WO2015199396A1 - O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 o-아세틸 호모세린을 생산하는 방법 - Google Patents

O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 o-아세틸 호모세린을 생산하는 방법 Download PDF

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서주희
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김소영
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배지연
손성광
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia

Definitions

  • the invention and using an Escherichia (escherichia) in the microorganism and the microorganism producing the O- acetyl-homoserine to a method of producing O- acetyl homoserine in high yield.
  • Escherichia Escherichia
  • O-acetyl homoserine acts as a precursor of methionine, a type of essential amino acid in vivo.
  • Methionine is a type of essential amino acid in vivo, and is widely used as a raw material for not only feed and food additives, but also for liquid preparations and pharmaceuticals.
  • Methionine is produced through biological and chemical synthesis. Recently, a two-stage method of producing L-methionine by enzymatic conversion reaction from L-methionine precursor produced through fermentation is also known (International Publication No. WO2008 / 013432).
  • O-succinyl homoserine and O-acetyl homoserine may be used as methionine precursors, and O-acetyl homoserine is produced in high yield for economic mass production of methionine. It is very important to.
  • the present inventors have made intensive efforts to increase the production of O-acetyl homoserine, and as a result, it was found that when the expression or activity of the citrate synthase protein is decreased, O-acetyl homoserine can significantly increase the production capacity.
  • the invention has been completed.
  • One object of the present invention is to provide a microorganism that produces O-acetyl homoserine with improved O-acetyl homoserine production capacity.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing O-acetyl homoserine using the microorganism.
  • O-acetyl homoserine When using a microorganism having O-acetyl homoserine production capacity according to the present invention, O-acetyl homoserine can be produced in a higher yield and environmentally friendly than chemical synthesis.
  • the produced O-acetyl homoserine can be used as a precursor of methionine and acetic acid synthesis by O-acetyl homoserine sulfhydrylase can bioconvert L-methionine with high efficiency, and the converted L-methionine is an animal It can be widely used in the production of human food or food additives as well as feed or animal feed additives.
  • 1 is a diagram showing an expression cassette design for preparation of a citrate synthase active attenuated strain.
  • Fig. 2 shows a cleavage map of the pBAD24-citrate synthase antisense RNA (asRNA) vector.
  • an Escherichia genus microorganism that produces O-acetyl homoserine, in which the intrinsic citrate synthase protein activity is attenuated or inactivated.
  • O-acetyl homoserine refers to an acetyl-derivative of L-homoserine as a specific intermediate material on the methionine biosynthetic pathway of a microorganism.
  • the O-acetyl homoserine may be produced by enzymatic activity of transferring acetyl groups of acetyl-CoA to homoserine by using homoserine and acetyl-CoA as substrates.
  • microorganism having O-acetyl homoserine producing ability is a prokaryotic or eukaryotic microorganism strain capable of producing O-acetyl homoserine in organisms, and O- Microorganisms endowed with the ability to produce acetyl homoserine, or microorganisms with inherent O-acetyl homoserine production capacity. O-acetyl homoserine production capacity can be imparted or enhanced by species improvement.
  • the microorganisms having the O-acetyl homoserine-producing ability are, Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp.
  • the genus Corynebacterium (Corynebacteria sp.), Pseudomonas species (Pseudomonas sp.), leptospira in (leptospira), Salmonella genus (Salmonella sp.), in breather ratio bacteria (Brevibacteria sp.), Scientific Pseudomonas genus (Hypomononas sp .), Chromobacterium sp. And Norcardia sp., Or fungi or yeast microorganism strains belonging to (yeast) may be included.
  • microbial strain and yeast of the genus Escherichia, Corynebacterium, and Leptospira More specifically, it is a microbial strain of the genus Escherichia , and may be, for example, Escherichia coli .
  • the microorganism having the O-acetyl homoserine producing ability may be a strain producing L-lysine, L-threonine, L-isoleucine or L-methionine, or a derivative thereof, but is not limited thereto.
  • the term “citrate synthase (EC 2.3.3.1)” refers to the first step of the TCA cycle, which mediates the reaction between oxaloacetate and acetyl-CoA. Specifically, the condensation reaction between the acetate residue with two carbons of acetyl-CoA and the acetate with four carbons is mediated to produce six carbonated citrate.
  • the citrate synthase is named GltA, and in the present invention, the citrate synthase is mixed with GltA.
  • the citrate synthase may be derived from Escherichia microorganisms, and more specifically, may be E. coli-derived GltA.
  • the citrate synthase may be a protein encoded from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90% homology.
  • sequence having homology and the amino acid sequence having a citrate synthase activity substantially the same as or corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added It is obvious that it is included in the category of.
  • polynucleotide sequences encoding the same amino acid sequence and variants thereof due to the genetic code degeneracy are also included in the present invention.
  • intrinsic activity refers to the state of activity of a protein originally possessed by a microorganism or before modification of the protein.
  • the activity of the protein is weakened or inactivated compared to the intrinsic activity means that the activity is reduced or absent compared to the natural state when compared to the activity of the protein inherent in the natural state of the microorganism.
  • the weakening may be caused by a mutation of the gene encoding the protein, such that the activity of the protein itself is reduced compared to the activity of the protein originally possessed by the microorganism, and the inhibition of expression or translation of the gene encoding the protein in the cell. If the overall degree of protein expression is lower than the natural strain, the concept also includes a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the inactivation includes a case in which the expression of a gene encoding a protein is not expressed at all as compared to a native strain, and a case in which there is no activity even when expressed.
  • Attenuation or inactivation of such protein activity can be achieved by the application of various methods well known in the art.
  • the method include a method of replacing a gene encoding the protein on a chromosome with a mutated gene such that the activity of the enzyme is reduced, including when the activity of the protein is removed; Introducing a mutation into an expression control sequence of a gene on a chromosome encoding said protein; Replacing the expression control sequence of the gene encoding the protein with a sequence with weak or no activity; Deleting all or part of a gene on a chromosome that encodes the protein; Introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to a transcript of a gene on the chromosome to inhibit translation from the mRNA to a protein; How to make a secondary structure by the addition of a sequence complementary to the SD sequence in front of the SD sequence of the gene encoding the protein to make the ribosomes impossible
  • a method of deleting part or all of a gene encoding a protein includes a polynucleotide encoding a target protein inherent in a chromosome through a chromosomal insertion vector in a microorganism into a polynucleotide or a marker gene in which some polynucleotide sequences are deleted. By replacement.
  • a method of deleting a gene by homologous recombination may be used, but is not limited thereto.
  • "part" in the above may vary depending on the type of polynucleotide, but may be specifically 1 to 300, more specifically 1 to 100, even more specifically 1 to 50, but is specifically limited to It is not.
  • the method of modifying the expression control sequence is carried out by inducing a mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or a combination thereof to further weaken the activity of the expression control sequence, By replacing with a polynucleotide sequence with weaker activity.
  • the expression control sequence may include, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, and a sequence that controls termination of transcription and translation.
  • a method of modifying a gene sequence on a chromosome may be performed by inducing a mutation on the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, to further weaken the activity of the protein, or to perform weaker activity. It may be carried out by replacing with a gene sequence that is improved to have or a gene sequence that has been modified to have no activity, but is not limited thereto.
  • a method of replacing some amino acids in the amino acid sequence of the citrate synthase protein with another amino acid may be used. More specifically, it may include a citrate synthase having an amino acid sequence in which the 145th amino acid or the 167th amino acid of the amino acid sequence of the citrate synthase protein is substituted with a different amino acid from tyrosine (Y) or lysine (K).
  • the amino acid sequence of the citrate synthase protein is a gene encoding a mutant polypeptide substituted with tyranine (Y), which is the 145th amino acid, to alanine (A) and 167th amino acid, which is substituted with lysine (K) to alanine (A) It may be replaced with a sequence.
  • Y tyranine
  • the amino acid residues are numbered with the number 1 amino acid located after methionine encoded by the start codon.
  • the polypeptide may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, respectively.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another may be determined by known techniques. For example, homology can be determined by aligning sequence information and directly aligning sequence information between two polynucleotide molecules or two polypeptide molecules using readily available computer programs.
  • the computer program may be BLAST (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign TM (DNASTAR Inc), and the like.
  • homology between polynucleotides can be determined by hybridization of polynucleotides under conditions of stable double-stranding between homologous regions, followed by digestion with single-strand-specific nucleases to determine the size of the digested fragments.
  • homologous refers to a relationship between a superfamily-derived protein in all grammatical or spelling variants and a homologous protein from another species, and refers to a protein having a "common evolutionary origin". Such proteins (and their coding genes) have sequence homology reflected by a high degree of sequence similarity. However, in general use and in the present invention, “homology” refers to sequence similarity when modified by an adjective such as "very high” and does not mean a common evolutionary origin.
  • the microorganism may further contain intrinsic activity of cystathionine gamma synthase (EC 2.5.1.48), homoserine kinase (EC 2.7.1.39), or both. It may be weakened or inactivated as compared to.
  • cystathione gamma synthase is an enzyme capable of synthesizing cystathionine by a chemical reaction as follows based on O-succinyl homoserine and L-cysteine.
  • cystathion gamma synthase derived from E. coli is named MetB.
  • the cystathionine gamma synthase derived from E. coli is not particularly limited thereto, and has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or 70% or more thereof, specifically 80% or more, more specifically 90% or more homology. Protein encoded from an amino acid sequence.
  • the sequence is homologous and has an amino acid sequence having cystathionine gamma synthase activity substantially the same as or corresponding to that of SEQ ID NO: 9, some sequences may have a deleted, modified, substituted or added amino acid sequence. It is obvious that it is included in the scope of the present invention.
  • polynucleotide sequences that encode the same amino acid sequence and variants thereof due to the degeneracy of the genetic code.
  • the method of weakening and deactivating the activity of such cystathionine gamma synthase may be performed according to the method described above.
  • homoserine kinase refers to an enzyme that performs phosphorylation of homoserine and performs a chemical reaction as follows.
  • E. coli-derived homoserine kinase is named ThrB.
  • the homoserine kinase derived from Escherichia coli is not particularly limited thereto, but may be selected from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or an amino acid sequence having 70% or more, specifically 80% or more, and more specifically 90% or more homology thereto. It may be a protein to be encoded.
  • the amino acid sequence having homoserine kinase activity substantially the same as or corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, even if some sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added It is obvious that it is included in the category.
  • polynucleotide sequences that encode the same amino acid sequence and variants thereof due to the degeneracy of the genetic code.
  • the method of attenuating and inactivating such homoserine kinase can be carried out according to the method described above.
  • the microorganism may further be introduced or enhanced homoserine O-acetyltransferase activity, or the endogenous homoserine O-succinyltransferase may be mutated to have the activity of O-acetyltransferase. have.
  • homoserine O-acetyltransferase (EC 2.3.1.31) means an enzyme having an activity capable of transferring an acetyl group from acetyl-CoA to homoserine.
