimA-3-XbaI(서열번호: 36):
5'-CGATCTAGATTAATTCAACAACATGTT-3'
<1-6> p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리의 제작
상기 실시예 <1-2>에서 제작한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)를 제한효소 NdeI 및 XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 상기 실시예 <1-5>에서 수득된 cimA(M)m 단편과 라이게이션하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니들을 모아 플라스미드 미니프랩 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하여 "p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리"를 제작하였다.
실시예 2: cimA 유전자 도입을 통한 L-이소루신 생산능 부여 확인
메타노칼도코커스 유래의 cimA 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입한 경우 L-이소루신 생산능이 부여되는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저 쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase)를 코딩하는 ilvA 유전자가 제거된 균주를 제작하고, 이 균주에 cimA 유전자를 도입하여 L-이소루신 생산능이 회복되는지 여부를 확인하였다.
쓰레오닌 디하이드라타아제는 L-이소루신 생합성의 전구체인 L-쓰레오닌을 2-케토부티르산으로 전환시키는 효소이다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 쓰레오닌 디하이드라타아제는 서열번호: 23으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 ilvA 유전자는 서열번호: 24로 기재되는 염기 서열을 갖는다. 또한, 실질적으로 쓰레오닌 디하이드라타아제 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 본 출원의 범주에 포함된다.
<2-1> ilvA 유전자 결손 벡터의 제작
ilvA 유전자의 단편을 얻기 위해, 제노믹-팁 시스템(Qiagen)을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 37 및 38의 프라이머 쌍과, 서열번호: 39 및 40의 프라이머 쌍을 사용하여 각각 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 45초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 각각 547 bp 및 467 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다.
상기에서 수득한 ilvA 유전자의 두 단편을 주형으로 하고 하기 서열번호: 37 및 40의 프라이머 쌍을 사용하는 융합 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1014 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였다. 이렇게 수득된 ilvA 유전자가 결손된 단편을 "DilvA"라고 명명하였다.
상기에서 수득한 DilvA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 pDZ 벡터(대한민국 등록특허 제10-0924065호)를 처리하여 수득한 선형 pDZ 단편과 라이게이션하여 ilvA 유전자 결손 재조합 벡터를 제작하였다.
이렇게 제작된 재조합 벡터를 대장균 DH5α 세포에 열 충격으로 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 하기 서열번호: 41 및 42의 프라이머 쌍을 사용하고 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "pDZ-ilvA(Del)"라 명명하였다.
프라이머 ilvA-5-XbaI(서열번호: 37):
5'-GCATCTAGAGAACACGGACAATGCCAC-3'
프라이머 ilvA-Del-R(서열번호: 38):
5'-CAAACAGCGTGATGTCCTGAGTGAGCTGCGCT-3'
프라이머 ilvA-Del-F(서열번호: 39):
5'-AGCGCAGCTCACTCAGGACATCACGCTGTTTG-3'
프라이머 ilvA-3-XbaI(서열번호: 40):
5'-GCATCTAGAACCTGCGGCACACCTTGGGC-3'
프라이머 Topo-F(서열번호: 41):
5'-GCAGTGAGCGCAACGCAAT-3'
프라이머 Topo-R(서열번호: 42):
5'-CGTTGTAAAACGACGGCCA-3'
<2-2> ilvA 유전자 결손 균주의 제작
모균주로서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 상기 실시예 <2-1>에서 제작된 재조합 벡터 pDZ-ilvA(Del)를 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
이로부터 2차 계대(passage)에 의해 pDZ-ilvA(Del) 벡터가 염색체 내로 도입된 균주를 각각 선발하였다. 상기 선발된 각 균주로부터 수득한 gDNA를 주형으로 하고, 하기 서열번호: 43 및 44의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 ilvA 유전자가 결손된 균주를 획득하였고, 이를 "ATCC13032△ilvA" 균주라 명명하였다.
프라이머 CFilvA(서열번호: 43):
5'-GATCTGTGATGAGGTGATG-3'
프라이머 CRilvA(서열번호: 44):
5'-CGTCCTTCCATGACTCTCA-3'
<2-3> L-이소루신 생합성 경로에 관여하는 유전자 단편의 준비
L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 코리네박테리움 속 미생물 유래의 lysC, asd, hom, thrB, thrC 및 ilvA 유전자 단편을 하기와 같이 준비하였다.
먼저, 아스파르테이트 키나아제(aspartate kinase) 및 아스파르테이트-β-세미알데히드 디하이드로게나아제(aspartate-β-semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 lysC-asd 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 45 및 46의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 2666 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "lysC-asd 단편"이라 명명하였다.
