TWI525195B - 合成烯酸及其衍生物之方法 - Google Patents
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Description
本發明係在Department of Energy授予之授權號DE-FG02-06ER84536及DE-FG02-07ER84865下由政府支持進行。美國政府在本發明中具有某些權利。
本發明一般係關於商品及特製化學品之生產，且更詳言之關於產生丙烯酸及丙烯酸酯之整合生物製程。
本申請案主張35 U.S.C.§ 119(e)下2007年8月10日申請之美國臨時申請案第60/955,321號之優先權，其全文係以引用的方式併入本文中。
丙烯酸及丙烯酸酯為大量生產之石油化學產品。舉例而言，丙烯酸為用於產生聚合材料(諸如為高吸水性尿布之主要組份之聚丙烯酸)之商品單體中間物。丙烯酸亦用於產生丙烯酸酯，丙烯酸酯係用於水溶性乳膠塗層、黏著劑及墨水中。丙烯酸及丙烯酸酯係藉由諸如丙烯氧化，隨後以諸如甲醇、丁醇及2-乙基己醇之醇來酯化的石油化學製程來製造。此等化學產品係以每年超過一百億lb之總量製造且代表超過$10 B之銷售市場。估計全球此等市場之年增長為4-5%。
由石油原料製造之化學品遭受較高且不穩定價格、不可靠外來供應鏈及儲量減低之負擔(Frost，J.W.，Redefining chemical
manufacture.Ind.Biotechnol.1：23-24(2005))。因此，藉由減少基於石油之方法以及使用較少能量及資本密集型方法的替代方式來產生大量化學品或其中間物的方法為有益的。基於生物方法產生化合物之能力可提供一該種替代方式。然而，化合物之完全生物合成並不總能獲得，且在某些情況下對宿主生物體具毒性。
基於低成本可再生資源之化學品製造作為基於石油之原料(諸如丙烯或丁烷)之可能替代為化學品製造之另一替代。然而，為使該等資源代替目前製造方法，需要為各種資源及/或靶化學品研發新化學或生物合成法。
因此，對降低使用丙烯酸及其衍生物之基於石油之合成的組合物及方法存在需要。本發明滿足此需要且同樣提供相關優勢。
本發明提供產生丙烯酸之方法。該方法包括在交叉複分解轉化催化劑存在下使反丁烯二酸與足量乙烯接觸以每莫耳反丁烯二酸產生約兩莫耳丙烯酸。亦提供丙烯酸酯。該方法包括在交叉複分解轉化催化劑存在下使反丁烯二酸二酯與足量乙烯接觸以每莫耳反丁烯二酸二酯產生約兩莫耳丙烯酸酯。提供聯合反丁烯二酸生物產生與複分解轉化之用於產生丙烯酸或丙烯酸酯的方法之整合製程。亦提供丙烯酸及丙烯酸酯之產生。
圖1為展示經由反丁烯二酸與乙烯之間之交叉複分解合成丙烯酸之示意圖(流程1)。
圖2為展示經由反丁烯二酸二酯與乙烯之間之交叉複分解合成丙烯酸酯之示意圖(流程2)
圖3為展示經由反丁烯二酸生物合成由葡萄糖產生丙烯酸之整合生物產生系統之示意圖。
圖4為展示丙烯酸乙酯之產率隨功能複分解催化劑而變化之條形圖。
本發明係關於丙烯酸與其衍生物之合成法。該方法提供每莫耳反丁烯二酸反應物產生兩莫耳丙烯酸產物之有效方法。本發明之化學合成法可與反丁烯二酸或反丁烯二酸酯之生物產生相聯合以有效利用碳，其中一莫耳碳源(諸如葡萄糖)可產生達至四莫耳丙烯酸。將化學合成步驟與反應物中間物之生物產生聯合之另一特別有用的結果為其避免對產生生物體具有可由丙烯酸或丙烯酸酯之完全生物合成產生的潛在毒性效應。
在一特定實施例中，本發明係關於由反丁烯二酸或反丁烯二酸二酯化學合成丙烯酸或丙烯酸酯。該方法利用交叉複分解轉化以於反丁烯二酸與乙烯之間交換雙鍵，每莫耳反丁烯二酸產生兩莫耳丙烯酸。關於丙烯酸酯之形成，使用交叉複分解轉化來將一莫耳反丁烯二酸二酯轉化為兩莫耳丙烯酸酯。酯基可包括多種不同化學部分。
在另一特定實施例中，本發明係關於將產生反丁烯二酸之微生物體與丙烯酸或丙烯酸酯之化學合成聯合的方法。產生反丁烯二酸之微生物體含有一組必需將反丁烯二酸產生與生長聯合之代謝修飾。培養基或醱酵肉湯中之反丁烯二酸可藉由與乙烯之交叉複分解而直接轉化為丙烯酸，或首先分離，且隨後轉化。在生物合成之反丁烯二酸二酯化後產生丙烯酸酯。
本文中所使用之術語"丙烯酸"意指具有化學式C3H4O2，分子質量為72.06g/mol，熔點為12℃且沸點為139℃之羧酸。丙烯酸為可溶於(例如)水中且可於(例如)醇、醚及氯仿中完全混溶之透明無色液體。丙烯酸為具有雙鍵及羧基之最簡單不飽和羧酸。於此項技術中亦已知丙烯酸為2-丙烯酸、丙烯酸(propenoic acid)、丙烯酸(acroleic acid)、
乙烯羧酸、丙烯酸(propene acid)及乙烯基甲酸。術語意欲包括丙烯酸根離子及丙烯酸之鹽形式。
本文中所使用之術語"丙烯酸酯"意指由丙烯酸之酯形式。酯係由通用化學式RCO2R'表示，其中R及R'可為相同或不同的，且可為脂族或芳族且其中脂族或芳族部分可經取代或未經取代。對於丙烯酸酯而言，R對應於酯之乙烯基(CH2=CH)部分。
本文中所使用之術語"反丁烯二酸"意指具有化學式C4H4O4，分子質量為116.07g/mol，熔點為287℃，且具有白色固體外觀之二羧酸。反丁烯二酸可溶於(例如)水及醇中，且一般已知在克雷布斯氏循環(Krebs cycle)及各種醱酵法中為L-蘋果酸鹽之前驅物。在此項技術中亦已知反丁烯二酸為(E)-丁烯二酸，反-1,2-乙烯二羧酸、2-丁烯二酸、反丁烯二酸(allomaleic acid)、富馬酸(boletic acid)及地衣酸(lichenic acid)。術語意欲包括反丁烯二酸根離子及反丁烯二酸之鹽形式。
本文中所使用之術語"反丁烯二酸酯"意指反丁烯二酸之酯形式，其中通用化學式RCO2R'中之R對應於反丁烯二酸部分且R'可為相同或不同的，且可為脂族或芳族的且其中脂族或芳族部分可為經取代或未經取代的。由於反丁烯二酸為二羧酸，故反丁烯二酸酯可在任一羧基或兩個羧基上包括R'部分。具有兩個羧基皆縮合於酯中之反丁烯二酸酯在本文中稱作"反丁烯二酸二酯"且可由通式R1O2CRCO2R2來表示，其中R對應於亞乙烯基(CH=CH)部分，且R、R1及R2可為相同或不同的且可為脂族或芳族。
本文中所使用之術語"乙烯"意指具有式C2H4，分子量為28.05g/mol，熔點為-169.1℃且沸點為-103.7℃之化合物。乙烯為於水中展現溶解性之無色可燃氣體。於此項技術中亦已知乙烯(Ethylene)為乙烯(ethene)。
本文中所使用之術語"複分解轉化"、"交叉複分解轉化"或其語法上等效形式意指通常涉及在類似相互作用化學物質之間交換化學鍵使得產物中之鍵接親和性與反應物中之彼等親和性大體上相同或大體上類似的雙分子法。複分解轉化可由以下通用反應示意地表示：RCH=CHR+R'CH=CHR'→RCH=R'CH+RCH=R'CH。當關於將反丁烯二酸或反丁烯二酸酯或二酯分別化學轉化為丙烯酸、丙烯酸酯或2丙烯酸酯使用時，術語意指於反丁烯二酸、反丁烯二酸酯或反丁烯二酸二酯與烯烴基團之間交換雙鍵。複分解轉化於此項技術中熟知且可發現其係描述於(例如)Grubbs，R.H.Olefin Metathesis.Tetrahedron 60：7117-40(2004)及R.H.Grubbs，Handbook of Metathesis，Wiley-VCH，New York，2003中。
本文中所使用之術語"二酯化"意指用以形成二酯之二羧酸之酯化反應。酯化反應係指縮合反應，其中兩個分子或部分聯合，在(例如)損失諸如水、氯化氫、甲醇或乙酸之小分子下形成單一分子。因此，本發明之反丁烯二酸之二酯化將反丁烯二酸與醇縮合以(例如)在脫水下形成反丁烯二酸二酯。
酯化反應之特定實例包括費希爾酯化(Fisher esterification)，其係指藉由在酸催化劑存在下使羧酸及醇回流而形成酯之方法。於此項技術中熟知用於費希爾酯化之催化劑包括(例如)硫酸、對甲苯磺酸及路易斯酸，諸如三氟甲磺酸鈧(III)。在60-110℃之溫度下，一般反應時間可為約1至10小時而不同。酯化反應為熟習此項技術者所熟知。亦可將除費希爾酯化以外於此項技術中熟知之酯化反應用於本發明之酯化反應中，該等熟知酯化反應諸如在諸如吡啶、第三胺或氫氧化鈉水溶液之鹼存在下，於羧酸氯化物與醇之間的反應。通常將最後的程序稱作肖滕-鮑曼反應(Schotten-Baumann reaction)。可發現包括機理、受質、試劑及條件之酯化反應係描述於(例如)Morrison及Boyd，
Organic Chemistry，第六版，Prentice Hall，New Jersey(1992)；Carey，F.A.及Sundberg，R.J.，Advanced Organic Chemistry，A及B部分，第三版，Plenum Press，New York(1990)，及March's Advanced Organic Chemistry，第5版，2001中。
本文中所使用之術語"酯化試劑"意指適用於酯化反應之化學品。
因此，酯化試劑包括諸如羧酸及/或醇之反應物，以及可包括於化學反應中之催化劑或其他化學上反應性之化合物。當與二羧酸一起使用時，酯化試劑亦包括二酯化試劑。舉例而言，本發明之二羧酸反丁烯二酸之一個羧基處的化學性質與其第二羧基處之化學性質大體上相同。類似地，酯化試劑亦包括可與相同受質上超過兩個羧基反應且形成酯之試劑。反應性化合物之實例為二環己基碳化二醯亞胺，其係用作脫水劑且經由形成二環己基脲促進酯化過程。
本文中所使用之術語"催化劑"意指在無系統中物質量之淨變化下增加化學反應速率之物質。因此，當關於交叉複分解轉化使用時，該術語意指增加雙分子鍵交換之速率，但不於轉化中消耗之物質。一類複分解轉化催化劑之特定實例為描述於下列文獻中之釕複分解催化劑：例如同上文之Grubbs，R.H.；Bai等人，Org.Biomol.Chem.3：4139-42(2005)及Gibson等人，Chem.Comm.，1107-08(1997)。當關於酯化反應(包括二酯化反應)使用時，該術語意指在無消耗下增加縮合反應速率之物質。費希爾酯化之酯化催化劑的特定實例係於以上例示。此等催化劑以及用於各種不同類型之酯化反應中之於此項技術中熟知之其他催化劑係描述於(例如)同上文之March；同上文之Morrison及Boyd；及同上文之Garey,F.A.及Sundberg,R.J.中。
