CN112501144B - 高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产o-乙酰高丝氨酸中的应用 - Google Patents
高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产o-乙酰高丝氨酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112501144B CN112501144B CN202110139085.1A CN202110139085A CN112501144B CN 112501144 B CN112501144 B CN 112501144B CN 202110139085 A CN202110139085 A CN 202110139085A CN 112501144 B CN112501144 B CN 112501144B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- methionine
- glycine
- mutant
- homoserine acetyltransferase
- homoserine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010034653 homoserine O-acetyltransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N O-acetyl-L-homoserine Chemical compound CC(=O)OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N 0.000 title claims abstract description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 53
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 55
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 47
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 19
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 17
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 17
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 16
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 15
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 12
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 12
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- 241001148629 Leptospira meyeri Species 0.000 claims description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 41
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 27
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 15
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 abstract description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 39
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 37
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 29
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 4
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- HCBFOIPUKYKZJC-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-acetamido-4-hydroxybutanoic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCO HCBFOIPUKYKZJC-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 108010076491 BsaI endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 239000004470 DL Methionine Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002932 Thiolase Human genes 0.000 description 1
- 108060008225 Thiolase Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000002742 combinatorial mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 1
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01031—Homoserine O-acetyltransferase (2.3.1.31)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明利用易错PCR随机突变和基于结构信息的定点饱和突变方法获得了多种酶活性和/或抗反馈抑制能力提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，相对于野生型的高丝氨酸乙酰转移酶存在G118V、F147I、M182T和M240G中一个或多个突变。在一具体实施中，突变体的酶活性比野生型提高了15.2倍，并具有较强的反馈抑制抗性，当10 mM O‑乙酰高丝氨酸存在时仍能保持42.7%的剩余酶活性。因此，本发明的高丝氨酸乙酰转移酶突变体可以为高效生产O‑乙酰高丝氨酸及下游代谢产物奠定了良好基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶活性和抗反馈抑制提升的高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在制备O-乙酰高丝氨酸中应用，属于生物工程领域。
背景技术
