CN109913514A - 一种固定化酶流化床连续催化合成ats-7的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种固定化酶流化床连续催化合成ATS‑7的方法。将葡萄糖与氧化型辅酶NADP+的混合液通过GDH流化床，生成还原型辅酶NADPH，再将ATS‑6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液通过CR流化床，实现固定化酶流化床连续催化合成ATS‑7。本发明采用固定化酶流化床连续反应催化方法，提高了酶催化效率和酶的利用率，其催化效率相对于传统游离酶提高了3.1‑4.2倍；可通过独立调节不同的进样流速控制各自反应进程；固定化酶不易脱落可连续进行催化反应，便于与产物分离，提高了产品的产率的同时简化了纯化步骤，更利于工业化。
Description
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法。
背景技术
阿托伐他汀(Atorvastatin)是由美国公司华纳－兰伯特(Warner-Lamber)研制而成，于1997年经批准上市，由于其见效快、药效持久、不良反应少，是心脑血管疾病患者的首选药物，也是第一个全球售药金额超过百亿美元的药物。
目前根据已报道过的关于阿托伐他汀的合成步骤中，最重要的部分就是两个羟基的立体构型控制，因此阿托伐他汀关键中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(ATS-7)的合成近年来受到广泛的关注。美国专利(US6867306B2)中公开了一种目标产物的化学合成方法，该方法以6-氰基-5-羟基-3-氧代异丁酸叔丁酯(ATS-6)为原料，在-15℃及氮气的保护下加入硼氢化锌反应18小时，产率为53％。相较于其他合成方法，该方法反应时间过长，产率低，不适合工业化生产。
美国专利(US8980592B2)中公开了一种目标产物的生物制备方法，通过细胞破碎将来自Rubrobacter xylanophilus DSM9941中的氧化还原酶提取出来，用于催化底物ATS-6转化为ATS-7，转化率>99％，d.e.>99％。该生物合成法转化率高，但由于底物溶解度低，需添加有机助溶剂，因此酶活损失较大，不能重复利用，且提纯步骤繁琐，造成了生产成本的增加。
发明内容
为了解决现有技术中存在的酶的利用率低和产率较低的缺陷，本发明在于提供一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，不仅省去了繁琐的提纯步骤，提高了产品的纯度，还提高了酶的利用率，降低了生产成本，适合工业化生产。
酶法催化合成ATS-7的反应式如下：
一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，包括：将葡萄糖与氧化型辅酶NADP+的混合液通过GDH流化床，生成还原型辅酶NADPH，再将ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液通过CR流化床，实现固定化酶流化床连续催化合成ATS-7。
优选地，所述GDH流化床包括GDH和用于吸附固定GDH的载体；所述GDH流化床的制备方法为：将载体置于GDH溶液中进行吸附固定，然后将固定了GDH的载体加入反应柱中进行加压处理，得到GDH流化床。
优选地，所述载体为大孔硅胶；所述GDH溶液的质量浓度为16.7-25％，更优选为19.5-20.5％，GDH溶液中载体的加入量为1.2-2.1g/g，更优选为1.6-1.8g/g；所述吸附固定是在温度为20-25℃，更优选为24-25℃，pH为6.8-7.2(更优选为6.9-7.1)的条件下进行的，时间为50-60min，固定率为57-62％，更优选为59-61％。
优选地，所述CR流化床包括CR和用于吸附固定CR的载体；所述CR流化床的制备方法为：将载体置于CR溶液中进行吸附固定，然后将固定了CR的载体加入反应柱中进行加压处理，得到CR流化床。
优选地，将CR固定在载体上之前，还包括对载体的预处理步骤：将载体放置于氢氧化钠溶液中浸泡8h，用蒸馏水冲洗至中性，放置于乙醇中浸泡4h并用蒸馏水冲洗至中性，再放置于盐酸溶液中浸泡8h并用蒸馏水冲洗至中性，倾倒上清液并将载体放于烘箱中烘干，烘干的温度为80℃。
优选地，所述载体为大孔树脂；所述CR溶液的质量浓度为0.89-1.23％，更优选为1.0-1.1％，CR溶液中载体的加入量为0.08-0.1g/mL，更优选为0.08-0.09g/mL；所述吸附固定是在温度为27-34℃，更优选为29-31℃，pH为6.5-7.8(更优选为6.9-7.1)的条件下进行的，时间为150-200min，固定率为90-95％，更优选为92-93％。
所述葡萄糖与氧化型辅酶NADP+的混合液中氧化型辅酶NADP+的浓度为1.6-2.3mol/L，更优选为1.88-2.11mol/L，葡萄糖的浓度为1.5-2.1mol/L，更优选为1.91-2.13mol/L。
优选地，所述ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液中ATS-6的浓度为0.89-1.34mol/L，更优选为1mol/L；NADPH的浓度为1.3-1.7mol/L，更优选为1.5mol/L，混合液浓度采用0.2mol/L的磷酸缓冲液进行配制。
优选地，ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液通过CR流化床时的流速为2.0-4.5mL/min，更优选为3mL/min。