  • the microorganism according to the present invention may be introduced into the activity of homoserine O-acetyltransferase.
  • the homoserine O-acetyltransferase may be derived from various microbial species, for example, from a strain selected from the genus Corynebacterium, Leptospira, Deinococcus, Pseudomonas, or Mycobacterium. It may be one protein.
  • homoserine O-acetyltransferase comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (Leptospira meeri), SEQ ID NO: 14 (Corynebacterium glutamicum) or SEQ ID NO: 15 (Denococcus radiodurance), Homoserine O-acetyltransferase, but is not limited thereto. It may also be a protein encoded from the amino acid sequence of the sequence number or 70% or more, specifically 80% or more, more specifically 90% or more homology thereof. Also included in the invention are polynucleotide sequences that encode the same amino acid sequence and variants thereof due to the degeneracy of the genetic code.
  • a protein in which the endogenous homoserine O-succinyltransferase (EC 2.3.1.46) is mutated to have the activity of homoserine O-acetyltransferase may be selected from a polypeptide having homoserine O-succinyltransferase activity. It refers to a variant polypeptide whose substrate specificity is converted from CoA to acetyl-CoA.
  • the mutated protein is not particularly limited thereto, and may be a polypeptide having homoserine O-acetyltransferase activity unlike wild type by replacing a part of the amino acid sequence of the polypeptide having homoserine O-succinyltransferase activity. .
  • the homoserine O-succinyltransferase is a polypeptide derived from the genus Enterobacteria, Salmonella, Pseudomonas, Bacillus, Escherichia, and specifically, from the genus Escherichia.
  • Polypeptide having lase activity for example, polypeptide having homoserine O-succinyltransferase activity from E. coli .
  • the E. coli-derived homoserine O-succinyltransferase may be a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, but is not limited thereto.
  • Homoserine O-succinyltransferase derived from E. coli is named MetA.
  • the mutated homoserine O-succinyltransferase was substituted with glutamic acid at amino acid 111 of the polypeptide consisting of SEQ ID NO: 16 or a polypeptide having at least 95% homology with the polypeptide sequence, and further amino acid 112 with threonine.
  • variant polypeptides substituted with histidine may be a polypeptide having an amino acid sequence of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17 to 19.
  • the protein may be a protein encoded from an amino acid sequence having at least 70%, specifically at least 80%, more specifically at least 90% homology with the amino acid sequence of the SEQ ID NO.
  • polynucleotide sequences that encode the same amino acid sequence and variants thereof due to the degeneracy of the genetic code.
  • Information on the mutated homoserine O-succinyltransferase can be obtained from Korean Patent Publication No. 10-2012-0070531 or International Publication WO2012 / 087039, the entirety of which is incorporated herein by reference. .
  • the term "introduce or enhance activity” means to give the activity of the protein to a microorganism that does not have a specific protein activity, to increase the intracellular activity in a microorganism having the activity of the protein, etc. , Means to increase the intracellular activity of the protein compared to the endogenous activity.
  • Such “introduction or enhancement of protein activity” includes not only the increase in the activity of the protein itself to elicit effects beyond its original function, but also the increase in intrinsic gene activity, intrinsic gene amplification from internal or external factors, and increase in gene copy number. , But the activity is increased by introduction of genes from outside, replacement or modification of expression control sequences, and increase in enzyme activity by mutation, and the like.
  • the gene copy number increase in the above is not particularly limited, but may be performed in a form operably linked to a vector or by inserting into a chromosome in a host cell.
  • a host capable of being cloned and functioning independently of a host, to which a polynucleotide encoding a protein of the present invention is operably linked may be performed by introducing into a host cell, or the host is operably linked to the polynucleotide.
  • a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome in the cell may be introduced into the host cell to increase the copy number of the gene in the chromosome of the host cell.
  • the vector is a DNA preparation containing a polynucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target protein operably linked to a suitable regulatory sequence to allow expression of the target protein in a suitable host, the regulatory sequence capable of initiating transcription. Promoter, any operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosomal binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation. After being transformed into a suitable host cell, the vector can be replicated or function independent of the host genome and integrated into the genome itself.
  • the vector to be used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A can be used as the phage vector or cosmid vector
  • pBR, pUC, and pBluescriptII systems are used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vector and the like can be used.
  • a vector for inserting a chromosome in a microorganism may replace a polynucleotide encoding a target protein inherent in the chromosome with a mutated polynucleotide. Insertion of the polynucleotide into the chromosome can be by any method known in the art, for example by homologous recombination. Since the vector of the present invention may be inserted into a chromosome by causing homologous recombination, the vector may further include a selection marker for confirming whether the chromosome is inserted.
  • Selection markers are used to select cells transformed with a vector, i.e., to confirm the insertion of a polynucleotide of interest, and confer a selectable phenotype such as drug resistance, nutritional requirements, resistance to cytotoxic agents or expression of surface proteins. Markers may be used, but are not limited thereto. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing a selection marker survive or exhibit different expression traits, so that transformed cells can be easily selected.
  • transformation in the present invention means to introduce a vector containing a polynucleotide encoding the target protein into the host cell so that the protein encoded by the polynucleotide in the host cell can be expressed.
  • Transformed polynucleotides include all of them, as long as they can be expressed in the host cell, whether they are inserted into or located outside the chromosome of the host cell.
  • the polynucleotide also includes DNA and RNA encoding the protein of interest.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be expressed by being introduced into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all elements necessary for self expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are usually operably linked to the polynucleotide, and may be in the form of an expression vector capable of self-replicating.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell.
  • operably linked means that the gene sequence and the promoter sequence for initiating and mediating the transcription of the polynucleotide encoding the protein of interest of the present invention.
  • modifying the expression control sequence to increase the expression of the polynucleotide is not particularly limited, but deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or their polynucleotide sequence to further enhance the activity of the expression control sequence. It can be carried out by inducing a variation in the sequence in combination with or by replacing with a polynucleotide sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence may include, but is not particularly limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosomal binding site, a sequence controlling termination of transcription and translation, and the like.
  • a strong heterologous promoter may be linked to the top of the polynucleotide expression unit instead of the original promoter.
  • modification of the polynucleotide sequence on the chromosome is not particularly limited thereto, and the expression of the polynucleotide sequence on the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof may further enhance the activity of the polynucleotide sequence. It can be carried out by inducing mutations or by replacing with polynucleotide sequences that have been modified to have stronger activity.
  • Introduction and enhancement of such protein activity is generally at least 1%, 10%, 25%, 50%, 75, where the activity or concentration of the corresponding protein is based on the activity or concentration in the wild type protein or the initial microbial strain. %, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, up to 1000% or 2000%.
  • microorganisms block the pathway of biosynthesis of O-succinyl homoserine in homoserine to enhance the biosynthetic pathway of O-acetyl homoserine, thereby inducing the activity of endogenous homoserine O-succinyltransferase to intrinsic activity. It may be weakened or inactivated in comparison.
  • the method of attenuating and inactivating the activity of homoserine O-succinyl transferase can be carried out according to the method described above.
  • the O-acetyl homoserine producing strain according to the present invention is a biosynthesis from phosphoenolpyruvate to homoserine to further increase the amount of homoserine which is a substrate of O-acetyl homoserine biosynthesis
  • the activity of enzymes involved in the pathway may be further introduced and enhanced.
  • the microorganism is phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc, EC 4.1.1.31), aspartate aminotransferase (aspC, EC 2.6.1.1) and aspartate semialdehyde dehydro
  • the activity of at least one protein selected from the group consisting of genease (aspartate semialdehyde dehydrogenase, asd, EC 1.2.1.11) may be introduced or enhanced.
  • ppc encoding phosphoenolpyruvate carboxylase comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • An aspC gene encoding a gene, an aspartate aminotransferase comprising an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 21, and an asd encoding an aspartate semialdehyde dehydrogenase comprising an amino acid sequence as set out in SEQ ID NO: 22 Genes can be introduced into the strains.
  • all of the genes encoding the three enzymes may be present in two or more copies in the chromosome of the host cell to introduce and enhance the activity of these enzymes, but is not limited thereto. Introduction and enhancement of the activity can be performed according to the methods described above.
  • the E. coli strain having O-acetyl homoserine-producing ability may lack the citrate synthase gene or encode a mutated citrate synthase protein whose citrate synthase protein activity is weakened compared to the wild type.
  • the activity of the citrate synthase protein was attenuated or inactivated by various methods of introducing a citrate synthase gene into the site or by introducing a citrate synthase gene antisense RNA expression vector.
  • a method for producing O-acetyl homoserine using a microorganism having the O-acetyl homoserine production capacity is improved O-acetyl homoserine production capacity.
  • the present invention (a) culturing the microorganism; And (b) obtaining O-acetyl homoserine produced during the culturing of the microorganism.
  • the culturing process of E. coli strain having O-acetyl homoserine production capacity according to the present invention can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected.
  • glutamate since the activity of citrate synthase, an enzyme that mediates the first step of the TCA cycle, is a weakened or inactivated strain compared to the intrinsic activity, glutamate may be included in consideration of the TCA cycle flow reduction. However, it is not particularly limited thereto.
  • Examples of the culture method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultures. Such various culture methods are disclosed, for example, in "Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.
  • the medium used for cultivation can suitably satisfy the requirements of a particular strain.
  • examples of media of various microorganisms are disclosed in "Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington DC 1981.
  • the medium may be a conventional medium containing a suitable carbon source, nitrogen source, phosphorus, inorganic compounds, amino acids and / or vitamins, and the like, and may be cultured while controlling temperature, pH, and the like under aerobic conditions.
  • Carbon sources include carbohydrates such as glucose, lactose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch and cellulose; Fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, castor oil and coconut oil; Fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid; Alcohols such as glycerol and ethanol and organic acids such as acetic acid may be included. These carbon sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • Nitrogen sources include organic nitrogen sources and urea, such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor (CSL), and bean flour.
  • Inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate. These nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • the medium may further comprise potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and corresponding sodium-containing salts as potassium phosphate sources.
  • the medium may also include metals such as magnesium sulfate or iron sulfate.
  • amino acids, vitamins and suitable precursors may be added. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture, without being limited to the examples above.
  • the pH of the culture can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid in an appropriate manner during the culture.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester during the culture, it is possible to suppress the generation of bubbles during the culture.
  • oxygen or a gas containing oxygen eg, air
  • the temperature of the culture may generally be 20 to 45 ° C, specifically 25 to 40 ° C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may continue until the production of O-acetyl homoserine reaches the desired level, specifically 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the method for producing O-acetyl homoserine of the present invention may further include recovering O-acetyl homoserine from the cultured microorganism or its culture.
  • the step of recovering the O-acetyl homoserine is the desired O- from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present invention, for example, batch, continuous or fed-batch culture method. Acetyl homoserine can be recovered.