L-甲硫氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于饲料，食品，医药以及化妆品等领域，具有广阔的应用前景（Huang JF, et al. Metabolic engineering of Escherichiacoli for microbial production of L-methionine. Biotechnol Bioeng, 2017, 114:843-51）。目前，甲硫氨酸主要通过化学合成的方法进行生产。然而由于其能耗高，工艺路线复杂，生产成本高，环境污染大，从而极大地限制了大规模甲硫氨酸的工业化生产。同时化学合成法的产物为DL-甲硫氨酸的混合物，分离难度大，仅能应用于饲料添加。随着能源和环境危机的日益严峻，利用成本低廉、环境友好、产物单一的微生物发酵法合成L-甲硫氨酸的研究越来越受到关注。然而由于细胞中L-甲硫氨酸合成途径复杂且受到严谨的调控作用，目前L-甲硫氨酸细胞工厂的产量和得率都比较低，尚无法满足工业化生产的需求。
O-乙酰高丝氨酸（OAH）是L-甲硫氨酸合成的重要前体，能够在乙酰高丝氨酸巯解酶（EC 2.5.1.49）的作用下直接与甲硫醇反应生成L-甲硫氨酸（Willke T. Methionineproduction-a critical review. Appl Microbiol Biot, 2014, 98: 9893-914）。基于上述工艺路线，一种偶联发酵-酶转化的工艺路线被开发并用于L-甲硫氨酸的生产。该工艺首先通过微生物发酵合成OAH，然后再通过酶催化缩合甲硫醇生成L-甲硫氨酸，可以获得较高的产率。在该工艺中，通过发酵法合成OAH是制约L-甲硫氨酸合成的关键问题之一。高得率的OAH发酵生产能够有效降低生产成本，提高L-甲硫氨酸的生产效率。在微生物细胞中，O-乙酰高丝氨酸是由高丝氨酸和乙酰辅酶A在高丝氨酸乙酰转移酶（Homoserine O-acetyltransferase，HAT，EC:2.3.1.31）的催化作用下形成的。然而研究表明，高丝氨酸乙酰转移酶不仅具有较低的催化活性，还受到产物OAH的强烈反馈抑制，从而限制了OAH的高效生产（Bourhy P, et al. Homoserine O-acetyltransferase, involved in theLeptospira meyeri methionine biosynthetic pathway, is not feedback inhibited.J Bacteriol, 1997, 179: 4396-98）。因此，构建酶活性和抗反馈抑制能力提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，对OAH的高效生产具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体，以使得其酶活性和抗反馈抑制能力得到提高。
本发明提供一种来源于Leptospira meyeri的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个或多个位点突变。优选实施方式之一是，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个位点突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸以及第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的组合突变；或者仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变。
其中最优选地，仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸以及第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的组合突变。
本发明进一步提供所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因。优先地实施方式中，所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因的核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。在更具体地实施方式中，所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因核苷酸序列优选为SEQ ID No.3（编码G118V-F147I-M182T）、SEQ ID No.4（编码 G118V-F147I-M240G）、SEQ ID No.5（编码F147I-M182T-M240G）以及SEQ ID No.6（编码 G118V-F147I-M182T-M240G）所示。
本发明还提供含有如所述这高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因的表达载体和宿主细胞。
本发明还提供所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体或其编码基因在制备O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸中的应用。在具体实施方式中，其是通过构建微生物细胞工厂用于发酵生产O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸。在更具体的实施方式中，所述微生物细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
本发明是通过下述的技术思路实现的：将来源于Leptospira meyeri的高丝氨酸乙酰转移酶（HAT）基因构建到表达载体上，获得带有目的酶编码基因的重组质粒。将上述重组质粒转入大肠杆菌感受态中，进行目的酶诱导表达，并对酶活性和抗反馈抑制能力进行测定。本发明采用易错PCR随机突变方法所述的高丝氨酸乙酰转移酶基因进行定向进化。通过对目的基因片段进行PCR扩增，获得目的基因突变序列文库，并将其构建到表达载体上，获得高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库。
本发明采用高通量筛选的方法对所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库进行高通量筛选，获得了三个酶活性提高的突变体，其突变位点分别为G118V、F147I和M182T(即原始基因序列的第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸)。
本发明还对所述的高丝氨酸乙酰转移酶进行同源建模，并对底物通道3Å范围内的氨基酸残基（L236，M240，Y267，E270，P348，A349，L356和P357）进行饱和定点突变，经过高通量筛选获得了酶活性和抗反馈抑制能力提高的突变体M240G（即原始基因序列的第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸）。最后还所获得的酶活性提高的突变体G118V、F147I、M182T和M240G进行组合突变，获得了最优的突变组合F147I-M182T-M240G，该突变体具有最高的酶活性和抗反馈抑制能力。
其中，在进行研究时，先对所述高丝氨酸乙酰转移酶（HAT）基因进行密码子优化（优化后的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示），以更有利于表达和达到最终效果。
本发明针对高丝氨酸乙酰转移酶催化活性低和/或反馈抑制强烈等问题，分别利用易错PCR随机突变和基于结构信息的定点饱和突变方法获得了多种酶活性和/或抗反馈抑制能力提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体。在最最优的突变组合体即F147I-M182T-M240G，其酶活性比野生型提高了15.2倍，并具有较强的反馈抑制抗性，当10 mM O-乙酰高丝氨酸存在时仍能保持42.7%的剩余酶活性，因此本发明的高丝氨酸乙酰转移酶突变体能够为高效生产O-乙酰高丝氨酸及下游代谢产物奠定了良好基础。