本文中所使用之術語"足量"或其語法上等效形式在關於反應中之化學試劑或關於培養物組份使用時意指可滿足化學反應或所培養微生物體需要之所提及試劑或組份量。舉例而言，催化劑之足量係指足夠
增加所提及化學反應速率之催化劑量。(例如)培養基中碳源之足量係指足夠支持所培養微生物體生長之量。
本文中所使用之術語"非天然"當關於本發明之微生物體或微生物使用時意指具有至少一種通常未見於所提及物種之天然產生品系(包括所提及物種之野生型品系)中之遺傳改變的微生物體。"野生型"或其語法等效物係指可見於自然界中或給定生物體之標準實驗室原料中之生物體之常見基因型或表型，或諸基因型或諸表型。遺傳改變包括(例如)基因缺失或遺傳物質之某種其他功能破壞。遺傳改變亦包括引入編碼代謝多肽之可表現核酸的修飾、其他核酸添加、核酸缺失及/或微生物遺傳物質之其他功能破壞。該修飾包括(例如)所提及物種之異源、同源或異源與同源多肽之編碼區及其功能片段。例示性代謝多肽包括所提及微生物體所使用之一或多個碳源之代謝途徑或吸收途徑內的酶，諸如糖酵解或戊糖磷酸途徑內之酶。
本文中所使用之術語"微生物體"、"微生物"意指以包括於古生菌域、細菌域或真核域內之微觀細胞形式存在之任何生物體。因此，術語意欲涵蓋具有顯微尺寸之原核或真核細胞或生物體，且包括所有物種之細菌、古細菌及真細菌以及諸如酵母及真菌之真核微生物。術語亦包括可經培養用於產生生物化學品之任何物種之細胞培養物。
所分離之微生物體係指大體上不含天然所見形式之所提及微生物體之至少一種組份的生物體。該術語包括以其天然環境中所見形式自一些或所有組份移除之微生物體。該術語亦包括以其於非天然產生環境中所見之微生物體形式自一些或所有組份移除之微生物體。因此，經分離微生物體係以其天然所見形式或以其於非天然產生環境中生長、儲存或固有之形式自其他物質部分或完全分離。所分離之微生物體之特定實例包括部分純微生物體、大體上純微生物體及培養於培養基中之非天然產生之微生物體。
本文中所使用之術語"聯合生長"在關於化合物或生物化學品之生物合成使用時意指所提及分子之生物合成為在微生物體之生長期間產生之必須產物。
本文中所使用之術語"代謝修飾"意指自其天然產生之狀態改變之生物化學反應或輸送過程。代謝修飾可包括(例如)藉由功能破壞編碼參與反應之酶之一或多個基因而消除生物化學反應活性。具有與生長聯合之反丁烯二酸產生之微生物體的例示性代謝修飾組係說明於表1中。該等代謝修飾及其相應基因補體所指定之個別反應係以大腸桿菌為代表性微生物體而例示於表2中。用於此等反應中之反應物及產物係例示於表3中。
本文中所使用之術語"基因破壞"或其語法上之等效物意指致使所編碼基因產物失活之遺傳改變。遺傳改變可為(例如)缺失整個基因；缺失轉錄或轉譯所需調控序列；缺失基因之一部分，產生經截短之基因產物；或藉由使所編碼基因產物失活之各種突變策略中之任一者。一種特別適用之基因破壞法為完整基因缺失，因為其在本發明之非天然產生微生物體中降低或消除遺傳復原(genetic reversion)之出現。
本文中所使用之術語"穩定"當關於聯合生長之生物化學產物之產生使用時意指可在不損失生長與生物化學合成之間之聯合下，培養超過五代之微生物體。一般而言，穩定之與生長聯合之生物化學產生將超過10代，詳言之，穩定之與生長聯合之生物化學產生將超過約25代，且更詳言之，穩定之與生長聯合之生物化學產生將超過50代(包括無定限者)。穩定之與生長聯合之生物化學產生可(例如)藉由在一組代謝修飾內缺失編碼催化各反應之酶之基因而達成。與生長聯合之生物化學產生之穩定性可經由多個缺失而增強，顯著降低了各破壞活性發生多個補償性復原的可能性。
熟習此項技術者將瞭解，本文中所例示之代謝修飾係關於大腸
桿菌基因及其相應代謝反應來描述。然而，在給定多種生物體之完全基因組定序及染色體組領域中之高水準技術之情況下，熟習此項技術者將易於能夠將本文中所提供之教示及指導用於基本上所有其他有機體。舉例而言，本文中所例示之大腸桿菌代謝改變可易於藉由於其他物種中併入相同或類似基因破壞而應用於其他物種中。該等破壞可包括一般而言(例如)物種同系物之遺傳改變，且詳言之直系同源物、旁系同源物或非直系同源物基因替代。
直系同源物為藉由垂直傳遞而相關且於不同生物體內造成大體上相同功能的基因。舉例而言，對於環氧化物水解之生物學功能而言，可認為小鼠環氧化物水解酶及人類環氧化物水解酶為直系同源物。基因在(例如)其共有足以指示其為同源之量之序列類似性時係藉由垂直傳遞相關，或藉由自共同祖先進化而相關。若基因共有三維結構，但在主要序列類似性不可鑑別之程度上不一定共有足以指示其係自共同祖先進化之量的序列類似性，則亦可認為基因為直系同源物。為直系同源物之基因可編碼具有約25%至100%胺基酸序列一致性之序列類似性的蛋白質。編碼共有小於25%之胺基酸類似性之蛋白質的基因若其三維結構亦展示類似性則認為其亦係藉由垂直傳遞產生。認為絲胺酸蛋白酶之酶家族成員(包括組織纖溶酶原活化因子及彈性蛋白酶)係藉由自共同祖先垂直傳遞而產生。
直系同源物包括經由(例如)進化而在結構或總體活性上偏離之基因或其所編碼之基因產物。舉例而言，當一種物種編碼展現兩種功能之基因產物時且當該等功能已分離至第二物種中之不同基因中時，則認為該三種基因及其相應產物為直系同源物。對於聯合生長之生物化學產物之產生而言，熟習此項技術者將瞭解選擇具有待破壞之代謝活性之直系同源物基因來建構非天然產生之微生物體。展現可分離之活性之直系同源物實例為在兩種或兩種以上物種之間或在單一物種內，
不同活性已分離至不同基因產物中之情況。特定實例為將彈性蛋白酶蛋白質水解及纖溶酶原蛋白質水解(兩種類型之絲胺酸蛋白酶活性)分離至如纖溶酶原活化因子及彈性蛋白酶之不同分子中。第二實例為分離支原體5'-3'外切核酸酶與果蠅DNA聚合酶III活性。可將來自第一物種之DNA聚合酶認作是來自第二物種之外切核酸酶或聚合酶中任一者或兩者之直系同源物，且可將來自第二物種之外切核酸酶或聚合酶之任一者或兩者認作是來自第一物種之DNA聚合酶的直系同源物。
與此相反，旁系同源物係藉由(例如)複製，隨後進化趨異而相關且具有類似或常見但不相同之功能。旁系同源物可源自或衍生自(例如)相同物種或不同物種。舉例而言，可將微粒體環氧化物水解酶(環氧化物水解酶I)與可溶環氧化物水解酶(環氧化物水解酶II)認為是旁系同源物，因為其表示自共同祖先共同進化，催化不同反應且在相同物種中具有不同功能之兩種不同酶。旁系同源物為彼此具有顯著序列類似性來表明其為同源，或經由自共同祖先共同進化而相關之來自相同物種的蛋白質。旁系同源物蛋白質家族組包括HipA同系物、螢光素酶基因、肽酶及其他。
非直系同源物基因替代為來自一個物種之可取代不同物種中所提及之基因功能的非直系同源物基因。取代包括(例如)能夠於來源物種中進行與不同物種中所提及之功能相比大體上相同或類似之功能。儘管，一般而言，可將非直系同源物基因替代鑑別為結構上與編碼所提及功能之已知基因相關，然而結構上較低相關但功能上類似之基因及其相應基因產物仍在本文所使用之術語含義之內。功能類似性需要(例如)與編碼設法取代之功能之基因相比在非直系同源物基因之活性位點或結合區中具有至少一些結構類似性。因此，非直系同源物基因包括(例如)旁系同源物或無關基因。
因此，在鑑別及建構具有聯合生長之生物化學品產生的本發明
非天然產生之微生物體中，熟習此項技術者將瞭解藉由將本文中所提供之教示及指導應用於特定物種中，代謝修飾之鑑別應包括直系同源物之鑑別及破壞。在旁系同源物及/或非直系同源物基因替代係存在於編碼催化類似或大體上類似之代謝反應之酶的所提及微生物體中的程度上，熟習此項技術者亦可消除此等進化相關基因以確保酶活性中任何功能性冗餘不阻礙所設計之代謝修飾。
直系同源物、旁系同源物及非直系同源物基因替代可由熟習此項技術者所熟知之方法確定。舉例而言，檢視兩個多肽之核酸或胺基酸序列將揭示所比較序列之間之序列一致性及類似性。基於該等類似性，熟習此項技術者將確定該類似性是否足夠高來指示蛋白質係經由自共同祖先進化而相關。熟習此項技術者所熟知之演算法(諸如Align、BLAST、Clustal W及其他)比較且測定原始序列類似性或一致性，且亦確定序列中間隙之存在或顯著性，其可經賦予權數或計分。該等演算法亦於此項技術中已知且類似地適用於測定核苷酸序列類似性或一致性。基於用於計算統計類似性之熟知方法，或於隨機多肽中發現類似匹配之機會及所測定匹配之顯著性來計算類似足以測定相關性之參數。若需要，兩個或兩個以上序列之電腦比較亦可由熟習此項技術者目視而最佳化。可預期相關基因產物或蛋白質具有較高類似性，例如25%至100%之序列一致性。無關蛋白質可具有與若掃描足夠大小之資料庫則可預期偶然發生之情況基本上相同的一致性(約5%)。5%與24%之間之序列可代表或可不代表足以推斷所比較序列相關之同源性。可在給予資料組大小下進行測定該等匹配顯著性之額外統計分析來測定此等序列之相關性。
使用BLAST演算法測定兩個或兩個以上序列相關性之例示性參數(例如)可於以下列出。簡言之，胺基酸序列比對可使用BLASTP版本2.0.8(Jan-05-1999)及以下參數進行：矩陣：0 BLOSUM62；間隙開
口：11；間隙延伸：1；x_dropoff：50；預期值：10.0；字長：3；過濾器：開。核酸序列比對可使用BLASTP版本2.0.6(Sept-16-1998)及以下參數進行：匹配：1；錯配：-2；間隙開口：5；間隙延伸：2；x_dropoff：50；預期值：10.0；字長：11；過濾器：關。熟習此項技術者已知可對以上參數進行何種改進來(例如)增加或減低比較之嚴格性且測定兩個或兩個以上序列之相關性。
本文中所使用之術語"原料"係指在工業製程中用作原材料之物質。當關於微生物體之培養(諸如使用細胞之醱酵過程)使用時，該術語係指用以向細胞供應碳或其他能量來源之原材料。"可再生"原料係指可再生能量來源，諸如源自活生物體之材料或其代謝副產物，包括如麩殼或乾草之源自生物質之材料，其通常係由未充分利用之組份組成。特別生長用作可再生原料之農產品(例如)在美國主要包括玉米、大豆、柳枝稷及諸如白楊之樹；在歐洲主要包括小麥、亞麻子及油菜籽；在巴西主要包括甘蔗，且在東南亞主要包括棕櫚油。因此，該術語包括全球源自農產品或畜產品之碳水化合物、脂肪及蛋白質組。