  • the recovery step may comprise a purification process.
  • the second step is an enzyme having O-acetyl homoserine sulfhydrylase activity using O-acetyl homoserine and methyl mercaptan produced by the L-methionine precursor-producing strain as substrates, or It includes a process for producing L-methionine and organic acid through the enzymatic reaction using a strain containing an enzyme.
  • the present invention provides a method for producing L-methionine by using an enzyme reaction such as O-acetyl homoserine sulfidylase using O-acetyl homoserine accumulated in the above method as a substrate.
  • the reaction is as follows.
  • E. coli a representative microorganism among Escherichia spp., was used to prepare O-acetyl homoserine producing strains.
  • E. coli K12 W3110 ATCC27325
  • ATCC American Type Resource Collection
  • metB gene SEQ ID NO: 10
  • cystathionine synthase was deleted to block the production pathway of O-succinyl-L-homoserine to cystathion.
  • metB a gene encoding cystathionine synthase
  • the FRT-one-step PCR deletion method was used (PNAS (2000) vol97: P6640-6645).
  • a deletion cassette was prepared by PCR using pKD3 vector (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) as a template using the primers of SEQ ID NOs: 30 and 31.
  • the denaturation step was performed at 94 ° C. for 30 seconds, the annealing step at 55 ° C. for 30 seconds, and the extension step at 72 ° C. for 1 minute, which was performed 30 times.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, followed by purification of DNA from a 1.2 kbp sized band.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to E. coli (K12) W3110 strain previously transformed with pKD46 vector (PNAS (2000) vol97: P6640-6645).
  • Selected strains were PCR as a template using the same primers under the same conditions and confirmed that the gene size was observed as 1.2Kb on 1.0% agarose gel. The deficiency of the metB gene was confirmed.
  • the identified strain was transformed with pCP20 vector (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) and cultured in LB medium, and the gene size was reduced to 150 bp on 1.0% agarose gel through PCR under the same conditions.
  • the final metB gene deletion strain was constructed and confirmed that the chloramphenicol marker was removed.
  • the produced strain was named W3-B.
  • the denaturation step was 30 seconds at 94 ° C
  • the annealing step was 30 seconds at 55 ° C.
  • the extension step was carried out for 1 minute at 72 °C, and proceeded the PCR reaction to perform this 30 times.
  • the resulting PCR product was electrophoresed on a 1.0% agarose gel, followed by purification of DNA from a 1.6 kbp band.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to a W3-B strain previously transformed with pKD46 vector.
  • the recovered strains were plated in LB plate medium containing 50 ⁇ g / L kanamycin and incubated overnight at 37 ° C., and strains showing resistance were selected.
  • Selected strains were PCR strains under the same conditions using the primers of SEQ ID NOs: 32 and 33 using the strains as templates, and the strains of the thrB gene were identified by selecting strains having a size of 1.6 Kb on a 1.0% agarose gel. It was confirmed.
  • the identified strain was transformed with pCP20 vector and cultured in LB medium, and again, the final thrB gene deletion strain was reduced to 150 bp on 1.0% agarose gel by PCR under the same conditions, and a kanamycin marker was obtained. It was confirmed that was removed.
  • the produced strain was named W3-BT strain.
  • homoserine O-succinyltransferase was prepared by performing PCR using primers of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 using a chromosome of the wild type strain W3110 as a template.
  • the metA gene encoding was amplified.
  • primers SEQ ID NOs: 38 and 39 were used to replace amino acid 111 of the O-succinyltransferase with glycamic acid for glutamic acid and amino acid 112 for leucine in histidine.
  • the plasmid containing the metA gene in which amino acid 111 was substituted from glycine to glutamic acid and amino acid 112 to leucine to histidine was named pCL_Pcj1_metA (EH).
  • the denaturation step was 94 ° C. for 30 seconds, and the annealing step was 55 ° C. At 30 seconds, the extension step was carried out for 2 minutes at 72 °C, and proceeded the PCR reaction to perform this 30 times.
  • the metA (EH) portion of the replacement cassette used the primers SEQ ID NOs: 42 and 43 as pCL-Pcj1-metA (EH) template, and the metA wild type portion was used for the respective PCR products using primers SEQ ID NOs: 44 and 45. Got it.
  • PCR products were prepared using the metA (EH) replacement cassette containing the chloramphenicol marker moiety using SEQ ID NOs: 42 and 45 primers, and W3-produced in Reference Example ⁇ 1-2> previously transformed with a pKD46 vector. Electroporation to BT strain. The identified strain was transformed with pCP20 vector and cultured in LB medium, and the strain in which the chloramphenicol marker was removed and the metA gene was replaced with metA (EH) was named W3-BTA.
  • the biosynthetic pathway was enhanced by quoting patent EP 2290051.
  • the primers of SEQ ID NOs: 46, 47, 48, and 49 were used to make 2 copies of the ppc gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase in the same manner as the above patent contents, and aspC encoding aspartate aminotransferase.
  • the gene encodes the primers SEQ ID NOs: 50 and 51, aspartate semialdehyde dehydrogenase
  • the asd gene was prepared by amplifying two copies of each gene using primers SEQ ID NOs 52, 53, 54 and 55.
  • the strain of the biosynthetic pathway is enhanced while producing O-acetyl homoserine was named W3-BTA2PCD (also named 'WCJM').
  • O-acetyl homoserine was not produced at all in wild type W3110, but 0.9 g / L of O-acetyl homoserine was produced in the W3-BTA strain, and 1.2 g / L of the WCJM strain with enhanced biosynthetic pathway was produced. The results are shown.
  • Citrate synthase is the first step in the TCA cycle and begins with the reaction of oxaloacetate and acetyl-CoA. Growth inhibition through reduced TCA cycles is well known (Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 2001; 66 (3a): 333-6), but increased the amount of acetylcoa used as a substrate for O-acetyl homoserine. In order to prepare the strains preferentially depleted the citrate synthase activity of the W3-BTA strain and WCJM strain.
  • the denaturation step at 94 °C 30 seconds, annealing step 55 °C 30 seconds in, the extension step was carried out for 2 minutes at 72 °C, it was carried out 30 times.
  • the resulting PCR product was confirmed to be 1.6Kb gene size in 1.0% agarose gel, the DNA was purified.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to the W3-BTA, WCJM strains previously transformed with the pKD46 vector.
  • the W3-BTA-AD strain and the WCJM-AD strain may be grown in LB medium due to a deletion of the citrate synthase gene, but not in O-acetyl homoserine medium conditions.
  • triangular flask culture was performed under the condition of adding 3 g / L of glutamate to the existing medium composition (Table 3 below-glutamate addition medium composition).
  • Example ⁇ 1-1> shows a low culture rate to attenuate the activity through various mutations of citrate synthase known in many literatures and to acetyl-CoA (Acetyl-CoA) Three variants with reduced binding force were selected (The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278, 35435-35443). Information on the three selected variants is shown in Table 5, where the 145th amino acid is tyrosine (Y) to alanine (A), the 167th amino acid is lysine (K) to alanine (A), and the 204th The amino acid represents a mutated gene in which threonine (T) is replaced with alanine (A).
  • the present inventors intended to increase the production capacity by introducing into the O-acetyl homoserine producing strain a mutation that weakens the citrate synthase protein activity described in Example ⁇ 2-1>.
  • a mutation replacement cassette was designed as shown in FIG. 1. Each variation was synthesized by substituting a nucleotide for the primer, and each cassette was made through three PCR products.
  • the citrate synthase gene was used as a template for the W3110 strain, and the 145th amino acid mutation was carried out using PCR primers of SEQ ID NOs: 60 and 63 and primers SEQ ID NOs: 62 and 61, respectively. PCR products were obtained.
  • the 167th amino acid mutation was obtained by using the primers of SEQ ID NOs: 60 and 65 and the primers of SEQ ID NOs: 64 and 61 to obtain a 580 bp and 1,046 bp PCR products.
  • PCR products of 688bp and 936bp sizes were obtained using primers of SEQ ID NOs: 66 and 61.
  • the common kanamycin portion was subjected to PCR reaction using the pKD4 vector as a template using primers SEQ ID NO: 68 and 69.
  • Sewing PCR was carried out using primers of SEQ ID NOs: 60 and 69 as templates for kanamycin DNA fragments, which were in common with each of the two recovered DNA fragments.
  • the denaturation step was performed at 94 ° C for 30 seconds, the annealing step at 55 ° C for 30 seconds, and the extension step at 72 ° C for 4 minutes, which was performed 30 times.
  • each obtained PCR product was identified on a 1.0% agarose gel to obtain DNA fragments of three citrate synthase gene mutation cassettes having a 3,115 bp size.
  • the recovered DNA fragments were electroporated to the above-mentioned WCJM-AD strain which was previously transformed with the pKD46 vector.
  • the amino acid of the citrate synthase gene was identified by sequencing the same strain using primers of SEQ ID Nos. 58 and 59 using the selected strains as a template, and confirming that the gene size was observed as 3.7 Kb on the 1.0% agarose gel. It was confirmed that this substituted variant cassette was inserted.
  • the identified strains were again transformed into pCP20 vector and cultured in LB medium, and again, three citrate synthase active mutant strains of which the gene size was reduced to 2.5Kb on 1.0% agarose gel were prepared by PCR under the same conditions. It was confirmed that the kanamycin marker was removed.
  • each of the prepared strains was named WCJM-A145, WCJM-A167, WCJM-A204, and the sequence information of the introduced citrate synthase gene was introduced into SEQ ID NOs: 1 to 3 (amino acid sequence) and SEQ ID NOs: 5 to 7 (nucleotide sequence), respectively.
  • Antisense RNA expression technique is a method of reducing protein expression by canceling the binding between the citrate synthase mRNA and ribosomes by overexpressing the complementary binding portion of the target gene citrate synthase mRNA.
  • the degree of inhibition can be controlled, and antisense RNA that regulates gene expression can be effectively produced and reduced gene expression without a process through existing gene deletion. It is useful for producing microorganisms.
  • the site where the citrate synthase gene antisense RNA is expressed is 100 bp in size including the promoter part 52 bp and the citrate synthase start coding from 48 bp, and a 38 bp repeating sequence on both sides reduces antisense RNA (asRNA) instability.
  • paired termini PT
  • SEQ ID NOs: 70 and 71 were used to obtain the citrate synthase gene antisense RNA portion, and the restriction enzyme Nco I site and Hind III site were included for cloning the vector.
  • the PCR product thus obtained was 194 bp in size, and the product was cloned by treating the pBAD24 plasmid with EcoR V and Hind III restriction enzymes, respectively.
  • E. coli DH5 ⁇ was transformed using the cloned plasmid, and then transformed E. coli DH5 ⁇ was selected from an LB plate containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin to obtain a plasmid.
  • the obtained plasmid was named pBAD24-gltA asRNA.