优选地，所述ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液的pH为7.0-7.8，温度为28-36℃，更优选为32℃。
本发明的有益效果：
(1)本发明中分步进行连续合成ATS-7，固定GDH催化生成的还原型辅酶NADPH可以直接用于催化底物ATS-6生成产物ATS-7，反应过程中固定化GDH和固定化CR可分别控制条件催化反应，解决了游离酶催化时两种酶因在相同条件下反应引起的原料及酶消耗高、副产物多、产率低等缺点，提高了酶催化效率和酶的利用率。
(2)反应易检测：反应中两个流化床分别进行，可通过独立调节不同的进样流速控制各自反应进程，不仅可以最大化的利用两种酶的催化活性，还方便于实时取样检测底物转化率，控制反应进程。
(3)产物易分离：固定化酶不易脱落可连续进行催化反应，便于与产物分离，提高了产品的产率的同时简化了纯化步骤，更利于工业化。
附图说明
图1为本发明的反应器结构示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中GDH、CR、NADP+由江苏美科生物科技有限公司提供，ATS-6由江苏万年长药业有限公司提供，大孔硅胶由青岛恒泽硅胶制品有限公司提供，大孔树脂D72由郑州勤实科技有限公司提供。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
图1为本发明的反应器结构示意图，将配制好的NADP+和葡糖糖的混合液置于第一贮液池，然后经过增压泵以一定流速压入GDH流化床，经过第一步反应后，反应产物再经过与进样口进来的ATS-6混合后，以一定的流速通过CR流化床，进行合成ATS-7的反应，生成的ATS-7再经萃取、减压蒸馏进行纯化，得到终产物ATS-7。
实施例1
一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，包括如下步骤：
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝6.5-7.8)，备用。
2)将15g大孔硅胶加入到35mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗大孔硅胶：去除上清液，将浸泡后的大孔硅胶加入35mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液，震荡3min，静置2min，更换缓冲液，清洗大孔硅胶的步骤重复4次。
3)将处理好的大孔硅胶置于8.5g GDH溶液(1.7g GDH用0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液稀释，GDH溶液质量浓度为20％)中，并在25℃下，以200r/min的转速搅拌吸附55min，得到固定化GDH，GDH的固定率为60％。
4)将26g大孔树脂D72加入到150mL、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用蒸馏水冲洗至中性，放置于150mL、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用蒸馏水冲洗至中性，再放置于150mL、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用蒸馏水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中以80℃烘干，得到活化后的大孔树脂D72。
5)将活化后的大孔树脂D72置于300mL CR溶液(3.25g CR用0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液稀释至300mL，CR溶液浓度为1.0％)中并在30℃下，以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化CR，CR的固定率为92.3％。
6)将步骤3)和5)中的固定化GDH和固定化CR加入反应柱，反应柱为玻璃材质的圆柱体，规格为：高25cm，内径3cm，然后用高压泵对反应柱进行加压处理，压力为0.02MPa，确保填充均匀紧实。
7)制备含有2mol/L NADP+，2mol/L葡萄糖的混合液，于37℃条件下以4.0mL/min的流速流经固定化GDH流化床进行反应，反应过程中滴加5％(w)的氢氧化钠溶液维持其pH＝7.0。
8)向反应液中添加ATS-6，并加入磷酸缓冲液将其配置成1.5mol/L NADPH和1.0mol/L ATS-6的反应液，其pH＝7.4，于32℃条件下以3.0mL/min的流速流经固定化CR流化床进行反应。
9)实验表明，当反应时间为2.5h时，检测出NADPH的残留浓度大于0.65mol/L，此时我们认为酶活损失严重，便停止反应，通过萃取、减压蒸馏，ATS-7的生成量为0.313moL，2.5h后，ATS-7的合成速率显著下降。
实施例2
一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，包括如下步骤：
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝6.5-7.8)，备用。
2)将15g大孔硅胶加入到35mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗大孔硅胶：去除上清液，将浸泡后的大孔硅胶加入35mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液，震荡3min，静置2min，更换缓冲液，清洗大孔硅胶的步骤重复4次。