本文中所使用之術語"生物質"意指任何源自植物之有機物。基於可持續之基礎，可用於能量之生物質包括草本及木質能源作物、農業食物及飼料作物、農作物廢料及殘餘物、樹木廢料及殘餘物、水生植物及包括一些城市廢水之其他廢料。生物質原料組合物、用途、分析程序及理論產率可易於自美國能源部獲得且可發現其描述於(例如)包括描述超過150個例示性種類之生物質來源之資料庫的URL 1.eere.energy.gov/biomass/information_resources.html中。可於本發明方法中用作原料之例示性生物質種類包括纖維素生物質、半纖維素生物質及木質素原料或原料部分。該等生物質原料含有(例如)適用作碳源之碳水化合物受質，諸如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖及澱粉。術語"生物質"亦可用以指微生物群體，例
如在醱酵過程期間及之後醱酵槽之總微生物群體。
本發明提供產生丙烯酸之方法。該方法包括在交叉複分解轉化催化劑存在下使反丁烯二酸與足量乙烯接觸以每莫耳反丁烯二酸產生約兩莫耳丙烯酸。
烯烴複分解及交叉複分解為烯烴碳-碳鍵及分子間碳-碳雙鍵形成之化學合成研究的一種嘗試(同上文之Grubbs；同上文之Bai等人及同上文之Gibson等人)。然而，此等努力取得不同成功。反應物之化學結構、取代基、立體化學及pKa引起不同結果(參見例如Chatterjee等人J.Am.Chem.Soc.125：11360-70(2003))。即使對於緊密相關之分子而言，亦僅在窮盡實驗途徑後才獲得可預測性。
將反丁烯二酸及丙烯酸歸類為烯烴，因為其不飽和烴結構具有通式CnH2n。未經由烯烴交叉複分解達成丙烯酸或其酯形式之化學合成。然而，與此相反，已報導順丁烯二酸二甲基酯(反丁烯二酸二甲基酯之順式異構體)在與乙烯之烯烴複分解中展現較低反應性。(Fomine,S.及Tlenkopatchev,M.A.，J.Org.Chem.691：5189-96(2006))。此外，已報導反丁烯二酸二甲基酯在交叉複分解中不向末端烯烴反應。(同上文之Chatterjee等人)。不受縛於理論，一般瞭解烯烴複分解大體上為可逆過程，且因此特定交叉複分解之產物通常反映取決於各種產物及起始材料之相對熱力學能量之統計分布。在此方面，熟習此項技術者將認識到將反丁烯二酸(或其二酯)轉化為丙烯酸(或其酯)之額外挑戰。實際上，丙烯酸酯至反丁烯二酸酯之二聚化為眾所熟知。
用於本發明之丙烯酸合成之反應物為反丁烯二酸，其為一種具有約3.0及4.5之pKa之二羧酸。已知二元酸之交叉複分解未經報導。因此，基於產生烯烴交叉複分解之歷史研究過程，反丁烯二酸至丙烯酸之本發明交叉複分解轉化為未預期的。使用乙烯而非末端烯烴可正
性影響烯烴受質之交叉複分解，因為攜帶鏈之催化劑[Ru=CH2]將含有在空間上妨害最小之連接至釕催化劑之次甲基配位體，從而提供高效催化作用(參見例如Lloyd-Jones等人，Chemie，Int.編，44，7442-7(2005))。
本發明之丙烯酸合成法利用反丁烯二酸與乙烯之間之交叉複分解。反丁烯二酸為於碳C-2與C-3之間具有雙鍵之二羧酸。與乙烯之交叉複分解將此二羧酸分裂為兩個分子，其中在各新丙烯酸分子中最後形成雙鍵。最後結果為如圖1所示，每莫耳反丁烯二酸反應物形成兩莫耳丙烯酸。儘管除乙烯以外反丁烯二酸交叉複分解亦可使用多種烯烴進行，但包含乙烯在每莫耳反丁烯二酸形成兩莫耳丙烯酸下產生碳-碳雙鍵。由於兩種反應物皆為對稱的，故僅形成單一產物(丙烯酸)。
說明將反丁烯二酸轉化為兩莫耳丙烯酸之交叉複分解轉化之例示性反應係展示如下。簡言之，具有下式之丙烯酸
可藉由使具有下式之反丁烯二酸
與乙烯在烯烴複分解催化劑存在下反應得到式I之丙烯酸而製造。
可使用於此項技術中已知之各種合成法及催化劑來進行反丁烯二酸與乙烯之間之交叉複分解。例示性程序及催化劑包括(例如)彼等描述於(例如)下列文獻中之程序及催化劑中之任一者：同上文
Grubbs；同上文之Bai等人；同上文之Gibson等人及Dias等人，J.Am.Chem.Soc.，119：3887-3897(1997)。該等程序可包括(例如)0-100℃範圍內之反應溫度，約2-10範圍內之pH值及包括(例如)二氯甲烷、二氯乙烷、醇、水、其他水溶液、醇/水混合物及其類似物之各種溶劑。
特別適用之催化劑包括釕種類複分解催化劑內之各種不同物質。例示性基於釕之催化劑包括(例如)不含膦之釕碳烯錯合物(諸如烷氧基醯亞胺基亞烷基鉬、亞苄基釕及醚繫栓之亞烷基釕衍生物)；由最新金屬鹽製備之具有活性雙(三苯膦)-二氯釕亞烷基錯合物，重氮化合物、釕亞苄基錯合物、三氯化釕之穩定16e釕碳烯錯合物。不含膦之碳烯釕催化劑之特定實例為[1,3-雙(2,6-二甲基苯基)4,5-二氫咪唑-2-亞基]C5H5N)2(Cl)2Ru=CHPh，其為雙吡啶錯合物。基於釕之催化劑之另一特定實例為Cl2(PCy3)2Ru=CHPh。
適用於本發明之合成法之交叉複分解催化劑的其他實例包括(例如)高氧化狀態最新金屬錯合物，諸如彼等描述於下列文獻中之錯合物：Tebbe等人，J.Am.Chem.Soc.，101：5075(1979)Wengrovius等人，J.Am.Chem.Soc.，102：4515(1980)及Osborn等人，Chem.Commun.，431-432(1980)；鈦亞甲基錯合物或Tebbe試劑(Pine等人，J.Am.Chem.Soc.，102：3270(1980))；不對稱Tebbe錯合物(Howard等人，J.Am.Chem.Soc.，102：6876(1980))；金屬環丁烷(Kress等人，J.Am.Chem.Soc.，109：899(1987)；Wengrovius等人，J.Am.Chem.Soc.，102：4515-4516(1980)及Quignard等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，31(5)：628-631(1992))；及/或含有龐大醯亞胺基配位體之鎢及鉬亞烷基錯合物(Schrock等人，J.Am.Chem.Soc.，110：1423-1435(1988))。
可例示(但不限於)以下適用於本發明之烯烴交叉複分解反應之額外催化劑：
選擇用於本發明之交叉複分解反應之最佳催化劑可易於由熟習此項技術者進行。舉例而言，可藉由在乙烯存在下接觸反丁烯二酸、反丁烯二酸單酯或反丁烯二酸二酯受質，且量測丙烯酸或丙烯酸酯產物形成速率來選擇具有於特定溶液、pH值及/或溫度下具有所需活性之催化劑。可為最佳活性篩檢以上所例示之催化劑中任一者以及於此項技術中已知之其他者。選擇一或多種最佳催化劑可有益於鑑別展現增強之催化速率之交叉複分解催化劑。
本發明之交叉複分解合成法亦可與反丁烯二酸酯或反丁烯二酸二酯及乙烯一起採用以產生丙烯酸酯。在前者反應中，與反丁烯二酸單酯之交叉複分解將每莫耳反丁烯二酸單酯產生一莫耳丙烯酸及一莫
耳丙烯酸酯。在後者反應中，最後結果為如圖2所示，每莫耳反丁烯二酸二酯反應物形成兩莫耳丙烯酸酯。
說明將反丁烯二酸酯轉化為兩莫耳丙烯酸酯之交叉複分解轉化之例示性反應係展示如下。簡言之，具有下式之丙烯酸酯
(其中R表示具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，其中該烷基可視情況且獨立經具有1至10個碳原子之烷基取代；苯基；苯烷基；胺基；羥基；具有1至10個碳原子之烷胺基；及具有1至10個碳原子之烷氧基或R表示具有3至6個環碳原子之環烷基，其中該等環碳原子可視情況及獨立經具有1至6個碳原子之烷基及羥基取代)可藉由使具有下式之反丁烯二酸二酯
(其中R係如上所定義)與乙烯在烯烴複分解催化劑存在下與乙烯反應得到式III之丙烯酸酯而製造。
在給出本文中所提供之教示及指導之情況下，熟習此項技術者將瞭解本發明之反丁烯二酸、反丁烯二酸二酯、丙烯酸及丙烯酸酯可經脂族及/或芳族部分進一步取代。舉例而言，反丁烯二酸二酯之C-2及C-3碳可經甲基取代。在此特定實施例中，與乙烯之交叉複分解將產生甲基丙烯酸酯。以相同方式，C-2及/或C-3亦可經(例如)其他烷基(諸如乙基、丙基或丁基)取代，且經受交叉複分解而產生相應經烷基取代之丙烯酸酯。熟習此項技術者將瞭解相應複分解轉化亦可與經類
似取代之反丁烯二酸進行。熟習此項技術者亦將瞭解上述經脂族及/或芳族取代之部分自身可另外經進一步取代。
除進一步取代上述之本發明之反丁烯二酸、反丁烯二酸二酯、丙烯酸及丙烯酸酯以外，熟習此項技術者亦應瞭解乙烯複分解反應物亦可經進一步取代。就此而言，可將多種經二取代之烯烴用於本發明之交叉複分解反應中以產生除丙烯酸或丙烯酸酯以外之化合物。該等經二取代之烯烴可由化學式RCH=CHR'表示，其中R及R'可為相同或不同化學部分，包括氫及任何直鏈或分支鏈烷基。該經二取代烯烴之特定實例為2-丁烯。例如與反丁烯二酸之交叉複分解，當R為氫時，產物為丙烯酸。比較而言，當R為甲基時，產物為丁烯酸(crotanoic acid)。
可藉由此項技術中熟知之各種酯化法來產生反丁烯二酸單酯及反丁烯二酸二酯。適用之酯化法為在無機酸(諸如硫酸或無水氯化氫)存在下以醇處理反丁烯二酸。儘管醇之選擇係由所需酯或二酯類型決定，但應理解本發明涵蓋第一、第二或第三脂族或芳族經取代或未經取代之醇。熟習此項技術者可知或可輕易決定可選擇何種醇或醇類用於特定類型之酯或二酯。
特別適用之酯化法為具有下式之反丁烯二酸
在無機酸存在下以具有式ROH之醇處理，其中R表示具有1至10個碳原子之直鏈或分支鏈烷基，其中該烷基可視情況且獨立經具有1至10個碳原子之烷基取代；苯基；苯烷基；胺基；羥基；具有1至10個碳原子之烷胺基；及具有1至10個碳原子之烷氧基，或R表示具有3至6個環碳原子之環烷基，其中該等環碳原子可視情況及獨立經具有1
至6個碳原子之烷基及羥基取代。
儘管以上酯化法描述在無機酸存在下以醇處理反丁烯二酸來產生反丁烯二酸二酯，但亦應瞭解可將反丁烯二酸轉化為酸氯化物，接著酸氯化物可經醇處理以產生酯或二酯。與直接酯化法相比，此兩步驟反應之一個益處為避免直接酯途徑之逆轉。