  • PBAD24-gltA-asRNA a citrate synthase antisense RNA expression vector prepared in Example ⁇ 3-1>, was transformed into a WCJM strain, which is an O-acetyl homoserine producing strain.
  • the introduced strain was named WCJM / A-asRNA.
  • the antisense RNA expression amount can be adjusted according to the arabinose (Arabinose) concentration.
  • Table 8 30 hours Arabinose (Arabinose) OD (562 nm) Glucose consumption (g / L) O-acetyl homoserine (g / L) WCJM 0mM 8.9 32 1.4 WCJM 2mM 9.1 34 1.3 WCJM 5 mM 8.9 33 1.3 WCJM / A-asRNA 0mM 9.2 33 1.3 WCJM / A-asRNA 2mM 8.8 32 1.6 WCJM / A-asRNA 5 mM 7.1 29 1.7
  • the OD was reduced by 1 according to the arabinose concentration in the WCJM / A-asRNA strain, and the O-acetyl homoserine concentration was similar.
  • the WCJM strain which is a control strain, showed the same OD or O-acetyl homoserine concentration even when the arabinose concentration was increased, whereas the WCJM / A-asRNA strain in which the citrate synthase antisense expression vector was introduced was arabinose. As the concentration increased, the result was obvious.
  • the abinose concentration of 0 mM was OD of 9.2 but the decrease of 1.9 at 5 mM was 7.1, and the amount of glucose consumed was small but O-acetyl homoserine was increased by 30.8%.
  • WO 2012/087039 describes in detail a method for producing a strain producing O-acetyl homoserine from a strain that produces threonine with an NTG mutation, derived from wild type W3110.
  • the produced high yield O-acetyl homoserine strain was deposited with the accession number KCCM11146P to the Korea Microorganism Conservation Center.
  • the KCCM11146P strain consumes 40 g / L of glucose and produces about 15-16 g / L of O-acetyl homoserine in the flask culture, and thus has a high yield of O-acetyl homoserine production.
  • the preparation method is the same as in Example ⁇ 1-1>, and a strain in which the citrate synthase activity of the KCCM11146P strain was deleted through this method was named KCCM11146P-AD.
  • Example ⁇ 2-2> Production method is the same as in Example ⁇ 2-2>, through this method, two strains of weakened citrate synthase activity of KCCM11146P strain were produced, respectively, and each strain was named KCCM11146P-A145 and KCCM11146P-A167. It was.
  • O-acetyl homoserine 15.0 g / L of O-acetyl homoserine was produced in the KCCM11146P strain, and two strains of KCCM11146P-A145 and KCCM11146P-A167 showed similar results as in Example ⁇ 2-3>. In both strains, O-acetyl homoserine was improved to 17.5 g / L and 17.3 g / L by about 16.7% as OD decreased. High production strains of O-acetyl homoserine also reduced glutamate from 1.6 g / L to 0 g / L as the TCA cycle flow decreased due to the weakening of citrate synthase activity.
  • the inventors have found that O-acetyl homoserine production is increased in the 167th amino acid variant of the KCCM11146P strain citrate synthase, and named the KCCM11146P-A167 strain as "CA05-4007". As of date, it was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM), an international depositary organization under the Budapest Treaty, and was assigned the accession number KCCM11483P.
  • KCCM Korea Microorganism Conservation Center

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Abstract

본 발명은, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아(escherichia) 속 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 고수율로 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법
본 발명은, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아(escherichia) 속 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 고수율로 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법에 관한 것이다.
O-아세틸 호모세린(O-acetyl homoserine)은 생체 내 필수 아미노산의 한 종류인 메치오닌의 전구체로 작용한다. 메치오닌은, 생체 내 필수 아미노산의 한 종류로 사료 및 식품 첨가제뿐만 아니라 수액제, 의약품의 합성 원료로도 널리 사용되고 있다.
메치오닌은 생물학적 합성과 화학 합성을 통해 생산된다. 최근에는, 발효를 통해 생산한 L-메치오닌 전구체로부터 효소전환 반응에 의하여 L-메치오닌을 생산하는 이단계 공법(국제공개공보 WO2008/013432)도 공지되었다.
상기의 이단계 공법에서는 메치오닌 전구체로 O-숙시닐 호모세린(O-succinyl homoserine)과 O-아세틸 호모세린이 사용될 수 있으며, 메치오닌의 경제적인 대량 생산을 위하여 O-아세틸 호모세린을 고수율로 생산하는 것이 매우 중요하다.
본 발명자들은 O-아세틸 호모세린의 생산을 증가시키기 위하여 예의 노력한 결과, 사이트레이트 신테이즈 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 경우, O-아세틸 호모세린을 생산능을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 미생물을 사용하는 경우, O-아세틸 호모세린을 화학적 합성에 비해 환경친화적이면서 더 높은 수율로 생산할 수 있다. 또한, 생산된 O-아세틸 호모세린은 O-아세틸 호모세린 설프하이드릴라아제에 의해 메치오닌과 아세트산 합성의 전구체로 사용하여 고효율로 L-메치오닌을 생물 전환할 수 있으며, 전환된 상기 L-메치오닌은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제의 생산에 널리 사용할 수 있다.
도 1은, 사이트레이트 신테이즈 활성 약화 균주 제작을 위한 발현 카세트 디자인을 나타낸 도이다.
도 2는, pBAD24-사이트레이트 신테이즈 안티센스 RNA(asRNA) 벡터의 개열 지도를 나타낸 도이다.
본 발명의 하나의 양태로서, 내재적 사이트레이트 신테이즈(citrate synthase) 단백질 활성이 약화 또는 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아(Escherichia) 속 미생물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "O-아세틸 호모세린"은 미생물의 메치오닌 생합성 경로상의 특이적 중간체 물질로, L-호모세린의 아세틸-유도체를 의미한다. 상기 O-아세틸 호모세린은 호모세린과 아세틸-CoA를 기질로 하여 아세틸-CoA의 아세틸기를 호모세린에 전이하는 효소 활성에 의하여 생성될 수 있다.
본 발명에서 용어, "O-아세틸 호모세린 생산능을 갖는 미생물"은 O-아세틸 호모세린을 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, O-아세틸 호모세린 생산능이 없는 모균주에 O-아세틸 호모세린의 생산능이 부여된 미생물, 또는 내재적으로 O-아세틸 호모세린 생산능을 갖는 미생물을 포함한다. O-아세틸 호모세린 생산 능력은 종 개량에 의해 부여되거나 증진될 수 있다. 상기 O-아세틸 호모세린 생산능을 갖는 미생물은, 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.) 및 노카디아 속(Norcardia sp.), 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더욱 구체적으로는, 에스케리치아 속의 미생물 균주이고, 이의 구체적인 예로 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 상기 O-아세틸 호모세린 생산능을 갖는 미생물은 L-라이신, L-트레오닌, L-이소류신 또는 L-메치오닌을 생산하는 균주, 또는 이의 유래일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "사이트레이트 신테이즈(citrate synthase, E.C. 2.3.3.1)"는 TCA 싸이클 첫 단계의 효소로, 옥살로아세테이트(oxaloacetate)와 아세틸-CoA 간의 반응을 매개한다. 구체적으로, 아세틸-CoA의 두 개의 탄소를 가진 아세테이트 잔기와 네 개의 탄소를 가지는 아세테이트 간의 축합 반응을 매개하여 6개의 탄소를 가지는 사이트레이트를 생성한다. 대장균(Escherichia coli)에서 상기 사이트레이트 신테이즈는 GltA로 명명되며, 본 발명에서 상기 사이트레이트 신테이즈는 GltA와 서로 혼용된다.
아세틸-CoA + 옥살로아세테이트 + H2O -> 사이트레이트 + CoA-SH
구체적으로 상기 사이트레이트 신테이즈는 에스케리치아 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있으며, 더욱 구체적인 예로 대장균 유래 GltA일 수 있다. 상기 사이트레이트 신테이즈는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로부터 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 4의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 사이트레이트 신테이즈 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에서 용어, "내재적" 활성은 본래 미생물이 천연의 상태 또는 해당 단백질의 변형 이전에 가지고 있는 단백질의 활성 상태를 의미한다.
상기 "단백질의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화된 것"은 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 천연의 상태에 비해 감소되거나 없는 것을 의미한다. 상기 약화는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 변이 등으로 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 코딩하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질 발현 정도가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이며, 이에 한정되지 않는다. 상기 불활성화는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 천연형 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우 및 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 포함한다.
이러한 단백질 활성의 약화 또는 불활성화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거된 경우를 포함하여 상기 효소의 활성이 감소되도록 돌연변이된 유전자로, 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 대체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 발현 조절 서열에 변이를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 발현 조절 서열을 활성이 약하거나 없는 서열로 교체하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 SD 서열 앞단에 SD 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 법 및 해당 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 역전사되도록 프로모터를 부가하는 RTE(Reverse transcription engineering) 방법 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 단백질을 암호화하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 폴리뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 보다 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 더 구체적으로는 1 내지 50개일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 사이트레이트 신테이즈 단백질의 활성을 약화시키기 위해 사이트레이트 신테이즈 단백질의 아미노산 서열 중 일부 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 방법을 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로 사이트레이트 신테이즈 단백질의 아미노산 서열 중 145번째 아미노산 또는 167번째 아미노산을 타이로신(Y) 또는 라이신(K)에서 이와 다른 아미노산으로 치환시킨 아미노산 서열을 가지는 사이트레이트 신테이즈를 포함할 수 있다. 더욱 더 구체적으로 사이트레이트 신테이즈 단백질의 아미노산 서열이 145번째 아미노산인 타이로신(Y)에서 알라닌(A)으로, 167번째 아미노산은 라이신(K)에서 알라닌(A)으로 치환된 변이 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열로 교체된 것일 수 있다. 여기서, 상기 아미노산 잔기의 번호는 개시 코돈에 의해 코딩되는 메티오닌 다음에 위치한 아미노산을 1번으로 하여 번호를 매긴 것이다. 상기 폴리펩티드는 각각 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 또한, 사이트레이트 신테이즈 활성이 야생형에 비하여 약화된 것이라면, 상기 서열번호의 아미노산 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1 또는 2의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상동성을 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 결정될 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 BLAST(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등일 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.
본 발명에서 용어, "상동"은 모든 문법적 형태나 스펠링 변이 형태인 슈퍼패밀리 유래 단백질 및 다른 종 유래의 상동 단백질을 포함하며, "공통 진화 기원"을 갖는 단백질 간의 관계를 말한다. 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 높은 정도의 서열 유사성에 의해 반영되는 서열 상동성을 갖는다. 그러나, 일반적 사용과 본 발명에서 "상동"은 "매우 높은"과 같은 형용 상에 의해 수식될 경우에는 서열 유사성을 말하는 것이고 공통 진화 기원을 의미하는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 양태로서, 상기 미생물은 추가로 시스타치오닌 감마 신테이즈(cystathionine gamma synthase, EC 2.5.1.48), 호모세린 키나아제(homoserine kinase, EC 2.7.1.39), 또는 둘 다의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "시스타치오닌 감마 신테이즈"는 O-숙시닐 호모세린 및 L-시스테인을 기질로 하여 하기와 같은 화학 반응으로 시스타치오닌을 합성할 수 있는 효소이다. 본 발명에서, 대장균 유래의 시스타치온 감마 신테이즈는 MetB로 명명된다.
