CN114317478A

CN114317478A - 一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法

Info

Publication number: CN114317478A
Application number: CN202210010284.7A
Authority: CN
Inventors: 梁浩; 徐海畅; 齐昊乐; 伍凌奇
Original assignee: Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-05
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-01-05
Also published as: CN114317478B

Abstract

本发明提供了一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2‑α‑甘油葡萄糖苷的方法。所述蔗糖磷酸化酶为游离酶或固定化酶；固定化酶的制备方法为：通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS‑TPP@NF载体固定游离酶，得到固定化酶。以蔗糖、甘油为底物，在水或水溶液中进行催化反应，得到2‑α‑甘油葡萄糖苷。本发明中筛选出的蔗糖磷酸化酶催化活性高，在24 h内能够将蔗糖快速转化，转化率达到95%，2‑α‑甘油葡萄糖苷产量可达288.28 g/L。同时本发明的固定化酶副产物耐受性比游离酶高30%、可回收再利用，在水溶液中反应，降低生产成本，工艺简单，适合大规模工业化生产。

Description

一种蔗糖磷酸化酶的应用及利用其制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法

技术领域

本发明属于生物催化剂技术领域，特别涉及一种新型蔗糖磷酸化酶生物的应用及利用其催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法。

背景技术

蔗糖磷酸化酶转化法是将蔗糖磷酸化酶基因在大肠杆菌中克隆表达，以蔗糖和甘油为底物，建立的一种酶促合成2-α-甘油葡萄糖苷的方法。目前，利用这种方法生产2-α-甘油葡萄糖苷的最高产量仅为122 g/L，并且都存在转化时间长、酶活低、稳定性差、缓冲液成本高等问题。不仅如此，副产物的产生一直是制约酶催化效率提高的重要因素。在利用蔗糖磷酸化酶催化合成2-α-甘油葡萄糖苷的过程中会产生果糖副产物。果糖的不断积累会严重影响蔗糖磷酸化酶的催化效率以及2-α-甘油葡萄糖苷的产量。因此蔗糖磷酸化酶的果糖耐受性问题也是制约其应用的一个因素。

针对现有技术中的蔗糖磷酸化酶稳定性差、不能重复利用的缺陷，已有公开的技术方案采用固定化手段来改善。目前，现有的蔗糖磷酸化酶大都通过交联酶聚集体进行固定化，此固定化方法侧重于蔗糖磷酸化酶热稳定性和重复使用次数的提高，其他方面的改善并不明显。

因此，寻找一种酶活高的新型蔗糖磷酸化酶，并提高其稳定性、重复使用次数、果糖耐受性，在水溶液中催化合成2-α-甘油葡萄糖苷，具有极高的工业利用价值。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种在水溶液中催化合成2-α-甘油葡萄糖苷的新型蔗糖磷酸化酶及其催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的具体方法，该酶酶活高、催化效率快，同时果糖耐受性强、稳定性好、可多次回收再利用，提高产量、降低生产成本。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种蔗糖磷酸化酶的应用，基因编码如序列1所述的蔗糖磷酸化酶在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2-α-甘油葡萄糖苷。本发明通过与现存蔗糖磷酸化酶进行同源度比对，筛选出一种来自于长双歧杆菌的蔗糖磷酸化酶（SPase），通过基因工程手段将所述基因导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶。

所述基因工程手段为：首先利用PCR对基因进行扩增，而后采用酶切连接手段将其导入表达载体质粒PET28a，通过大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达。

本发明用于在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2-α-甘油葡萄糖苷的酶可以是游离酶也可以是固定化酶，具体制备方法如下。

一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：1）通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶，将表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌细胞用高压匀浆法破碎，得到含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液；2）利用步骤1）得到的粗酶液在水中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。

进一步的，步骤1）中所述粗酶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为1mg/mL~6 mg/mL。

进一步的，步骤2）的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，形成混合溶液，加入粗酶液，使去离子水中蔗糖磷酸化酶的浓度为0.5~1.5mg/mL；摇床催化反应后，加热灭活酶；催化反应的温度为30℃~ 50℃，时间为24h~ 48h，pH值为6~8；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、甘油在去离子水中的浓度1.8~2.4M。

另一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：Ⅰ、通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS-TPP@NF载体固定所述游离酶，得到固定化酶，记作CS-TPP@NF@SPase； Ⅱ、利用步骤Ⅰ得到的固定化酶在水溶液中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。CS为壳聚糖，TPP为三聚磷酸钠, NF为TPP和氯化钙的络合物。

进一步的，步骤Ⅰ中，将壳聚糖和三聚磷酸钠在水溶液中常温下反应5~20min后，加入游离酶和氯化钙反应5~20min，离心收集沉淀即为固定化酶CS-TPP@NF@SPase；反应液中壳聚糖的浓度为 1mg/mL-5mg/mL，三聚磷酸钠的浓度为100mg/mL-150mg/mL，氯化钙的浓度为10mg/mL-50mg/mL；固定化温度为20℃~30℃，固定时间10min~30min，固定环境为金属浴振荡800rpm~1000rpm；所述常温为20℃~30℃。