本發明亦提供產生丙烯酸之方法。該方法包括：(a)在足量營養素及培養基中培養一種非天然產生的微生物體，其具有一組將反丁烯二酸產生與微生物體生長強制偶合之代謝修飾，該代謝修飾組包括破壞具有：(1)fumABC、zwf、purU或(2)fumABC、zwf、glyA或其直系同源物之基因組中至少一者，以產生穩定之與生長偶合之反丁烯二酸產生；及(b)在交叉複分解轉化催化劑存在下使反丁烯二酸與足量乙烯接觸以每莫耳反丁烯二酸產生約兩莫耳丙烯酸。
本發明之另一實施例包括以整合製程將反丁烯二酸受質生物合成與丙烯酸或丙烯酸酯之化學合成聯合。圖3說明由反丁烯二酸受質生物合成整合產生丙烯酸之一種方法。熟習此項技術者將瞭解，儘管經由諸如醱酵之生物製程之受質產生與經由一或多種化學合成程序之最終產物製造的整合在本文中係關於反丁烯二酸之生物合成來說明，但在給出本文中所提供之教示及指導之情況下，可使用本發明方法來完成一或多種中間物之生物合成與最終產物之化學合成的任何組合及改變。在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者亦將瞭解可於一或多種中間物至最終產物之合成中利用化學合成步驟。類似地，熟習此項技術者亦可採用遺傳修飾及生物合成來實現反丁烯二酸至丙烯酸之轉化。因此，展示於圖3中，說明使用反丁烯二酸作為中間受質自葡萄糖碳源至丙烯酸之生物合成之整合製程為例示性的。因此，可在本發明方法中採用致使反丁烯二酸產生增加之致使經由糖酵解、TCA或其他代謝途徑中之任何部分進入及流出的遺傳修
飾來產生本發明之丙烯酸及丙烯酸酯。
本發明整合製程之適用實施例為經遺傳工程設計之產物(其為烯烴複分解之受質或中間物)之生物產生。就此而言，經修飾用以生物合成特定產物之非天然產生生物體之醱酵作用為諸如反丁烯二酸及其他烯烴之化合物的特別適用來源。在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者應瞭解本文中關於烯烴反丁烯二酸及至丙烯酸之交叉複分解轉化所例示之整合製程可等同地應用於產生基本上任何所關注之烯烴。可將該等烯烴與複分解轉化聯合來化學合成多種其他烯烴。熟習此項技術者亦將瞭解將藉由(例如)烯烴受質醱酵作用之生物產生與複分解轉化聯合之整合製程亦可用於產生烯烴中間物。可將中間物化學轉化為可用作烯烴複分解受質之烯烴。
將生物產生(諸如醱酵)之烯烴產物與烯烴複分解聯合之特定實例為烯烴反丁烯二酸之產生及至丙烯酸及先前所述之其他化合物之交叉複分解。將生物產生(諸如醱酵)以產生中間物之產物與烯烴複分解聯合的特定實例係如下例示。該等中間物至烯烴之化學轉化產生適用於烯烴複分解之受質，且亦可以如先前所述及如下所述之整合製程來進行。舉例而言，3-羥基丙酸(3-HP)可藉由使產生3-HP之微生物體醱酵而產生且經脫水為烯烴丙烯酸。可使丙烯酸經受與所關注烯烴之複分解以產生所需烯烴產物。類似地，亦可使用本文中所提供之教示及指導，藉由醱酵來產生2,3-丁烷二醇。可使2,3-丁烷二醇中間物進一步脫水為丁二烯，可將丁二烯用作烯烴受質來經由複分解轉化產生多種烯烴產物。
因此，本發明提供用於產生烯烴之方法。該方法包括：(a)藉由於足量之營養素及培養基中醱酵來培養產生第一烯烴之微生物體，且(b)使第一烯烴與足量之經二取代烯烴在烯烴複分解轉化催化劑存在下接觸以產生第二不同烯烴。經二取代之烯烴可為乙烯。微生物體可
為(例如)非天然產生之微生物體，諸如經遺傳工程設計來產生第一烯烴之生物體；或天然產生之微生物體，諸如天然產生第一烯烴之生物體。
本發明另外提供用於產生烯烴之方法。該方法包括：(a)藉由於足量之營養素及培養基中醱酵來培養產生烯烴中間物之微生物體；(b)進行化學修飾以將該烯烴中間物轉化為第一烯烴，且(c)使第一烯烴與足量之經二取代烯烴在烯烴複分解轉化催化劑存在下接觸以產生第二不同烯烴。化學修飾可為(例如)脫氫。經二取代之烯烴可為乙烯。微生物體可為(例如)非天然產生之微生物體，諸如經遺傳工程設計來產生烯烴中間物之生物體；或天然產生之微生物體，諸如天然產生烯烴中間物之生物體。
說明於圖3中之步驟1例示反丁烯二酸之生物產生，反丁烯二酸係衍生自TCA循環且為中心細胞代謝之常見中間物。中心代謝物為特別適用之代謝工程設計靶，因為其通常在基礎代謝期間組成性產生。
說明於圖3中之整合製程之步驟2例示聯合如先前所述且展示於圖1中之涉及乙烯的烯烴交叉複分解。在一實施例中，將反丁烯二酸之生物產生與交叉複分解偶合係藉由直接添加所選交叉複分解催化劑及乙烯至反丁烯二酸培養物或醱酵肉湯中來進行。該直接偶合為一種有效及改進型丙烯酸製造過程。已展示基於釕催化劑之烯烴複分解在水中良好進行(參見例如Lynn等人，J.Am.Chem.Soc.，118：784-90(1996)及Lynn等人J.Am.Chem.Soc.120：1627-28(1998))。在另一實施例中，可將反丁烯二酸自培養基或醱酵肉湯分離，且分別與交叉複分解催化劑及乙烯反應以合成丙烯酸。
將反丁烯二酸之生物合成與和乙烯之化學交叉複分解轉化整合以(例如)產生丙烯酸格外適用，因為其致使高度有效地將受質碳(例如葡萄糖或蔗糖)轉化為所需產物(例如丙烯酸)。類似地，將反丁烯二酸
酯化(包括二酯化)為反丁烯二酸單酯或反丁烯二酸二酯之聯合亦產生相同碳利用效率。舉例而言，來自1莫耳進入糖酵解代謝途徑之葡萄糖之碳提供兩莫耳磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，使磷酸烯醇丙酮酸與二氧化碳經由PEP羧化酶反應以產生最大理論產率之約2.0莫耳反丁烯二酸。在與乙烯交叉複分解後，每一莫耳反丁烯二酸產生兩莫耳丙烯酸，產生將一莫耳葡萄糖及2.0莫耳乙烯轉化為達至四莫耳丙烯酸之方法。
說明於圖3中之本發明整合製程之另一特別適用的屬性為可避免在藉由醱酵由葡萄糖直接產生丙烯酸中所遇的任何熱力學限制以及丙烯酸對宿主生物體可能之毒性。本發明之整合製程生物上產生反丁烯二酸(其為正常代謝中間物)且接著以後培養或後醱酵步驟將反丁烯二酸轉化為丙烯酸，從而避免將產生有機物暴露於(例如)致命之醱酵產物。
在一實施例中，可用於本發明整合製程中之產生反丁烯二酸之微生物體包括天然產生反丁烯二酸之經分離生物體。在另一實施例中，產生反丁烯二酸之微生物細胞可經遺傳工程設計來增強反丁烯二酸之表現。特別適用的工程設計微生物體包括將生物體生長與產物生物合成聯合之代謝修飾。對於本發明丙烯酸及/或丙烯酸酯之整合產生方法而言，生物合成產物為反丁烯二酸。
與生長偶合之反丁烯二酸產生可藉由(例如)鑑別強制性將反丁烯二酸與生長偶合之代謝修飾而完成。可用以回應遺傳改變精確預測生物特性之特別適用方法包括矽中法(in silico method)，諸如彼等於以下進一步例示，且描述於(例如)美國專利公開案US 2002/0012939、US 2003/0224363、US 2004/0029149、US 2004/0072723、US 2003/0059792、US 2002/0168654及US 2004/0009466及美國專利第7,127,379號中之方法。該方法包括於矽中建構、最佳化且修飾代謝及
調控網路，包括(例如)鑑別被破壞時強制性將生長與反丁烯二酸產生偶合之基因組。鑑別後，藉由功能破壞基因組中編碼各代謝反應之至少一個基因，而於靶細胞或生物體中進行待破壞之反應組來達成與生長聯合之反丁烯二酸產生。
如先前所述，用以達成反應組之功能破壞之一種特別適用的方式係藉由缺失各編碼基因。然而，在某些情況下，藉由其他遺傳畸變(包括例如突變、缺失諸如調控因子之啟動子或順結合位點之調控區)或藉由在許多位置中之任一處截短編碼序列而破壞反應為有益的。例如當需要快速評定反丁烯二酸聯合或當很少會發生遺傳復原時，產生小於整體之基因組缺失的此等後種畸變可為適用的。熟習此項技術者亦應瞭解，任何分子設計及重組實施(例如)可用以添加、缺失或取代編碼在代謝途徑中之酶之一或多個基因來賦予宿主生物體所需活性。因此，儘管本發明之非天然產生之微生物體在本文中係關於破壞基因以產生強制性將反丁烯二酸與生長偶合之代謝網路而例示，但熟習此項技術者應理解本發明之非天然產生之微生物體亦包括藉由(例如)將一或多種代謝活性引入宿主微生物體中而賦予所需代謝活性之遺傳修飾。
簡言之，關於引入一或多種所需代謝活性，熟習此項技術者將瞭解待引入之可表現形式之編碼核酸數將與待建構之靶途徑之缺乏相當。因此，用於本發明之整合製程之一或多個宿主微生物體可具有編碼組成靶產物生物合成途徑之酶之一個、兩個、三個、四個、五個或六個編碼核酸。在某些實施例中，宿主微生物體亦可包括促進靶產物生物合成或使靶產物生物合成最佳化或賦予宿主微生物體其他適用功能之其他遺傳修飾。
可用於產生各種代謝修飾(包括例如表現異源代謝多肽)，實現代謝基因之標靶破壞或用於本文中所例示之其他重組工程設計修飾的編
碼核酸來源可包括(例如)所編碼基因產物能夠催化所提及之反應或活性之任何物種。該等物種包括原核生物及真核生物，包括(但不限於)細菌、古細菌、真細菌、動物、哺乳動物(包括人類)。
可(例如)藉由於此項技術中熟知之重組程序及偵測法來進行建構及測試任何非天然產生之微生物體之表現量的方法，該等非天然產生之微生物體包括彼等經修飾來合成編碼多肽以及經破壞基因降低或消除所編碼多肽之表現的構型之微生物體。可發現該等方法係描述於(例如)Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley及Sons，Baltimore，MD(1999)。
採用以上所例示及以下進一步例示之方法，已鑑別強制性將反丁烯二酸之產生與微生物體生長偶合之代謝修飾。使用經鑑別之代謝修飾建構之微生物體品系在指數生長期間產生高含量反丁烯二酸。此等品系可有利地用於在不經受先前所述之負性選擇壓力下以(例如)連續醱酵法商業產生反丁烯二酸。可在整合製程中將該生產與交叉複分解轉化或與二酯化隨後交叉複分解轉化聯合以分別有效地產生丙烯酸及丙烯酸酯。
