CN110358750A - 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用，该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在氨基酸序列SEQ ID NO：2中第L195位、第L235位、第H294位进行单突变、两两联合突变、三个联合突变中的一种突变；该新型蔗糖磷酸化酶突变体酶用于催化合成甘油葡糖苷。本发明构建的新型蔗糖磷酸化酶突变体酶具有成本低，转化时间短、工艺操作简单等特点，具有大规模工业应用的广泛前景。

Description

新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用

技术领域

本发明涉及一种新的蔗糖磷酸化酶突变体，具体涉及用于酶法合成2-甘油葡糖苷的工业酶及其突变体，属于生物酶工程技术领域。

背景技术

甘油葡萄糖苷（又称为2-甘油葡糖苷），普遍存在于自然界中，特别是在耐盐的蓝藻细菌中，比如蓝绿藻和南非密罗木（也叫不死草、复活草）。它是密罗木能在极端环境中生存和重新激活复生的最主要的活性物质，能牢牢锁住体内珍贵的最后一滴水，因而甘油葡萄糖苷具有极强的“滋润、锁水、保湿”的生理效果，可作为化妆品的功能性原料，具有较大的市场需求。

目前关于甘油葡萄糖苷的制备主要采用生物酶法来合成。植物提取受限于场地、来源等，不能大规模生产；化学合成存在着杂质较多的问题（合成中会引入1-甘油葡萄苷，而2-甘油葡糖苷的锁水保湿功能最好），因而目前主要采用专一性高的生物酶法来合成。以蔗糖和甘油为原料，在蔗糖磷酸化酶的作用下生产2-甘油葡萄糖苷。然而，目前国内报道的蔗糖磷酸化酶及其突变体的酶活不高，甘油葡萄糖苷的生产量在55g/l（CN109423485A），远达不到工业生产的要求。

蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，是近年来发展起来的对原始基因序列进行人工改造、以满足工业化应用需求的高科技技术，其中蛋白定向进化技术更是获得了2018年诺贝尔化学奖。本发明采用蛋白质三维结构模拟和蛋白定向进化技术，对来源于罗伊乳杆菌Lactobacillus reuteri的蔗糖磷酸化酶进行了人工改造，改造后的突变体单位酶活相对于原始蛋白来说提高了约9倍，甘油葡萄糖苷的生产量超过100 g/l，具有良好的工业化应用前景。

发明内容

发明目的：为了解决上述问题，本发明的第一个目的在于提供一种新的蔗糖磷酸化酶及其突变体。

本发明的第二个目的在于提供新的蔗糖磷酸化酶催化合成2-甘油葡糖苷的方法及应用。

技术方案：本发明公开了一种来源于罗伊乳杆菌Lactobacillus reuteri的蔗糖磷酸化酶及其突变体基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法和酶突变体的构建方法，以及该酶及其突变体作为生物催化剂用于制备甘油葡萄糖苷的方法。

蔗糖磷酸化酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

蔗糖磷酸化酶的基因序列通过常州基宇生物技术有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加NdeI和HindIII限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶NdeI和HindIII酶切后，与经过同样双酶切的pET29a（+）载体（Novagen公司）进行连接、转化和筛选，筛选得到的阳性质粒转入BL21（DE3）宿主菌中，从而构建蔗糖磷酸化酶的体外异源表达体系。

蔗糖磷酸化酶的突变体的构建，是通过定向进化的技术手段得到的。具体的为，利用易错PCR、DNA重排、半理性设计及三维结构模拟等定向进行技术来获得突变体。更为具体的是，本发明通过三维结构模拟技术来进行酶的定向进化。采用同源建模的方法来模拟蔗糖磷酸化酶的三维结构，利用能量最低原理和分子对接技术预测出可能的与催化相关的一个或多个位点，然后对这些位点进行定点（NNK）饱和定点突变，从中筛选出活性有显著提高的突变体。

