CN118126975A - 一种亚胺还原酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种亚胺还原酶突变体及其制备方法与应用，该亚胺还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，其中发生突变的氨基酸序列具有以下至少1个突变位点：第16、19、25、29、39、48、54、55、61、66、67、78、79、83、89、101、105、107、108、118、123、163、164、172、176、177、179、180、183、184、197、202、229、230、231位。该亚胺还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2～45所示，酶突变体的稳定性有不同程度的提高，其中，SEQ ID NO：43和45所示突变体在60℃的半衰期可达20h以上。

Description

一种亚胺还原酶突变体及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物转化技术领域，具体涉及一种亚胺还原酶突变体及其制备方法与应用。

背景技术

酶是具有复杂三维结构的生物大分子，绝大多数是天然蛋白质。如今，酶已经作为一种绿色、高效、专一性强的生物催化剂广泛应用在食品、生物化工、生物制药等相关领域。在酶促反应过程中，高温可以加速酶的催化反应、降低反应液粘稠度、减少微生物污染等。因此，一般情况下工业酶的应前提就是具有较高的热稳定性，即能在高温下保持较高的催化活性，热稳定性也成为是评判酶能否应用在工业上的一个关键因素。

热稳定性是指在高温条件下，酶分子保持结构与功能完整性的能力，主要涉及到热力学稳定性和动力学稳定性，热力学稳定性是酶的天然折叠状态在能量上处于某种平衡，该平衡是由该状态下熵焓值决定。动力学热稳定性是基于酶分子内部相互作用力的一种表观稳定性。除了极少部分嗜热酶外，大部分的天然酶是在温和的条件下发挥催化作用。高温容易破坏其三维结构和空间构象，进而影响其催化活性。

手性胺是生物制药和化学中重要的结构单元，40％-45％的小分子药物和工业/农业化学品中含有手性胺结构。亚胺还原酶是一种NADPH/NADH依赖性酶，它广泛存在于自然界中，并在细胞的氮代谢过程中发挥着重要的作用。其能够催化C＝N的还原得到手性胺。然而，现有亚胺还原酶来源有限，且存在酶活低、底物或产物抑制作用、热稳定性差、底物适用范围较窄、产品手性纯度低、催化效率低等问题，限制了其在小分子药物、工业/农业化学品、食品加工中的应用。因此，许多研究人员将提高亚胺还原酶对于某些底物的催化活力作为开发方向。例如，CN116218803A、CN116083384A、CN115927230A、CN115704014A、CN114085802B、CN116200357A、CN116814574A、CN117230091B、CN116103256A、CN116287050A、CN116024284A、CN114317472B、CN116064443A、CN106232619B、CN117363667A、CN115948360A、CN115838697A、CN107904216B、CN116286700A、CN107384885B、CN107002050A、CN115873815A、CN110564788B、CN109355266B、CN114774383A、CN116218804A、CN114836490A、CN114717211B等专利中，均报道了各种亚胺还原酶突变体，这些突变体对于某些化合物的催化活力高、产品手性纯度也有所提高。但是，影响亚胺还原酶工业化的另一主要的问题是大多数亚胺还原酶的自身热稳定性较差(Chem.Sci.,2022,13,4697-4713)。因此，从工业酶的需求出发，通过蛋白质工程技术提高酶热稳定性，改善亚胺还原酶的催化特性，使其适应特定的催化条件和环境，对新型酶制剂的开发具有重要意义。

发明内容

基于目前现有野生型亚胺还原酶存在的热稳定差的问题，本发明针对野生型亚胺还原酶进行基因工程改造，并通过高通量酶活筛选，得到了一系列同时满足热稳定性好、催化效率高的亚胺还原酶突变体。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：亚胺还原酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO：2～45所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列；其中，所述发生突变的氨基酸序列具有以下至少1个突变位点：第16位、第19位、第25位、第29位、第39位、第48位、第54位、第55位、第61位、第66位、第67位、第78位、第79位、第83位、第89位、第101位、第105位、第107位、第108位、第118位、第123位、第163位、第164位、第172位、第176位、第177位、第179位、第180位、第183位、第184位、第197位、第202位、第229位、第230位、第231位。