本發明之非天然產生之微生物體包括細菌、酵母、真菌或可適用於醱酵方法之多種其他微生物體中之任一者。例示性細菌包括選自下列各物之種類：大腸桿菌、產琥珀酸厭氧螺菌(A.succiniciproducens)、琥珀酸放線桿菌(A.succinogenes)、產琥珀酸曼氏桿菌(M.succiniciproducens)、菜豆根瘤菌(R.etli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、麩胺酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)、運動醱酵單胞菌(Zymomonas mobilis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳酸桿菌
(Lactobacillus plantarum)、天藍色鏈黴菌(Streptomyces coelicolor)、丙酮丁醇梭桿菌(Clostridium acetobutylicum)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)及惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。例示性酵母包括選自下列各物之種類：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克西安克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)、土麴菌(Aspergillus terreus)、黑麴菌(Aspergillus niger)、少根根黴(Rhizopus arrhizus)、米根黴(Rhizopus oryzae)及巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)。關於以下進一步描述之本發明之整合製程，由於避免任何所需中和步驟且降低與使用不耐受酸之生物體之產酸相關的鹽形成，故耐受低pH值之微生物體特別適用。若此等特徵在產生丙烯酸及/或丙烯酸酯之整合製程中為合乎需要的，則可使用耐受約3.0或更低pH值之微生物體。然而，亦可使用耐受約6.0、5.5、5.0、4.5、4.0或3.5或更低pH值(包括此等例示值之間或以下之所有pH值)之微生物體。
在本文中關於大腸桿菌遺傳背景來例示具有與生長聯合之反丁烯二酸產生之微生物體。然而，藉由目前可用於超過550個物種之完整基因組序列(其中超過一半可在諸如NCBI之公開資料庫上獲得)，包括395個微生物體基因組及各種酵母、真菌、植物及哺乳動物基因組，一或多個基因之替代物種同系物(包括例如直系同源物、旁系同源物及非直系同源物基因替代)之鑑別及生物體之間之遺傳改變互換為常規的且於此項技術中眾所熟知。因此，本文中關於諸如大腸桿菌之特定生物體描述之使能夠與生長聯合產生反丁烯二酸之代謝修飾可易於應用於其他微生物體，包括原核及真核生物體。在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者已知一種生物體中所例示之代謝修飾可同等應用於其他生物體。
舉例而言，可藉由缺失或功能移除一或多個編碼催化本文中稱為FUM之反應之酶的基因，一或多個編碼催化本文中稱作PGDH之反應之酶的基因及一或多個編碼催化本文中稱作FTHFD之反應之酶的基因，將反丁烯二酸產生與大腸桿菌中之指數生長聯合。如表2中所示，編碼催化FUM反應之酶之大腸桿菌基因為fumABC或b1611、b1612及b4122。又，在表2中展示編碼催化PGDH反應之酶之大腸桿菌基因。此PDGH相關基因為gnd或b2029。類似地，編碼催化FTHFD反應之酶之大腸桿菌基因為purU或b1232。為產生展現與生長聯合之琥珀酸鹽產生之代謝工程設計大腸桿菌，編碼催化各FUM、PGDH及FTHFD反應之至少一種酶之基因必需經功能破壞。此等基因之破壞應包括直系同源物。該破壞可(例如)藉由缺失fumAB或C基因(b1611、b1612及b4122)及gnd(b2029)及purU(b1232)基因中之任一者而進行。為於除大腸桿菌以外之細胞或生物體中與生長聯合產生反丁烯二酸，可功能上破壞所關注物種內編碼與FUM、PGDH及FTHFD相當之反應之基因。對於具有類似代謝途徑之彼等生物體而言，該破壞可藉由缺失(例如)與fumAB或C基因(b1611、b1612及b4122)及gnd(b2029)及purU(b1232)基因同源之物種而實現。
如先前所述，該等同系物可包括直系同源物及/或非直系同源物基因替代。在某些情況下，諸如當於所關注物種中存在取代代謝途徑時，可藉由(例如)缺失催化替代對照反應之類似但不相同之代謝反應的旁系同源物而實現。由於不同生物體之間代謝網路中之特定差異，熟習此項技術者應瞭解，不同生物體之間所破壞之實際基因可不同。然而，在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者亦應瞭解本發明方法可應用於所有微生物體來鑑別生物體之間之同源代謝修飾且於所關注物種中建構將增強將反丁烯二酸生物合成與生長聯合之生物體。
一般關於代謝反應、其反應物或產物，或特別關於與所提及之代謝反應、反應物或產物相關之一或多個基因描述本發明之產生反丁烯二酸之生物體。除非本文中另外明確指出，否則熟習此項技術者將瞭解提及反應亦構成提及反應之反應物及產物。類似地，除非本文中另外明確指出，否則提及反應物或產物亦提及反應，且提及此等代謝構成之任一者亦提及編碼催化所提及反應、反應物或產物之酶之基因。同樣，只要在熟知之代謝生物化學、酶學及染色體組領域中，本文中提及基因亦構成提及相應之編碼酶及其催化之反應以及反應之反應物及產物。將涉及於與生長聯合之反丁烯二酸產生中之例示性反應、反應命名法、反應物、產物、輔因子及編碼催化反應的酶之基因列於表1、2及3中。
將在指數生長期間產生高含量反丁烯二酸生物合成之代謝修飾或轉化組例示於表1中。組內各修飾對應於應被功能破壞之必要代謝反應。各組內所有反應之功能破壞致使在生長期間藉由工程設計之品系必須產生反丁烯二酸。將表1中所提及之修飾之相應反應及可能在大腸桿菌中編碼該等反應之基因列於表2中。表3提供表2反應中所提及之反應物、輔因子及產物之完整生物化學名稱。
舉例而言，對於表1中所例示之各品系而言，可產生以用於與生長聯合之反丁烯二酸產生之代謝修飾展示於各列中。此等修飾包括一至六或六個以上反應之功能破壞。詳言之，於表1中例示具有非天然產生代謝基因型之187個品系。此等各非天然產生之修飾在適當培養條件下，與野生型品系相比在微生物體之指數生長期間致使反丁烯二酸產生之含量增強。適當條件包括(例如)以下於實例中進一步例示之彼等條件，諸如特定碳源或反應物可用性及/或適應進化。
在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者應瞭解為破壞酶促反應，必需破壞涉及於反應中之一或多種酶之催化
活性。可藉由多種方式來進行破壞，包括(例如)於一或多個編碼基因序列中缺失編碼基因或併入遺傳改變。經標靶以供破壞之編碼基因可為編碼涉及於催化活性中之酶之基因中的一者、一些或所有。舉例而言，當在標靶之催化活性中涉及單一酶時，可藉由降低或破壞所編碼基因產物之催化活性之遺傳改變而進行破壞。類似地，當單一酶為多聚的(包括雜聚)時，則可藉由降低或破壞所編碼基因產物之一個或所有次單位功能之遺傳改變而進行破壞。活性破壞可藉由損耗一或多個次單位結合活性以形成活性複合物，藉由破壞多聚複合物之催化次單位或藉由此兩種方法來完成。亦可靶向多聚蛋白質締合及活性之其他功能以破壞本發明之代謝反應。該等其他功能為熟習此項技術者所熟知。此外，可根據本發明破壞單一多肽或多聚複合物之一些或所有功能以降低或消除涉及於本發明之反應或代謝修飾中之一或多種酶的催化活性。類似地，可破壞涉及於本發明反應或代謝修飾中之一些或所有酶，只要破壞靶向之反應即可。
在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者亦將瞭解，可藉由降低或消除藉由常見基因及/或藉由彼基因展現類似或大體上相同活性之一或多種直系同源物編碼之反應來破壞酶促反應。常見基因與所有直系同源物皆降低可引起完全消除所靶向反應之任何催化活性。然而，破壞常見基因或一或多種直系同源物可引起足以促進生長與反丁烯二酸生物合成之聯合的所靶向反應催化活性之降低。本文中例示編碼多種代謝修飾之催化活性之常見基因以及其直系同源物。熟習此項技術者將瞭解破壞編碼靶向代謝反應之酶之基因中的一些或所有可以本發明方法實踐且併入本發明之非天然產生之微生物體中以達成與生長聯合之反丁烯二酸產生。
因此，本發明另外提供具有一組強制性將反丁烯二酸產生與該微生物體生長偶合之代謝修飾的非天然產生之微生物體。代謝修飾組
包括破壞編碼催化選自包括以下反應組之各反應之酶的一或多種基因：
(a)FUM(fumABC)、PGDH(gnd)、FTHFD(purU)；(品系A)
(b)FUM(fumABC)、PGDH(gnd)、FTHFD(purU)、ACKr(ackA-pta)；(品系B)
(c)FUM(fumABC)、PGDH(gnd)、GHMT2(glyA)；(品系C)
(d)FUM(fumABC)、PGDH(gnd)、GHMT2(glyA)、GLCpts(ptsG)；(品系D)
(e)FUM(fumABC)、PGDH(gnd)、FTHFD(purU)、GLUDy(gdhA)；(品系E)
(f)FUM(fumABC)、PGDH(gnd)、FTHFD(purU)、THD2(pntAB)；(品系F)
(g)FUM(fumABC)、FTHFD(purU)、THD2(pntAB)、ACKr(ackA-pta)、PGM(yibO)、PGL(ybhE)；(品系G)
其中該微生物體展現穩定之與生長聯合之反丁烯二酸產生。括號中展示編碼負責催化指定反應之酶之基因的常見名稱。
在具有代謝修飾(a)FUM、PGDH、FTHFD；(b)FUM、PGDH、FTHFD、ACKr或(d)FUM、PGDH、GHMT2、GLCPts之非天然產生之微生物體中，fumA、fumB及fumC為編碼可能能夠進行FUM反應之獨立酶的基因。因此，必須移除至少一種及可能所有三種fumA、fumB及fumC來防止FUM分離反丁烯二酸產生與細胞生長。或者，藉由以多基因編碼之蛋白質複合物來進行反應GLCpts。因此，自pts基因簇缺失一個基因或基因組合足以破壞GLCpts反應。