프라이머 lysC-5-KpnI(서열번호: 45):
5'-TGAGGTACCCATGCGATTGTTAATGC-3'
프라이머 asd-3-SfoI(서열번호: 46):
5'-CTAGGCGCCAGTGTAGCACTCAAGCGGA-3'
호모세린 디하이드로게나아제(homoserine dehydrogenase) 및 호모세린 키나아제(homoserine kinase)를 코딩하는 hom-thrB 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 47 및 48의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 90초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 2633 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "hom-thrB 단편"이라 명명하였다.
프라이머 hom-5-BamHI(서열번호: 47):
5'-CTAGGATCCCTCACCATTCTCAATGGT-3'
프라이머 thrB-3-BamHI(서열번호: 48):
5'-CTAGGATCCGCCTTCCTTGTTGGGC-3'
쓰레오닌 신타아제(threonine synthase)를 코딩하는 thrC 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 49 및 50의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1703 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "thrC 단편"이라 명명하였다.
프라이머 thrC-5-SpeI(서열번호: 49):
5'-TGCACTAGTGAGAACATACAGGTTCCA-3'
프라이머 thrC-3-ilvA(서열번호: 50):
5'-GGCATTGTCCGTGTTCTTACTTCACGGAAGTG-3'
쓰레오닌 디하이드라타아제(threonine dehydratase)를 코딩하는 ilvA 유전자의 ORF를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, 상기 실시예 <2-1>에 기재한 바와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 하기 서열번호: 51 및 52의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 60초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 1862 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "ilvA 단편"이라 명명하였다.
프라이머 ilvA-5-thrC(서열번호: 51):
5'-CACTTCCGTGAAGTAAGAACACGGACAATGCC-3'
프라이머 ilvA-3-SpeI(서열번호: 52):
5'-TGCACTAGTACCTGCGGCACACCTTGGGC-3'
상기에서 획득한 thrC 단편과 ilvA 단편을 주형으로 하고 서열번호: 49 및 52의 프라이머 쌍을 사용하여 융합 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 120초의 신장 과정을 30회 반복 수행하였다.
이로부터 증폭된 PCR 결과물을 1.0% 아가로스 겔에서 전기 영동한 후 3565 bp 크기의 밴드를 용리하여 수득하였고, 이를 "thrC-ilvA 단편"이라 명명하였다.
<2-4> L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 벡터의 제작
L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터를 제조하기 위하여, 상기 실시예 <2-3>에서 획득한 lysC-asd 단편을 제한효소 KpnI과 SfoI으로 처리한 후, KpnI과 EcoRV로 처리된 선형 p117 단편과 라이게이션하였다.
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 제작 여부는 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 100초 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-lysC-asd"라 명명하였다.
상기 실시예 <2-3>에서 수득한 hom-thrB 단편을 제한효소 BamHI으로 처리한 후, BamHI으로 처리된 선형 p117-lysC-asd 단편과 라이게이션하였다.
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 제작 여부는 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 180초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-lysC-asd-hom-thrB"라 명명하였다.
상기 실시예 <2-3>에서 수득한 thrC-ilvA 단편을 제한효소 SpeI으로 처리한 후, SpeI으로 처리된 선형 p117-lysC-asd-hom-thrB 단편과 라이게이션하였다.
상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 회수하였다. 재조합 벡터의 제작 여부는 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 300초의 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다.
이로부터 수득된 재조합 벡터를 "p117-IBGC (Isoleucine Biosynthesis Genes Cluster)"라 명명하였고, 이는 L-이소루신 생합성에 관연하는 6종의 lysC, asd, hom, thrB, thrC 및 ilvA 유전자 단편을 포함하는 L-이소루신 생합성 경로 유전자 강화 재조합 벡터이다.
<2-5> L-이소루신 생산능 비교
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 실시예 <1-2>, <1-4> 및 <2-4>에서 제조한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M), p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 및 p117-IBGC를 각각 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 이로부터 선별된 균주들을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 "ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)", "ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD" 및 "ATCC13032/p117-IBGC"로 명명하였다.
또한, 상기 실시예 <2-2>에서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032△ilvA 균주에도 상기와 같이 p117-cj7-cimA(M) 및 p117-cj7-cimA(M)-leuBCD를 각각 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다. 이로부터 선별된 균주들을 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 "ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)" 및 "ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD"로 명명하였다.
