CN107557412B

CN107557412B - 一种固定化酶催化合成nadph的方法

Info

Publication number: CN107557412B
Application number: CN201710929892.7A
Authority: CN
Inventors: 秦正红
Original assignee: Chongqing Institute Of Bench To Bed Bioengineering Technology Co ltd
Current assignee: Shandong Lankang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-10-09
Filing date: 2017-10-09
Publication date: 2020-02-28
Anticipated expiration: 2037-10-09
Also published as: CN107557412A

Abstract

本发明公开了一种固定化酶催化合成NADPH的方法，包括以下步骤：(1)在二价金属离子存在下，以NAD和偏磷酸盐为底物配制成第一反应液，向第一反应液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；(2)去除第一反应液中的固定化NAD激酶，继续加入葡萄糖配制成第二反应液，向第二反应液中加入固定化葡萄糖脱氢酶，催化合成NADPH。上述方法实现了以连续反应合成NADPH，生产工艺简单，生产周期短，生产成本低，产品质量更加稳定；另一方面，采用固定化酶催化制备NADPH，固定化酶能够连续、反复多次使用，进一步降低了生产成本，避免了产物中引入蛋白杂质，固定化酶应用于上述方法中有利于生产高纯度和高收率的NADPH。

Description

一种固定化酶催化合成NADPH的方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种固定化酶催化合成NADPH的方法。

背景技术

还原型辅酶II(triphosphopyridine nucleotide，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，简称：NADPH)是一种极为重要的核苷酸类辅酶，它是氧化型辅酶I(NicotinamideAdenine Dinucleotide，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称：NAD)中与腺嘌呤相连的核糖环系2’-位的磷酸化衍生物。NADPH作为细胞内最为重要的电子供体和生物合成的还原剂，可为还原性生物合成提供氢离子，参与如氨基酸、脂肪酸、胆固醇、单加氧酶系、类固醇激素等生物分子的合成。NADPH除了参与生物合成，还参与体内羟化反应和药物、毒物及某些激素的生物转化。例如，NADPH可利用解毒细胞的电子供体，通过体内代谢减少生物体氧化型化合物，维持其氧化还原的平衡，在氧化防御系统发挥重要作用。NADPH也可以借助于异柠檬酸穿梭作用进入呼吸链产生ATP:由于线粒体内膜对物质的通透性很低，线粒体外产生的NADPH不能直接进入呼吸链被氧化。NADPH上的Η可以在异柠檬酸脱氢酶的作用下被交给NAD+，然后由NAD+进入呼吸链产生能量。NADPH还是谷胱甘肽(GSH)的还原酶的辅酶，可使氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成还原型GSH，维持还原型的GSH的正常含量。GSH是细胞内重要的抗氧化剂，可保护一些含巯基的蛋白质、脂肪和蛋白酶类免受氧化剂的破坏，特别在维持红细胞膜的完整性方面起着重要作用。目前，基于NADPH的多重生理功能，已有文献报道NADPH作为制备防治脑缺血性中风、心脏疾病，以及抗疲劳药物的应用。随着NADPH在医药行业及保健品行业越来越广泛的应用，对生产NADPH方法的研究具有重大的理论意义和经济意义。

NADPH是NADP+的还原形式，目前NADP+的合成方法可以分为化学法和生物法，化学法以烟酰胺为原料，经多步反应合成出NADP+，化学法存在反应路线长，反应条件苛刻，选择性差，易生成副产物，产物纯度低，收率低，需用到昂贵的试剂，成本较高等不足；此外，大量有机溶剂的使用还会造成环境污染。因此，该工艺路线不适合于工业化大生产(JamesDowden et al,Chemical Synthesis of the Second Messenger Nicotinic AcidAdenine Dinucleotide Phosphate by Total Synthesis of Nicotinamide AdenineDinucleotide Phosphate,Angew.Chem.Int.Ed.2004,43:4637-4640)。传统的生物法是采用发酵或其它微生物培养技术,并通过对酵母或其它微生物的分离提取得到NADP+。该工艺过程虽然已很成熟，但是原料耗费巨大，劳动强度大，能源消耗大，产量有限，生产成本高，产品价格高，限制了氧化型辅酶II(NADP+)的广泛应用(Sakai.T,Biotech.Bioeng.1980,22,Suppl.1,143-162；Uchida，T.etal,Agric.Biol.Chem.1971,37,1049-1056；Sakai,T.and Uchida，T.et al,Agric.Biol.Chem.1973,37,1041-1048)。