簡言之，關於以上所例示之基因及其與多聚複合物中之其同源次單位之關係，其直系同源物及其基因產物催化之反應，FUM係藉由以b1611、b1612及b4122編碼之酶，PGDH係藉由一個基因b2029(gnd)
產物編碼之酶，且FTHFD活性係藉由purU(b1232)。ACKr係藉由具有直系同源物b3115之一個基因b2296(ackA-pta)之產物編碼。GHMT2係藉由基因：b2551(glyA)產物編碼。GLCpts活性需要藉由九種基因：b2415、b2416、b2417、b1817、b1818、b1819、b1101、b0679及b1621(共同表示為ptsG)編碼之酶次單位。THD2為藉由基因pntA(b1603)及pntB(b1602)編碼之複合物之反應產物。因為反應THD2及GLCpts係藉由以多基因編碼之蛋白質複合物進行，因此自pts及pnt基因簇缺失一個基因或基因組合足以破壞反應。GLUDy係藉由以基因gdhA(b1761)編碼之酶催化。PGM及PGL活性分別為以b3612及b0767編碼之酶之功能。
如上所述，功能破壞上述代謝反應來產生生產反丁烯二酸之微生物體亦可藉由以zwf基因取代gnd基因以消除PGDH反應而完成。採用此基因取代產生以下代謝修飾，該等修飾破壞催化以上關於品系A-G列出之反應的酶：
(a)fumABC、zwf、purU(品系A)
(b)fumABC、zwf、purU、ackA-pta(B)
(c)fumABC、zwf、glyA(C)
(d)fumABC、zwf、glyA、ptsG(D)
(e)fumABC、zwf、purU、gdhA(E)
(f)fumABC、zwf、purU、pntAB(F)
(g)fumABC、pntAB、purU、ackA-pta、yibO、ybhE(G)
可(例如)用以產生生產反丁烯二酸之微生物體之以上例示的品系內兩種常見基因組缺失包括：
(a)fumABC、zwf、purU
(b)fumABC、zwf、glyA。
因此，提供具有一組將反丁烯二酸產生與微生物體生長聯合之
代謝修飾之非天然產生微生物體，其中代謝修飾組包括破壞選自包括以下之基因組的一或多個基因：(a)fumABC、zwf、purU及(b)fumABC、zwf、glyA或其直系同源物，其中微生物體展現穩定之與生長聯合之反丁烯二酸產生。此外提供具有編碼代謝修飾之基因(a)fumABC、zwf、purU之非天然產生之微生物體，該非天然產生之微生物體另外包括破壞選自(1)ackA-pta、(2)gahA、(3)pntAB及(4)ackA-pta、yibO、ythE之至少一種基因。
在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者應瞭解關於適用於本發明方法及製程之非天然產生之微生物體存在多種組合及改變。用於鑑別且設計有利於產物之生物合成之代謝修飾的一種特別適用計算方法為OptKnock計算框架，Burgard等人，Biotechnol Bioeng，84：647-57(2003)。OptKnock為表明產生過度產生靶產物之遺傳穩定微生物體之基因缺失策略的代謝模型及模擬程式。詳言之，該框架檢查完整的微生物體代謝及/或生物化學網路以表明迫使所需生物化學變為細胞生長之必須副產品的遺傳操作。藉由將生物化學產生與細胞生長經由策略性置放基因缺失或其他功能基因破壞而聯合，在生物反應器中較長時段後，對經工程設計品系施加生長選擇壓力由於必需與生長聯合之生物化學產生而致使效能改良。最後，當建構基因缺失時，由於待將OptKnock所選擇之基因自基因組完全移除，故所設計之品系復原為其野生型狀態幾乎不可能。因此，此計算方法學可用以鑑別引起反丁烯二酸之生物合成之替代途徑或與非天然產生之微生物體聯合用於使反丁烯二酸生物合成進一步最佳化。
簡言之，本文中使用術語OptKnock來指用於使細胞代謝模型化之計算法及系統。OptKnock程式係關於在通量平衡分析(FBA)模型中併入特定限制之模型及方法框架。此等限制包括(例如)定性動力學資
訊、定性調控資訊及/或DNA微陣列實驗資料。OptKnock亦計算各種代謝問題之解決方案，例如藉由使經由通量平衡模型衍生之通量界限嚴格化且隨後在基因添加或缺失存在下探測代謝網路之效能範圍。
OptKnock計算框架使得建構模型調配物，使得能夠有效查詢代謝網路之效能範圍且提供解決所得經混合整數線性程式化問題的方法。本文中稱作OptKnock之代謝模型及模擬方法係描述於(例如)2002年1月10日申請之美國專利申請案系列號10/043,440中及2002年1月10日申請之國際專利第PCT/US02/00660號中。
用於鑑別且設計有利於產物之生物合成產生之代謝修飾的另一計算法為稱為SimPheny®之代謝模型及模擬系統。此計算法及系統係描述於(例如)於2002年6月14日申請之美國專利申請系列案第10/173,547號及於2003年6月13日申請之國際專利申請案第PCT/US03/18838號中。
SimPheny®為一種計算系統，其可用以矽中產生網路模型及用以模擬經由生物系統之化學反應之物質、能量或電荷通量來在系統中界定含有化學反應之任何及所有功能性的解空間，藉此測定一系列所允許之生物系統活性。將此方法稱為基於限制之模型化，因為解空間係藉由諸如所包括反應之已知化學計量以及與經由反應之最大通量相關之反應熱力學及容量限制之限制來界定。可查詢藉由此等限制定義之空間來測定生物系統或其生物化學組份之表型能力及行為。可使用如(例如)Schilling等人，J.Theor.Biol.203：229-248(2000)；Schilling等人，Biotech.Bioeng.71：286-306(2000)及Schilling等人，Biotech.Prog.15：288-295(1999)中所述之分析法(諸如凸分析、線性程式化及極端途徑計算)來測定該等表型能力。如以下實例所述，此計算方法學係用以鑑別及分析4-HB非產生微生物體中可行以及最佳4-HB生物合成途徑。
如上所述，用於可適用於本發明之計算程式之一種基於限制的方法為通量平衡分析。通量平衡分析係基於穩態條件中之通量平衡且可如(例如)Varma及Palsson，Biotech.Bioeng.12：994-998(1994)中所述進行。將通量平衡法應用於反應網路來模擬或預測(例如)描述於Fell及Small，J.Biochem.138：781-786(1986)中之脂肪細胞代謝，如Majewski及Domach，Biotech.Bioeng.35：732-738(1990)中所述在ATP最大化條件下自大腸桿菌分泌乙酸鹽，或如Vanrolleghem等人，Biotech.Prog.12：434-448(1996)中所述，藉由酵母分泌乙醇的全身特性。此外，如Edwards及Palsson，Proc.Natl.Acad.Sci.97：5528-5533(2000)；Edwards及Palsson，J.Bio.Chem.274：17410-17416(1999)及Edwards等人，Nature Biotech.19：125-130(2001)中所述，可使用此方法來預測或模擬各種單一碳源上大腸桿菌生長，以及流感嗜血桿菌(H.influenzae)代謝。
在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者將能夠應用用於代謝模型及模擬之各種計算框架來於除大腸桿菌及酵母以外之宿主微生物體中設計及實施反丁烯二酸或其他所需化學受質之生物合成。該等代謝模型及模擬法包括(例如)以上例示為SimPheny®及OptKnock之計算系統。
可將本發明之非天然產生之微生物體用於本發明之整合製程中用於聯合轉化為丙烯酸或二酯化隨後轉化為丙烯酸酯之與生長聯合之反丁烯二酸產生。可使用本發明之與生長聯合產生反丁烯二酸之生物體來合成基本上任何量(包括商業量)反丁烯二酸受質。由於用於本發明方法之微生物體強制性將反丁烯二酸與生長偶合，故連續或接近連續生長法特別適用於生物合成產生反丁烯二酸。於以下進一步例示該等連續及/或接近連續生長法。連續及/或接近連續微生物體生長法亦於此項技術中熟知。簡言之，連接及/或接近連續生長法涉及使微生
物體維持在指數生長或對數相。程序包括使用諸如EvolugatorTM進化機(Evolugate LLC，Gainesville，FL)、醱酵槽及其類似物之裝置。此外，亦可採用在微嗜氧性條件下搖瓶醱酵及生長。在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者將瞭解可在各種不同條件下，使用於此項技術中熟知之各種不同方法及/或裝置採用各種不同設定之與生長聯合產生反丁烯二酸之微生物體。
一般而言，反丁烯二酸之連續及/或接近連續產生將包括在足以維持及/或幾乎維持指數期生長之營養素及培養基中培養本發明之非天然產生之與生長聯合產生反丁烯二酸的生物體。在該等條件下連續培養可(例如)生長1天、2、3、4、5、6或7天或更長時間。此外，連續培養可包括1週、2週、3週、4週或5週或更多週及達至數月之持續時間。應瞭解，連續及/或接近連續培養條件亦可包括此等例示性時段之間之所有時間間隔。
適用於化學產品之大規模生物產生之一種特別適用的方法為醱酵。簡言之，醱酵程序於此項技術中熟知。可(例如)以分批醱酵、饋入-分批醱酵；饋入分批醱酵或連續醱酵來利用一般及例如用於生物合成產生本發明之靶產物(諸如化合物)之一組互補代謝生物體的醱酵。此外，亦可將此等醱酵法中之任一者與適用於諸如分批分離或連續分離之醱酵程序的熟知分離法聯合。適用於生物產生本發明之靶化合物(諸如反丁烯二酸)之例示性醱酵作用與分離法之組合包括(例如)分批醱酵與分批分離；分批醱酵與連續分離；饋入-分批醱酵與分批分離；饋入-分批醱酵與連續分離；連續醱酵與分批分離或連續醱酵與連續分離。
分批與連續醱酵程序之實例為此項技術所熟知。饋入-分批醱酵及分批分離之例示性程序包括在10L以N2/CO2混合物噴射之生物反應器中，使用含有5g/L磷酸鉀；2.5g/L氯化銨；0.5g/L硫酸鎂及30g/L