이렇게 준비된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, ATCC13032/p117-IBGC, ATCC13032/p117-cj7-cimA(M), ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, ATCC13032△ilvA, ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M) 및 ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD를 대상으로 L-이소루신 생산성에 대한 역가 평가를 진행하였다.
구체적으로, 하기 표 1의 조성과 같이 포도당이 함유된 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 상기 균주들을 각각 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 동안 배양하였다. 이로부터 생산된 L-이소루신 농도는 하기 표 2에 나타내었다.
조성물 농도(리터당)
포도당 60 g
KH2PO4 1.1 g
(NH4)2SO4 20 g
MgSO4·7H2O 1.2 g
FeSO4·7H2O 90 mg
MnSO4·4H2O 90 mg
Thiamine-HCl 4.5 mg
d-Biotin 0.9 mg
HSM 20 g
탄산칼슘 30 g
pH 7.0
균주 L-이소루신(g/L)
ATCC13032 0.02
ATCC13032/p117-IBGC 0.70
ATCC13032/p117-cj7-cimA(M) 0.83
ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 1.25
ATCC13032△ilvA 0.00
ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M) 0.08
ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 0.15
상기 표 2에 기재된 바와 같이, ilvA 유전자가 결손되지 않은 야생형 균주 ATCC13032는 0.02 g/L의 L-이소루신을 생산하였고, L-이소루신 생합성 경로 유전자 6종을 동시에 도입한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-IBGC는 0.70 g/L의 L-이소루신을 생산하여 야생형 대비 3400% 향상된 L-이소루신 생산능을 보였다.
또한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)과 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD는 각각 0.83 g/L와 1.25 g/L의 L-이소루신을 생산하였고, 이는 L-이소루신 생산능이 야생형 대비 각각 4050% 및 6150% 향상된 것이다.
이로부터 L-이소루신 생합성 경로 자체를 강화한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-IBGC보다 기존의 L-이소루신 생합성 경로에 cimA 유전자를 추가 도입한 형질전환균주 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)의 L-이소루신 생산능이 더 우수함을 확인하였다. 또한, leuBCD 유전자를 추가로 강화한 형질전환 균주 ATCC13032/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD의 L-이소루신 생산능은 보다 더 우수할 수 있음을 확인하였다.
한편, ilvA 유전자를 결손한 ATCC13032△ilvA 균주는 L-이소루신의 생산능을 상실하였으나, 여기에 cimA 유전자가 도입된 ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M) 균주는 0.08 g/L, cimA 유전자가 도입되고 leuBCD 유전자를 강화한 ATCC13032△ilvA/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 균주는 0.15 g/L의 L-이소루신을 생산하였다.
상기 결과는 L-쓰레오닌을 전구체로 사용하는 기존의 L-이소루신 생합성 경로가 아닌 cimA 유전자 도입을 통한 신규 생합성 경로를 이용하여 L-이소루신 생산이 가능함을 보여주는 것이다.
실시예 3: 형질전환된 재조합 균주의 제조 및 L-이소루신 생산성 비교
<3-1> 야생형 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 재조합 균주의 제조
cimA 유전자의 전구체로 사용되는 아세틸-CoA(acetyl-CoA)의 공급을 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)를 코딩하는 aceE 유전자가 결손된 아세테이트(acetate) 요구성 균주를 제조하고, 이 균주를 "ATCC13032△aceE"라 명명하였다(Schreiner et al., J Bacteriol. 187: 6005-18, 2005).
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 파이루베이트 디하이드로게나아제는 서열번호: 25로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 aceE 유전자는 서열번호: 26으로 기재되는 염기 서열을 갖는다.
상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M)과 p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리를 상기에서 제조한 ATCC13032△aceE 균주에 전기천공법으로 도입하였다. 이렇게 제작된 균주를 각각 "ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)" 및 "ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리"로 명명하였다.
상기 균주 ATCC13032△aceE, ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M) 및 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m 돌연변이 라이브러리를 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별한 후 선별된 균주들을 대상으로 L-이소루신 생산성에 대한 역가 평가를 진행하였다.
구체적으로, 역가 평가는 하기 표 3의 조성과 같이 암모늄아세테이트(Ammonium acetate) 형태로 아세테이트를 함유한 역가 배지를 이용하여 수행되었다. 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 상기 균주들을 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 동안 배양하였다. 이로부터 L-이소루신 농도가 증가한 콜로니 7종을 선별하였고, 이의 목록과 생산된 L-이소루신 농도를 하기 표 4에 나타내었다.