O-숙시닐-L-호모세린 + L-시스테인 -> L-시스타치오닌 + 숙시네이트(succinate)
구체적으로 상기 대장균 유래의 시스타치오닌 감마 신테이즈는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 9의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로부터 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 9의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 시스타치오닌 감마 신테이즈 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다. 또한, 유전 암호의 축퇴성에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
이러한 시스타치오닌 감마 신테이즈의 활성의 약화 및 불활성화시키는 방법은 상기에서 설명한 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명에서 용어, "호모세린 키나아제"는 호모세린의 인산화를 가져오는 효소로서 하기와 같은 화학 반응을 수행하는 효소를 의미한다. 본 발명에서 대장균 유래의 호모세린 키나아제는 ThrB로 명명된다.
ATP + L-homoserine -> ADP + O-phospho-L-homoserine
구체적으로 상기 대장균 유래의 호모세린 키나아제는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 서열번호 11의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로부터 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 11의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하게 호모세린 키나아제 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다. 또한, 유전 암호의 축퇴성에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
이러한 호모세린 키나아제의 활성의 약화 및 불활성화시키는 방법은 상기에서 설명한 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적 양태로서, 상기 미생물은 추가로 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성이 도입 또는 강화되거나, 내재적 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제가 O-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 가지도록 변이된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.31)"는 아세틸-CoA로부터 아세틸기를 호모세린으로 전달할 수 있는 활성을 가지는 효소를 의미한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 미생물은 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 활성이 도입될 수 있다. 상기 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 다양한 미생물 종들로부터 유래한 것일 수 있으며, 그 예로, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속, 데이노코커스 속, 슈도모나스 속, 또는 마이코박테리움 속으로부터 선택된 균주에서 유래한 단백질일 수 있다. 구체적으로 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 13(렙토스피라 메에리), 서열번호 14(코리네박테리움 글루타미쿰) 또는 서열번호 15(데이노코커스 라디오듀란스)의 아미노산 서열을 포함하는, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 서열번호의 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로부터 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한, 유전 암호의 축퇴성에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에 적용될 수 있는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 예는 대한민국 공개특허공보 제10-2011-0023703호 또는 유럽 특허출원공개공보 EP2290051에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있다.
또한, 내재적 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제(EC 2.3.1.46)가 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 가지도록 변이된 단백질은 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드가 숙시닐-CoA에서 아세틸-CoA로 기질 특이성이 변환된 변이 폴리펩티드를 의미한다. 또한, 상기 변이된 단백질은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 일부를 치환시킴으로써 야생형과 달리 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제는 엔테로박테리아 속, 살모넬라 속, 슈도모나스 속, 바실러스 속, 에스케리치아 속 미생물로부터 유래된 폴리펩티드, 구체적으로는 에스케리치아 속 미생물 유래의 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제 활성을 가지는 폴리펩티드, 그 예로 대장균(E. coli) 유래의 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성을 가지는 폴리펩티드일 수 있다. 보다 구체적인 예로 상기 대장균 유래의 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제는 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 대장균 유래의 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제는 MetA로 명명된다.
상기 변이된 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제는 서열번호 16으로 이루어지는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드 서열과 95% 이상의 상동성을 가지는 폴리펩티드의 111번 아미노산이 글루탐산으로 치환되고, 추가로 112번 아미노산이 쓰레오닌 또는 히스티딘으로 치환된 변이형 폴리펩티드 일 수 있다. 구체적으로 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한 상기 서열번호의 아미노산 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로부터 암호화되는 단백질일 수 있다. 또한, 유전 암호의 축퇴성에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 변이체 또한 본 발명에 포함된다. 상기 변이된 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제에 대한 정보는 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0070531호 또는 국제공개공보 WO2012/087039에서 얻을 수 있으며, 상기 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함된다.
본 발명에서 용어, "활성을 도입 또는 강화"한다는 것은, 특정 단백질 활성을 가지고 있지 않은 미생물에 그 단백질의 활성을 부여하거나, 그 단백질의 활성을 보유하고 있는 미생물에서 세포 내 활성을 증가시키는 등으로, 상기 단백질의 세포 내 활성을 내재적 활성에 비해 증가시키는 것을 의미한다.
이러한 "단백질 활성의 도입 또는 강화"는, 단백질 자체의 활성이 증대되어 본래 기능 이상의 효과를 도출하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 내재적 유전자 활성의 증가, 내부 또는 외부 요인으로부터 내재적 유전자 증폭, 유전자 카피수 증가, 외부로부터의 유전자 도입, 발현 조절 서열의 교체 또는 변형 및 돌연변이에 의한 효소 활성의 증가 등에 의해 그 활성이 증가되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기에서 유전자 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 유전자의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 제조물로, 상기 조절서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
또한, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 용이하게 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있으며, 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
다음으로, 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열을 변형하는 것은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있다.
아울러, 염색체상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 도입 및 증진은, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물 균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% 또는 500%, 최대 1000% 또는 2000%까지 증가되는 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 호모세린에서 O-숙시닐 호모세린을 생합성하는 경로를 차단하여 O-아세틸 호모세린의 생합성 경로를 강화하기 위해, 내재적 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제의 활성을 내재적 활성에 비하여 약화시키거나 불활성화시킨 것일 수 있다.
호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제의 활성의 약화 및 불활성화시키는 방법은 상기에서 설명한 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 양태로서, 본 발명에 따른 O-아세틸 호모세린 생산 균주는 O-아세틸 호모세린 생합성의 기질인 호모세린의 양을 더욱 증가시키기 위하여 포스포에놀파이루베이트로부터 호모세린까지의 생합성 경로에 관여하는 효소의 활성이 추가적으로 도입 및 증진된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 미생물은 포스포에놀파이루베이트카복실라제(phosphoenolpyruvate carboxylase, ppc, EC 4.1.1.31), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(aspartate aminotransferase, aspC, EC 2.6.1.1) 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제(aspartate semialdehyde dehydrogenase, asd, EC 1.2.1.11)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 활성이 도입 또는 강화된 것일 수 있다.
그 예로, 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 포스포에놀파이루베이트 카복실라아제를 암호화하는 ppc 유전자, 서열번호 21로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제를 암호화하는 aspC 유전자, 및 서열번호 22로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 아스파테이트 세미할데히드 디히드로게나아제를 암호화하는 asd 유전자가 균주 내에 도입될 수 있다. 예컨대, 상기 3종의 효소를 암호화하는 유전자 모두를 숙주세포의 염색체 내에 2 카피수 이상으로 존재시켜 이들 효소의 활성을 도입 및 증진시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 활성의 도입 및 증진은 상기에서 설명한 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적 예에서는, O-아세틸 호모세린 생산능을 갖는 대장균 균주에서 사이트레이트 신테이즈 유전자를 결손시키거나, 사이트레이트 신테이즈 단백질 활성이 야생형에 비하여 약화된 변이된 사이트레이트 신테이즈 단백질을 코딩하는 유전자를 사이트레이트 신테이즈 유전자 위치에 도입하거나, 사이트레이트 신테이즈 유전자 안티센스 RNA 발현벡터를 도입하는 다양한 방법을 이용하여 사이트레이트 신테이즈 단백질의 활성을 약화 또는 불활성화시켰다. 그 결과, 제작된 사이트레이트 신테이즈 단백질 활성이 약화 또는 불활성화된, O-아세틸 호모세린 생산 균주는 모두 모균주에 비하여 O-아세틸 호모세린의 생산능이 향상된 결과를 나타내었다(실시예 1 내지 4).
본 발명의 또 하나의 양태로서, 상기 O-아세틸 호모세린 생산능이 향상된 O-아세틸 호모세린 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 O-아세틸 호모세린을 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 (a) 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 미생물의 배양 과정에서 생성된 O-아세틸 호모세린을 수득하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 대장균 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 특히, 본 발명의 균주의 경우, TCA 사이클의 첫 단계를 매개하는 효소인 사이트레이트 신테이즈의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화된 균주이므로, TCA 싸이클 흐름 감소를 고려하여 글루타메이트를 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.　이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시킬 수시켜있다. 구체적으로 다양한 미생물의 배지의 예는 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington DC 1981)에 개시되어 있다. 상기 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내일 수 있으며, 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
탄소원은 포도당(glucose), 젖당(lactose), 자당(sucrose), 유당, 과당(fructose), 맥아당(maltose), 녹말(starch) 및 섬유소(cellulose)와 같은 탄수화물; 콩 기름(soybean oil), 해바라기 기름(sunflower oil), 피마자 기름, 베버 기름(castor oil) 및 코코넛 기름(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)과 같은 지방산; 글리세롤(glycerol) 및 에탄올(ethanol)과 같은 알코올과 아세트산(acetic acid)과 같은 유기산(organic acid)을 포함할 수 있다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육수(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor, CSL) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소(urea), 황산암모늄(ammonium sulfate), 염화암모늄(ammonium chloride), 인산암모늄(ammonium phosphate), 탄산암모늄(ammonium carbonate) 및 질산암모늄(ammonium nitrate)과 같은 무기 질소원을 포함할 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 인산수소칼륨(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 나트륨 함유 염(sodium-containing salts)을 포함할 수 있다. 또한 배지는 황산마그네슘(magnesium sulfate) 또는 황산철(iron sulfate)과 같은 금속을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으며, 상기의 예에 제한되지 않는다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄(ammonium hydroxide), 수산화칼륨(potassium hydroxide), 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가함으로써 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르(polyglycol ester)와 같은 소포제를 사용함으로써 배양하는 동안 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양액의 호기성(aerobic) 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 O-아세틸 호모세린의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고, 구체적으로는 10 내지 160시간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 O-아세틸 호모세린의 생산방법은, 상기 배양된 미생물 또는 그의 배양물로부터 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 O-아세틸 호모세린을 회수하는 단계는 본 발명의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 O-아세틸 호모세린을 회수할 수 있다.
상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.
이와 같이 회수된 O-아세틸 호모세린은 이단계 공법(대한민국 등록특허 제10-0905381호) 에 의해 메치오닌을 생산할 수 있다.
2단계 공정은 상기 L-메치오닌 전구체 생산 균주에 의하여 생산된 O-아세틸 호모세린과 메칠 머캅탄을 기질로 이용하여 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제(O-acetyl homoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용한 효소반응을 통하여 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 공정을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기의 방법으로 축적된 O-아세틸 호모세린을 기질로 이용하여 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제등의 효소 반응을 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 2단계 공정에서 O-아세틸 호모세린을 L-메티오닌 전구체로 사용하는 경우, 구체적으로는 렙토스피라속(Leptospira sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.), 하이포모나스속(Hyphomonas sp.)에 속하는 미생물 균주, 보다 구체적으로는 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium), 크로모박테리움 비오라슘(Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 O-아세틸 호모세린 설피드릴라아제가 사용될 수 있다.