进一步的，步骤Ⅱ的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，固定化酶CS-TPP@NF@SPase，摇床催化反应后，加热灭活酶结束反应；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、甘油在去离子水中的浓度1.8~2.4M；步骤Ⅱ催化反应的温度为30℃~40℃，时间为24h~48h，pH值为6~9；反应液中固定化酶CS-TPP@NF@SPase的浓度为0.5~1.5mg/mL。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1.本发明中所应用的蔗糖磷酸化酶，克服了现有技术生产2-α-甘油葡萄糖苷时，存在的酶活低、反应时间长、缓冲液成本高的问题。本发明中所应用的蔗糖磷酸化酶催化效率高，能在水溶液中24 h内将底物蔗糖近乎完全转化，产量可达288.28 g/L。是迄今为止体外单酶生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的最高产量。

2.现有多数固定化酶的制备耗时较长，实用性差，本发明采用CS-TPP@NF，可以在20min内迅速固定游离蔗糖磷酸化酶，可以通过离心回收再利用，降低了生产成本，工艺简单，经济节约，非常适合于大规模工业化生产。

3.本发明的所采用的蔗糖磷酸化酶固定化酶CS-TPP@NF@SPase，不仅稳定性好、催化效率高，并且固定化酶的果糖耐受性比游离酶高30%，有利于解决2-α-甘油葡萄糖苷生产中存在的副产物抑制问题。反应条件温和、高效、绿色、安全，具有光明的工业化前景。

附图说明

图1为不同蔗糖浓度下2-α-甘油葡萄糖苷的产量图；

图2为游离酶SPase、固定化酶CS-TPP@NF@SPase果糖耐受性图；

图3为HPLC测定的蔗糖、甘油、果糖、2-α-甘油葡萄糖苷产品图。

具体实施方式

一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：1）通过基因工程手段（所述基因工程手段为：首先利用PCR对基因进行扩增，而后采用酶切连接手段将其导入表达载体质粒PET28a，通过大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达）将序列1导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶，将表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌细胞用高压匀浆法破碎，得到含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液（游离酶）；2）利用步骤1）得到的粗酶液在水中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。以下实施例1~3为采用此种方法的具体的实施例。

实施例1

本实施例利用游离酶SPase催化蔗糖、甘油制备2-α-甘油葡萄糖苷，具体方法为：称量蔗糖0.855 g（0.5M），甘油 0.92 g溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入粗酶液，其中含有0.5 mg 的游离酶SPase，在30 ℃ 摇床反应24 h，100 ℃ 下10 min终止反应。如图1所示，通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，氨基柱，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，并计算得最终转化率为95%，产量为144.78 g/L。

实施例2

本实施例利用游离酶SPase催化蔗糖、甘油制备2-α-甘油葡萄糖苷，具体方法为：称量蔗糖1.71 g（1M），甘油 0.92 g溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入粗酶液，其中含有1 mg 的游离酶SPase，在35 ℃ 摇床反应24 h，100 ℃ 下10 min终止反应。如图1所示，通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，并计算得最终转化率为96%，产量为217.17 g/L。

实施例 3

本实施例利用游离酶SPase催化蔗糖、甘油制备2-α-甘油葡萄糖苷，具体方法为：称量蔗糖2.565 g（1.5M），甘油 0.92 g溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入粗酶液，其中含有1.5 mg 的游离酶SPase，在40 ℃ 摇床反应24 h，100 ℃ 下10 min终止反应。如图1所示，通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，并计算得最终转化率为95%，产量为288.16 g/L。

另一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，所述方法包含以下步骤：Ⅰ、通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，在磷酸盐缓冲液中，用CS-TPP@NF载体固定所述游离酶，得到固定化酶，记作CS-TPP@NF@SPase； Ⅱ、利用步骤Ⅰ得到的固定化酶在水溶液中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。以下实施例4~6为采用此种方法的具体的实施例。

实施例4~6中制备固定化酶CS为壳聚糖，其在水溶液中的浓度为2mg/mL, TPP为三聚磷酸钠, 其在水溶液中的浓度为125mg/mL, NF为TPP和氯化钙的络合物，氯化钙在水溶液中的浓度为20mg/mL。固定化过程：在2 mL离心管中，加入500uL CS和200uL TPP, 25℃下反应10min后，加入200uL游离酶和500uL 氯化钙，在反应10min, 1200rpm下离心5min，收集沉淀物即为固定化酶。固定化温度为25℃，固定时间20min，固定环境为金属浴振荡900rpm。。

实施例4

本实施例利用固定化酶CS-TPP@NF@SPase催化蔗糖、甘油制备2-α-甘油葡萄糖苷，具体方法为：称量蔗糖0.855g（0.5M），甘油 0.92 g溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入0.5 mg 的固定化酶CS-TPP@NF@SPase，在30 ℃ 摇床反应24 h，离心，取上清终止反应。如图1所示，通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，氨基柱，流速1 mL/min，柱温40℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，并计算得最终转化率为94%，产量为142.58 g/L。