附图说明
图1 高丝氨酸乙酰转移酶催化反应示意图。
图2高丝氨酸乙酰转移酶有益突变位点的组合突变体的酶活。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：高丝氨酸乙酰转移酶的诱导表达和酶活测定
1.1重组质粒的构建
本发明将来源于Leptospira meyeri的高丝氨酸乙酰转移酶基因进行按照大肠杆菌的密码子使用频率进行密码子优化，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，并进行基因合成（其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2）。利用限制性内切酶NdeI和XhoI连接至pET21b表达载体上，构建重组质粒。
1.2将重组质粒的转化至大肠杆菌BL21(DE3)中
具体转化方法为：（1）取10 μL重组质粒于50 μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30 min；（2）42℃水浴热激90 s，快速置于冰上1～2 min；（3）加入新鲜LB液体培养基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L）600 μL，于37 ºC振荡培养60 min；（4）取200μL菌液涂布于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37 ºC培养12～16 h。
1.3高丝氨酸乙酰转移酶的诱导表达
具体方法为：挑取单菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ºC、200 r/min培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到新鲜的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ºC、200 r/min培养至OD600达到0.6~0.8。随后在培养基中添加终浓度为0.4 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），30 ºC继续培养6~10 h。
1.4 高丝氨酸乙酰转移酶的酶活测定
收集诱导表达的菌体，离心去除培养基，加入5 mL 50 mM Tris-HCl缓冲液重悬，使用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设定200W功率，超声2 s间歇1 s，超声10 min；随后在高速冷冻离心机上8000×g离心10 min，收集上清用于酶活测定。酶活测定体系为：50 mMTris-HCl（pH 7.0），2 mM 高丝氨酸（homoserine），0.12 mM acetyl-CoA，1 mM 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) DTNB，适当稀释的粗酶液。以不加homoserine样品为空白对照，室温下使用酶标仪测定412 nm的吸光值。由于DTNB不稳定，见光易分解，需现配现用，并在测定时需重复制作CoA标准曲线。标准曲线的测定体系为：50 mM Tris-HCl（pH 7.0），2 mMhomoserine，0~0.1 mM CoA，1 mM DTNB。MetX的酶活单位定义为：单位时间内（min）生成1 μmol CoA所需的酶量。
经酶标仪检测，来源于Leptospira meyeri的高丝氨酸乙酰转移酶活性为0.85±0.21 U/mg protein，并受到OAH高丝氨酸强烈的反馈抑制，当10 mM OAH存在时，仅能保存23%的剩余酶活（0.19 U/mg 蛋白质）。
实施例2：采用易错PCR方法定向进化高丝氨酸乙酰转移酶
2.1 高丝氨酸乙酰转移酶突变体文库的构建
本发明首先采用易错PCR的方法构建高丝氨酸乙酰转移酶突变体文库。本发明采用的易错PCR体系为：10 x Taq 缓冲液，5 μL；25 mmol/L Mg2+，14 μL；10 mmol/L Mn2+，0-5μL；10 pmol 引物1，2 μL；10 pmol 引物2，2 μL；10 mmol/L dNTP，4 μL；50 ng DNA模板；Takara rTaq DNA聚合酶，5 U；加ddH2O补充至50 μL。易错PCR程序为：95 ºC，3 min；95 ºC，30 s；58 ºC，30 s；72 ºC，2 min；循环35 times，72 ºC延伸5 min。
将上述获得的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用胶回收试剂盒进行切胶回收。然后通过限制性内切酶NdeI和XhoI酶切，酶切体系为：10 μL 10 x缓冲液；5 μL XhoI；5 μL NdeI；500 ng目的片段；加ddH2O补充至100 μL。随后连接至用同样内切酶处理的pET21b表达载体上，构建高丝氨酸乙酰转移酶突变体质粒文库。然后将上述获得的质粒文库按照实施例1中的第1.2点所示方法转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。
2.2高丝氨酸乙酰转移酶突变体文库的高通量筛选
将实施例2中的第2.1点获得的含有高丝氨酸乙酰转移酶突变体文库的大肠杆菌，挑取单克隆接种至已含有800 μL LB液体培养基的96 深孔板中，37 ºC、800 r/min震荡培养。当菌体浓度OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度0.4 mM IPTG诱导剂，30 ºC、800 r/min继续震荡培养12 h。4 ºC 5000´g 离心10 min，去除培养基上清。随后加入1 mL已含有2 mg/mL溶菌酶和0.05% Triton X-100的裂解缓冲液（20 mM Na2HPO4, 200 mM NaCl, pH 7.0），37 ºC孵育2 h，4 ºC 5000´g 离心10 min，收集上清用于酶活测定。
按照实施例1中的第1.4点所述的酶活测定方法，对上述获得的突变体文库进行酶活测定，从约1000个突变体中筛选获得三个酶活明显提升的候选突变体，即G118V、F147I和M182T。然后将三个含有候选突变体的菌株按照实施例1.3所示的方法，重新进行诱导表达和酶活验证。
结果表明，高丝氨酸乙酰转移酶突变体G118V、F147I和M182T的酶活性可达8.37±0.42、7.68±0.51和6.49±0.24 U/mg 蛋白质，分别是野生型高丝氨酸乙酰转移酶活性的9.7倍、8.9倍和7.5倍。然而，上述三个突变体仍然受到目标产物OAH的较明显反馈抑制作用，在10 mM OAH存在时，三个突变体仅能保留20%~25%的剩余酶活。
实施例3：3Å范围内底物通道氨基酸残基的定点饱和突变
本发明首先利用软件RosettaCM，以来源于Leptospira interrogans的高丝氨酸乙酰转移酶为模板（PDB ID: 2PL5），通过同源建模的方法构建了Leptospira meyeri的高丝氨酸乙酰转移酶的三维模型。随后利用Rosetta分子对接方法，将CoA对接至上述构建的高丝氨酸乙酰转移酶三维模型中。根据同源建模和分子对接结果分析，对底物通道3Å范围内8个可变的氨基酸残基进行定点饱和突变，分别为：L236、M240、Y267、E270、P348、A349、L356和P357。