상기의 반응은 하기와 같다.
CH3SH + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 메치오닌
이와 같은 추가 메치오닌 생산 공정에 대해서는 대한민국 등록 특허 제10-0905381호에 개시되어 있으며, 상기 특허의 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
참고예 : O-아세틸 호모세린 생산균주 제작
<1-1> 야생형 대장균 유래 metB 유전자의 결손(국제공개공보 WO 2008/013432)
O-아세틸 호모세린 생산 균주를 제작하기 위하여 에스케리치아 속 미생물 중에서 대표적인 미생물인 대장균을 사용하였다. 이를 위해, 야생형 대장균인 E. coli K12 W3110(ATCC27325)을 미국생물자원센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 입수하여 사용하였다. 먼저, O-숙시닐-L-호모세린의 시스타치온으로의 생산 경로를 차단하기 위해서 시스타치오닌 신테이즈(cystathionine synthase)를 암호화하는 metB 유전자(서열번호 10)를 결손시켰다. 구체적으로는 시스타치오닌 신테이즈를 코딩하는 유전자인 metB 유전자를 결손시키기 위하여, FRT-one-step PCR 결손 방법을 사용하였다(PNAS (2000) vol97: P6640-6645).
구체적으로, 서열번호 30 및 31의 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 주형으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트(deletion cassette)를 제작하였다. 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하였고, 이를 30회 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 미리 형질 전환시킨 E.coli (K12) W3110 균주에 일렉트로포레이션하였다.
일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 W3110 균주를 100㎍/L 암피실린(ampicilin)과 5mM 아라비노스(l-arabinose)가 포함된 LB 배지를 이용하여 30℃에서 OD600=0.6까지 배양시킨 후, 멸균 증류수로 2회, 10% 글리세롤(glycerol) 로 1회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 25㎍/L 클로람페니콜(chloramphenichol)을 포함하는 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2Kb로 관찰되는 것을 확인함으로서 metB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645)로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 metB 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-B로 명명하였다.
<1-2> thrB 유전자의 결손(국제공개공보 WO 2008/013432)
호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자인 thrB 유전자를 결손시킴으로써 호모세린으로부터 O-숙시닐호모세린의 합성량을 증가시키고자 하였다. 상기 실시예 1에서 제작된 W3-B 균주에 thrB 유전자를 결손시키기 위하여, metB 유전자 결손시와 동일한 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다.
thrB 결손 카세트를 제작하기 위하여 pKD4 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 주형으로, 서열번호 32 및 33의 프라이머를 이용하여 변성 단계는 94℃에서 30초, 어닐링 단계는 55℃에서 30초, 연장 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.6kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 W3-B 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 50 ㎍/L 카나마이신 (kanamycin)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 32 및 33의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한 후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 확인되는 균주를 선별함으로써 thrB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 thrB 유전자 결손 균주를 제작하였고, 카나마이신 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주는 W3-BT 균주로 명명하였다.
<1-3> 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 가지는 변이형 metA(국제공개공보 WO 2012/087039)
상기 참고예 <1-2>에서 수득한 균주에 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase) 활성을 강화하기 위하여, 균주에 강화된 활성을 가지는 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제를 암호화하는 변이형 metA 유전자(서열번호 24 및 26)를 도입하고자 하였다.
먼저 활성이 강화된 변이형 metA 유전자를 제조하기 위하여, 야생형 균주인 W3110 균주의 염색체를 주형으로 서열번호 34 및 서열번호 35의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제를 코딩하는 metA 유전자를 증폭하였다.
PCR에 사용한 프라이머는 미국 국립보건원 진뱅크(NIH Gene Bank)에 등록되어 있는 NC_000913의 대장균 염색체 폴리뉴클레오티드 서열을 바탕으로 제작하였으며, 서열번호 34 및 35의 프라이머는 각각 제한효소 EcoRV 부위 및 HindIII 부위를 가지고 있다. 이렇게 획득된 PCR 산물 및 Pcj1가 들어 있는 pCL1920 플라스미드에 각각 EcoRV 및 HindIII 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환한 후, 스펙티노마이신(spectinomycin) 50㎍/ml을 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA로 명명하였다.
그 다음, 위치 지정 돌연변이 키트(site directed mutagenesis kit, Stratagene, 미국)을 이용하여, 상기에서 제작된 pCL_Pcj1_metA 플라스미드를 주형으로 하여, 서열번호 36 및 37인 프라이머를 이용하여 O-숙시닐트랜스퍼라제의 111번 아미노산 글리신(Gly)을 글루탐산(Glu)으로 치환하였다(G111E). 제작된 변이 G111E metA 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA(EL)로 명명하였다.
또한, 상기 O-숙시닐트랜스퍼라제의 111번 아미노산을 글리신에서 글루탐산으로 치환하고, 추가로 112번 아미노산을 류신에서 히스티딘으로 치환하기 위하여 서열번호 38 및 39인 프라이머를 이용하였다. 111번 아미노산이 글리신에서 글루탐산으로, 112번 아미노산이 류신에서 히스티딘으로 치환된 metA 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCL_Pcj1_metA(EH)로 명명하였다.
그 다음, metA(EH)로 균주 내 교체를 하기 위한 교체 카세트를 제작하기 위하여 pKD3 벡터를 주형으로, 서열번호 40 및 41의 프라이머를 이용하여 변성 단계는 94℃에서 30초, 어닐링 단계는 55℃에서 30초, 연장 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다. 교체 카세트의 metA(EH) 부분은 pCL-Pcj1-metA(EH)를 주형으로 서열번호 42 및 43인 프라이머를 이용하였고, metA 야생형 부분은 서열번호 44 및 45인 프라이머를 이용하여 각각의 PCR 산물을 얻었다. 3개의 PCR 산물을 서열번호 42 및 45 프라이머를 이용하여 클로람페니콜 마커 부분을 포함하는 metA(EH) 교체 카세트를 제작하였고, pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 상기 참고예 <1-2>에서 제작된 W3-BT 균주에 일렉트로포레이션하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며 클로람페니콜 마커가 제거되고 metA 유전자가 metA(EH)로 교체된 균주를 W3-BTA라 명명하였다.
<1-4> ppc, aspC, asd 유전자 2 카피(copy) 균주의 제작(유럽 특허출원공개공보 EP 2290051)
상기 참고예 <1-3>에서 제조한 W3-BTA 균주의 O-아세틸 호모세린 생산능을 증가시키기 위하여 기 출원된 특허 EP 2290051을 인용하여 생합성 경로를 강화하였다. 상기 특허 내용과 동일하게 포스포에놀파이루베이트카복실라제를 코딩하는 ppc 유전자를 2 카피 제작하기 위해 서열번호 46, 47, 48 및 49인 프라이머를 이용하였고, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 aspC 유전자는 서열번호 50 및 51인 프라이머, 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제를 코딩하는 asd 유전자는 서열번호 52, 53, 54 및 55인 프라이머를 이용하여 각각의 유전자를 2 카피로 증폭된 균주를 제작하였다. 이때, O-아세틸 호모세린을 생성하면서 생합성 경로가 강화된 상기의 균주는 W3-BTA2PCD('WCJM'로도 명명)라 명명하였다.
<1-5> 플라스크 배양 실험
상기 참고예 <1-3> 및 <1-4>에서 제작된 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다.
구체적으로, LB 배지에 W3110, W3-BTA 및 WCJM 균주를 접종하여 33℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 33℃에서 5 시간 배양하고, 다시 25ml O-아세틸 호모세린 생산 배지를 포함한 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였다. 하기 표 1에 사용한 배지 조성을 나타내었고, 표 2에 확인한 O-아세틸 호모세린 생산량을 표시하였다.
표 1 O-아세틸 호모세린 생산 플라스크 배지 조성
조성 농도(리터당)
포도당 40 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g
FeSO4ㆍ7H2O 5 mg
MnSO4ㆍ8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모엑기스 2 g
메치오닌 0.15g
쓰레오닌 0.15g
표 2
OD(562nm) 포도당 소모(g/L) O-아세틸 호모세린(g/L)
W3110 14.2 40 0
W3-BTA 8.4 36 0.9
WCJM 9.6 35 1.2
그 결과, 야생형 W3110에서는 O-아세틸 호모세린이 전혀 생성되지 않지만, W3-BTA 균주에서 O-아세틸 호모세린이 0.9g/L 생성되었고, 생합성 경로가 강화된 WCJM 균주는 1.2g/L를 생성된 결과를 나타내었다.
실시예 1: 사이트레이트 신테이즈 활성 결실
<1-1> O-아세틸 호모세린 생산균주에서의 사이트레이트 신테이즈(citrate synthase) 유전자 결손 균주 제작
사이트레이트 신테이즈(citrate synthase, GltA)는 TCA 싸이클 첫 단계의 효소로, 옥살로아세테이트(oxaloacetate)와 아세틸 코에이(Acetyl-CoA)의 반응으로 시작된다. TCA 싸이클 감소를 통한 생장 저해는 잘 알려져 있으나(Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 2001;66(3a):333-6), O-아세틸 호모세린의 기질로 사용되는 아세틸 코에이 양을 증가시키기 위해 상기의 W3-BTA균주와 WCJM 균주의 사이트레이트 신테이즈활성을 우선적으로 결손된 균주를 제작하고자 하였다.
구체적으로, 상기 W3-BTA 균주와 WCJM 균주에 사이트레이트 신테이즈를 결손하기 위해 서열번호 56 및 57번의 프라이머를 이용하고 pKD4 벡터를 주형으로 하여 변성 단계는 94℃에서 30초, 어닐링 단계는 55℃에서 30초, 연장 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하였다. 그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 관찰되는 것을 확인하였고, DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터를 미리 형질 전환시킨 상기 W3-BTA, WCJM 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 W3-BTA, WCJM 균주는 100㎍/L 암피실린과 5mM 아라비노스가 포함된 LB 배지를 이용하여 30℃에서 OD600=0.6까지 배양시킨 후, 멸균 증류수로 2회, 10% 글리세롤로 1회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 50 ㎍/L 카나마이신을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 서열번호 58 및 59번 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한 후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 2.5Kb로 관찰되는 것을 확인함으로써, 염색체 상의 사이트레이트 신테이즈 유전자 부분에 결손카세트가 삽입된 것을 알 수 있었다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.1 Kb로 작아진 사이트레이트 신테이즈 유전자가 결손된 균주를 제작하였고, 카나마이신 마커가 제거되었음을 확인하였다. 이때 제작된 균주는 각각 W3-BTA-AD, WCJM-AD로 명명하였다.