3)将处理好的大孔硅胶置于8.5g GDH溶液(1.7g GDH用0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液稀释，GDH溶液质量浓度为16.7％)中，并在25℃下，以200r/min的转速搅拌吸附55min，得到固定化GDH，GDH的固定率为60％。。
4)将24g大孔树脂D72加入到150mL、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用蒸馏水冲洗至中性，放置于150mL、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用蒸馏水冲洗至中性，再放置于150mL、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用蒸馏水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中以80℃烘干，得到活化后的大孔树脂D72。
5)将活化后的大孔树脂D72置于300mL CR溶液(2.89g CR用0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液稀释至300mL，CR溶液质量浓度为0.89％)中并在30℃下，以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化CR，CR的固定率为92.3％。
6)将步骤3)和5)中的固定化GDH和固定化CR加入反应柱，反应柱为玻璃材质的圆柱体，规格为：高25cm，内径3cm，然后用高压泵对反应柱进行加压处理，压力为0.02MPa，确保填充均匀紧实。
7)制备含有2mol/L NADP+，2mol/L葡萄糖的混合液，于37℃条件下以4.0mL/min的流速流经固定化GDH流化床进行反应，反应过程中滴加5％(w)的氢氧化钠溶液维持其pH＝7.0。
8)向反应液中添加ATS-6，并加入磷酸缓冲液将其配置成1.3mol/L NADPH和0.89mol/L ATS-6的反应液，其pH＝7.2，于30℃条件下以2.5mL/min的流速流经固定化CR流化床进行反应。
9)实验表明，当反应时间为2.8h时，检测出NADPH的残留浓度大于0.65mol/L，此时我们认为酶活损失严重，便停止反应，通过萃取、减压蒸馏，ATS-7的生成量为0.275moL，2.8h后，ATS-7的合成速率显著下降。
实施例3
一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，包括如下步骤：
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝6.5-7.8)，备用。
2)将15g大孔硅胶加入到35mL、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗大孔硅胶：去除上清液，将15g浸泡后的大孔硅胶加入34.6mL、0.2mol/L的新鲜磷酸缓冲溶液，震荡3min，静置2min，更换缓冲液，清洗硅胶的步骤重复4次。
3)将处理好的大孔硅胶置于8.5g GDH溶液(1.7g GDH用0.2mol/L磷酸缓冲溶液稀释，GDH溶液质量浓度为25％)中，并在25℃下，以200r/min的转速搅拌吸附55min，得到固定化GDH，GDH的固定率为60％。。
4)将28g大孔树脂D72加入到150mL、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用蒸馏水冲洗至中性，放置于150mL、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用蒸馏水冲洗至中性，再放置于150mL、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用蒸馏水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中以80℃烘干，得到活化后的大孔树脂D72。
5)将活化后的大孔树脂D72置于300mL CR溶液(4.0g CR用0.2mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液稀释至300mL，CR溶液浓度为1.23％)中并在30℃下，以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化CR，CR的固定率为92.3％。
6)将步骤3)和5)中的固定化GDH和固定化CR加入反应柱，反应柱为玻璃材质的圆柱体，规格为：高25cm，内径3cm，然后用高压泵对反应柱进行加压处理，压力为0.02MPa，确保填充均匀紧实。
7)制备含有2mol/L NADP+，2mol/L葡萄糖的混合液，于37℃条件下以4.0mL/min的流速流经固定化GDH流化床进行反应，反应过程中滴加5％(w)的氢氧化钠溶液维持其pH＝7.0。
8)向反应液中添加ATS-6，并加入磷酸缓冲液将其配置成1.7mol/LNADPH和1.34mol/L ATS-6的反应液，其pH＝7.6，于34℃条件下以4.5mL/min的流速流经固定化CR流化床进行反应。
9)实验表明，当反应时间为3.4h时，检测出NADPH的残留浓度大于0.65mol/L，此时我们认为酶活损失严重，便停止反应，通过萃取、减压蒸馏，ATS-7的生成量为0.262moL，3.4h后，ATS-7的合成速率显著下降。