本发明通过三维结构模拟技术预测出的对酶活可能有影响的位点为L195、L235、H294。分别对这三个位点进行NNK饱和突变，利用高压液相色谱法（HPLC）来进行突变体的筛选。

随后以LrSP-pET29a（+）重组质粒为模板，对这三个位点分别进行了NNK饱和突变（具体突变操作参照stratagene公司的QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit操作说明）。其中第L195位突变正向引物：CATGGCGCGGATATGATTCGCNNKGATGCGTTTGCGTATGCGATT，反向引物：AATCGCATACGCAAACGCATCMNNGCGAATCATATCCGCGCCATG；第L235位点突变正向引物：GCGCCGTATAAAGCGATTATTNNKCCGGAAATTCATGAACATTAT，反向引物：ATAATGTTCATGAATTTCCGGMNNAATAATCGCTTTATACGGCGC；第H294位点突变正向引物：CAGTTTACCACCCTGGATACCNNKGATGGCATTGGCGTGGTGGAT，反向引物：ATCCACCACGCCAATGCCATCMNNGGTATCCAGGGTGGTAAACTG。

突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21（DE3）宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，30℃培养过夜。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。

突变体的筛选：蔗糖浓度200g/l, 甘油 200g/l, 50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液，按10%比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应。分别于2h和24h取样进行HPLC检测。

将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，蔗糖磷酸化酶突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：位点195的亮氨酸（L）突变为精氨酸（R），位点235的亮氨酸（L）突变为天冬氨酸（D），位点294的组氨酸（H）突变为精氨酸（R）。

更为具体的为，当位点195的亮氨酸（L）突变为精氨酸（R）时，突变体的催化活性相对于野生型酶来说得到了提高。当位点235的亮氨酸（L）突变为天冬氨酸（D）时，突变体酶活得到了提高。当位点294的组氨酸（H）突变为精氨酸（R）时，突变体酶活相对野生型酶来说得到了提高。当将上述3个位点的突变、两两联合突变或三个联合突变时，突变体的催化活性相对于单个突变体来说得到了更大的提高。

根据现有公共知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，蔗糖磷酸化酶及其突变体表达的载体可以为pET 或者pCW 或者pUC 或者pPIC9k 等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌，枯草芽孢杆菌等。

本发明还提供了蔗糖磷酸化酶及其突变体作为生物催化剂在转化底物甘油和蔗糖生成甘油葡萄糖苷中的应用。反应式为：

反应体系为：蔗糖磷酸化酶突变体酶，三乙醇胺-盐酸缓冲液，底物为甘油和蔗糖。具体的为酶的用量在1-10g/l，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，底物浓度在40-200g/l；反应后产物经HPLC验证，产物含量>100g/l。

可进行上述生物催化反应的酶包括纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。

有益的效果：本发明所涉及的酶突变体，可在室温、24h之内将40-200g/l的底物完全转化为不低于100g/l的产物。反应条件温和，几乎无副产物，具有广阔的工业化应用前景。

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础等译，第三版，北京：科学出版社，2002）中所述的方法进行。

实施例1 原核表达体系的构建

蔗糖磷酸化酶基因片段（LrSP）由常州基宇生物技术有限公司合成，并重组到PUC57载体上。经限制性内切酶NdeI和HindIII（购自New England Biolabs公司，NEB）在37℃双酶切4h后，1%琼脂糖凝胶电泳分离并进行切胶回收（胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司）。随后与经过同样双酶切的表达载体pET29a（+）（Novagen公司），在T4 DNA连接酶（购自Takara公司）作用下于16℃连接过夜。连接液转化Top10感受态细胞（购自天根生化科技(北京)有限公司），并进行菌落PCR筛选和测序验证，从而得到阳性重组质粒LrSP-pET29a（+）。

将阳性重组质粒LrSP-pET29a（+）转化表达宿主菌BL21（DE3）（购自天根生化科技(北京)有限公司），得到原核表达菌株LrSP-pET29a（+）/ BL21（DE3），作为后续定向进化和发酵的原代菌株。