玉米漿及20g/L之初始第一及第二碳源濃度之5L肉湯培養諸如一組互補代謝生物體之產生生物體。隨著CMO生長且利用碳源，將額外70%之碳源混合物以幾乎平衡碳源消耗之速率饋入生物反應器中。一般將生物反應器之溫度維持在30℃下。生長持續約24小時或更長時間，靶化合物達到20-200g/L之間之濃度，其中細胞密度在約5與10g/L之間。在培育時段完成後，可使醱酵槽內容物通過諸如離心機之細胞分離單元以移除細胞及細胞碎片，且可將醱酵肉湯轉移至產物分離單元中。靶化合物之分離可藉由用以將有機產物自稀水溶液分離之於此項技術中已知之標準分離程序進行，該等分離程序諸如使用與水不混溶之有機溶劑(例如甲苯)液-液萃取來提供靶化合物之有機溶液。接著可使所得溶液經受標準蒸餾法來(例如)移除且再循環有機溶劑，且分離具有已知沸點之靶化合物作為經純化液體。
連續醱酵及連續分離之例示性程序包括最初使用(例如)生物反應器裝置及以上所例示之培養基組成(但起始至少第一及第二碳源為約30-50g/L)以分批模式培養生產生物體，諸如一組互補代謝生物體。當碳源消盡時，以約0.5L/h與1L/h之間之速率持續供應相同組成之饋入培養基且以相同速率抽取液體。生物反應器中靶化合物濃度一般在30-40g/L下保持恆定，且細胞密度一般在約3-5g/L之間保持恆定。溫度一般維持在30℃下，且若需要，使用濃NaOH及HCl將pH值一般維持在約4.5。可使生物反應器持續運作(例如)約一個月，每天獲取樣本或視需要確保靶化合物濃度之稠度。以連續方式，在供應新體料培養基時持續移除醱酵槽內容物。接著可在移除或不移除細胞及細胞碎片下使含有細胞、培養基及靶化合物或其他所需產物之排出流經受連續產物分離程序，且該程序可藉由用以將有機產物自稀水溶液分離之於此項技術中熟知之連續分離法，及諸如以上例示及於此項技術中熟知之彼等之蒸餾及/或純化法進行。
在某些實施例中，產生反丁烯二酸之本發明生物體可在缺氧或大體上缺氧條件下維持、培養或醱酵。簡言之，缺氧條件係指缺乏氧之環境。大體上缺氧條件包括(例如)培養、分批醱酵或連續醱酵，使得培養基中所溶解之氧濃度保持在0與10%之間飽和。大體上缺氧條件亦包括使細胞在維持在小於1%氧之氣氛下之密封室內，於液體介質中或在固體瓊脂上使細胞生長或靜息。氧百分比可藉由(例如)以N2/CO2混合物噴射培養物來維持。
在生物產生反丁烯二酸期間或之後，可將於此項技術中熟知之各種反應條件用於交叉複分解轉化及/或包括二酯化反應之酯化反應中。使反丁烯二酸交叉複分解以每莫耳受質產生兩莫耳丙烯酸之一種特別適用的方法係於以下實例中例示。此方法可類似地適用於反丁烯二酸單酯及反丁烯二酸二酯之交叉複分解轉化中以產生如先前所述之丙烯酸酯。可與生物產生反丁烯二酸聯合採用此方法以及先前所例示之彼等交叉複分解反應中之任一者來整合本發明丙烯酸及/或丙烯酸酯之產生。
類似地，亦可採用多種酯化反應中之任一者來將反丁烯二酸轉化為反丁烯二酸單酯或反丁烯二酸二酯。亦於以下實例中進一步例示特別適用之酯化法。在某些實施例中，如圖3中所例示之藉由培養或醱酵產生之反丁烯二酸可與諸如乙醇、丁醇或彼等先前所述之醇中任一者之醇反應以產生反丁烯二酸之二酯，該反丁烯二酸二酯隨後藉由與乙烯反應產生丙烯酸酯來提供交叉複分解轉化之受質(參見例如圖2)。形成反丁烯二酸二酯可促進與含水培養基或醱酵肉湯分離且藉此促進複分解轉化及隨後分離純丙烯酸酯產物。在以下進一步描述之實施例中(其中受質之生物產生係衍生自可再生原料)，亦可由微生物體自可再生原料產生諸如乙醇及丁醇之醇。進一步整合來自可再生原料之醇生物產物可致使除本發明丙烯酸酯之碳以外所有均衍生自非耗盡
性來源。
可使用多種方法組態來進行交叉複分解及/或酯化之整合。舉例而言，可直接於培養基及/或醱酵肉湯中進行交叉複分解轉化。在此實施例中，可將交叉複分解及/或酯化試劑以足以催化反丁烯二酸轉化或酯化為丙烯酸或丙烯酸酯之濃度直接添加至培養基或肉湯中。類似地，酯化或二酯化後，可視情況將酯化試劑移除或中和，且可將交叉複分解試劑以足以催化反丁烯二酸單酯或反丁烯二酸二酯轉化產生丙烯酸/丙烯酸酯混合物或產生丙烯酸酯之濃度添加至培養基或肉湯中。
在另一實施例中，亦可在任一對於培養基及/或醱酵肉湯之各種處理後進行交叉複分解及/或酯化反應。舉例而言，可在添加交叉複分解及/或酯化試劑之前或同時處理培養基或肉湯以將pH、溫度及/或其他特徵調節至所需水準。可在添加合成試劑之前，藉由例如沈澱、過濾、離心或此項技術中熟知之其他方法，移除或部分移除細胞或其他微粒物質。培養基及/或肉湯中之多肽及/或其他可溶性大分子可藉由例如沈澱、大小排斥層析法、離子交換層析法或此項技術中熟知之其他方法移除。培養基或肉湯亦可與適用於或最適用於交叉複分解轉化及/或酯化之所需溶液、緩衝液或反應調配物交換或部分交換。給予本文中所提供之教示及指導，熟習此項技術者可知或可決定適合直接於產生反丁烯二酸之細胞之培養基或醱酵肉湯中偶合交叉複分解轉化及/或酯化的條件。舉例而言，可藉由幾乎不操作至不操作培養基或肉湯下偶合生物產生及化學合成步驟來達成丙烯酸或丙烯酸酯之流線型生產。可藉由聯合交叉複分解或酯化反應或在交叉複分解或酯化反應之前採用一些或所有以上方法組態來使丙烯酸或丙烯酸酯之產生最佳化。
在一個替代實施例中，可在如上例示之培養期間或在連續及/或
接近連續之培養時段期間的任何時間點收集或分離反丁烯二酸，接著經受交叉複分解轉化或二酯化，隨後經受交叉複分解轉化，以分別產生丙烯酸及丙烯酸酯。熟習此項技術者將瞭解微生物體維持在連續及/或接近連續生長期中越久，可產生成比例越大量之反丁烯二酸。丙烯酸或丙烯酸酯之各種純化法於此項技術中熟知。可使用該等方法中之任一者分離及/或純化本發明之丙烯酸或丙烯酸酯。
因此，本發明亦提供用於產生丙烯酸酯之方法。該方法包括：(a)在足量營養素及培養基中培養具有一組強制性將反丁烯二酸產生與微生物體生長偶合之代謝修飾之非天然產生的微生物體，代謝修飾組包括破壞具有：(1)fumABC、zwf、purU或(2)fumABC、zwf、glyA或其直系同源物之基因組中至少一者以產生穩定之與生長聯合之反丁烯二酸產生；(b)進行該反丁烯二酸之二酯化以產生反丁烯二酸二酯，且(c)在交叉複分解催化劑存在下使反丁烯二酸二酯與足量乙烯接觸以每莫耳反丁烯二酸二酯產生約兩莫耳丙烯酸酯。
除使用葡萄糖作為糖酵解碳源產生如圖3中所例示之丙烯酸及/或丙烯酸酯以外，亦可使用本發明之整合製程來由可再生原料產生此等產物。許多不同碳基質，諸如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、山梨糖醇、蔗糖、甘油或合成氣體(一氧化碳、氫與二氧化碳之混合物)可衍生自可再生原料且藉此用作用於培養或醱酵法之能量來源。可將於此項技術中已知之此等及其他受質用於反丁烯二酸之生物產生。
在本發明之某些實施例中，用於生物生長及代謝之碳源可衍生自各種不同生物質。在給出本文中所提供之教示及指導的情況下，熟習此項技術者將瞭解產生反丁烯二酸或其他反丁烯二酸受質之本發明生物製程可涵蓋使用多種不同碳源。因此，諸如反丁烯二酸及/或醇之受質之生物產生適用於與多種不同碳源及/或包括(例如)生物質及可再生原料之碳源混合物一起使用。
適用於生物產生受質(諸如反丁烯二酸)之碳源包括(例如)生長培養基、醱酵肉湯或其類似物中糖或糖之混合物或其他能量來源。舉例而言，可產生生產反丁烯二酸受質之本發明生物製程，其中使產生反丁烯二酸之微生物體於(例如)單一或多個碳源，諸如於葡萄糖上或於葡萄糖及阿拉伯糖上生長。可獲得、產生或補充培養基使其含有此等糖中之任一者或兩者，以及於此項技術中已知之其他糖或碳源。或者，具有或能夠產生必需之能量來源混合物之不均勻混合物亦可用作受質混合物。該不均勻混合物之特定實例包括原料，包括(例如)可再生原料及/或衍生自生物質之可再生原料。因此，碳源混合物可包括具有一種以上可用於培養或醱酵本發明之微生物體之不同能量來源的生長培養基、醱酵肉湯及/或複合原料。亦可與本發明之生物製程一起利用於此項技術中熟知之其他碳源。
單一或複合混合物內之能量來源包括(例如)碳水化合物、蛋白質、脂質、脂肪及適用於藉由細胞生物化學方法轉化之其他大分子或化合物。該等能量來源通常供應用於生物化學法之能量產生之必需碳源。例示性碳水化合物包括(例如)單一及複合碳水化合物，分別諸如單醣(諸如糖)及多醣(諸如澱粉)。例示性蛋白質包括(例如)所有類型之多肽，包括蛋白聚糖。此等例示性大分子以及脂質、脂肪及其他大分子為此項技術中所熟知且均可以能量來源用於本發明之互補代謝生物體組。
在諸如生物質及/或可再生原料之複合混合物內供應此等能量來源之例示性材料及/或物質包括(例如)彼等先前所述者以及為熟習此項技術者熟知之其他可再生資源或副產物。舉例而言，生物質可提供多種能量來源，包括上述碳水化合物、蛋白質、脂質、脂肪以及諸如芳族化合物及/或諸如木質素之蛋白質性物質之其他分子。生物質及可再生原料特別適用作多種碳水化合物之來源。該等來源包括(例如)纖
維素性生物質、半纖維素性生物質、麥桿、玉米秸、草蘆、澱粉、玉米、小麥或玉米木屑澱粉、玉米、小麥、棉花。此等例示性生物質及可再生原料以及於此項技術中熟知之其他原料之部分、麩殼、餾份及廢物亦為可用於一組本發明之互補代謝生物體之生長培養基之多種碳水化合物的特別適用來源。特別適用之碳源包括含有不同簡單或複合碳水化合物之培養基或原料。碳水化合物提供細胞增殖之有效碳源。
例示性碳水化合物包括糖，葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖或果糖。
含有以上例示之糖能量來源或適用於本發明之互補代謝生物體生長之其他碳源的原料包括(例如)纖維素生物質、半纖維素生物質及木質素原料。該等生物質原料含有(例如)適用作碳源之碳水化合物受質，諸如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖及澱粉。
在其他實施例中，生物質水解可產生亦可有利地自受質培養基利用作生物製程之碳源的毒性化合物。可用作碳源或其他燃料來源之例示性毒性化合物包括糠醛、芳族物、乙酸鹽及其他未確定之受質。移除此等毒性化合物亦特別適用於製程之總成本有效性，因為其消除在(例如)實際生物轉化步驟之前實施獨立單元操作之需要。當用作碳源時，毒性化合物可(例如)在發生主要生物轉化之前，或於相同反應容器中同時被消耗。一個特定實施例藉由轉化為所關注之細胞物質或其他產物而達成毒性產物之移除。