本发明所采用定点饱和突变具体方法为：在待突变的氨基酸位点设计随机的兼并引物NNK(其中N代表A、C、G或T，K代表G或T)，如下所示；
以含有密码子优化后高丝氨酸乙酰转移酶基因的pET21b质粒为模板，利用上述兼并引物，通过PCR扩增获得基因突变文库；随后采用基于Golden Gate 克隆的片段装配方法连接成完整质粒文库。Golden Gate组装体系为：10 x T4连接酶缓冲液，1.5 μL；100 xBSA，1.5 μL； BsaI内切酶，1 μL；T4 Ligase，1 μL；DNA片段，100 ng；补充ddH2O至15 μL。Golden Gate组装程序为：37 °C，3 min；22 °C，4 min；循环30次；22 °C，20 min；50 °C，2min；80 °C，2 min；16 °C，5 min。将Golden Gate 反应液直接转化E. coli BL21（DE3）感受态，构建待突变氨基酸位点的饱和突变文库。为了保证文库的覆盖率，每个点的饱和突变均随机选择95个单克隆进行验证，将获得的单克隆接种至含有800 μL LB液体培养基的96 深孔板中，37 ºC、800 r/min震荡培养。当菌体浓度OD600达到0.6~0.8时，加入终浓度0.4 mMIPTG诱导剂，30 ºC、800 r/min继续震荡培养12 h。4 ºC 5000 x g 离心10 min，去除培养基上清。随后加入1 mL已含有2 mg/mL溶菌酶和0.05% Triton X-100的裂解缓冲液（20 mMNa2HPO4, 200 mM NaCl, pH 7.0），37 ºC孵育2 h，4 ºC 5000 x g 离心10 min，收集上清用于酶活测定。
按照实施例1中的第1.4点所述的酶活测定方法，将上述获得的突变体文库进行酶活测定。从8个位点的饱和突变中筛选获得1个酶活性提高的候选突变体，即M240G。然后将该突变体菌株按照实施例1中的第1.3点所示的方法重新进行诱导表达和酶活验证。
结果表明，突变体M240G酶活性达到2.73±0.35 U/mg蛋白质，是野生型的3.21倍。同时该突变体酶有较强的反馈抑制能力，在10 mM OAH存在时，仍能保留54.2%的剩余酶活（1.48 U/mg 蛋白质）。
实施例4：有益突变位点的组合突变进一步提高酶活性
4.1有益突变位点的组合突变
为了进一步提高酶的催化能力，将上述获得突变位点G118V、F147I、M182T和M240G进行组合突变。本发明所涉及的定点突变采用QuikChange定点突变试剂盒（QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit）完成，所涉及的引物如下：
QuikChange定点突变体系为：10´Phusion 缓冲液，5 μL；10 μmol 引物1，2 μL；10μmol 引物2，2 μL；10 mmol/L dNTP，4 μL；50 ng DNA 模板；Phusion High-Fidelity DNA聚合酶，5 U；补充ddH2O至50 μL。PCR程序为：98 ºC，30 s；98 ºC，10 s；58 ºC，30 s；72 ºC，5 min；循环30次，72 ºC延伸5 min。
将上述获得的反应液转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，具体转化方法如实施例1中的第1.2点所示。挑取单菌落进行测序验证，最终构建了6个双突变体组合（G118V-F147I、G118V-M182T、G118V-M240G、F147I-M182T、F147I-M240G和M182T-M240G），3个三突变体组合（G118V-F147I-M182T、F147I-M182T-M240G和G118V-M182T-M240G）以及1个四突变体组合（G118V-F147I-M182T-M240G）。
4.2高丝氨酸乙酰转移酶突变体诱导表达及酶活测定
将上述获得的含有高丝氨酸乙酰转移酶组合突变体的菌株接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37ºC、200 r/min培养过夜。将过夜培养的种子液以1%的接种量转接到新鲜的含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ºC、200 r/min培养至OD600达到0.6~0.8。随后在培养基中添加终浓度为0.4 mM IPTG，30 ºC继续培养6~8 h。收集诱导表达的菌体，离心去除培养基，加入5 mL 50 mM Tris-HCl缓冲液重悬，使用超声波细胞破碎仪破碎细胞，设定200 W功率，超声2 s间歇1 s，超声10 min；随后在高速冷冻离心机上8000 x g离心10 min，收集上清用于酶活测定。
按照实施例1中的第1.4点所述的方法，进行酶活分析，测定结果如表1和图2所示。表中所列出的突变体均表现相对于贤野生型来说有提高的酶活性（至少是约9.4倍），其中高丝氨酸乙酰转移酶突变体F147I-M182T-M240G表现出最高的酶催化能力，其酶活性为12.96 ± 0.19 U/mg 蛋白质，是野生型的15.25倍。所列出的突变体均表现增加的抗反馈抑制能力，其中仍以高丝氨酸乙酰转移酶突变体F147I-M182T-M240G表现最优，在10 mMOAH存在时，突变体能保留42.7%的剩余酶活，酶性活仍达5.54 ± 0.23 U/mg 蛋白质。其中本实施例中，G118V-F147I-M182T突变的编码核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，G118V-F147I-M240G 如SEQ ID No.4所示，F147I-M182T-M240G 如SEQ ID No.5所示，G118V-F147I-M182T-M240G 如SEQ ID No.6所示。
表1高丝氨酸乙酰转移酶有益突变位点的组合突变体的酶活
因此，所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体具有明显优于野生型的催化活性，具有良好的应用前景。
实施例5：构建工程菌株发酵生产O-乙酰高丝氨酸
基于实施例4获得的高丝氨酸乙酰转移酶组合突变体，构建微生物细胞工厂用于发酵生产O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸。以野生型大肠杆菌W3110或谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发背景菌株，采用强启动子对最优高丝氨酸乙酰转移酶组合突变体F147I-M182T-M240G进行优化表达。利用引物对（MetX-F: 5’-CTAGAAGCTTATGCCAACCTCCGAACAGAAC-3’和MetX-R: 5’-CTAGGGTACCTTACAGGAACACGCCTTCATC-3’），扩增获得F147I-M182T-M240G突变体编码基因，经过HindIII和KpnI双酶切后，亚克隆至表达载体pXMJ19（大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体），获得重组表达质粒pXMJ19-F147I-M182T-M240G。随后，将对照表达质粒pXMJ19和重组表达质粒pXMJ19-F147I-M182T-M240G，转入野生型大肠杆菌W3110中，分别获得菌株Ec-pXMJ19和Ec-pXMJMut；将对照表达质粒pXMJ19和重组表达质粒pXMJ19-F147I-M182T-M240G，转入野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，分别获得菌株Cg-pXMJ19和Cg-pXMJMut.