酶催化转化是一种高选择性反应，不同种类的酶可作用于不同构型和不同种类的特定底物，从而达到定向转化的目的，酶法以其所具有的反应条件温和、立体专一性强、转化率高等特点，被广泛地研究和应用。生物酶法合成NADP+的研究中，Whitesides和其同事构建了聚丙烯酰胺凝胶固定化的NAD焦磷酸化酶和NAD激酶及ATP再生酶催化反应体系，催化烟酰胺核苷磷酸(简称NMN)合成NADP+的方法(An Efficient Chemical and EnzymaticSynthesis of Nicotinamide Adenine Dinucleotide(NAD+).J.Am.Chem.SOC,1984,106,234-239)。然而，该工艺存在以下缺陷：一是原料合成烟酰胺核苷磷酸的合成收率低，且不易放大生产，原料来源受到限制；二是酶催化合成NAD+和NADP+只能在克级范围得到高的转化率，但反应时间长达16天，产能低；三是NADP+的生产需要在ATP的存在下进行，由于ATP价格昂贵，增加了NADP+的生产成本。

应用酶催化转化法生产NADPH，在得到NADP后，需要将NADP纯化后进一步使用脱氢酶以催化合成NADPH，操作步骤繁琐，无法以原料NAD连续反应制备NADPH。另一方面，现有的还原态辅酶的再生系统中使用最多是FDH，但其酶活较低，并且对NADH再生优于NADPH的再生(KarstenSeelbach,Beflina Riabel,Werner Hummel et al.A novel efficientregeneration method of NADPH using a new formate de-hydrogenase.TetrahedronLetters,1996)。因此，确定高效稳定的NADPH生产酶，以及步骤简便、能够连续反应合成NADPH的方法对实现NADPH的工业化生产具有重要意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中NADPH合成的收率低、生产成本高，以及合成步骤繁琐、生产周期长的问题；从而提供一种以固定化酶连续催化制备NADPH，且工艺简单、周期短、成本低，以及产物收率高的生产方法。

为此，本发明提供了一种固定化酶催化合成NADPH的方法，包括以下步骤：

(1)在二价金属离子存在下，以NAD和偏磷酸盐为底物配制成第一反应液，向所述第一反应液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；

(2)去除所述第一反应液中的固定化NAD激酶，继续加入葡萄糖配制成第二反应液，向所述第二反应液中加入固定化葡萄糖脱氢酶，催化合成NADPH。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述二价金属离子为镁离子，所述NAD、所述偏磷酸盐和所述镁离子以1：(1～20)：(0.1～10)的质量比混和于溶剂中，所述溶剂与所述NAD的质量比为(10～100)：1，形成所述第一反应液。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述固定化NAD激酶与所述NAD的质量比为(1～20)：1。

优选地，所述固定化NAD激酶与所述NAD的质量比为2：1。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述NADP合成的反应条件为：调节pH为4～8，在25℃～55℃的温度下反应10～40小时。

优选地，所述NADP合成的反应条件为：调节pH为7，在25℃～55℃的温度下反应10～40小时。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述葡萄糖与所述NAD的摩尔比为(0.1～5)：1，加入所述葡萄糖后，补充加入所述溶剂，至所述溶剂与所述NAD的质量比为(10～100)：1，形成所述第二反应液。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述固定化葡萄糖脱氢酶与所述NAD的质量比为(0.1～5)：1。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述NADPH合成的反应条件为：调节pH为6～9，在5℃～35℃的温度下反应至pH保持稳定。

优选地，所述NADPH合成的反应条件为：调节pH为8，在5℃～35℃的温度下反应至pH保持稳定。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述溶剂为包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中至少一种的水溶液。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，还包括将NAD激酶和葡萄糖脱氢酶固定化的方法：

a.将酶载体用质量浓度1-3％的戊二醛活化后过滤，作为固定化载体；

b.分别将固定化载体加入NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的酶液中，调节pH为5～9，在10℃～30℃下缓慢搅动，固定18～36小时得到固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶。

优选的，所述酶载体用质量浓度2％的戊二醛活化。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述NAD激酶与所述酶载体的质量为比1:5，所述葡萄糖脱氢酶与所述酶载体的质量为比1:5。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，固定所述NAD激酶的酶载体为LX-1000HFA，固定所述葡萄糖脱氢酶的酶载体为LX-1000NH。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，还包括NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的制备方法：