实施例2 酶的摇瓶发酵制备

上述构建的表达菌株LrSP-pET29a（+）/ BL21（DE3）在加有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的5ml LB液体培养基【10g/l 胰蛋白胨（OXIOD），5g/l 酵母粉（OXIOD），10g/l 氯化钠（国药试剂）】中于37℃、200rpm振荡培养过夜后，按1%（V/V）比例接种于含有终浓度为30μg/ml硫酸卡那霉素的500ml LB液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.8-1.0之间时，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG），并在30℃诱导过夜。菌体在4℃、8000rpm条件下离心收集，然后悬浮于50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液中，超声破碎（200W，3s/5s，20min），4℃、12000rpm离心20min，取上清进行冷冻干燥，即得粗酶粉。

实施例3 突变体的构建和筛选

突变体的构建：采用同源建模的方法来进行蔗糖磷酸化酶LrSP的三维结构模拟，并利用分子对接和能量最低原理预测出可能的与催化反应相关的位点，初步确定为L195、L235、H294三个位点。随后以LrSP-pET29a（+）重组质粒为模板，对这三个位点分别进行了NNK饱和突变（具体突变操作参照stratagene公司的QuikChange® Site-Directed MutagenesisKit操作说明）。其中195位突变正向引物：CATGGCGCGGATATGATTCGCNNKGATGCGTTTGCGTATGCGATT，反向引物：AATCGCATACGCAAACGCATCMNNGCGAATCATATCCGCGCCATG；235位点突变正向引物：GCGCCGTATAAAGCGATTATTNNKCCGGAAATTCATGAACATTAT，反向引物：ATAATGTTCATGAATTTCCGGMNNAATAATCGCTTTATACGGCGC；294位点突变正向引物：CAGTTTACCACCCTGGATACCNNKGATGGCATTGGCGTGGTGGAT，反向引物：ATCCACCACGCCAATGCCATCMNNGGTATCCAGGGTGGTAAACTG。

突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21（DE3）宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养。过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜。4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应。

突变体的筛选：蔗糖浓度200g/l, 甘油 200g/l, 50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液，按10%比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应。分别于2h和24h取样进行HPLC检测。

将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况。测序结果显示，突变体酶活得到显著提高的克隆中含有的突变位点如下：位点195的亮氨酸（L）突变为精氨酸（R），位点235的亮氨酸（L）突变为天冬氨酸（D），位点294的组氨酸（H）突变为精氨酸（R）。

随后对这几个位点进行单点突变、两两联合突变和三个联合突变，活性检测发现某些位点的联合突变后催化活性相较于单点突变来说又得到了显著提高，具体酶活数值见下表：

1U 定义为 单位时间内（1min）生产1μmol 产物所需的酶量。

实施例4 突变体的生物催化

将200g蔗糖和200g甘油溶解于1L 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入2g蔗糖磷酸化酶突变体酶L195R / H294R冻干粉。反应液置于30℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC检测，2-甘油葡萄糖的生产量为100g/l，未检测到1-甘油葡萄糖苷。

实施例5 突变体的生物催化

将200g蔗糖和200g甘油溶解于1L 50mM pH6.0磷酸钠缓冲液中，待底物完全溶解后加入2g 酶突变体L195R / L235D/ H294R冻干粉。反应液置于30℃恒温水浴锅中，机械搅拌反应。反应24h后进行HPLC检测，2-甘油葡萄糖的生产量为140g/l，未检测到1-甘油葡萄糖苷。