其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列为野生型亚胺还原酶的氨基酸序列，来源于为Actinomadura rifamycini。具体地，“野生型”是指在自然界发现的形式。例如，天然存在的或野生型的多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，能够从自然界来源中分离并且没有被人为操作或有意修饰的。但是，这些基因表达后得到的酶普遍存在对于某些底物的催化活力低，热稳定性较差的缺陷。

本发明筛选得到的亚胺还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2～45所示。如表1所示，SEQ ID NO：2～45所示的酶突变体的稳定性有不同程度的提高。作为优选，SEQ IDNO：43、45所示突变体的在60℃的半衰期可达20h以上。表1中，“-”指按照实施例5检测酶活力，酶在反应体系中催化2h时，无式(b)所示产物生成；“+”指酶在反应体系中催化2h时，有0～20％的式(a)所示原料转化为式(b)所示产物；“++”指酶在反应体系中催化2h时，有20～40％的式(a)所示原料转化为式(b)所示产物；“+++”指酶在反应体系中催化2h时，有40～60％的式(a)所示原料转化为式(b)所示产物；“++++”指酶在反应体系中催化2h时，有60～80％的式(a)所示原料转化为式(b)所示产物；“+++++”指酶在反应体系中催化2h时，有80～100％的式(a)所示原料转化为式(b)所示产物。

表1本发明中性能较好的亚胺还原酶及其突变体的酶活力及热稳定性

本发明的另一方面，提供了一种重组表达载体，其可通过本领域常规方法将含有本发明所述亚胺还原酶突变体基因的核苷酸序列连接于各种原核表达载体或真核表达载体上构建而成。如pGEX，pMAL，pET系列等原核表达载体以及真核表达载体，更优选地选自pET系列，本发明所使用的载体质粒为pET-24a。

本发明还提供了一种用于生产所述亚胺还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的亚胺还原酶突变体基因或本发明所述的重组表达载体；上述基因工程菌的宿主细胞优选为大肠埃希氏菌，更优选地选自大肠埃希氏菌BL21(DE3)菌株。

再一方面，本发明提供了一种用于制备上述亚胺还原酶突变体的方法，包括发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备重组亚胺还原酶突变体。

上述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述亚胺还原酶突变体的步骤；所述生产罐发酵条件优选：培养温度为36-38℃，酶表达诱导后，培养温度降低为21-23℃，DO 20％以上，空气流量1:0.1～2vvm。

再一方面，将用SEQ ID NO：36～45所示的亚胺还原酶突变体催化式(a)所示化合物二氢罂粟碱或其盐酸盐生成成式(b)所示的手性胺类化合物R-四氢罂粟碱，催化效果如表2所示。

表2本发明中性能较好的亚胺还原酶及其突变体应用于转胺反应的催化效果

相对于野生亚胺还原酶，本发明中的亚胺还原酶突变体具有如下优势：

1、热稳定性好，亚胺还原酶突变体可以在更高的温度下催化产品合成，高温时，底物溶解度更高，反应速率更快，收率更高。

2、酶活力高。酶的三级结构由一级结构决定。大多数酶的氨基酸突变都会导致酶三级结构的变化，进而导致酶活力变差。如表1所示，本发明中所述亚胺还原酶突变体可有效提高酶热稳定性，但大多突变会导致酶活力降低。发明人通过多轮次理性设计及随机突变组合，获得的SEQ ID NO：36～45所示的酶突变体不仅在60℃的半衰期显著提高，对于式a所示底物的催化活力也提高了2倍以上。

3、将SEQ ID NO：36～45所示的酶突变体应用于二氢罂粟碱或其盐酸盐转化R-四氢罂粟碱的转胺反应中，如表2所示，在反应7h后，均可达到摩尔收率大于90％的效果，且R-构型产品的手性纯度大于99.0％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例8应用产物R-四氢罂粟碱盐酸盐的核磁图谱；

图2为本发明实施例8应用产物手性纯度HPLC检测结果。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

实施例1：野生型亚胺还原酶基因工程菌的建立

根据NCBI收录的Actinomadura rifamycini亚胺还原酶野生型基因序列(GenBank:WP_026403156.1)进行序列优化后，经基因合成公司人工合成全基因片段，并通过NdeI和BamHI内切酶将基因插入pET-24a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立亚胺还原酶基因工程菌。