1)分别发酵培养所述NAD激酶的生产菌和所述葡萄糖脱氢酶的生产菌，发酵结束后收集菌体，将收集的菌体破碎后得到NAD激酶的粗酶液和葡萄糖脱氢酶的粗酶液；

2)将步骤1)中得到的粗酶液进行絮凝，然后过滤所述粗酶液，得到纯化的NAD激酶的酶液和葡萄糖脱氢酶的酶液。

优选的，所述步骤2)中，向所述粗酶液中滴加含质量浓度5％无水氯化钙和质量浓度1％的壳聚糖使pH降至5.0，然后再滴加1M的KOH调pH至7.5，所述粗酶液进行絮凝。

上述的固定化酶催化合成NADPH的方法，所述NAD激酶的生产菌为克隆有SEQ IDNO.1所示基因的大肠杆菌基因工程菌，所述葡萄糖脱氢酶的生产菌为克隆有SEQ ID NO.2所示基因的大肠杆菌基因工程菌。

本发明相对现有技术具有如下优点：

1、本发明提供的固定化酶催化合成NADPH的方法，在二价金属离子存在下，以NAD和偏磷酸盐为底物，按次序加入固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶，实现了以连续反应合成NADPH，简化了NADPH的生产工艺，大幅度缩短了NADPH的生产周期(生产时间控制在41h以内)；本发明选择的固定化葡萄糖脱氢酶催化NADP转化为NADPH具有高的转化率，相应提高了NADPH的收率。

另一方面，固定化酶能够反复、多次使用，提高了酶的使用效率，减低了生产成本；固定化酶易与反应体系分离，避免了产物中残留蛋白杂质，简化了产物的提纯工艺，提高了产物的纯度；固定化酶的稳定性较游离酶有提高，使不同批次之间产物的稳定性提高。

最后，固定化酶具有一定的机械强度，可以用搅拌或装柱的方式作用于底物溶液，便于酶催化反应的连续化和自动化操作，有利于实现NADPH的大规模的工业生产。

2、本发明提供的固定化酶催化合成NADPH的方法，通过控制第一反应液和第二反应液中各物质成分的添加比例，以及合成NADP以及合成NDPH的pH、温度和反应时间，使固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶具有高的催化活性和高的底物转化率，能够有效催化NAD磷酸化生成NADP，并使NADP连续还原为NADPH，提高了NADPH的收率(～70％)和纯度(>70％)。

3、本发明提供的NAD激酶和葡萄糖脱氢酶固定化的方法，反应条件温和、酶活回收率高，能够用于制备高稳定性和高催化活性的固定化NAD激酶与固定化葡萄糖脱氢酶，固定化NAD激酶能够连续使用10次以上，固定化葡萄糖脱氢酶能够连续使用10次以上，酶的使用效率高，相对降低了反应成本。

固定化过程不需要额外添加稳定剂来提高固定化酶的稳定性，避免了固定化酶在催化合成NADPH时向反应体系中引入杂质，有利于提高NADPH的纯度，以保障NADPH作为药用原料在医药领域中的应用。

本发明提供的固定化的方法得到的固定化NAD激酶在pH为6～7的环境下能实现高效催化，适于NAD和NADP的酸性的合成环境，反应过程中不需要进行pH的调整，简化了反应步骤；固定化葡萄糖脱氢酶在pH为8左右的环境下能实现高效催化，有利于碱性NADPH的合成。

4、本发明提供的固定化方法结合NAD激酶的酶载体LX-1000HFA，和葡萄糖脱氢酶的酶载体LX-1000NH，使载体与酶的结合力强，固定化酶在使用过程中不易从载体上脱落，提高了酶的固定效果，避免酶脱落后向反应体系中引入杂质。

5、本发明提供的NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的制备方法，制备条件温和，环境友好性提高，能够高效制备纯度高的两种酶，为NAD激酶和葡萄糖脱氢酶提供了稳定的酶源，即NAD激酶生产菌和葡萄糖脱氢酶生产菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例5中制备的NADPH生成液的HPLC检测图；

图2为本发明实验例2中提供以不同含量的标准蛋白溶液绘制的标准曲线。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得，本发明中测序和基因合成由(苏州金唯智生物科技有限公司)完成。

实施例1

本发明提供了一种固定化NAD激酶的制备方法，具体包括以下步骤：

1、制备NAD激酶生产菌

人工合成结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的NAD激酶表达基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示，将其通过NdeI和HindIII位点连接至pET24a载体(Novagen公司，69749-3)，测序正确后，将其装入Ecoli BL21菌株，筛选高表达菌株作为NAD激酶生产菌。