簡言之，可設計且產生微生物體來利用在共培養互補代謝生物體期間產生之一或多種副產物，包括毒性副產物。舉例而言，產生受質之微生物體亦可經修飾以代謝培養或醱酵自身之副產物。在此特定實施例中，含於支持生長及代謝之培養基中之初始碳源產生(例如)經修飾生物體進一步利用之可再生能量來源。
如上所述之本發明整合製程中之任一者可經組態為適用於製造丙烯酸及/或丙烯酸酯之生產系統。可製造之丙烯酸或丙烯酸酯量可在小量、研究量至大商業規模量之範圍內。在前者中，熟習此項技術者應瞭解產生反丁烯二酸之生物體之小量培養可適用於簡化操作及效能。在後者中，熟習此項技術者應瞭解產生反丁烯二酸之生物體之醱酵規模培養可適用於有效地達成所需生產力水準。
本發明之生產系統可以多種不同方式經組態。舉例而言，生產系統可含有產生反丁烯二酸、丙烯酸及/或丙烯酸酯所需之組份中的一些或所有。在生產系統含有所有組份之特定實施例中，產生反丁烯二酸之細胞可為固定相或對數生長相。生產系統亦可含有小於所有之組份且藉由添加先前所述之本發明整合製程之一或多個組份而為細胞生長、反丁烯二酸產生、丙烯酸產生及/或丙烯酸酯產生而平衡。
因此，本發明另外提供丙烯酸產生系統。該產生系統包括(a)具有一組強制性將反丁烯二酸產生與微生物體生長偶合之代謝修飾之非天然產生微生物體的培養物，代謝修飾組包括破壞具有：(1)fumABC、zwf、purU或(2)fumABC、zwf、glyA或其直系同源物之基因組中至少一者，其賦予穩定之與生長聯合之反丁烯二酸產生，及(b)足以使每莫耳反丁烯二酸產生約兩莫耳丙烯酸之量之乙烯及交叉複分解轉化催化劑。
亦提供丙烯酸酯產生系統。該產生系統包括(a)具有一組強制性將反丁烯二酸產生與微生物體生長偶合之代謝修飾之非天然產生微生物體的培養物，代謝修飾組包括破壞具有：(1)fumABC、zwf、purU或(2)fumABC、zwf、glyA或其直系同源物之基因組中至少一者，其賦予穩定之與生長聯合之反丁烯二酸產生；(b)足以由該反丁烯二酸產生反丁烯二酸二酯之至少一種二酯化試劑；(c)足以使每莫耳反丁烯二酸二酯產生約兩莫耳丙烯酸酯之量之乙烯及交叉複分解催化劑。
應瞭解，大體上並不影響本發明之各種實施例之效力的修改亦包括於本文中所提供之本發明定義內。因此，以下實例意欲說明而非限制本發明。
此實例描述用於將反丁烯二酸交叉複分解為丙烯酸及其酯且用於將反丁烯二酸二酯化為反丁烯二酸二酯之化學合成法。
來自反丁烯二酸及乙烯之丙烯酸：簡言之，在氮或氬下於由厚壁玻璃組成之1L玻璃反應器中裝入諸如二氯甲烷或二氯乙烷(500mL)之適當溶劑、反丁烯二酸(100g，0.86mol)，及Grubbs釕複分解催化劑(1.0-0.01mol%)。在氬下攪拌10-60min後，以1.0-5.0atm乙烯氣體對容器加壓，且將反應在0-50℃下攪拌經達至24小時之時段或直至製程監控指示反應完成。接著移除且恢復未使用之乙烯且將反應容器對大氣開放。以氫氧化鈉水溶液(300-500mL，1-5M溶液)處理溶液，且將含水層以上述溶劑萃取兩次。接著將含水層酸化至pH值為0-2且以二氯甲烷或乙醚(5×100mL)萃取。移除溶劑後，添加氫醌來限制聚合，且藉由蒸餾(b.p.139-140℃)純化粗丙烯酸。
來自反丁烯二酸二烷基酯及乙烯之丙烯酸烷酯：採用如上所述之相同通用方案，其中於反應容器中裝入反丁烯二酸二烷基酸而非反丁烯二酸。藉由結晶或蒸餾處理反應完成後之最終混合物獲得經純化之丙烯酸烷基酯。
來自生物學上產生之反丁烯二酸之丙烯酸：藉由在合適催化劑(例如Grubbs催化劑)存在下，於醱酵產生之反丁烯二酸與乙烯之間反應而產生丙烯酸。在此情況下，使用經工程設計之生物體來實施醱酵法來高水準產生反丁烯二酸。在醱酵法完成後，直接對醱酵肉湯進行複分解法為較佳方法。所組合之醱酵與複分解法之一般程序如下：
使產生生物體於以N2/CO2混合物噴射，使用含有5g/L磷酸鉀、
2.5g/L氯化銨、0.5g/L硫酸鎂及30g/L玉米漿及20g/L初始葡萄糖濃度之5L肉湯之10L生物反應器中生長。隨著細胞生長及利用葡萄糖，將額外70%之葡萄糖以幾乎平衡葡萄糖消耗之速率饋入生物反應器中。將生物反應器之溫度維持在30℃下。生長持續約24小時直至反丁烯二酸達到10-200g/L之間之濃度，其中細胞密度在5與50g/L之間。完成培育時段後，使醱酵槽內容物通過細胞分離單元(例如離心機)以移除細胞及細胞碎片，且將醱酵肉湯轉移至第二反應單元中，其中將Grubbs催化劑(1.0-0.01mol%)可能連同用以增加催化劑溶解度之適當有機溶劑一起添加至肉湯中，且以乙烯對反應器加壓(1.0-5.0atm)。攪拌歷時完全反應所需之時間後，釋放且恢復乙烯壓力，且將丙烯酸與肉湯分離且如上所述純化。
反丁烯二酸之二烷基酯：二烷基反丁烯二酸酯或反丁烯二酸之二酯(例如反丁烯二酸二甲基酯及反丁烯二酸二丁基酯)易自許多商業來源獲得，且係藉由包括在對甲苯磺酸催化劑存在下以脂族醇使反丁烯二酸二酯化之各種途徑製備。或者，可使用胺催化劑由反丁烯二醯基氯及烷基醇製備酯。於以下提供代表性實例。
反丁烯二酸二烷基酯之費希爾合成係如(例如)美國專利申請案20020040123 A1描述進行。簡言之，由反丁烯二酸及1-二十烷醇之單體合成係藉由向反應燒瓶(裝備有冷凝器及Dean-Stark收集裝置以在反應水形成時將其移除)中添加2.8g(FW 116.07，0.01875莫耳)反丁烯二酸，11.2g(0.0375莫耳)1-二十烷醇(FW 298.56)，0.3567g(0.00188莫耳)單水合.rho.-甲苯磺酸及50mL甲苯而進行。在氮下將混合物在130℃下加熱18小時。接著將反應冷卻至室溫且過濾且藉由旋轉蒸發器移除溶劑甲苯來獲得產物(mp 71-73℃)。C20反丁烯二酸酯產物係以IR及NMR光譜學來表徵。產物之IR譜係以NaCl盤中之熔融固態膜來記錄。該頻譜展示1728cm-1之酯峰值及1647cm-1之雙鍵吸收峰值。產
物之13C NMR展示134.0ppm之雙鍵吸收峰值(反-HC.dbd.CH-，碳)及165ppm之羰基酯峰值。NMR譜亦由於緊鄰酯官能基之亞甲基(-C(O)O-CH2-)而展示66ppm之吸收峰值。脂族區中之吸收峰值代表直鏈烷基。
反丁烯二酸酯之複分解之實例：為表明經由添加乙烯將反丁烯二酸酯轉化為丙烯酸酯之可行性，篩檢一系列可購得之複分解催化劑。以下結果表明進行複分解反應之能力，且暗示探索增強之效能之空間。
一般： 在150psi下於150mL Fisher-Porter壓力瓶中進行實驗。經壓縮乙烯(99.95%)係自Praxair購得且係如所接受之原狀使用。所有溶劑及化學品係自Aldrich Chemicals購得。在使用前蒸餾反丁烯二酸二乙基酯(98%)。如所接受之原狀來使用順丁烯二酸二乙基酯、反丁烯二酸二甲基酯、丙烯酸乙酯及丙烯酸。所有催化劑係由Materia，Inc.製備且係自Materia或Aldrich Chemicals獲得。使用J&W Scientific之HP-5管柱，以Agilent Technologies 6850 Series II來獲得所有氣相層析(GC)數據。溫度分布保持在100℃下1分鐘，以每分鐘10℃之速率遞增至250℃，且固持在250℃下歷時5分鐘。核磁共振(NMR)數據係由Varian 400MHz儀器獲得。NMR溶劑係自Cambridge Isotope Inc購得。
標準程序：將受質(例如二乙基反丁烯二酸酯，5g)、催化劑(2.5莫耳%)及磁力攪拌棒添加至充氮手套箱內之Fisher-Porter瓶中。組裝Fisher-Porter瓶且將裝置移出箱中且與乙烯缸連接。將乙烯管線以乙烯淨化歷時數分鐘，且接著將Fisher-Porter瓶以乙烯加壓至所需水準(150psi)。將瓶置放於磁性攪拌器熱盤上之60℃之油浴中。所指定之反應時間後，將瓶自油浴中移除且在空氣中冷卻至室溫。釋放壓力且將內容物經由濾紙過濾。將等分試樣於GC瓶中之二氯甲烷或氯苯中
稀釋且藉由GC分析樣本將反丁烯二酸二乙酯轉化為丙烯酸乙基酯之轉化率百分比。
於此實驗中篩檢之催化劑包括五種市售催化劑。所有催化劑可獲自Materia或Sigma-Aldrich。將關於此等五種催化劑之完全詳述提供於下表4中。
在上述實驗條件下篩檢展示於表4中之催化劑產生表明將反丁烯二酸酯轉化為丙烯酸酯之結果。將反丁烯二酸二乙基酯之結果展示於下表5中且展示於圖4中。此等反應係以純受質且在無額外溶劑下進行。反應一般係以緩慢方式進行，尤其在使用1代及2代Grubbs催化劑
下更是如此，在該兩種情況中分別觀測到無轉化(C823)及1%轉化(C848)。使用催化劑C627(其為所測試之唯一不含膦系統)可見7%之最佳轉化及產率。以反丁烯二酸二甲酯達成類似結果。
表2：已知與經鑑別在表1中所列之策略中缺失之反應相關的所有反應化學計量及相關基因列表
在本申請案全文中，已在圓括號內參考多種公開案。此等公開案之揭示內容據此以引用的方式全部併入本申請案中以更充分描述本發明所屬之現有技術之狀態。
儘管本發明已參照所揭示之實施例來加以描述，但熟習此項技術者將易於瞭解以上詳述之特定實例及研究僅說明本發明。應瞭解可在不偏離本發明精神下進行多種修改。因此，本發明僅由以下申請專利範圍限制。
Claims (3)
- 一種產生烯烴之方法，其包含：(a)藉由在足量營養素及培養基中醱酵培養產生反丁烯二酸之微生物體，及(b)在烯烴複分解轉化催化劑之存在下使該反丁烯二酸與足量2-丁烯接觸以產生丁烯酸。
- 一種烯烴產生方法，其包含：(a)藉由在足量營養素及培養基中醱酵培養產生反丁烯二酸之微生物體；及(b)執行包含利用乙烯之烯烴複分解之化學修飾以將該反丁烯二酸轉化為丙烯酸。
- 一種烯烴產生方法，其包含：(a)藉由在足量營養素及培養基中醱酵培養產生反丁烯二酸之微生物體；(b)執行酯化以將該反丁烯二酸轉化為反丁烯二酸二酯；及(c)使該反丁烯二酸二酯與複分解試劑及乙烯接觸，以產生丙烯酸酯。
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