将上述获得的菌株接种于LB培养基中，过夜培养后，接种于含有50 mL新鲜的种子培养基（5 g/L酵母粉，5 g/L蛋白胨，15 g/L葡萄糖，尿素0.1 g/L，玉米浆 15 g/L，硫酸铵15 g/L，pH为6.5）的500 mL三角瓶中，培养16 h至对数中期。按照10%接种量接种至新鲜发酵培养基中（葡萄糖50 g/L，玉米浆 20 g/L，(NH4)2SO4 20 g/L，KH2PO4 1 g/L，K2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，MnSO4·H2O 0.01 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，柠檬酸钠 0.5 g/L，维生素B1 2 mg/L，生物素0.1 mg/L），进行摇瓶发酵。
菌株发酵培养60 h后，取样使用高效液相色谱测定发酵液中O-乙酰高丝氨酸含量。结果如表2所示。
表2 菌株生产O-乙酰高丝氨酸的发酵分析
从结果可知，在大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌中过表达高丝氨酸乙酰转移酶突变体F147I-M182T-M240G后，相较于原始出发菌而言，菌株OAH发酵生产能力分别提升13.2倍和10.8倍。因此，构建酶活性和抗反馈抑制能力提高的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，对于大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌等底盘菌株高效生产O-乙酰高丝氨酸具有重要的应用价值。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产O-乙酰高丝氨酸中的应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1137
<212> DNA
<213> Leptospira meyeri
<400> 1
atgccaacct ccgaacagaa cgaattctcc cacggctctg tcggcgtcgt gtacacccaa 60
tccatccgct tcgaatccct caccctggaa ggtggcgaga ccatcacccc tctggaaatt 120
gcctacgaga cctacggcac cctgaacgag aagaaagaca acgccatcct ggtctgccat 180
gccctgtccg gtgacgccca cgcagcaggc ttccacgaag gtgacaagcg ccctggctgg 240
tgggattact acatcggccc aggcaagtct tttgacacca accgctactt catcatctcc 300
tccaacgtga tcggcggttg caaaggttcc tccggcccac tcaccatcaa cggcaagaac 360
ggtaagccat ttcagtccac cttcccattc gtgtccatcg gtgatatggt caacgcccag 420
gagaagctga tctcccattt cggcatccac aagctcttcg cagtggccgg tggttctatg 480
ggcggcatgc aggccctgca atggtccgtc gcctaccctg accgcctcaa gaactgcatt 540
gtgatggcct cctcctctga gcactccgcc cagcagatcg catttaacga ggtgggccgt 600
caggccatcc tgtccgaccc taactggaac caaggcctgt atacccagga gaaccgccct 660
tccaagggtc tggcactggc ccgtatgatg ggccacatca cctacctgtc cgacgagatg 720
atgcgcgaaa aattcggccg caagccacca aagggcaaca tccagtccac cgacttcgca 780
gtgggctcct acctgattta ccagggcgag tccttcgtcg accgcttcga tgcaaactcc 840
tacatctacg tcaccaaggc actggaccac ttctccctgg gcaccggcaa ggaactgacc 900
aaggtgctcg ccaaagtccg ctgccgcttc ctcgtggtcg cctatacctc cgattggctg 960
tacccaccat accagtccga ggagatcgtg aagtccctcg aagtgaacgc agtgcctgtc 1020
tccttcgtgg aactcaataa cccagcaggc cacgattctt tcctgctgcc atccgaacag 1080
caggattcca tcctgcgcga cttcctgtcc tctactgatg aaggcgtgtt cctgtaa 1137
<210> 2
<211> 378
<212> DNA
<213> Leptospira meyeri
<400> 2
MPTSEQNEFS HGSVGVVYTQ SIRFESLTLE GGETITPLEI AYETYGTLNE KKDNAILVCH 60
ALSGDAHAAG FHEGDKRPGW WDYYIGPGKS FDTNRYFIIS SNVIGGCKGS SGPLTINGKN 120
GKPFQSTFPF VSIGDMVNAQ EKLISHFGIH KLFAVAGGSM GGMQALQWSV AYPDRLKNCI 180
VMASSSEHSA QQIAFNEVGR QAILSDPNWN QGLYTQENRP SKGLALARMM GHITYLSDEM 240
MREKFGRKPP KGNIQSTDFA VGSYLIYQGE SFVDRFDANS YIYVTKALDH FSLGTGKELT 300
KVLAKVRCRF LVVAYTSDWL YPPYQSEEIV KSLEVNAVPV SFVELNNPAG HDSFLLPSEQ 360
QDSILRDFLS STDEGVFL 378
<210> 3
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgccaacct ccgaacagaa cgaattctcc cacggctctg tcggcgtcgt gtacacccaa 60
tccatccgct tcgaatccct caccctggaa ggtggcgaga ccatcacccc tctggaaatt 120
gcctacgaga cctacggcac cctgaacgag aagaaagaca acgccatcct ggtctgccat 180
gccctgtccg gtgacgccca cgcagcaggc ttccacgaag gtgacaagcg ccctggctgg 240
tgggattact acatcggccc aggcaagtct tttgacacca accgctactt catcatctcc 300
tccaacgtga tcggcggttg caaaggttcc tccggcccac tcaccatcaa cgtcaagaac 360
ggtaagccat ttcagtccac cttcccattc gtgtccatcg gtgatatggt caacgcccag 420
gagaagctga tctcccatat cggcatccac aagctcttcg cagtggccgg tggttctatg 480
ggcggcatgc aggccctgca atggtccgtc gcctaccctg accgcctcaa gaactgcatt 540
gtgacggcct cctcctctga gcactccgcc cagcagatcg catttaacga ggtgggccgt 600
caggccatcc tgtccgaccc taactggaac caaggcctgt atacccagga gaaccgccct 660
tccaagggtc tggcactggc ccgtatgatg ggccacatca cctacctgtc cgacgagatg 720
atgcgcgaaa aattcggccg caagccacca aagggcaaca tccagtccac cgacttcgca 780
gtgggctcct acctgattta ccagggcgag tccttcgtcg accgcttcga tgcaaactcc 840
tacatctacg tcaccaaggc actggaccac ttctccctgg gcaccggcaa ggaactgacc 900
aaggtgctcg ccaaagtccg ctgccgcttc ctcgtggtcg cctatacctc cgattggctg 960
tacccaccat accagtccga ggagatcgtg aagtccctcg aagtgaacgc agtgcctgtc 1020
tccttcgtgg aactcaataa cccagcaggc cacgattctt tcctgctgcc atccgaacag 1080