实施例2：亚胺还原酶突变体基因的获得

由于亚胺还原酶野生型基因的三维结构，目前尚未被揭示；本申请通过对野生型基因序列进行Blast比对发现，其与结构为PDB:8JYT的蛋白序列一致性为60.64％。

本申请还利用易错PCR随机突变的方法，对亚胺还原酶进行了蛋白质工程改造。易错PCR通过DNA聚合酶进行目的基因扩增时，调整反应条件(包括提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTP浓度或运用低保真度DNA聚合酶等)来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

本实施例采用较低保真度的Taq聚合酶，同时利用Mn²⁺替代天然辅助因子Mg²⁺增加易错概率，设计体系如下：

50μL PCR体系如下:

其中：亚胺还原酶模板基因，为按照实施例1中的方法将亚胺还原酶基因插入至pET-24a质粒中所构建；引物设计，根据实施例1中构建重组质粒中目的基因上下游序列设计。

PCR反应条件为：95℃预变性2.5min；94℃变性15s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃继续延伸10min，冷却至4℃。

将所得PCR扩增产物，连接至pET-24a载体，并转入至大肠杆菌BL21(DE3)中建立亚胺还原酶基因突变文库。

利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET-24a质粒为载体，表达扩展亚胺还原酶突变体。其中，该亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列；其中，发生突变的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中的至少1个突变位点：第16位、第19位、第25位、第29位、第39位、第48位、第54位、第55位、第61位、第66位、第67位、第78位、第79位、第83位、第89位、第101位、第105位、第107位、第108位、第118位、第123位、第163位、第164位、第172位、第176位、第177位、第179位、第180位、第183位、第184位、第197位、第202位、第229位、第230位、第231位。

进一步地，以实施例5中反应方法筛选得到突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2～45所示。

实施例3：在摇瓶中小规模生产野生型亚胺还原酶以及亚胺还原酶突变体

将包含实施例1、2所构建的重组质粒的大肠杆菌(包含亚胺还原酶突变体基因)，接种到含卡那霉素(50μg/mL)的100mL LB培养基中(蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，pH7.2)。于摇床中培养，37℃、210rpm摇动，培养16小时。然后按1:100比例转接于100mL含卡那霉素的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值(OD600)，以监测菌体生长密度。当培养物的OD600＝0.4～0.6时，加入终浓度1mM的IPTG来诱导目的亚胺还原酶基因表达，诱导培养过夜(16～20小时)。10000rpm、4℃离心10min，弃上清，细胞沉淀以预冷的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)按200g/L重悬后，超声破碎，然后13000rpm、4℃离心30min，收集上清，即粗酶液，储存于-20℃。

实施例4：亚胺还原酶的发酵生产

发酵方案：将实施例1、2构建的大肠杆菌以及重组大肠杆菌(含突变的亚胺还原酶基因)保藏菌种接种于400mL LB培养基中(含卡那霉素50μg/mL)，37℃、210rpm震荡培养过夜(≥16小时)，然后在30L发酵罐中发酵：种子液按2％的接种量接入15L发酵培养基，发酵液通过加入氨水维持pH＝7.0～7.2，罐温37℃，搅拌转速300～900rpm，过程中控制溶氧30％左右，空气流量1:0.1～2vvm。培养8小时后加入IPTG(终浓度1mmol/L)诱导亚胺还原酶的表达，罐温调整至22℃，继续发酵12～16小时。发酵过程中需加入补料液(葡萄糖200g/L，酵母提取物100g/L，pH7.2)维持培养物的生长。发酵结束后将培养物直接用高压均质机匀浆破碎。破碎后的发酵液，加入终浓度为10g/L的氯化钙和80g/L的硅藻土，搅拌30分钟。絮凝沉降结束后，用铺有硅藻土的滤布过滤后，用30kDa聚醚砜超滤膜浓缩至原体积的1/10，制备得到亚胺还原酶粗酶液并于-20℃保存。

实施例5：亚胺还原酶及其突变体筛选方法

100mM Tris-HCl缓冲溶液，包含10g/L式(a)所示底物二氢罂粟碱的盐酸盐，1mMNADPH，1mM二硫苏糖醇、300mM葡萄糖、10％DMSO，调节pH 7.5，定容至5mL，混匀后加入20ml反应瓶。加入亚胺还原酶粗酶液(包括野生型亚胺还原酶以及亚胺还原酶突变体)或其稀释液1mL、葡萄糖脱氢酶粗酶液1mL并混匀，40℃反应2h。