<1-2> O-아세틸 호모세린 생산균주에서의 사이트레이트 신테이즈 결손균주 평가
상기의 W3-BTA-AD 균주와 WCJM-AD 균주는 사이트레이트 신테이즈 유전자가 결손되어 LB 배지에서는 생장이 가능하지만, O-아세틸 호모세린 배지 조건에서는 생장하지 않았다. O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 기존 배지조성에 글루타메이트(glutamate)를 3g/L를 첨가해 주는 조건(하기 표 3 - 배지 내 글루타메이트 첨가 배지조성)으로 삼각플라스크 배양을 실시하였다.
구체적으로, LB 배지에 W3-BTA-AD 균주와 WCJM-AD 균주를 접종하여 33℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 33℃에서 5 시간 배양하고, 다시 25ml O-아세틸 호모세린 생산 배지(+ 글루타메이트 첨가)를 포함한 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였고, 하기 표 4에 O-아세틸 호모세린 생산량을 나타내었다.
표 3 기본 배지에 글루타메이트 첨가 배지조성
조성 농도(리터당)
포도당 40 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g
FeSO4ㆍ7H2O 5 mg
MnSO4ㆍ8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모엑기스 2 g
메치오닌 0.15g
쓰레오닌 0.15g
글루타메이트 3g
표 4 플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산
OD (562nm) 포도당 소모 (g/L) O-아세틸 호모세린 (g/L) 글루타메이트 (g/L)
W3-BTA 9.9 38 0.9 3.2
W3-BTA-AD 6.1 34 1.4 2.3
WCJM 9.2 37 1.3 3.5
WCJM-AD 5.6 33 2.1 1.7
그 결과, W3-BTA 균주에서 O-아세틸 호모세린이 0.9g/L 생성되었고, W3-BTA-AD 균주는 포도당 소모량이 감소하였지만 O-아세틸 호모세린이 1.4g/L으로 생산이 55.6% 증가하였다. WCJM 균주에서도 O-아세틸 호모세린이 1.3g/L 생성되었고, WCJM-AD 균주는 2.1g/L가 생산되어 사이트레이트 신테이즈 유전자가 결손됨에 따라 O-아세틸 호모세린 생산능이 61.5% 향상됨을 확인하였다.
실시예 2: 사이트레이트 신테이즈 단백질 활성 약화
<2-1> 사이트레이트 신테이즈 유전자 변이 종류
상기의 실시예 <1-1>에서 제작된 WCJM-AD 균주는 낮은 배양속도를 보임으로써 많은 문헌에 알려진 사이트레이트 신테이즈의 다양한 변이를 통해 활성을 약화하고 아세틸 코에이(Acetyl-CoA)에 대한 결합력이 감소되는 변이 3종을 선별하였다(The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278, 35435-35443). 선별된 3종의 변이에 대한 정보는 하기 표 5와 같으며, 145번째 아미노산은 타이로신(Y)에서 알라닌(A)으로, 167번째 아미노산은 라이신(K)에서 알라닌(A)으로, 그리고 204번째 아미노산은 쓰레오닌(T)이 알라닌(A)으로 치환된 변이 유전자를 나타내고 있다.
표 5 사이트레이트 신테이즈(citrate syntase, gltA)의 변이 정보
KM VALUE [mM]
Acetyl-CoA OAA
WT 0.12 0.026
Y145A 0.23 0.051
K167A 0.22 0.037
T204A 0.21 0.004
<2-2> O-아세틸 호모세린 생산균주에서의 사이트레이트 신테이즈 단백질 활성이 약화된 균주 제작
본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 설명된 사이트레이트 신테이즈 단백질 활성이 약화되는 변이를 O-아세틸 호모세린 생산균주에 도입하여 생산능을 높이고자 하였다.
상기 WCJM-AD 균주에 사이트레이트 신테이즈 유전자 변이 3종을 도입하기 위해 변이 교체 카세트를 도 1과 같이 디자인 하였다. 각각의 변이는 프라이머에 뉴클레오타이드를 치환하여 합성하였고, 각각의 카세트는 3개의 PCR 산물을 통해 제작하였다. 사이트레이트 신테이즈 유전자 부분은 W3110 균주를 주형으로 사용하였고, 145번째 아미노산 변이는 서열번호 60 및 63번의 프라이머와 서열번호 62 및 61번의 프라이머를 이용하여 각각의 PCR 반응을 통해 514bp, 1,112bp 사이즈의 PCR 산물을 획득하였다. 상기와 동일한 방법으로 167번째 아미노산 변이는 서열번호 60 및 65번의 프라이머와 서열번호 64 및 61번의 프라이머를 이용하여 580bp, 1,046bp 사이즈의 PCR 산물을 획득하고, 204번째 아미노산 변이는 서열번호 60 및 67번의 프라이머와 서열번호 66 및 61번의 프라이머를 이용하여 688bp, 936bp 사이즈의 PCR 산물을 획득하였다. 공통된 카나마이신 부분은 서열번호 68 및 69번의 프라이머를 이용하여 pKD4 벡터를 주형으로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 이때, 사이트레이트 신테이즈 유전자 위치에 도입하기 위해 서열번호 69번에 사이트레이트 신테이즈 유전자 뒷부분의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하도록 제작하였고 전기영동을 통해 1,571bp 사이즈의 PCR 산물을 획득하였다.
변이에 따른 2개씩 회수된 각각의 DNA 절편과 공통된 부분인 카나마이신 DNA절편을 주형으로 서열번호 60 및 69번의 프라이머를 이용하여 sewing PCR 반응하였다. 변성 단계는 94℃에서 30초, 어닐링 단계는 55℃에서 30초, 연장 단계는 72℃에서 4분 동안 실시하고, 이를 30회 수행하였다. 최종적으로 얻어진 각각의 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 확인하여, 3,115bp 사이즈를 가진 사이트레이트 신테이즈 유전자 변이 카세트 3종의 DNA 절편을 획득하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터를 미리 형질 전환시킨 상기의 WCJM-AD 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 WCJM-AD 균주는 100㎍/L 암피실린과 5mM 아라비노스가 포함된 LB 배지를 이용하여 30℃에서 OD600=0.6까지 배양시킨 후, 멸균 증류수로 2회, 10% 글리세롤로 1회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 25㎍/L 카나마이신을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하룻밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주를 주형으로 하여 동일한 서열번호 58 및 59번 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR한 후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 3.7Kb로 관찰되는 것을 확인함으로써, 사이트레이트 신테이즈 유전자의 아미노산이 치환된 변이 카세트가 삽입됨을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 2.5Kb로 작아진 사이트레이트 신테이즈 활성 변이 균주 3종을 제작하였고, 카나마이신 마커가 제거되었음을 확인하였다. 이때 제작된 각각의 변이 균주를 WCJM-A145, WCJM-A167, WCJM-A204로 명명하였고, 변이가 도입된 사이트레이트 신테이즈 유전자의 서열정보를 서열번호 1 내지 3(아미노산 서열) 및 서열번호 5 내지 7(뉴클레오티드 서열)에 각각 나타내었다.
<2-3> O-아세틸 호모세린 생산균주에서의 사이트레이트 신테이즈 단백질 활성이 약화된 균주 평가
상기의 사이트레이트 신테이즈 유전자의 활성이 약화된 WCJM-A145, WCJM-A167, WCJM-A204 3종 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다. LB 배지에 WCJM 포함 WCJM-A145, WCJM-A167, WCJM-A204 4종의 균주를 접종하여 33℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 33℃에서 5시간 배양하고, 다시 25ml O-아세틸 호모세린 생산 배지가 첨가된 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
표 6 플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산
OD (562nm) 포도당 소모 (g/L) O-아세틸 호모세린 (g/L) 글루타메이트 (g/L)
WCJM 8.9 35 1.3 1.3
WCJM-A145 7.4 35 2.0 0
WCJM-A167 6.3 29 1.9 0
WCJM-A204 9.1 40 1.1 1.8
그 결과, WCJM 균주에서 O-아세틸 호모세린이 1.3g/L 생성되었고, WCJM-A145, WCJM-A167 두 균주는 OD가 감소하면서 포도당 소모량도 감소하였지만, O-아세틸 호모세린이 2.0/L 및 1.9g/L가 생산되었다. 특이적으로 글루타메이트가 1.3g/L 에서 0g/L로 감소하는 것으로 보아 사이트레이트 신테이즈 활성 약화로 인한 TCA 싸이클 흐름 감소에 따른 결과임을 확인하였다. 하지만, WCJM-A204 균주는 O-아세틸 호모세린 생성량은 0.2g/L 감소하면서 글루타메이트가 오히려 증가되는 것으로 보아 활성이 강화된 변이임을 확인하였다.
실시예 3: 사이트레이트 신테이즈 단백질 발현 약화
<3-1> 사이트레이트 신테이즈 유전자 안티센스 RNA(asRNA) 발현벡터의 제작
본 발명자들은 사이트레이트 신테이즈 단백질 발현을 약화시키기 위하여, 안티센스 RNA(asRNA) 발현기법을 적용하고자 하였다. 안티센스 RNA 발현 기법은 표적 유전자인 사이트레이트 신테이즈 mRNA와 상보적 결합 부분을 과발현시킴을 통해 사이트레이트 신테이즈 mRNA와 라이보좀(Ribosome) 간의 결합을 상쇄시켜 단백질 발현을 감소시키는 방법이다. 사이트레이트 신테이즈 유전자의 mRNA와의 결합력을 조절함으로써 억제 정도를 조절할 수 있는 장점이 있으며, 유전자 발현을 조절하는 안티센스 RNA를 통해 기존의 유전자 결실을 통한 과정 없이 효과적으로 제작, 유전자 발현을 감소시킬 수 있어 재조합 미생물 제조에 유용하다.
벡터제작을 위하여 문헌(Methods Mol Biol. 2012;815:307-19. doi: 10.1007/978-1-61779-424-7_23.)을 참고하였고, 과발현을 위해 인덕션이 가능한 pBAD24 플라스미드에 신테이즈 유전자 안티센스 RNA 부분을 도입하고자 하였다. 도 2에 pBAD24-사이트레이트 신테이즈 asRNA 벡터도면을 표시하였다.
사이트레이트 신테이즈 유전자 안티센스 RNA가 발현된 부분은 프로모터 부분 52bp와 사이트레이트 신테이즈 시작 코딩부터 48bp 부분을 포함하여 100bp 사이즈이며, 양 옆에는 안티센스 RNA(asRNA) 불안정성을 감소시켜 주는 38bp의 반복서열(paired termini; PT)이 연결되어 있다. 상기의 사이트레이트 신테이즈 유전자 안티센스 RNA 부분을 얻고자 서열번호 70 및 71을 사용하였고, 벡터에 클로닝을 하기 위해 제한효소 NcoI 부위와 HindIII 부위를 포함하도록 하였다.