caggattcca tcctgcgcga cttcctgtcc tctactgatg aaggcgtgtt cctgtaa 1137
<210> 4
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgccaacct ccgaacagaa cgaattctcc cacggctctg tcggcgtcgt gtacacccaa 60
tccatccgct tcgaatccct caccctggaa ggtggcgaga ccatcacccc tctggaaatt 120
gcctacgaga cctacggcac cctgaacgag aagaaagaca acgccatcct ggtctgccat 180
gccctgtccg gtgacgccca cgcagcaggc ttccacgaag gtgacaagcg ccctggctgg 240
tgggattact acatcggccc aggcaagtct tttgacacca accgctactt catcatctcc 300
tccaacgtga tcggcggttg caaaggttcc tccggcccac tcaccatcaa cgtcaagaac 360
ggtaagccat ttcagtccac cttcccattc gtgtccatcg gtgatatggt caacgcccag 420
gagaagctga tctcccatat cggcatccac aagctcttcg cagtggccgg tggttctatg 480
ggcggcatgc aggccctgca atggtccgtc gcctaccctg accgcctcaa gaactgcatt 540
gtgatggcct cctcctctga gcactccgcc cagcagatcg catttaacga ggtgggccgt 600
caggccatcc tgtccgaccc taactggaac caaggcctgt atacccagga gaaccgccct 660
tccaagggtc tggcactggc ccgtatgatg ggccacatca cctacctgtc cgacgaggga 720
atgcgcgaaa aattcggccg caagccacca aagggcaaca tccagtccac cgacttcgca 780
gtgggctcct acctgattta ccagggcgag tccttcgtcg accgcttcga tgcaaactcc 840
tacatctacg tcaccaaggc actggaccac ttctccctgg gcaccggcaa ggaactgacc 900
aaggtgctcg ccaaagtccg ctgccgcttc ctcgtggtcg cctatacctc cgattggctg 960
tacccaccat accagtccga ggagatcgtg aagtccctcg aagtgaacgc agtgcctgtc 1020
tccttcgtgg aactcaataa cccagcaggc cacgattctt tcctgctgcc atccgaacag 1080
caggattcca tcctgcgcga cttcctgtcc tctactgatg aaggcgtgtt cctgtaa 1137
<210> 5
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgccaacct ccgaacagaa cgaattctcc cacggctctg tcggcgtcgt gtacacccaa 60
tccatccgct tcgaatccct caccctggaa ggtggcgaga ccatcacccc tctggaaatt 120
gcctacgaga cctacggcac cctgaacgag aagaaagaca acgccatcct ggtctgccat 180
gccctgtccg gtgacgccca cgcagcaggc ttccacgaag gtgacaagcg ccctggctgg 240
tgggattact acatcggccc aggcaagtct tttgacacca accgctactt catcatctcc 300
tccaacgtga tcggcggttg caaaggttcc tccggcccac tcaccatcaa cggcaagaac 360
ggtaagccat ttcagtccac cttcccattc gtgtccatcg gtgatatggt caacgcccag 420
gagaagctga tctcccatat cggcatccac aagctcttcg cagtggccgg tggttctatg 480
ggcggcatgc aggccctgca atggtccgtc gcctaccctg accgcctcaa gaactgcatt 540
gtgacggcct cctcctctga gcactccgcc cagcagatcg catttaacga ggtgggccgt 600
caggccatcc tgtccgaccc taactggaac caaggcctgt atacccagga gaaccgccct 660
tccaagggtc tggcactggc ccgtatgatg ggccacatca cctacctgtc cgacgaggga 720
atgcgcgaaa aattcggccg caagccacca aagggcaaca tccagtccac cgacttcgca 780
gtgggctcct acctgattta ccagggcgag tccttcgtcg accgcttcga tgcaaactcc 840
tacatctacg tcaccaaggc actggaccac ttctccctgg gcaccggcaa ggaactgacc 900
aaggtgctcg ccaaagtccg ctgccgcttc ctcgtggtcg cctatacctc cgattggctg 960
tacccaccat accagtccga ggagatcgtg aagtccctcg aagtgaacgc agtgcctgtc 1020
tccttcgtgg aactcaataa cccagcaggc cacgattctt tcctgctgcc atccgaacag 1080
caggattcca tcctgcgcga cttcctgtcc tctactgatg aaggcgtgtt cctgtaa 1137
<210> 6
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgccaacct ccgaacagaa cgaattctcc cacggctctg tcggcgtcgt gtacacccaa 60
tccatccgct tcgaatccct caccctggaa ggtggcgaga ccatcacccc tctggaaatt 120
gcctacgaga cctacggcac cctgaacgag aagaaagaca acgccatcct ggtctgccat 180
gccctgtccg gtgacgccca cgcagcaggc ttccacgaag gtgacaagcg ccctggctgg 240
tgggattact acatcggccc aggcaagtct tttgacacca accgctactt catcatctcc 300
tccaacgtga tcggcggttg caaaggttcc tccggcccac tcaccatcaa cgtcaagaac 360
ggtaagccat ttcagtccac cttcccattc gtgtccatcg gtgatatggt caacgcccag 420
gagaagctga tctcccatat cggcatccac aagctcttcg cagtggccgg tggttctatg 480
ggcggcatgc aggccctgca atggtccgtc gcctaccctg accgcctcaa gaactgcatt 540
gtgacggcct cctcctctga gcactccgcc cagcagatcg catttaacga ggtgggccgt 600
caggccatcc tgtccgaccc taactggaac caaggcctgt atacccagga gaaccgccct 660
tccaagggtc tggcactggc ccgtatgatg ggccacatca cctacctgtc cgacgaggga 720
atgcgcgaaa aattcggccg caagccacca aagggcaaca tccagtccac cgacttcgca 780
gtgggctcct acctgattta ccagggcgag tccttcgtcg accgcttcga tgcaaactcc 840
tacatctacg tcaccaaggc actggaccac ttctccctgg gcaccggcaa ggaactgacc 900
aaggtgctcg ccaaagtccg ctgccgcttc ctcgtggtcg cctatacctc cgattggctg 960
tacccaccat accagtccga ggagatcgtg aagtccctcg aagtgaacgc agtgcctgtc 1020