实施例6 HPLC分析方法

HPLC系统：Agilent 1260；

色谱柱：Waters Amide柱(34 .6×150mm ,3 .5μm)；

流动相:乙腈:1‰氨水=4:1(V/V)；

进样量10μL；

柱温30℃；

流速1mL/min；

RID检测器检测。

在上述色谱条件下，2-甘油葡萄糖苷标准品的出峰位置为8.141min，1-甘油葡萄

糖苷标准品的出峰位置为9.108min。

序列

SEQ ID No.1 核苷酸序列

ATGCCGATTAAAAACGAAGCGATGCTGATTACCTATAGCGATAGCATGGGCAAAAACATTAAAGAAACCCATGAAGTGCTGAAAAACTATATTGGCGATGCGATTGGCGGCGTGCATCTGCTGCCGTTTTTTCCGAGCACCGGCGATCGCGGCTTTGCGCCGTATCGCTATGATGTGGTGGATAGCGCGTTTGGCAACTGGGATGATGTGGAAGCGCTGGGCGAAGATTATTATCTGATGTTTGATTTTATGATTAACCATATTAGCAAAAAAAGCGAAATGTATCAGGATTTTAAAAAAAAACATGATGATAGCAAATATAACGATTTTTTTATTCGCTGGGAAAAATTTTGGGAAAAAGCGGGCAAAAACCGCCCGACCCAGGAAGATGTGGATCTGATTTATAAACGCAAAGATAAAGCGCCGAAACAGGAAATTACCTTTGATGATGGCACCACCGAAAACCTGTGGAACACCTTTGGCGAAGAACAGATTGATATTAACGTGAAAAGCAAAGTGGCGAACGAATTTTTTAAAGAAACCCTGATTGATATGGTGAAACATGGCGCGGATATGATTCGCCTGGATGCGTTTGCGTATGCGATTAAAAAAGTGGGCACCAACGATTTTTTTGTGGAACCGGAAATTTGGGATCTGCTGAACGAAGTGCAGGATATTCTGGCGCCGTATAAAGCGATTATTCTGCCGGAAATTCATGAACATTATACCATTCCGCAGAAAATTAGCCAGCATGATTTTTTTATTTATGATTTTACCCTGCCGATGACCACCCTGTATACCCTGTATAGCGGCAAAACCAACCGCCTGGCGAAATGGCTGAAAATGAGCCCGATGAAACAGTTTACCACCCTGGATACCCATGATGGCATTGGCGTGGTGGATGCGAAAGATATTCTGACCGATGATGAAATTGAATATGCGAGCAACGAACTGTATAAAGTGGGCGCGAACGTGAAACGCAAATATAGCAGCGCGGAATATAACAACCTGGATATTTATCAGATTAACAGCACCTATTATAGCGCGCTGGGCGATGATGATAAAGCGTATCTGCTGAGCCGCGTGTTTCAGGTGTTTGCGCCGGGCATTCCGATGGTGTATTATGTGGGCCTGCTGGCGGGCAGCAACGATCTGGAACTGCTGGAAAAAACCAAAGAAGGCCGCAACATTAACCGCCATTATTATACCAAAGAAGAAGTGGCGCAGGAAGTGCAGCGCCCGGTGGTGAAAAACCTGCTGGATCTGCTGGCGTGGCGCAACAAATTTGCGGCGTTTGATCTGGATGGCAGCATTGAAGTGGAAACCCCGACCGAAACCACCATTAAAGTGACCCGCAAAGATAAAGATGGCAAAAACGTGGCGGTGCTGGATGCGGATGCGGCGAACAAAACCTTTACCATTACCGCGAACGGCGAAAAAGTGATGGAACAGAAATAA

SEQ ID No.2 氨基酸序列

MPIKNEAMLITYSDSMGKNIKETHEVLKNYIGDAIGGVHLLPFFPSTGDRGFAPYRYDVVDSAFGNWDDVEALGEDYYLMFDFMINHISKKSEMYQDFKKKHDDSKYNDFFIRWEKFWEKAGKNRPTQEDVDLIYKRKDKAPKQEITFDDGTTENLWNTFGEEQIDINVKSKVANEFFKETLIDMVKHGADMIRLDAFAYAIKKVGTNDFFVEPEIWDLLNEVQDILAPYKAIILPEIHEHYTIPQKISQHDFFIYDFTLPMTTLYTLYSGKTNRLAKWLKMSPMKQFTTLDTHDGIGVVDAKDILTDDEIEYASNELYKVGANVKRKYSSAEYNNLDIYQINSTYYSALGDDDKAYLLSRVFQVFAPGIPMVYYVGLLAGSNDLELLEKTKEGRNINRHYYTKEEVAQEVQRPVVKNLLDLLAWRNKFAAFDLDGSIEVETPTETTIKVTRKDKDGKNVAVLDADAANKTFTITANGEKVMEQK