이렇게 획득된 PCR 산물의 사이즈는 194bp 이며, 이 산물을 pBAD24 플라스미드에 각각 EcoRV 및 HindIII 제한효소를 처리하여 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드를 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환한 후, 암피실린 100㎍/ml를 포함하는 LB 플레이트에서 형질전환된 대장균 DH5α를 선별하여 플라스미드를 획득하였다. 획득한 플라스미드를 pBAD24-gltA asRNA로 명명하였다.
<3-2> 사이트레이트 신테이즈 유전자 안티센스 RNA 발현벡터의 O-아세틸 호모세린 생산 균주 도입 및 평가
상기 실시예 <3-1>에서 제작한 사이트레이트 신테이즈 안티센스 RNA 발현벡터인 pBAD24-gltA-asRNA를 O-아세틸 호모세린 생산균주인 WCJM 균주에 형질전환(transfomration) 하였다. 여기서, 상기 도입된 균주는 WCJM/A-asRNA라 명명하였다.
이때, 사이트레이트 신테이즈 안티센스 RNA 발현량을 조절함으로써 사이트레이트 신테이즈 단백질 발현량을 조절하고자 하였고, 이때, 안티센스 RNA 발현량은 아라비노즈(Arabinose) 농도에 따라 조절할 수 있다.
그 결과, 실시예 2에서처럼 사이트레이트 신테이즈 활성을 약화하였을 때 O-아세틸 호모세린 생산량이 증가되는 것을 확인하였다.
또한, 사이트레이트 신테이즈 단백질 발현량 역시 감소됨에 따라 O-아세틸 호모세린 생산량이 증가되는 것인지 알아보기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다.
구체적으로, LB 배지에 WCJM 균주와 WCJM/A-asRNA 균주를 접종하여 33℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 33℃에서 5시간 배양하고, 다시 25ml O-아세틸 호모세린 생산 배지가 첨가된 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하였다. 이때 사이트레이트 신테이즈 안티센스 RNA 발현량을 조절하기 위하여 아라비노즈를 0mM, 2mM, 5mM 첨가하여 33℃ 200 rpm에서 15, 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였고, 그 결과를 표 7 및 8에 나타내었다.
표 7
15시간 아라비노즈 (Arabinose) OD (562nm) 포도당 소모 (g/L) O-아세틸 호모세린 (g/L)
WCJM 0mM 4.2 9.7 0.5
WCJM 2mM 4.5 8.9 0.6
WCJM 5mM 4.7 8.9 0.5
WCJM/A-asRNA 0mM 4.5 10.1 0.6
WCJM/A-asRNA 2mM 4.2 8.8 0.6
WCJM/A-asRNA 5mM 3.4 6.9 0.5
표 8
30시간 아라비노즈 (Arabinose) OD (562nm) 포도당 소모 (g/L) O-아세틸 호모세린 (g/L)
WCJM 0mM 8.9 32 1.4
WCJM 2mM 9.1 34 1.3
WCJM 5mM 8.9 33 1.3
WCJM/A-asRNA 0mM 9.2 33 1.3
WCJM/A-asRNA 2mM 8.8 32 1.6
WCJM/A-asRNA 5mM 7.1 29 1.7
그 결과, 15시간 배양결과에서는 WCJM/A-asRNA 균주에서 아라비노즈 농도에 따라 OD가 1 정도 감소되는 것을 확인할 수 있었고, O-아세틸 호모세린 농도는 비슷하였다. 하지만, 30시간 배양결과 컨트롤 균주인 WCJM 균주는 아라비노즈 농도가 증가하여도 OD나 O-아세틸 호모세린 농도는 동일한 반면, 사이트레이트 신테이즈 안티센스 발현벡터가 도입된 WCJM/A-asRNA 균주는 아라비노즈 농도가 증가함에 따라 극명한 결과를 나타내었다. 아라비노즈 농도가 0mM 에서는 OD가 9.2였지만 5mM 농도에서는 1.9가 감소된 7.1을 나타내었고, 소모한 포도당 양은 적지만 O-아세틸 호모세린 양은 30.8% 증가하였다. 이 결과를 통해 사이트레이트 신테이즈 활성 약화뿐 아니라 단백질 발현 약화도 동일한 결과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 4: O-아세틸 호모세린 고수율 균주에서의 사이트레이트 신테이즈 활 성 약화 및 불활성화
<4-1> O-아세틸 호모세린 고수율 균주에서의 사이트레이트 신테이즈 활성이 불활성화된 균주 제작 및 평가
국제특허공개공보 WO 2012/087039에는 야생형 W3110 유래의, NTG 돌연변이로 쓰레오닌을 생산하는 균주로부터 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주를 제작하는 방법이 상세히 기술되어 있다. 이때 제작된 고수율의 O-아세틸 호모세린을 생산하는 균주는 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM11146P로 기탁하였다.
상기의 KCCM11146P 균주는 플라스크 배양시 포도당 40g/L를 소진하고 약 15~16g/L의 O-아세틸 호모세린을 생산하므로, 고수율의 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지고 있다. 하여, 사이트레이트 신테이즈 활성이 결실되었을 때 더 높은 O-아세틸 호모세린을 생산하는지 알아보기 위하여, 상기 KCCM11146P에 적용하였다. 제작 방법은 상기의 실시예 <1-1>과 동일하며, 이 방법을 통해 KCCM11146P 균주의 사이트레이트 신테이즈 활성이 결실된 균주를 제작하였고 KCCM11146P-AD라 명명하였다.
상기의 사이트레이트 신테이즈 유전자의 활성이 결실된 KCCM11146P-AD 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다. LB 배지에 KCCM11146P 또는 KCCM11146P-AD 균주를 접종하여 33℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종하고 33℃에서 5 시간 배양하고, 다시 25ml O-아세틸 호모세린 생산 배지(+ 글루타메이트 첨가)가 첨가된 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
표 9 플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산
OD (562nm) 포도당소모 (g/L) O-아세틸 호모세린 (g/L) 글루타메이트 (g/L)
KCCM11146P 18.3 60 14.2 4.6
KCCM11146P-AD 14.6 60 16.7 1.8
그 결과, KCCM11146P 균주에서 O-아세틸 호모세린이 14.2g/L 생성되었고, KCCM11146P-AD 균주는 OD가 감소하였지만 O-아세틸 호모세린이 16.7g/L으로 17.6% 정도 향상된 결과를 나타내었다.
<4-2> O-아세틸 호모세린 고수율 균주에서의 사이트레이트 신테이즈 활성 약화 균주 제작 및 평가
상기의 O-아세틸 호모세린 고수율 균주인 KCCM11146P에서 사이트레이트 신테이즈 활성을 약화시켰을 때도 더 높은 O-아세틸 호모세린을 생산하는지 알아보기 위하여 실시예 <2-1>에 설명되어 있는 단백질 활성을 약화시키는 변이 3종 중 가장 높은 O-아세틸 호모세린 생산능을 보였던 145번째 아미노산 변이(타이로신(Y)에서 알라닌(A))와 167번째 아미노산 변이(라이신(K)에서 알라닌(A))를 KCCM11146P에 적용하였다. 제작 방법은 상기의 실시예 <2-2>와 동일하며, 이 방법을 통해 KCCM11146P 균주의 사이트레이트 신테이즈 활성이 약화된 균주 2종을 각각 제작하였고 각 균주는 KCCM11146P-A145, KCCM11146P-A167이라 명명하였다.
상기의 사이트레이트 신테이즈 유전자의 활성이 약화된 KCCM11146P-A145, KCCM11146P-A167, 2종 균주의 O-아세틸 호모세린 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다.
LB 배지에 KCCM11146P 포함 KCCM11146P-A145, KCCM11146P-A167 3 종의 균주를 접종하여 33℃에서 하룻밤 배양한 후, 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 33℃에서 5시간 배양하고, 다시 25ml O-아세틸 호모세린 생산 배지가 첨가된 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 33℃ 200 rpm에서 30시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 O-아세틸 호모세린 생산량을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
표 10 플라스크 배양을 통한 O-아세틸 호모세린 생산
OD 562nm 포도당 소모 (g/L) O-아세틸 호모세린 (g/L) 글루타메이트 (g/L)
KCCM11146P 16.3 60 15.0 1.6
KCCM11146P-A145 14.6 60 17.5 0
KCCM11146P-A167 14.2 60 17.3 0
그 결과, KCCM11146P 균주에서 O-아세틸 호모세린이 15.0g/L 생성되었고, KCCM11146P-A145, KCCM11146P-A167 두 균주는 상기 실시예 <2-3>과 비슷한 결과를 나타내었다. 두 균주 모두 OD가 감소하면서 O-아세틸 호모세린이 17.5g/L, 17.3g/L로, 약 16.7% 정도 향상되었다. O-아세틸 호모세린 고생산 균주 역시 사이트레이트 신테이즈 활성 약화로 인한 TCA 싸이클 흐름 감소에 따라 글루타메이트가 1.6g/L에서 0g/L로 감소하였다.
상기의 결과들은 사이트레이트 신테이즈 활성이 약화 변이를 적용하여 O-아세틸 호모세린을 생산할 수 있음을 나타내는 것이고, 출원번호 WO2008/013432에 의거하여 생산된 O-아세틸 호모세린을 기질로 사용하고 추가적으로 시스타치오닌 감마 신테이즈(cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸 호모세린 설피드릴라제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 갖는 전환효소를 이용하여 전환 반응을 일으킬 경우 보다 더 저비용으로 L-메치오닌과 아세테이트를 동시에 생산할 수 있음을 또한 나타내는 것이다.
본 발명자는 KCCM11146P 균주 사이트레이트 신테이즈의 167번째 아미노산 변이주에서 O-아세틸 호모세린 생산이 증가함을 확인하고, 상기 KCCM11146P-A167 균주를 "CA05-4007"로 명명한 후, 이를 2013년 11월 22일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11483P를 부여받았다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2015006307-appb-I000001

Claims (7)

  1. 내재적 사이트레이트 신테이즈(citrate synthase) 단백질 활성이 약화 또는 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아(Escherichia) 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 내재적 사이트레이트 신테이즈(citrate synthase) 단백질 활성이 약화된 미생물은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아 속 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 시스타치오닌 감마 신테이즈(cystathionine gamma synthase), 호모세린 키나아제(homoserine kinase), 또는 둘 다의 활성이 내재적 활성에 비해 약화 또는 불활성화된, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 활성이 도입 또는 강화되거나, 내재적 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라제가 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 가지도록 변이된 것인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아 속 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포에놀파이루베이트카복실라제, 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 활성이 도입 또는 강화된 것인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아 속 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(E.coli)인 것인, O-아세틸 호모세린을 생산하는 에스케리치아 속 미생물.
  7. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 미생물의 배양 과정에서 생성된 O-아세틸 호모세린을 수득하는 단계를 포함하는, O-아세틸 호모세린의 생산 방법.
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