2、制备NAD激酶

(1)将保藏有NAD激酶生产菌的菌种管常温融化，然后用接种环蘸取一环画线于含有硫酸卡那霉素的种子培养基(硫酸卡那霉素5mg/L)平板，种子培养基成分如表1所示，37℃过夜培养活化。

表1种子培养基配制成分

原料	浓度(g/L)
		酵母膏	12
蛋白胨	24
		磷酸氢二钾	16.43
磷酸二氢钾	2.31
		甘油	4ml

(2)挑取单菌落于两支装有5ml液态种子培养基(硫酸卡那霉素5mg/L)的试管中，37℃过夜培养。

(3)按1％接种量接到500mL种子培养基中摇瓶(每瓶装液量200mL)，在37℃温度下，以200rpm的转速摇瓶培养8h，作为二级种子。

(4)配制3.5L发酵培养基(发酵培养基成分如表2所示)，121℃下高温灭菌20分钟；另称2g无水硫酸镁于250mL三角瓶中，加蒸馏水100mL，灭菌后，冷却备用。

表2发酵培养基配制成分

(5)用质量分数为20％～28％的氨水调节发酵培养基的pH到8.0，将步骤(3)中制备的两瓶二级种子转接到5L发酵罐，同时加入灭菌的硫酸镁，溶氧不低于30％，37℃温度下，以300rpm的转速搅动培养。

(6)培养至pH开始急速上升时，打开补料泵，补料泵按3％的功率补料，半小时后关闭补料泵，观察pH上升所需时间：若大于5分钟pH上升，则调小补料功率；若补料过程中pH不下降，则加大补料功率。

(7)取发酵罐中样品，稀释到合适倍数，测OD600。当OD600达到20-25时，加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度0.1mM诱导表达。

(8)发酵罐内样品OD值不上升时，发酵结束，打开发酵罐过滤收集菌体，将菌体称重，记录，-20℃保存待用。

(9)用天平准确称取100g湿菌体，加入500mL蒸馏水搅拌均匀，然后使用高压均质机将搅拌均匀的菌悬液破碎两次，过滤，得粗酶液。

(10)将破碎过的粗酶液用1M的KOH调pH至7.0，然后滴加含质量浓度为5％无水氯化钙和质量浓度为1％的壳聚糖的溶液到粗酶液中，pH降至5.0左右；继续滴加1M的KOH调pH至7.5，将絮凝好的粗酶液过滤，所得滤液即纯化的NAD激酶的酶液。

3、制备固定化NAD激酶

(1)向酶载体LX-1000HFA中加入质量浓度为2％的戊二醛活化1h，过滤得活化后的载体。

(2)向步骤1中制备的酶液中以蛋白：载体＝1:5(或湿菌体：载体＝1:2)的质量比，加入活化后的LX-1000HFA，再调节pH为8.0，在20℃温度下以100rpm的转速缓慢搅动，固定18h。

(3)用500mL 0.2M的磷酸氢二钠溶液洗一遍，再用含0.5M NaCl的500mL 0.2M的磷酸氢二钠溶液在150rpm转速下摇5min，过滤。

(4)最后用0.2M的磷酸氢二钠溶液洗涤后抽干，得到固定化NAD激酶。

实施例2

本发明提供了一种固定化NAD激酶的制备方法，与实施例1中所示的制备方法的区别仅在于：

1、向酶载体LX-1000HFA中加入质量浓度为1％的戊二醛活化1.5h，过滤得活化后的载体。

2、将实施1中制备的酶液中以蛋白：载体＝1:5(或湿菌体：载体＝1:2)的质量比，加入活化后的LX-1000HFA，再调节pH为5.0，在30℃温度下以100rpm的转速缓慢搅动，固定25h。

实施例3

本发明提供了一种固定化葡萄糖脱氢酶的制备方法，具体包括以下步骤：

1、制备葡萄糖脱氢酶生产菌

人工合成枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的葡萄糖脱氢酶表达基因，基因序列如SEQ ID NO.2所示，将其通过NdeI和HindIII位点连接至pET24a载体(Novagen公司，69749-3)，测序正确后，将其装入Ecoli BL21菌株，筛选高表达菌株作为葡萄糖脱氢酶生产菌。