实施例6：温度对亚胺还原酶稳定性的影响

分别取20mL野生和突变的亚胺还原酶粗酶液，于60℃孵育，每1h取样后冰浴冷却，按照实施例5中的方法测定残余酶活。残余酶活降至原始酶活50％左右的时间，为酶在该温度下的半衰期，以此确定亚胺还原酶的温度稳定性。

表1给出了野生亚胺还原酶和突变体在不同温度时的酶活半衰期：其中野生亚胺还原酶在60℃时，半衰期小于1h；而SEQ ID NO：2～45所示亚胺还原酶突变体在60℃半衰期显著提高。

实施例7：小规模反应验证亚胺还原酶及其突变体

反应在氮气保护下进行，反应在250ml圆底烧瓶中进行，反应体系体积为100ml。在50mL 100mM磷酸缓冲溶液中依次加入0.05g NADP⁺，0.02g巯基乙酸、7g式(a)所示底物二氢罂粟碱的盐酸盐、15g葡萄糖，20mL DMSO，调节pH 7.5，定容至50mL，混匀后加入烧瓶中。加入SEQ ID NO 43所示亚胺还原酶粗酶液30mL、葡萄糖脱氢酶粗酶液3.5mL并混匀。用100mM磷酸缓冲溶液定容到100mL。在45℃反应7h，期间通过水浴锅控制反应体系温度为45℃，每30min用5M氢氧化钠溶液调节反应体系pH为7.5±0.2。SEQ ID NO：36～45所示的亚胺还原酶突变体催化效果如表2所示。

实施例8：R-四氢罂粟碱的生产

反应在氮气保护下进行。在1500mL 100mM磷酸缓冲溶液中依次加入1.48g NADP+，0.62g巯基乙酸、210g式(a)所示底物二氢罂粟碱的盐酸盐、450g葡萄糖，600mL DMSO，调节pH 7.5，定容至2500mL，混匀后加入5L反应器中。加入SEQ ID NO 43所示亚胺还原酶粗酶液210mL、葡萄糖脱氢酶粗酶液105mL并混匀。用100mM磷酸缓冲溶液定容到3000mL。在45℃反应7h，期间通过温度自控系统实时控制反应体系温度为45℃，通过pH自控系统用5M氢氧化钠溶液控制反应pH为7.5±0.2。产品转化率为95.8％，手性纯度达99.85％。产品经提取、精制后获得的R-四氢罂粟碱盐酸盐的核磁图谱如图1所示，其手性纯度如图2所示。

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，并不用于限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是SEQID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列；其中，所述发生突变的氨基酸序列具有以下至少1个突变位点：第16位、第19位、第25位、第29位、第39位、第48位、第54位、第55位、第61位、第66位、第67位、第78位、第79位、第83位、第89位、第101位、第105位、第107位、第108位、第118位、第123位、第163位、第164位、第172位、第176位、第177位、第179位、第180位、第183位、第184位、第197位、第202位、第229位、第230位、第231位。

2.根据权利要求1所述的亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2～45所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求2所述的亚胺还原酶突变体的编码基因。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pET-24a为载体质粒。

5.一种用于生产权利要求2所述亚胺还原酶突变体的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌包含权利要求4所述的重组表达载体，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌。

6.权利要求2所述的亚胺还原酶突变体、权利要求3所述的重组表达载体、权利要求5所述的基因工程菌在制备权利要求2所述的亚胺还原酶突变体中的应用。

7.一种用于制备权利要求2所述亚胺还原酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：培养权利要求6所述的基因工程菌，获得亚胺还原酶突变体。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括发酵制备所述亚胺还原酶突变体的步骤。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，生产罐发酵条件为：培养温度为36-38℃，酶表达诱导后，培养温度降低为21-23℃，DO 20％以上，空气流量1:0.1～2vvm。

10.权利要求2所述的亚胺还原酶突变体的应用，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ IDNO：36～45所示的亚胺还原酶突变体应用于亚胺还原反应中，所述还原反应的底物为二氢罂粟碱或其盐酸盐，其产品为R-四氢罂粟碱。