对比例1
一种固定化酶催化制备ATS-7的工艺，包括如下步骤：
对比例1中的步骤1)～5)同实施例1的步骤1)～5)，然后省略实施例1的步骤6)～9)，替换为如下步骤：
于250mL三颈瓶中搅拌下加入70mL磷酸缓冲溶液，加入葡萄糖30g，ATS-6 20g，NADP+0.6g，以及加入步骤3)中的固定化GDH和步骤5)中的固定化CR，于35℃恒温搅拌，并不断滴加5％(w)的氢氧化钠溶液，维持pH＝7.0。
实验表明，当反应时间为3.6h时，检测出NADPH的残留浓度大于0.65mol/L，此时我们认为酶活损失严重，便停止反应，通过萃取、减压蒸馏，ATS-7生成量为0.208moL，3.6h后，ATS-7的合成速率显著下降。
对比例2
1)用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/L的磷酸缓冲溶液(pH＝6.5-7.8)，备用。
2)于250mL三颈瓶中搅拌下加入70mL磷酸缓冲溶液，加入葡萄糖30g，ATS-6 20g，CR 3g，GDH 1g，NADP+0.6g，于35℃恒温搅拌，并不断滴加5％(w)的NaOH溶液维持pH＝7.0。
3)实验表明，当反应时间为5h时，检测出NADPH的残留浓度大于0.65mol/L，此时我们认为酶活损失严重，便停止反应，通过萃取、减压蒸馏，ATS-7的生成量为0.076moL，5h后，ATS-7的合成速率显著下降。
将实施例1～3和对比例1～2中各反应时间段ATS-7的生成量列于表1，如下所示：
表1
由表1可看出，反应时间为5.5h时，实施例1中的固定化酶流化床连续反应的催化效率为0.105mol/g(酶催化效率：ATS-7的生成量除以参与催化反应的CR质量)，对比例1中的固定化酶催化效率为0.07mol/g，对比例2中的游离酶催化效率为0.025mol/g，由此可见，固定化酶流化床连续反应的催化效率是固定化酶催化效率的1.5倍，是游离酶催化效率的4.1倍，因此利用固定化酶流化床连续催化合成ATS-7时，固定化GDH和固定化CR可分别控制条件催化反应，解决了游离酶催化时两种酶因在相同条件下反应引起的原料及酶消耗高、副产物多、产率低等缺点，提高了酶催化效率和酶的利用率，可以最大化的利用两种酶的催化活性，提升了反应产率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.一种固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：将葡萄糖与氧化型辅酶NADP+的混合液通过GDH流化床，生成还原型辅酶NADPH，再将ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液通过CR流化床，实现固定化酶流化床连续催化合成ATS-7。
2.根据权利要求1所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述GDH流化床包括GDH和用于吸附固定GDH的载体；所述GDH流化床的制备方法为：将载体置于GDH溶液中进行吸附固定，然后将固定了GDH的载体加入反应柱中进行加压处理，得到GDH流化床。
3.根据权利要求2所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述载体为大孔硅胶；所述GDH溶液的质量浓度为16.7-25％，GDH溶液中载体的加入量为1.2-2.1g/g；所述吸附固定是在温度为20-25℃，pH为6.8-7.2的条件下进行的，时间为50-60min，固定率为57-62％。
4.根据权利要求1所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述CR流化床包括CR和用于吸附固定CR的载体；所述CR流化床的制备方法为：将载体置于CR溶液中进行吸附固定，然后将固定了CR的载体加入反应柱中进行加压处理，得到CR流化床。
5.根据权利要求4所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述载体为大孔树脂；所述CR溶液的质量浓度为0.89-1.23％，CR溶液中载体的加入量为0.08-0.1g/mL；所述吸附固定是在温度为27-34℃，pH为6.5-7.8的条件下进行的，时间为150-200min，固定率为90-95％。
6.根据权利要求1所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述葡萄糖与氧化型辅酶NADP+的混合液中氧化型辅酶NADP+的浓度为1.6-2.3mol/L，葡萄糖的浓度为1.5-2.1mol/L。
7.根据权利要求1所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液中ATS-6的浓度为0.89-1.34mol/L，NADPH的浓度为1.3-1.7mol/L，混合液的浓度采用0.2mol/L的磷酸缓冲液进行配制。
8.根据权利要求1所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液通过CR流化床时的流速为2.0-4.5mL/min。
9.根据权利要求1所述的固定化酶流化床连续催化合成ATS-7的方法，其特征在于：所述ATS-6和生成的还原型辅酶NADPH的混合液的pH为7.0-7.8，温度为28-36℃。
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