2、制备葡萄糖脱氢酶

依据实施例1中提供的制备方法，利用葡萄糖脱氢酶生产菌制备葡萄糖脱氢酶的酶液。

3、制备固定化葡萄糖脱氢酶

依据实施例1中提供的制备方法，将步骤2中制备的葡萄糖脱氢酶固定于酶载体LX-1000NH上，得到固定化葡萄糖脱氢酶。

(1)向酶载体LX-1000NH中加入质量浓度为1.5％的戊二醛活化1h，过滤得活化后的载体。

(2)向步骤1中制备的酶液中以蛋白：载体＝1:5(或湿菌体：载体＝1:2)的质量比，加入活化后的LX-1000NH，再调节pH为7.0，在18℃温度下以100rpm的转速缓慢搅动，固定22h。

(4)最后用0.2M的磷酸氢二钠溶液洗涤后抽干，得到固定化葡萄糖脱氢酶。

实施例4

本发明提供了一种葡萄糖脱氢酶的制备方法，与实施例3中所示的制备方法的区别仅在于：

1、向酶载体LX-1000NH中加入质量浓度为3％的戊二醛活化40min，过滤得活化后的载体。

2、向实施例3中制备的酶液中以蛋白：载体＝1:5(或湿菌体：载体＝1:2)的质量比，加入活化后的LX-1000NH，再调节pH为9.0，在10℃温度下以100rpm的转速缓慢搅动，固定36h。

实施例5

本实施例提供一种固定化酶催化合成NADPH的方法，应用实施1中制备的固定化NAD激酶和实施例3中制备的固定化葡萄糖脱氢酶，合成方法具体包括以下步骤：

(1)取4g NAD和8g三偏磷酸钠，与80mL 0.05M的MgCl₂水溶液混合后，用质量浓度20％的氢氧化钠调节pH至7.0，补充水至100mL，加入4g固定化NAD激酶，在37℃的温度下，以150rpm的搅拌速度反应36h，然后过滤除去固定化NAD激酶。

(2)再称取3g无水葡萄糖(或3.3g一水葡萄糖)加入步骤(1)中的滤液中，补充水至100mL，用20％的氢氧化钠调pH至8.0，然后加入9g固定化葡萄糖脱氢酶，25℃的温度下开始反应。

反应过程中随时监测pH，并用20％的氢氧化钠调节pH，使pH维持在7.8～8.0之间，至pH不再下降时，即为反应结束。反应结束后迅速过滤，滤液即为NADPH的生成液。

实施例6

(1)取10g NAD和10g三偏磷酸钠，与250mL 0.8M的MgCl₂水溶液混合后，用20％的氢氧化钠调节pH至4.0，补充水至400mL，加入15g固定化NAD激酶，在25℃的温度下，以150rpm的搅拌速度反应40h，然后过滤除去固定化NAD激酶。

(2)再称取0.3g无水葡萄糖加入步骤(1)中的滤液中，补充水至400mL，用20％的氢氧化钠调pH至7.0，然后加入1g固定化葡萄糖脱氢酶，35℃下开始反应。

实施例7

(1)取2g NAD和40g三偏磷酸钠，与100mL 1M的MgCl₂水溶液混合后，用20％的氢氧化钠调节pH至7.0，补充磷酸氢二钾水溶液至200mL，加入40g固定化NAD激酶，在55℃的温度下，以150rpm的搅拌速度反应10h，然后过滤除去固定化NAD激酶。

(2)再称取2.7g无水葡萄糖，补充磷酸氢二钾水溶液至200mL，用20％的氢氧化钠调pH至9.0，然后加入6g固定化葡萄糖脱氢酶，5℃的温度下开始反应。

反应过程中随时监测pH，并用20％的氢氧化钠调节pH，使pH维持在8.8～9.0之间，至pH不再下降时，即为反应结束。反应结束后迅速过滤，滤液即为NADPH的生成液。

实施例8

(1)取4g NAD和12g三偏磷酸钠，与200mL 2M的MgCl₂水溶液混合后，用20％的氢氧化钠调节pH至6.5，补充水至300mL，加入4g固定化NAD激酶，在37℃的温度下，以150rpm的搅拌速度反应32h，然后过滤除去固定化NAD激酶。

(2)再称取4.8g无水葡萄糖，补充水至300mL，用20％的氢氧化钠调pH至8.0，然后加入20g固定化葡萄糖脱氢酶，25℃的温度下开始反应。

实施例9

(1)取10g NAD和10g三偏磷酸钠，与40mL 0.25M的MgCl₂水溶液混合后，用20％的氢氧化钠调节pH至7.0，补充水至100mL，加入12g固定化NAD激酶，在37℃的温度下，以150rpm的搅拌速度反应25h，然后过滤除去固定化NAD激酶。