조성물 농도(리터당)
포도당 60 g
C2H7NO2 5 g
KH2PO4 1.1 g
(NH4)2SO4 20 g
MgSO4·7H2O 1.2 g
FeSO4·7H2O 90 mg
MnSO4·4H2O 90 mg
Thiamine-HCl 4.5 mg
d-Biotin 0.9 mg
HSM 20 g
탄산칼슘 30 g
pH 7.0
균주 L-이소루신(g/L)
ATCC13032△aceE 0.05
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M) 0.84
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m1 1.02
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m2 1.35
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3 2.23
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m4 1.24
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m5 0.96
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m6 1.73
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m7 0.97
그 결과, 상기 표 4에 기재된 바와 같이, 모균주인 ATCC13032△aceE 균주는 0.05 g/L의 L-이소루신을 생산하였으나, 형질전환 균주들은 0.84 ~ 2.23 g/L의 L-이소루신을 생산하여 모균주에 비해 향상된 L-이소루신 생산능을 나타내었고, 이는 모균주 대비 L-이소루신 생산능이 약 1580% 내지 4360% 향상된 것이다. 이들 중에서 특히 형질전환 균주 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3이 모균주인 ATCC13032△aceE 대비 가장 높은 L-이소루신 생산능을 보였다.
표 4와 같이 L-이소루신 생산능 증가를 보여 선별된 변이형 cimA(M) 유전자의 변이 위치와 각 변이의 치환된 아미노산을 확인하기 위하여 시퀀싱(sequencing)을 진행하였다.
그 결과, CimA(M)m 돌연변이 라이브러리로서,
CimA(M)m1은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 4의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m2는 서열번호: 5의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 6의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m3은 서열번호: 7의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 8의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m4는 서열번호: 9의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 10의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m5는 서열번호: 11의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 12의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m6은 서열번호: 13의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 14의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있고;
CimA(M)m7은 서열번호: 15의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 16의 염기 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로부터 코딩될 수 있다.
<3-2> 선별된 p117- cimA(M)m 돌연변이 라이브러리 중 가장 활성이 높은 p117-cj7-cimA(M)m3을 이용한 재조합 균주의 제조
상기 실시예 <3-1>에서 가장 높은 L-이소루신 생산능을 나타내는 것으로 선별된 p117-cj7-cimA(M)m3 벡터를 XbaI으로 처리한 후, 실시예 <1-3>에서 수득한 leuBCD 단편을 제한효소 XbaI으로 처리하여 획득한 DNA 단편과 라이게이션하였다.
이로부터 제작된 재조합 벡터로 대장균 DH5α 세포를 열 충격에 의해 형질전환시켰고, 이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 고체 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양한 콜로니 한 백금이를 카나마이신 25 μg/ml 함유 LB 액체 배지 3 ml에 접종하여 밤새 배양한 후, 플라스미드 미니프랩 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 회수하였다.
재조합 벡터의 제작 여부는 제한효소 XbaI으로 처리하여 확인하였으며, 서열번호: 29 및 30의 프라이머 쌍으로 95℃에서 30초의 변성, 56℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 180초의 신장 과정을 30회 반복하는 조건으로 PCR을 수행하여 클론을 확인하였다. 상기 재조합 벡터를 "p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD"라 명명하였다.
상기 실시예 <1-2>의 p117-cj7-cimA(M), 실시예 <1-4>의 p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, 실시예 <3-1>의 p117-cj7-cimA(M)m3 및 실시예 <3-2>의 p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD를 실시예 <3-1>에서 사용된 ATCC13032△aceE 균주에 각각 전기천공법으로 도입한 후 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주들을 상기 표 3의 조성에 따라 포도당이 함유된 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 30시간 배양하여 L-이소루신 생산성을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
균주 L-이소루신(g/L)
ATCC13032△aceE 0.04
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M) 0.98
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 2.09
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3 2.22
ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD 3.76
상기 표 5에 기재된 바와 같이, 모균주 ATCC13032△aceE는 0.04 g/L의 L-이소루신을 생산하였으나, 형질전환 균주 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)는 0.98 g/L, ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD는 2.09 g/L로 모균주보다 각각 0.94 g/L 및 2.05 g/L 상승한 L-이소루신 생산량을 보였다.
또한 실시예 <3-1>에서 수득한 cimA(M)m3 변이형 유전자를 포함하는 형질전환 균주 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3과 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD는 각각 2.22 g/L와 3.76 g/L의 L-이소루신 생산량을 보였다. 이는 모균주 대비 각각 5450%와 9300% 증가한 것으로서 CimA(M)m3 변이형이 그 야생형보다 L-이소루신 생산능 증가에 효과적임을 보여주는 결과이다.