tccttcgtgg aactcaataa cccagcaggc cacgattctt tcctgctgcc atccgaacag 1080
caggattcca tcctgcgcga cttcctgtcc tctactgatg aaggcgtgtt cctgtaa 1137
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 7
caccaggtct caatcaccta cnnktccgac gagatgatgc g 41
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caccaggtct catgatgtgg cccatcatac gggcc 35
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 9
caccaggtct catccgacga gnnkatgcgc gaaaaattcg gccg 44
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caccaggtct cacggacagg taggtgatgt ggccc 35
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 11
caccaggtct catacctgat tnnkcagggc gagtccttc 39
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
caccaggtct caggtaggag cccactgcga agtcg 35
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 13
caccaggtct cataccaggg cnnktccttc gtcgaccgc 39
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
caccaggtct caggtaaatc aggtaggagc ccactgcg 38
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 15
caccaggtct cacaataacn nkgcaggcca cgattctttc c 41
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
caccaggtct caattgagtt ccacgaagga gacaggc 37
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 17
caccaggtct cataacccan nkggccacga ttctttcctg c 41
<210> 18
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caccaggtct cagttattga gttccacgaa ggagacaggc ac 42
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 19
caccaggtct catttcctgn nkccatccga acagcag 37
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
caccaggtct cagaaagaat cgtggcctgc tgg 33
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> n=a或c或g或t，k=g或t
<400> 21
caccaggtct catgctgnnk tccgaacagc agg 33
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
caccaggtct caagcaggaa agaatcgtgg cctgc 35
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
tcaccatcaa cgtcaagaac ggtaagccat ttcagtccac c 41
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tggcttaccg ttcttgacgt tgatggtgag tgggccg 37
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ctcccatatc ggcatccaca agctcttcgc agtggcc 37
<210> 26
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gaagagcttg tggatgccga tatgggagat cagcttctcc 40
<210> 27
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cctcaagaac tgcattgtga cggcctcctc ctctgagc 38
<210> 28
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ggaggccgtc acaatgcagt tcttgaggcg gtcaggg 37
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
acgagggaat gcgcgaaaaa ttcggccg 28
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cggccgaatt tttcgcgcat tccctcgt 28
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ctagaagctt atgccaacct ccgaacagaa c 31
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ctagggtacc ttacaggaac acgccttcat c 31
Claims (9)
1.一种来源于Leptospira meyeri的高丝氨酸乙酰转移酶突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸或者第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的一个位点突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸和第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸的组合突变；仅存在第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变；仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸以及第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸中的组合突变；或者仅存在第118位由甘氨酸突变为缬氨酸，第147位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸，第182位由甲硫氨酸突变为苏氨酸和第240位甲硫氨酸突变为甘氨酸的组合突变。
2.如权利要求1所述高丝氨酸乙酰转移酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。
4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。
5.含有如权利要求2至4任一项所述编码基因的表达载体。
6.含有如权利要求2至4任一项所述编码基因的宿主细胞。
7.如权利要求1所述的高丝氨酸乙酰转移酶突变体或其编码基因在制备O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，通过构建微生物细胞用于发酵生产O-乙酰高丝氨酸或甲硫氨酸。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述微生物细胞是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110139085.1A CN112501144B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产o-乙酰高丝氨酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110139085.1A CN112501144B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产o-乙酰高丝氨酸中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112501144A CN112501144A (zh) | 2021-03-16 |