(2)再称取5g无水葡萄糖，补充水至100mL，用20％的氢氧化钠调pH至8.5，然后加入9g固定化葡萄糖脱氢酶，25℃的温度下开始反应。

反应过程中随时监测pH，并用20％的氢氧化钠调节pH，使pH维持在8.0～8.5之间，至pH不再下降时，即为反应结束。反应结束后迅速过滤，滤液即为NADPH的生成液。

实验例1

1、实验目的：通过高效液相色谱法/HPLC检测实施例5～实施例9制备的NADPH生成液进行检测。

2、实验方法：

依据中华人民共和国药典(2010版)第二部附录(ⅤD)方法，以ReproSil-Pur 120ODS-3(5μm，4.6×250mm)为色谱柱，以乙腈为流动相A，以100mM NaH₂PO₄的水溶液为流动相B，按如下表3所示的程序进行梯度洗脱：

表3梯度洗脱程序

进样量为20μL，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，检测波长为260nm。

用HPLC系统工作站对结果进行数据处理，用面积归一化法计算出产物中NADPH的纯度和收率。

3、实验结果：检测结果如表4所示，其中，实施例5中制备的NADPH生成液的HPLC检测图如图1所示。

表4实施例5～实施例9所示方法制备NADPH的产率和纯度

	转化率	纯度	反应时间/h
				实施例5中制备的NADPH	75％	70％	37
实施例6中制备的NADPH	55％	40％	41
				实施例7中制备的NADPH	58％	55％	14
实施例8中制备的NADPH	71％	67％	33
				实施例9中制备的NADPH	70％	69％	26

由表3可知，本发明提供的固定化酶催化合成NADPH的方法，能够在同一反应容器内经过连续反应，制得高产率和高纯度的NADPH，并且大幅度缩短了NADPH制备的生产周期。在实施例5～实施例9所示的反应液的物质配比和反应条件下，NADPH转化率平均达65％以上，纯度平均超过60％，反应时间控制在41h以内。表明实施例5～实施例9所示的方法均能用于稳定生产高质量的NADPH。其中，在实施例5所示的物质配比和反应条件下，NADPH的转化率达75％，纯度达70％以上，反应时间为37h，表明此条件下的固定化酶具有最高的催化活性；该合成方法具有最佳的生产效果，适用于在工业领域中的大规模生产和应用。

实验例2

1、实验目的：检测实施例1～实施例2中制备的固定化NAD激酶和实施例3～实施例4中制备的固定化葡萄糖脱氢酶使用后的脱落程度

2、实验方法：

准备考马斯亮蓝溶液和标准蛋白质溶液：

(1)考马斯亮蓝溶液

称取考马斯亮蓝G―250 100mg，溶于50mL质量浓度95％乙醇中，加入100mL质量浓度85％磷酸；将上述溶液转移至容量瓶中，用蒸馏水稀释至1000mL；再以0.45微米的滤膜过滤溶液，滤液转移至棕色玻璃瓶中，备用。

(2)标准蛋白质溶液

称取0.15mol的NaCl，溶解于1000ml蒸馏水中，配置成0.15mol/L NaCl溶液。继续称取50mg的结晶牛血清蛋白，溶解于50ml的0.15mol/L NaCl溶液中，配置成1mg/mL蛋白溶液，备用。

绘制标准曲线：

取六支试管，按照0～5进行编号，以表5所示的溶液的量在六支试管中配制不同含量的标准蛋白溶液；然后将试管摇匀，以0号管委空白对照，1h以内在595nm处比色测定，以测得的A_595nm为纵坐标，以标准蛋白含量为横坐标，绘制得到如图2所示的标准曲线。

表5不同含量的标准蛋白溶液配制体系

固定化NAD激酶使用后脱落程度检测：

称取总重量为M₁的固定化NAD激酶，用于催化合成NADP。记录反应结束后反应液的体积V₁，然后将反应液过滤，以去除固定化NAD激酶，记录过滤后反应液的总体积V₂，取部分体积(V_X)的过滤后溶液测定其A_595nm的值，所取溶液的体积使其测定值能够在标准曲线的直线范围内，在标准曲线上查出所取体积的溶液对应的蛋白含量M’，根据V₂与V_X的比例得到V₂体积溶液中的蛋白总量M₂，进而计算出反应结束后的反应液中的蛋白浓度(mg/mL)，相应得到固定化NAD激酶使用后脱落程度。