상기 실시예를 통하여 획득한 형질전환 균주 중에서 ATCC13032△aceE/p117-cj7-cimA(M)m3을 "코리네박테리움 글루타미쿰 CA10-1002"로 명명하고 부다페스트 조약 하에 2015년 2월 27일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11672P를 부여 받았다.
<3-3> L-이소루신 생산 균주 KCCM11248P를 이용한 재조합 균주의 제조
상기 실시예 <3-1> 및 <3-2>에서 사용된 재조합 벡터 p117-cj7-cimA(M), p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, p117-cj7-cimA(M)m3 및 p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD를 각각 L-이소루신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P(대한민국 등록특허 제10-1335789호)에 전기천공법으로 도입하고, 카나마이신 25 μg/ml이 포함된 고체 배지에 도말하여 단일 콜로니를 선별하였다.
선별된 균주를 각각 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M), KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 및 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD로 명명하였다.
이들 균주를 하기 표 6의 조성으로 만들어진 이소루신 역가 배지를 이용하여 삼각 플라스크에서 아래 기술한 방법과 같이 배양하여 L-이소루신 생산성을 확인하였다.
조성물 농도(리터당)
포도당 45 g
BM 10 g
KH2PO4 1.1 g
(NH4)2SO4 12.5 g
MgSO4·7H2O 1.2 g
FeSO4·7H2O 180 mg
MnSO4·4H2O 180 mg
ZnSO4·5H2O 0.9 mg
CuSO4·5H2O 0.9 mg
Thiamine-HCl 9 mg
d-Biotin 1.8 mg
Ca-Pantothenate 9 mg
NCA 60 mg
HSM 20 g
탄산칼슘 30 g
pH 7.0
구체적으로, 모균주 KCCM11248P와, 형질전환 균주 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M), KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD, KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 및 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD를 표 6의 조성과 같이 포도당이 포함된 25 ml의 역가 배지를 함유한 250 ml 삼각 플라스크에 접종한 다음, 이를 32℃, 200 rpm의 배양기에서 60시간 배양하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
균주 L-이소루신(g/L)
KCCM11248P 3.33
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M) 4.04
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD 4.82
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3 4.71
KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD 11.21
상기 표 7에 기재된 바와 같이, 모균주 KCCM11248P는 3.33 g/L의 L-이소루신을 생산하였으나, 형질전환 균주 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)는 4.04 g/L, KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)-leuBCD는 4.82 g/L로 모균주보다 각각 0.71 g/L 및 1.49 g/L 증가한 L-이소루신 생산량을 보였다.
반면, 형질전환 균주 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3과 KCCM11248P/p117-cj7-cimA(M)m3-leuBCD는 각각 4.71 g/L와 11.21 g/L의 L-이소루신 생산량을 보였고, 이는 모균주 대비 각각 41.4%와 236.6% 증가한 것이다.
이는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 사용한 실시예 <3-2>의 결과와 마찬가지로 CimA(M)m3 변이형이 그 야생형보다 L-이소루신 생산능 증가에 효과적임을 다시 한번 입증하는 결과이다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 본 출원의 범위를 제한하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 본 출원의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2016011923-appb-I000001

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는 L-이소루신을 생산하는 방법:
    시트라말레이트 신타아제(citramalate synthase) 활성을 가지는 단백질을 포함하는 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계, 및
    상기 미생물 또는 배지로부터 L-이소루신을 회수하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제가 메타노칼도코커스 속(genus Methanocaldococcus) 미생물 유래인, L-이소루신을 생산하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제가 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 추가적으로 활성이 강화된 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제(3-isopropylmalate dehydrogenase) 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제(3-isopropylmalate dehydratase)를 포함하는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 추가적으로 불활성화된 파이루베이트 디하이드로게나아제(pyruvate dehydrogenase)를 포함하는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물의 배양 단계에서 아세테이트가 추가적으로 공급되는, L-이소루신을 생산하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, L-이소루신을 생산하는 방법.
  8. 시트라말레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 포함하는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 시트라말레이트 신타아제가 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 활성이 강화된 이소프로필말레이트 디하이드로게나아제 및 이소프로필말레이트 디하이드라타아제 단백질을 포함하는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 불활성화된 파이루베이트 디하이드로게나아제를 포함하는, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인, L-이소루신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
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