| CN112501144B true CN112501144B (zh) | 2021-04-20 |
Family
ID=74952859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110139085.1A Active CN112501144B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产o-乙酰高丝氨酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112501144B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116240185A (zh) * | 2023-04-13 | 2023-06-09 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 高丝氨酸脱氢酶突变体及其在生产l-高丝氨酸中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018019867A1 (en) * | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Evonik Degussa Gmbh | N-acetyl homoserine |
| CN108026516A (zh) * | 2015-08-07 | 2018-05-11 | 赢创德固赛有限公司 | 通过发酵的蛋白硫代羧化物依赖性l-甲硫氨酸生产 |
| CN110129294A (zh) * | 2018-02-02 | 2019-08-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 高丝氨酸乙酰基转移酶突变体及其宿主细胞和应用 |
| CN110592153A (zh) * | 2014-06-23 | 2019-12-20 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-乙酰基高丝氨酸的微生物和用其生产o-乙酰基高丝氨酸的方法 |
-
2021
- 2021-02-02 CN CN202110139085.1A patent/CN112501144B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110592153A (zh) * | 2014-06-23 | 2019-12-20 | Cj第一制糖株式会社 | 生产o-乙酰基高丝氨酸的微生物和用其生产o-乙酰基高丝氨酸的方法 |
| CN108026516A (zh) * | 2015-08-07 | 2018-05-11 | 赢创德固赛有限公司 | 通过发酵的蛋白硫代羧化物依赖性l-甲硫氨酸生产 |
| WO2018019867A1 (en) * | 2016-07-27 | 2018-02-01 | Evonik Degussa Gmbh | N-acetyl homoserine |
| CN110129294A (zh) * | 2018-02-02 | 2019-08-16 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 高丝氨酸乙酰基转移酶突变体及其宿主细胞和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Combining Protein and Metabolic Engineering Strategies for High-Level Production of O-Acetylhomoserine in Escherichia coli;Liang Wei等;《ACS Synth Biol》;20190517;第8卷(第5期);第1153-1167页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112501144A (zh) | 2021-03-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220307061A1 (en) | Phosphinothricin dehydrogenase mutant, genetically engineered bacterium and one-pot multi-enzyme synchronous directed evolution method | |
| CN109055289B (zh) | 一种高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用 | |
| CN112391372B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶突变体、基因工程菌及其应用 | |
| CN110358750A (zh) | 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用 | |
| CN114207121A (zh) | 甲醇利用 | |
| CN112501144B (zh) | 高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其在生产o-乙酰高丝氨酸中的应用 | |
| CN114107152A (zh) | 一种高产3-岩藻糖基乳糖微生物的构建方法及应用 | |
| CN117778342B (zh) | 羰基还原酶突变体及其在合成11β-羟基甾体化合物中的应用 | |
| US20230024648A1 (en) | Ean B Mutants and Their Uses | |
| CN116855471B (zh) | 一种嘌呤核苷磷酸化酶突变体及其应用 | |
| CN112375726B (zh) | 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 | |
| CN112908417A (zh) | 功能序列和结构模拟相结合的基因挖掘方法、nadh偏好型草铵膦脱氢酶突变体及应用 | |
| JP2023071865A (ja) | メチオニン生産酵母 | |
| CN114736884A (zh) | 一种胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应用 | |
| CN111690675B (zh) | 一种表达腈水合酶突变体的重组菌及其制备方法和应用 | |
| CN113122563A (zh) | 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 | |
| CN117683739A (zh) | 一种高丝氨酸乙酰转移酶突变体及其应用 | |
| US11939599B2 (en) | Gene mining method combining functional sequence and structure simulation, NADH-preferring phosphinothricin dehydrogenase mutant and application thereof | |
| CN110846288A (zh) | 一种谷胱甘肽双功能酶突变体及其应用 | |
| CN110872595B (zh) | 抗酸表达盒及其在发酵产有机酸中的应用 | |
| CN116240193B (zh) | 胆碱激酶突变体及其在胞磷胆碱生产中的应用 | |
| CN114525266B (zh) | 一种来源于南极细菌的磷脂酶d突变体及其应用 | |
| CN114703212B (zh) | 一种运用特定区段随机突变法改造漆酶的方法及漆酶菌株lac123 | |
| CN114277013B (zh) | 一种nad激酶突变体及其应用 | |
| CN116515802A (zh) | 天冬氨酸酶突变体及其工程菌的合成与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240428 Address after: No. 15 West 8th Road, Airport Economic Zone, Binhai New Area, Tianjin, 300308 Patentee after: Tianjin National Synthetic Biotechnology Innovation Center Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: No.32, Xiqi Road, Airport Economic Zone, Binhai New Area, Tianjin 300308 Patentee before: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES Country or region before: China |
|
| TR01 | Transfer of patent right |