固定化葡萄糖脱氢酶使用后脱落程度检测：

称取总重量为M₃的固定化葡萄糖脱氢酶，向上述体积为V₂的反应液中加入固定化葡萄糖脱氢酶和葡萄糖，记录反应结束后反应液的体积V₃，然后将反应液过滤，以去除固定化葡萄糖脱氢酶，记录过滤后反应液的总体积V₄，取部分体积(V_y)的过滤后溶液测定其A_595nm的值，所取溶液的体积使其测定值能够在标准曲线的直线范围内，在标准曲线上查出所取体积的溶液对应的蛋白含量M”，根据V₄与V_y的比例得到V₄体积溶液中的蛋白总量M₄，进而计算出反应结束后的反应液中的蛋白浓度(mg/mL)，相应得到固定化NAD激酶使用后脱落的量。

3、实验结果：

利用上述方法检测使用后的固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶的脱落程度，其中，实施例1和实施例2中制备的固定化NAD激酶连续使用10次以内，实施例3和实施例4中制备的固定化葡萄糖脱氢酶连续使用10次以内，均未检测到酶的脱落，说明依据本发明提供的制备方法得到的固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶，酶与载体的结合牢固，能够多次重复使用而不从载体上脱落，避免了使反应体系中引入蛋白杂质，简化了产物的提纯工艺，提高了产物的纯度。

实验例3

1、实验目的：测定固定化NAD激酶以及固定化葡萄糖脱氢酶的酶活

2、实验方法：

固定化NAD激酶的酶活测定：

(1)测定反应体系(100ml)为：5mM的底物NAD、15mM的七水硫酸镁、50mM的三篇磷酸钠，0.2M pH8.0PBS缓冲液，和固定化NAD激酶5g。

(2)将按上述体系配制的测定溶液摇匀后，在45℃条件下，以200rpm转速搅拌反应，每1h取样，通过HPLC于280nm下测定NADP峰面积，连续测定10h。以峰面积对时间作图，取反应最初线性部分计算△S值。根据公式计算酶活力。

酶活力单位(U)定义为：45℃条件下，每小时固定化NADK催化生成1μmol NADP的酶量为一个单位。

计算公式为：

式中：△S为280nm NADP峰面积变化值，S为NADP标准品1g/ml对应峰面积，V为酶促反应体积(mL),787为NADP分子量，m为加入体系中固定化NADK的量(g)。

固定化葡萄糖脱氢酶的酶活测定:

(1)测定反应体系(50ml)为：1mL浓度为1M的Tris-HCl缓冲液、浓度为50mM的底物NADP，和1g固定化葡萄糖脱氢酶。

(2)将按上述体系配制的测定溶液摇匀后，在25℃条件下，以200rpm转速搅拌反应，每1min取样，通过HPLC于280nm下测定NADPH峰面积，连续测定10min。以峰面积对时间作图，取反应最初线性部分计算△S值。根据公式计算酶活力。

(3)酶活力单位(U)定义为：25℃条件下，每分钟固定化葡萄糖脱氢酶催化生成1μmol NADPH的酶量为一个单位。

计算公式为：

式中：△S为280nm NADP峰面积变化值，S为NADPH标准品1g/ml对应峰面积，V为酶促反应体积(mL)，833为NADP分子量，m为加入体系中固定化葡萄糖脱氢酶的量(g)。

3、实验结果：

利用上述的酶活测定方法，对多次使用后的固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶的活力进行检测，检测结果如表6所示：固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶在重复使用8次后，仍保持有较高的酶活，固定化酶的重复使用在保障NADPH高效生产的前提下，极大的降低了反应的生产成本。