序列表

<120> 新型蔗糖磷酸化酶突变体及其在合成甘油葡糖苷中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 蔗糖磷酸化酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgccgatta aaaacgaagc gatgctgatt acctatagcg atagcatggg caaaaacatt 60

aaagaaaccc atgaagtgct gaaaaactat attggcgatg cgattggcgg cgtgcatctg 120

ctgccgtttt ttccgagcac cggcgatcgc ggctttgcgc cgtatcgcta tgatgtggtg 180

gatagcgcgt ttggcaactg ggatgatgtg gaagcgctgg gcgaagatta ttatctgatg 240

tttgatttta tgattaacca tattagcaaa aaaagcgaaa tgtatcagga ttttaaaaaa 300

aaacatgatg atagcaaata taacgatttt tttattcgct gggaaaaatt ttgggaaaaa 360

gcgggcaaaa accgcccgac ccaggaagat gtggatctga tttataaacg caaagataaa 420

gcgccgaaac aggaaattac ctttgatgat ggcaccaccg aaaacctgtg gaacaccttt 480

ggcgaagaac agattgatat taacgtgaaa agcaaagtgg cgaacgaatt ttttaaagaa 540

accctgattg atatggtgaa acatggcgcg gatatgattc gcctggatgc gtttgcgtat 600

gcgattaaaa aagtgggcac caacgatttt tttgtggaac cggaaatttg ggatctgctg 660

aacgaagtgc aggatattct ggcgccgtat aaagcgatta ttctgccgga aattcatgaa 720

cattatacca ttccgcagaa aattagccag catgattttt ttatttatga ttttaccctg 780

ccgatgacca ccctgtatac cctgtatagc ggcaaaacca accgcctggc gaaatggctg 840

aaaatgagcc cgatgaaaca gtttaccacc ctggataccc atgatggcat tggcgtggtg 900

gatgcgaaag atattctgac cgatgatgaa attgaatatg cgagcaacga actgtataaa 960

gtgggcgcga acgtgaaacg caaatatagc agcgcggaat ataacaacct ggatatttat 1020

cagattaaca gcacctatta tagcgcgctg ggcgatgatg ataaagcgta tctgctgagc 1080

cgcgtgtttc aggtgtttgc gccgggcatt ccgatggtgt attatgtggg cctgctggcg 1140

ggcagcaacg atctggaact gctggaaaaa accaaagaag gccgcaacat taaccgccat 1200

tattatacca aagaagaagt ggcgcaggaa gtgcagcgcc cggtggtgaa aaacctgctg 1260

gatctgctgg cgtggcgcaa caaatttgcg gcgtttgatc tggatggcag cattgaagtg 1320

gaaaccccga ccgaaaccac cattaaagtg acccgcaaag ataaagatgg caaaaacgtg 1380

gcggtgctgg atgcggatgc ggcgaacaaa acctttacca ttaccgcgaa cggcgaaaaa 1440

gtgatggaac agaaataa 1458

<210> 2

<211> 294

<212> RNA

<213> 蔗糖磷酸化酶(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

mknamysdsm gknkhvknyg daggvhsgdr gayrydvvds agnwddvagd yymdmnhskk 60

smydkkkhdd skyndrwkwk agknrdvdyk rkdkakddgn wngdnvkskv ankdmvkhga 120

dmrdaayakk vgndvwdnvd aykahhyksh dydmyysgkn rakwkmsmkd hdggvvdakd 180

ddyasnykvg anvkrkyssa ynndynsyys agdddkaysr vvagmvyyvg agsndkkgrn 240

nrhyykvavr vvkndawrnk aaddgsvkvr kdkdgknvav dadaankang kvmk 294

Claims (8)