实施例5

本实施例利用固定化酶CS-TPP@NF@SPase催化蔗糖、甘油制备2-α-甘油葡萄糖苷，具体方法为：称量蔗糖1.71 g（1M），甘油 0.92 g溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入1 mg 的固定化酶CS-TPP@NF@SPase，在35 ℃ 摇床反应24 h，离心，取上清终止反应。如图1所示，通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，并计算得最终转化率为97%，产量为218.2 g/L。

实施例 6

本实施例利用固定化酶CS-TPP@NF@SPase催化蔗糖、甘油制备2-α-甘油葡萄糖苷，具体方法为：称量蔗糖2.565 g（1.5M），甘油 0.92 g溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入1.5 mg 的固定化酶CS-TPP@NF@SPase，在40 ℃ 摇床反应24 h，离心，取上清终止反应。如图1所示，通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，并计算得最终转化率为96%，产量为288.86 g/L。

果糖耐受性检测：

利用纯化的游离酶SPase测定其果糖耐受性，具体方法为：称量蔗糖1.03 g，甘油0.92 g，取果糖分别为 0.54 g（0.6M）、1.08g（1.2M）、1.62g（1.8M）溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入0.1 mg游离酶SPase，在30 ℃ 摇床反应2 h，100 ℃下10 min终止反应。通过HPLC（乙腈：水 85:15，视差检测器，氨基柱，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，计算游离酶的相对活性（图2）。

利用固定化酶CS-TPP@NF@SPase测定其果糖耐受性，具体方法为：称量蔗糖1.03g，甘油 0.92 g，取果糖分别为0.54 g（0.6M）、1.08g（1.2M）、1.62g（1.8M）溶解于5 mL去离子水中，取1 mL混合溶液，加入0.1 mg固定化酶CS-TPP@NF@SPase，在30 ℃ 摇床反应2 h，离心，取上清终止反应。通过HPLC （乙腈：水 85:15，视差检测器，氨基柱，流速1 mL/min，柱温40 ℃）检测上清中甘油、果糖、蔗糖、2-α-甘油葡萄糖苷的含量，计算固定化酶的相对活性（图2）。

最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种蔗糖磷酸化酶的应用，其特征在于：基因编码如序列1所述的蔗糖磷酸化酶在水或水溶液中催化蔗糖、甘油制备生成2-α-甘油葡萄糖苷。

2.根据权利要求1所述的蔗糖磷酸化酶的应用，其特征在于：所述蔗糖磷酸化酶为游离酶或固定化酶；所述固定化酶的制备方法为：通过基因工程手段将所述序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS-TPP@NF载体固定所述游离酶，得到固定化酶，记作CS-TPP@NF@SPase。

3.一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：1）通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到蔗糖磷酸化酶，将表达蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌细胞用高压匀浆法破碎，得到含有蔗糖磷酸化酶的粗酶液；2）利用步骤1）得到的粗酶液在水中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。

4.根据权利要求3所述的生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤1）中所述粗酶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为1mg/mL~6mg/mL。

5.根据权利要求3所述的生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤2）的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，形成混合溶液，加入粗酶液，使混合溶液中蔗糖磷酸化酶的浓度为0.5~1.5mg/mL；摇床催化反应后，加热灭活酶；催化反应的温度为30℃~ 50℃，时间为24h~ 48h，pH值为6~8；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、甘油在去离子水中的浓1.8~2.4M。

6.一种生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：Ⅰ、通过基因工程手段将序列1导入大肠杆菌表达得到游离酶，用CS-TPP@NF载体固定所述游离酶，得到固定化酶，记作CS-TPP@NF@SPase； Ⅱ、利用步骤Ⅰ得到的固定化酶在水中催化蔗糖、甘油生成2-α-甘油葡萄糖苷。

7.根据权利要求6所述的生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤Ⅰ中，固定化过程：将壳聚糖和三聚磷酸钠在水溶液中常温下反应5~20min后，加入游离酶和氯化钙反应5~20min，离心收集沉淀即为固定化酶CS-TPP@NF@SPase；反应液中壳聚糖的浓度为 1mg/mL-5mg/mL, 三聚磷酸钠的浓度为100mg/mL-150mg/mL, 氯化钙的浓度为10mg/mL-50mg/mL；固定化温度为20℃~30℃，固定时间10min~30min，固定环境为金属浴振荡800rpm~1000rpm；所述常温为20℃~30℃。

8.根据权利要求6所述的生物催化制备2-α-甘油葡萄糖苷的方法，其特征在于，步骤Ⅱ的具体操作为：称量蔗糖、甘油溶解于去离子水中，加入吸去上清磷酸盐缓冲液的固定化酶CS-TPP@NF@SPase，摇床催化反应后，加热灭活酶结束反应；蔗糖在去离子水中的浓度为0.3~1.5M、甘油在去离子水中的浓度1.8~2.4M；步骤Ⅱ催化反应的温度为30℃~40℃，时间为24h~48h，pH值为6~9；反应液中固定化酶CS-TPP@NF@SPase的浓度为0.5~1.5mg/mL。