表6固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶的酶活检测结果

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州人本药业有限公司

<120> 一种固定化酶催化合成NADPH的方法

<130> SHA201700389

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> 人工序列（NADK）

<400> 1

atgaccgctc atcgcagtgt tctgctggtc gtccacaccg ggcgcgacga agccaccgag 60

accgcacggc gcgtagaaaa agtattgggc gacaataaaa ttgcgcttcg cgtgctctcg 120

gccgaagcag tcgaccgagg gtcgttgcat ctggctcccg acgacatgcg ggccatgggc 180

gtcgagatcg aggtggttga cgcggaccag cacgcagccg acggctgcga actggtgctg 240

gttttgggcg gcgatggcac ctttttgcgg gcagccgagc tggcccgcaa cgccagcatt 300

ccggtgttgg gcgtcaatct gggccgcatc ggctttttgg ccgaggccga ggcggaggca 360

atcgacgcgg tgctcgagca tgttgtcgca caggattacc gggtggaaga ccgcttgact 420

ctggatgtcg tggtgcgcca gggcgggcgc atcgtcaacc ggggttgggc gctcaacgaa 480

gtcagtctgg aaaagggccc gaggctcggc gtgcttgggg tggtcgtgga aattgacggt 540

cggccggtgt cggcgtttgg ctgcgacggg gtgttggtgt ccacgccgac cggatcaacc 600

gcctatgcat tctcggcggg aggcccggtg ctgtggcccg acctcgaagc gatcctggtg 660

gtccccaaca acgctcacgc gctgtttggc cggccgatgg tcaccagccc cgaagccacc 720

atcgccatcg aaatagaggc cgacgggcat gacgccttgg tgttctgcga cggtcgccgc 780

gaaatgctga taccggccgg cagcagactc gaggtcaccc gctgtgtcac gtccgtcaaa 840

tgggcacggc tggacagtgc gccattcacc gaccggctgg tgcgcaagtt ccggttgccg 900

gtgaccggtt ggcgcggaaa gtag 924

<210> 2

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列（GDH）

<400> 2

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120

aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180

gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240

aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300

tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360

tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420

attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg ggataaagct gatgacacga acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540

attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600

gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660

ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720

ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acactatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

Claims

1.一种固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在二价金属离子存在下，以NAD和偏磷酸盐为底物配制成第一反应液，向所述第一反应液中加入固定化NAD激酶，催化合成NADP；

（2）滤除所述第一反应液中的固定化NAD激酶，加入葡萄糖配制成第二反应液，向所述第二反应液中加入固定化葡萄糖脱氢酶，催化合成NADPH。

2.根据权利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述二价金属离子为镁离子，所述NAD、所述偏磷酸盐和所述镁离子以1：（1~20）：（0.025~2.5）的质量比混和于溶剂中，所述溶剂与所述NAD的质量比为（10~100）：1，形成所述第一反应液。

3.根据权利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述固定化NAD激酶与所述NAD的质量比为（1~20）：1。

4.根据权利要求1或2所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NADP合成的反应条件为：调节pH为4~8，在25℃~55℃的温度下反应10~40小时。

5.根据权利要求1所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，按照所述葡萄糖与所述NAD的摩尔比为（0.1~5）：1加入所述葡萄糖后，补充加入溶剂，至所述溶剂与所述NAD的质量比为（10~100）：1，形成所述第二反应液。

6.根据权利要求1或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述固定化葡萄糖脱氢酶与所述NAD的质量比为（0.1~5）：1。

7.根据权利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NADPH合成的反应条件为：调节pH为6~9，在5℃~35℃的温度下反应至pH保持稳定。

8.根据权利要求2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述溶剂为纯化水或包括磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和磷酸二氢钠中至少一种的水溶液。

9.根据权利要求1或2或5所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，还包括将所述NAD激酶和葡萄糖脱氢酶固定化的方法：

a. 将酶载体用质量浓度为1-3%的戊二醛活化后过滤，作为固定化载体；

b. 分别将固定化载体加入NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的酶液中，调节pH为5~9，在10℃~30℃下缓慢搅动，固定18~36小时得到固定化NAD激酶和固定化葡萄糖脱氢酶。

10.根据权利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NAD激酶与所述酶载体的质量为比1:5，所述葡萄糖脱氢酶与所述酶载体的质量为比1:5。

11.根据权利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，固定所述NAD激酶的酶载体为LX-1000HFA，固定所述葡萄糖脱氢酶的酶载体为LX-1000NH。

12.根据权利要求9所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，还包括NAD激酶和葡萄糖脱氢酶的制备方法：

1）分别发酵培养所述NAD激酶的生产菌和所述葡萄糖脱氢酶的生产菌，发酵结束后收集菌体，将收集的菌体破碎后得到NAD激酶的粗酶液和葡萄糖脱氢酶的粗酶液；

2）将步骤1）中得到的粗酶液进行絮凝，然后过滤所述粗酶液，得到纯化的NAD激酶的酶液和葡萄糖脱氢酶的酶液。

13. 根据权利要求12所述的固定化酶催化合成NADPH的方法，其特征在于，所述NAD激酶的生产菌为克隆有SEQ ID NO.1所示基因的大肠杆菌基因工程菌，所述葡萄糖脱氢酶的生产菌为克隆有SEQ ID NO.2所示基因的大肠杆菌基因工程菌。