1.一种新型蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：该突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID NO.2相比，在该氨基酸序列SEQ ID NO：2中第L195位、第L235位、第H294位进行单点突变、两两联合突变、三个联合突变中的一种突变。

2.根据权利要求1所述的新型蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：将氨基酸序列SEQ IDNO：2中第L195位的亮氨酸（L）突变为精氨酸（R）。

3.根据权利要求1所述的新型蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：将氨基酸序列SEQ IDNO：2中第L235位的亮氨酸（L）突变为天冬氨酸（D）。

4.根据权利要求1所述的新型蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：将氨基酸序列SEQ IDNO：2中第H294位的组氨酸（H）突变为精氨酸（R）。

5.根据权利要求1所述的新型蔗糖磷酸化酶突变体，其特征在于：所述新型蔗糖磷酸化酶突变体表达宿主为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌，枯草芽孢杆菌中的一种。

6.一种制备如权利要求1所述新型蔗糖磷酸化酶突变体酶的方法，包括如下步骤：1）以LrSP-pET29a（+）重组质粒为模板，对第L195位、第L235位、第H294位三个位点进行定点饱和突变，其中第L195位突变正向引物：CATGGCGCGGATATGATTCGCNNKGATGCGTTTGCGTATGCGATT，第L195位突变反向引物：AATCGCATACGCAAACGCATCMNNGCGAATCATATCCGCGCCATG；第L235位点突变正向引物：GCGCCGTATAAAGCGATTATTNNKCCGGAAATTCATGAACATTAT，第L235位点突变反向引物：ATAATGTTCATGAATTTCCGGMNNAATAATCGCTTTATACGGCGC；第H294位点突变正向引物：CAGTTTACCACCCTGGATACCNNKGATGGCATTGGCGTGGTGGAT；H294位点突变反向引物：ATCCACCACGCCAATGCCATCMNNGGTATCCAGGGTGGTAAACTG；2）突变体培养：将上述突变得到的质粒转化BL21（DE3）宿主菌后，涂布于含30μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜，随后从平板上挑取单克隆置于96孔板中进行培养；过夜培养的菌液再转接于含有新鲜LB培养基的96孔板中，37℃、220rpm振荡培养4h后加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，30℃培养过夜；4℃、4000rpm离心10min收集菌体，用50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液悬浮，作为全细胞进行筛选反应；3）突变体的筛选：蔗糖浓度200g/l, 甘油 200g/l, 50mM pH7.0 磷酸钠缓冲液，按10%比例加入上述制备的全细胞悬浮液，放于30℃、220rpm振荡反应；分别于2h和24h取样进行HPLC检测；将底物转化率在2h和24h均有显著提高的克隆进行扩大培养后测序验证突变情况；测序结果显示，突变位点如下：位点195的亮氨酸（L）突变为精氨酸（R），位点235的亮氨酸（L）突变为天冬氨酸（D），位点294的组氨酸（H）突变为精氨酸（R）。

7.一种如权利要求1所述的新型蔗糖磷酸化酶突变体酶的应用，用于催化合成甘油葡萄糖苷。

8.一种如权利要求7所述的新型蔗糖磷酸化酶突变体酶催化合成甘油葡萄糖苷的方法，包括如下步骤：1）反应体系为：蔗糖磷酸化酶突变体酶，三乙醇胺-盐酸缓冲液，底物为甘油和蔗糖；2）新型蔗糖磷酸化酶突变体酶的用量在1-10g/l，缓冲液浓度在50-200mM，缓冲液pH值在6.0-8.0之间，底物浓度在40-200g/l；反应后产物经HPLC验证，产物含量>100g/l。